El Pharma Innovación Diario 2015; 3 (12): 77-82
ISSN: 2277- 7695
TPI 2015; 3 (12): 77-82 © 2015
TPI
www.thepharmajournal.com Recibido:
15-01-2015 Aceptado: 03/02/2015
M.Rukmini 
Nitza Biológicos (P) Ltd, Shree colonia,
Secunderabad-500056, Telangana, India.
Debasish sahoo
Nitza Biológicos (P) Ltd, Shree colonia,
Secunderabad-500056, Telangana, India.
Jikasmita Dalei
Nitza Biológicos (P) Ltd, Shree colonia,
Secunderabad-500056, Telangana, India.
Ravitosh Ray
Nitza Biológicos (P) Ltd, Shree colonia,
Secunderabad-500056, Telangana, India.
Correspondencia:
M.Rukmini
Nitza Biológicos (P) Ltd, Shree colonia,
Secunderabad-500056, Telangana,
India.
 
Producción, purificación y caracterización de
bacitracina de Bacillus subtilis.
M.Rukmini, Debasish sahoo, Jikasmita Dalei, Ravitosh Ray
Abstracto
Bacillus subtilis capaz de producir bacitracina se aisló a partir del suelo y se cribaron para la producción de bacitracina en medios nutrientes
contra prueba patógena viz organismos: Micrococcus luteus, ( ATCC 9341) y Staphylococcus aureus ( ATCC 13565). Bacitracina fue
producida por fermentación sumergida de las bacterias aisladas y se analiza en su actividad antimicrobiana por el método de difusión en
pocillos de agar. La bacitracina se extrajo y se purificó por el sistema de extracción líquido Butanol-éter y se identifica mediante cromatografía
en capa fina. Mediante la optimización de la composición y Medios de Cultivo condiciones, el efecto de diferentes fuentes de nitrógeno
(asparagina, metionina, peptona, extracto de levadura, nitrito de sodio, nitrito de amonio), fuentes de carbono (glucosa, fructosa, sacarosa,
lactosa) pH (5, 6, 7 , 8, 9), el tiempo (48 horas, 72 horas, 120 horas, 144 horas), la temperatura (-4 ° C, 37 ° C, 42 ° C y 30 ° C) sobre la
producción de bacitracina fueron investigados por ensayo de difusión en agar tal como se detecta por el tamaño de las zonas de inhibición.
La producción máxima se observó mediante el uso de la glucosa como de carbono y asparagina como fuente de nitrógeno y después de la
incubación a 42 ° C de pH 7,0 durante 144 horas.
palabras clave: bacitracina, Bacillus subtilis, Actividad antimicrobiana
1. Introducción
El descubrimiento y el uso de antibióticos, que ha sido producido por varios microorganismos a través de las vías
metabólicas secundarias ha sido uno de los grandes logros científicos en el más temprano de 20 º siglo [ 1] y estos compuestos
pueden luchar contra diversas enfermedades. Generalmente antibiótico es una sustancia química, que posee un peso
molecular menor que 2 kilo Dalton y se utiliza para matar o evitar el crecimiento de cualquier otro tipo de microorganismos
en una dosase inferior [ 2].
La mayoría de los antibióticos peptídicos son producidos por bacilos que son activos contra bacterias gram-positivas; sin
embargo, los compuestos tales como polimixina, colistina y exhiben actividad circulin casi exclusivamente en bacterias
gram-negativas, mientras que bacillomycin, mycobacillin y fungistatin son eficaces contra hongos y levaduras [ 3]. bacitracina se
deriva a partir de cultivos de Bacillus subtilis. Es un blanco a piel de ante pálido, polvo higroscópico, inodoro o con un ligero olor.
Se precipita a partir de sus soluciones y se inactiva por muchos de los metales pesados. La bacitracina es una mezcla de varios
polipéptidos que difieren en su composición de aminoácidos [ 4] y funciona como un inhibidor de la biosíntesis de la pared celular.
Bacitracina de otro microorganismo es un antibiótico, así como no ribosomally producido por Bacillus licheniformis [ 5]. Bacitracin
afecta a la síntesis de proteínas, síntesis de la pared celular y funciones de la membrana. Los estudios sobre los antibióticos y
los antibióticos con combinación de enzimas han sido realizadas por Neeraj et al, 2010 [ 6] y Meshcer, 1974 [ 7].
Es un potente antibiótico dirigido principalmente contra organismos gram positivos como Bacilos spp, Staphylococcus sp. Estreptococo
sp. Clostridium sp. así como algunas arqueobacterias [ 8]. Es uno de los antibióticos importante utilizado en la medicina humana y
también se utiliza en la cría de animales para la prevención y control de enfermedades existentes en los animales de granja.
Es una en gradiente en varios ungüentos triples tópicos disponibles comercialmente antibióticos tales como Polysporin y Neosporin
que se utilizan para prevenir infecciones en heridas y quemaduras [menores 9].
La bacitracina es un suplemento alimenticio importante para un número de especies animales. Se mejora la ganancia de peso y la eficiencia
alimenticia cuando se añade en una concentración de 5-100 ppm.
2. Materiales y métodos
2.1 Aislamiento y selección de especies de Bacillus
Las muestras de suelo se recogieron en bolsa de la cremallera de la rizosfera y se sometieron a 10 veces la dilución en serie y partes
alícuotas (0,1 ml) se colocó en placas de agar nutriente y se incubaron durante 24 horas a condiciones óptimas [ 10]. Las cepas aisladas se
mantuvieron en cultivos inclinados a 4 ° C.
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2.2 Caracterización de las cepas aisladas
Las cepas aisladas se identificaron sobre la base de sus características morfológicas y
bioquímicas como la tinción de Gram, la tinción de endospora, prueba de la hidrólisis
del almidón, test MR-VP, prueba de la motilidad, la prueba de citrato, prueba de NaCl
6,5%, etc. acuerdo con el Manual de Bacteriología Determinativa [de Bergey 10].
2.3 Proyección de la producción de bacitracina
La producción de bacitracina por las bacterias aisladas se confirmó en los
organismos de prueba a cribar. Los organismos de ensayo fueron sembradas como
en zig-zag de la moda en los medios de agar nutriente en el que se hizo una raya
central. El resultado fue tomada como positiva por la creación de zona de inhibición
en el lado de la racha.
2.4 fermentación sumergida para la producción de bacitracina
La fermentación sumergida se llevó a cabo con medios sintéticos en
Erlenmeyer de 250 ml para la producción de bacitracina. medios sintéticos
que contienen la siguiente composición en (g / L), L-ácido glutámico-5,0; KH 2 correos
4- 0,5; K 2 HPO 4- 0,5; MgSO 4. 7H 2 O-0.2;
MnSO 4. H 2 O-0,01; NaCl-0,01;
FeSO 4. 7H 2 O-0,01; CuSO 4. 7H 2 O-0,01; CaCl 2. 2H 2 O-0.015; La glucosa-10; Se
preparó pH-7 y en autoclave durante 15 minutos a 121 0 C a 15 psi de presión.
Después de enfriar, los medios se inocularon con 24 horas de edad cultivo
vegetativo (inóculo) y el matraz se incubó a 30 ° C en un agitador orbital a 150
rpm. Después de 48 horas de incubación, el caldo de fermentación se centrifugó
a 10.000 rpm durante 15 minutos y los sobrenadantes se ensayaron para
potencia antimicrobiana.
2.5 Purificación de antibiótico por el método de extracción con disolvente
Se añadió un volumen igual de solución de Butanol-éter para concentrado acuoso en un
embudo de separación y se agitó vigorosamente. HCl concentrado se añade gota a gota hasta
que la mezcla se separa en capas inmediatamente después de la agitación. La capa superior se
vuelve más oscuro a medida que se añadió ácido debido a la eliminación de las impurezas de la
cámara acuosa. El pH de la capa acuosa se mantiene entre 3 - 4. La capa acuosa inferior que
contiene el material activo se decanta y se repite la extracción. La extracción se repitió cinco
veces se dejó reposar durante diez minutos y el pH se prueba. La capa inferior se decanta y se
extrae cinco veces con éter libre de peróxidos. se obtuvieron 40 ml del extracto de fermentación
sumergida. La capa acuosa final se destila bajo presión reducida hasta que todo butanol y éter
se ha eliminado. El volumen de los extractos es de 13 ml para sumergido. Después de la
destilación de la solución se lleva a pH 7 con bicarbonato sódico. a continuación, se liofiliza la
solución neutralizada, que es un polvo amarillento. se añaden 100 mg de MgO a 10 ml de
solución débilmente ácido o neutro de bacitracina concentrado. Esta mezcla se agita y después
de un almacenamiento de varias horas en la nevera, se filtró en frío. El filtrado se encontró
alcalina y se neutralizó con HCl tratamiento y MgO. El proceso se repitió hasta que la actividad
de MgO es insignificante. El primer precipitado formado se descartó ya que no presenta
actividad antibiótica. El filtrado se neutralizó con bicarbonato de sodio y después se añadió
ácido salicílico para la precipitación completa. El precipitado se recogió y Después de la
destilación de la solución se lleva a pH 7 con bicarbonato sódico. a continuación, se liofiliza la
solución neutralizada, que es un polvo amarillento. se añaden 100 mg de MgO a 10 ml de
solución débilmente ácido o neutro de bacitracina concentrado. Esta mezcla se agita y después
de un almacenamiento de varias horas en la nevera, se filtró en frío. El filtrado se encontró
alcalina y se neutralizó con HCl tratamiento y MgO. El proceso se repitió hasta que la actividad
de MgO es insignificante. El primer precipitado formado se descartó ya que no presenta
actividad antibiótica. El filtrado se neutralizó con bicarbonato de sodio y después se añadió
ácido salicílico para la precipitación completa. El precipitado se recogió y Después de la
destilación de la solución se lleva a pH 7 con bicarbonato sódico. a continuación, se liofiliza la solución neutralizada, que es un polvo amarillento. se añaden 100 mg de MgO a 10 ml de solución débilmente ácido
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se secó, se lavó repetidamente con éter libre de peróxido para eliminar el exceso
de ácido salicílico. Se basa en embudo y se lavó de nuevo con éter libre de
peróxido, se secó en vacío a temperatura ambiente sobre anhídrido fosfórico. El
salicilato se disolvió mediante percolación HCl 0,05 N y se utiliza para ensayo.
2.6 ensayo de difusión en agar
Agar método de difusión en pocillo se utiliza para comprobar los cultivos para la
producción de metabolitos antimicrobianos [ 11]. Veinticuatro horas cultivos frescos
de Staphylococcus aureus, y
Micrococcus luteus se diluyeron con pre esterilizada solución salina normal y la
turbidez de los cultivos se ajustó con 0,5 estándares McFarland (106 UFC / ml). 200 l
de suspensiones celulares estandarizados se extendieron sobre un agar
Mueller-Hinton. Los pocillos se entonces se clavaron en el agar usando un 6 mm
perforador de corcho diámetro estéril. Los extractos brutos de diferente conc. (70 l, 80
l, 90 l, 100 l) se introdujeron en los pocillos, se dejó reposar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 2 horas y después se incubó a 37 ° C. Después de 24
horas de incubación se observaron y midieron las zonas de inhibición.
2.7 condición óptima para la producción de antibióticos
Optimización de las condiciones de cultivo y medios de composición se hizo para
estudiar los efectos sobre la productividad de bacitracina antibiótico. Fue hecho
mediante el estudio de los efectos de diferentes fuentes de carbono (glucosa,
sacarosa, fructosa y lactosa),
fuentes de nitrógeno (asparagina, metionina, extracto de levadura, peptona, nitrito
de sodio y nitrito de amonio) y cambiando el pH (5, 6, 7, 8, 9) de tiempo de
incubación (48 h, 72 h, 120 h, 144 h) y la incubación temperatura (-4 ° C, 37 ° C, 42
° C, temperatura de la habitación 30 ° C).
2.8 Identificación de Bacitracin usando cromatografía en capa fina
El gel de sílice se preparó con agua destilada en proporción 1: 2 y se transfiere
inmediatamente sobre el portaobjetos de vidrio de manera uniforme, se secó al aire y se
mantuvo en el horno a 105 ° C durante 30 min. El disolvente para la fase móvil se preparó
como Butanol: Agua (8: 2). La línea de referencia se elaboró ​en la placa de gel de sílice a
una distancia de
1,5 cm desde el extremo inferior. Las manchas se marcaron en el extremo y las
muestras de ensayo se aplicaron en los puntos (10-20 l) la placa de gel de sílice
se suspendió en el disolvente. La placa se toma en el momento de la migración
del disolvente, es casi igual a 80% de la longitud de la placa. La caracterización
se realiza comparando el factor de retardo de bacitracina al factor de retraso
bacitracina estándar. factor de retardo (R f) = la distancia recorrida por el disolvente
/ distancia recorrida por soluto
3. Resultados y discusión
3.1 Aislamiento e identificación de microorganismos
Bien hecho con las otras colonias seleccionado y proyectado para la producción de
bacitracina. Cuatro colonias fueron identificadas sobre la base de estudio morfología,
tinción de Gram y pruebas bioquímicas (Tabla
1). Después de realizar todas las pruebas de colonias 1, 2, 3 y 4 fueron confirmados
como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus y Bacillus polymyxa respectivamente
 
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Tabla 1: Las pruebas bioquímicas para Bacillus spp.

Las pruebas bioquímicas colonia 1 colonia 2 colonia 3 colonia 4

tinción de Gram Gram + Varilla Gram + Varilla Gram + Varilla Gram + Varilla
tinción endospora Positivo (+ ve) Positivo (+ ve) Positivo (+ ve) Positivo (+ ve)
hidrólisis del almidón Positivo (+ ve) Positivo (+ ve) Positivo (+ ve) Positivo (+ ve)
prueba de la motilidad *N/A *N/A Positivo (+ ve) *N/A

prueba de VP Positivo (+ ve) Positivo (+ ve) Positivo (+ ve) Positivo (+ ve)

prueba de utilización de citrato Positivo (+ ve) Positivo (+ ve) *N/A *N/A

fermentación de manitol *N/A *N/A *N/A Positivo (+ ve)

Crecimiento a 55 0 do Negativo (- ve) Positivo (+ ve) *N/A *N/A

Las bacterias identificadas Bacillus subtilis Bacillus licheniformis de Bacillus cereus Bacillus polymyxa

NA - procedimiento / prueba bioquímica no adaptado / no hecho.

Todas las cuatro bacterias se cribaron para la producción de bacitracina y sólo Bacillus 3.2 Actividad antibacteriana de Bacitracin
subtilis mostró resultados positivos para la producción. La actividad antibacteriana de crudo se proyectó primero contra
Staphylococcus aureus ( La Figura 1a y 1b) y Micrococcus luteus ( Figura 1c).
(Tabla 2)

Tabla 2: La actividad antibacteriana de extracto crudo de Bacitracin que muestra una zona de inhibición.

Los organismos de ensayo Staphylococcus aureus Micrococcus luteus

Concentración 70 l 80 l 90 l 100 l 70 l 80 l 90 l 100 l
Zona de inhibición 18 mm 18 mm 22 mm 22 mm 20 mm 20 mm 26 mm 26 mm
 

Figura 1: Proyección de bacitracina crudo contra Staphylococcus aureus al (a) 70 l y 80 l (b) 90 l y 100 l y en contra
Micrococcus luteus ( c) a diferentes volúmenes.

muestras extraídas y purificadas se sometieron al método de difusión en pocillos Tabla 3: La actividad antibacteriana de la zona de Bacitracin purificado de

de agar y zona de inhibición se midió en mm. Más zona de inhibición se midió en inhibición

muestras purificadas en comparación con los extractos crudos (Tabla 3) (Figura Los organismos de ensayo Zona de inhibición
Staphylococcus aureus 24mm
2).
Micrococcus luteus 27mm

(un) (segundo)
Figura 2: Zona de inhibición para el extracto purificado de Bacitracin contra (a) Staphylococcus aureus ( segundo) Micrococcus luteus.

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La bacitracina fue purificado identificado por Delgado capa el factor de retardo de la bacitracina estándar (es decir 0,96). (Tabla 4)
cromatografía y su R F Se encontró valor a ser 0,95 cerca de

Tabla 4: Resultados de la identificación TLC de Bacitracin

organismo de prueba fuente solvente fuente soluto R F valor

bacitracina estándar 7.3 cm 7,0 cm 0.96 cm
bacitracina de muestras 6,4 cm 6.1 cm 0,95 cm

3.3 Optimización de los medios
La condición óptima para la producción de bacitracina se llevó a cabo para fuentes de
carbono, fuentes de nitrógeno, el pH del tiempo en los medios de producción,
temperatura de incubación y la incubación. Las mejores condiciones se analizaron como
el efecto bactericida para cada
condiciones contra Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus. La zona más
grande de las inhibiciones contra estos microbios patógenos estándar indica la
mejor potencia y la eficacia para la producción de bacitracina. (Tabla 5) (Figura
3-7).

Tabla 5: optimización para diferentes condiciones para una mejor producción de bacitracina.

Optimización de las condiciones Zona de inhibición (en mm)

luteus Staphylococcus aureus Micrococcus
Optimización de carbono Fuente (figura 5)
Glucosa como fuente de carbono 15 mm 14 mm
Sacarosa como fuente de carbono 09 mm 10 mm
Lactosa como fuente de carbono 10 mm 11 mm
Fructosa como fuente de carbono 12 mm 08 mm
Optimización de nitrógeno Fuente (figura 6)
Asparagina como fuente de nitrógeno 12 mm 11 mm
La metionina como fuente de nitrógeno 05 mm 06 mm
Extracto de levadura como fuente de nitrógeno 01 mm 00 mm
Peptona como fuente de nitrógeno 04 mm 02 mm
El nitrito de sodio como fuente de nitrógeno 02 mm 01 mm
nitrito de amonio como fuente de nitrógeno 02 mm 01 mm
Optimización de pH (figura 7)
pH a 5 10 mm 15 mm
pH a 6 15 mm 20 mm
pH a 7 30 mm 35 mm
pH a 8 10 mm 20 mm
pH a 9 20 mm 25 mm
Optimización de la temperatura de incubación ( o C) (figura 8)
La temperatura de incubación a -4 ( o DO) 10 mm 10 mm
La temperatura de incubación a 37 ( o DO) 40 mm 50 mm
La temperatura de incubación a 42 ( o DO) 45 mm 60 mm
La temperatura de incubación ( o C) a temperatura ambiente. 20 mm 10 mm
Optimización por horas de incubación (en horas) (figura 9)
horas de incubación a 48 horas 00 mm 00 mm
horas de incubación a 72 horas 10 mm 10 mm
horas de incubación a 96 horas 10 mm 15mm
horas de incubación a 120 horas 20 mm 30 mm
horas de incubación a 144 horas 55 mm 60 mm

Fig. 3: Optimización de fuente de carbono.

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Fig 4: Optimización de la fuente de nitrógeno.

Fig 5: Optimización del pH

Fig 6: Optimización de la temperatura (en ° C).

Fig 7: Optimización del tiempo de incubación (en horas).

4. Conclusión que estaba más cerca del R F valor de la bacitracina estándar de

Bacillus subtilis se aisló y se seleccionan para la producción de bacitracina. Bacitracina
fue producido mediante el uso de producción específicas, medios de comunicación y
se caracteriza por su actividad antimicrobiana contra los organismos patógenos de
prueba tales como
Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus. Bacitracin se purificó por sistema
disolvente Butanol-éter. La bacitracina purificada se caracterizó mediante la
comparación de la R F valor en capa fina
cromatografía con el bacitracina norma
comercialmente disponible. El r F valor de uno purificada fue 0,95
~ 81 ~
0.96. La producción, el medio se optimiza mediante el cambio de las condiciones de
cultivo, tales como fuente de carbono, fuente de nitrógeno, pH, temperatura y tiempo
de incubación y de análisis en contra de la actividad antimicrobiana contra Staphylococcus
aureus y
Micrococcus luteus. El mejor resultado se encontraban en 144 horas de incubación mediante el
uso de la glucosa como fuente de carbono, asparagina como fuente de nitrógeno con el pH de
los medios de comunicación a las 7 y período de incubación de 42 0 DO.
 
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5. Referencias
1. Singh SH, Owen AP. Sala. Los avances en el uso de
para especies de Bacillus la producción industrial, Can. J
Microbiol 2004; 50: 117.
2. Chopra M, Smith KN, Weinberg HR. Bacitracin inducida
lisis celular, Diario de Ciencias Biológicas 1996; 23: 564-
575.
3. Hammes EJ, Frank MP. Bacitracin Chemistry,
Metabolismo, fuentes de la dieta, Proc. Nat Acad Sci 1979; 17: 405-417.

4. Ohki R. Un Bacitracina - Resistente Bacillus subtilis Gene

Codifica un homólogo de la subunidad que atraviesa la membrana de la Bacillus
licheniformis ABC Transporter. J Bact 2003; 185 (1): 51-59.

5. Jyothi P, Kiran KJ, estudios Radhika M. antimicrobianas de los

antibióticos seleccionados y su combinación con enzimas. Revista
Internacional de Farmacia y Ciencias Farmacéuticas 2010; 2 (3).

6. Neeraj M, Behal KK. La actividad antimicrobiana de algunos

especies contra microbios seleccionados. Revista Internacional de Farmacia
y Ciencias Farmacéuticas 2010; 2 (3).
7. Meshcer R, Hummel JP, Dreyer WJ. la actividad bactericida
de bacitracina. J Bioquímica 1974; 92: 97-299.
8. Arky R. La bacitracina es de metal dependiente antibiótico péptido
a partir de cultivos de Bacilo. Journal of Serbio Sociedad 1997; 69:
883-886.
9. Capuchino, Sherman. En: Microbiología Labaratory
Manual, Edn 7, Pearson Education, India, 2007.
10. Buchanan JR, NE. Gibbons. Manual de Bergey
Determinante Bacteriología, Edn 8, The Williams y Wilkins
Company, Baltimore, 1974.
11. Sen KS, FS Haque, CS Pal. Nutrientes para la optimización
producción de antibióticos de amplio espectro por Streptomyces
Antibioticus Str. 15. 4. Acta Microbial Hung 1995; 42: 155-162.

~ 82 ~