COLORACIÓN SIMPLE Y GRAM.

COLORACIÓN DE CÁPSULA Y
ESPORAS.

1. INTRODUCCION:
En las bacterias Gram positivas la red de mureína supone del 30 al 70% del
peso seco de la pared celular (40 capas de grosor). En lugar de ácido meso-
diaminopimelico es frecuente la presencia de ácido LL-diaminopimelico o de
lisina. En Staphylococcus aureus las cadenas tetrapeptidicas del ácido
murámico
En la pared celular de las bacterias Gram positivas los polisacáridos, en
el caso de que los haya, están unidos par enlaces covalentes. EI contenido
proteico es bajo. Con frecuencia se encuentran ácidos teicoicos; son
cadenas de moléculas de glicerina o ribitol esterificadas entre el par
puentes fosfato. Los ácidos teicoicos se unen probablemente a la mureína a
través del fosfato formando una amida.
La pared celular de las bacterias Gram negativas. En las bacterias Gram
negativas la red de mureína presenta una sola capa Y supone menos del 10%
del peso seco de la pared celular (en Escherichia coli B). La mureína
contiene siempre únicamente meso-diaminopimelico y nunca lisina, y no se
encuentran puentes interpeptidicos. La constitución del saco de mureína es
igual en todas las bacterias Gram negativas. Junto a este esqueleto se
encuentran grandes cantidades de lipoproteínas, lipopolisacáridos y otros
lípidos, que parecen estar pegados a la estructura de mureína. Están unidos
covalentemente y representan hasta el 80% del peso seco de la pared
celular. Parece ser que para mantener la estabilidad de la capa de
lipopolisacáridos es imprescindible el ion Ca2+. En muchas bacterias Gram
negativas la capa de mureína se hace accesible al enzima lisozima que la
destruye, cuando se han tratado con EDTA para eliminar los iones Cac+. Este
agente quelante libera una parte de los lipopolisacáridos. Hasta ahora no
han podido demostrarse ácidos teicoicos. (Jawetz, Melnick y Adelberg,
2001)

CAPSULA
Muchas bacterias sintetizan grandes cantidades de polímeros extracelulares
cuando crecen en sus ambientes naturales. Con
En una excepción conocida (cápsulas de ácido poli-d-glutámico de Bacillus
anthracis y Bacillus licheniformis), el material extracelular es un
polisacárido. Los términos cápsula y capa mucilaginosa con frecuencia se
utilizan para describir capas de polisacáridos; también se utiliza el
término más incluyente, glucocáliz que se define como el material que se
encuentra fuera de la célula y que contiene polisacáridos. Una capa
condensada, bien defi nida que rodea en forma estrecha a la célula y que
excluye partículas, como la tinta china, se conoce como cápsula
(Hans-Günter Schlegel, 1997)
2. OBJETIVOS:
 Observar la distinta coloración de bacterias Gram positivas y Gram
negativas
 Observar la coloración de la capsula
 Observar la coloración de esporas

3. TECNICAS
3.1 TECNICA PARA GRAM:
o Fijar de la muestra y cubrirla con solución fenicada de violeta de
genciana, dejar en reposo 30 a 60 segundos
o Lavar con agua a chorro y cubrir con Lugol, dejar actuar 2 min.
o Decolorar con alcohol y luego lavar
o Contrastar con safranina
o Lavar y secar

3.2 COLORACION DE CAPSULA (técnica de MANEVAL)

o Preparacion de una suspensión turbia del germen
o Colocar una gota de rojo de congo
o Mezclar en la lamina a temperatura ambiente
o Agregar el colorante maneval dejarlo reposar un minuto por lo menos
o Lavar y secar a temperatura ambiente

3.3 COLORACION DE ESPORAS

o Hacer una extencion bacteriana y fijar al calor
o Añadir verde de malaquita
o Calentar hasta desprenderse vapores por 3 o 4 veces
o Lavar y agregar safranina a un minuto
o Lavar y secar
4. RESULTADOS:

Pseudomonas Gram negativas

Color rojo

Bastones

Stafilococcus Aureus

Gram positiva

Color violeta

se forman cocos en racimos

Bastones rojos de Bacilos

En el centro también encontramos cuerpo bacteriano
de color rojo y de color verde esporas
 Observacion de capsulas sin color de
Klebsiella

Cuerpo bacteriano color rojo

5. BIBLIOGRAFIA:

o Microbiología médica, Jawetz, Melnick

y Adelberg, 2001

o Microbiologia General, Hans-Günter Schlegel, 1997

 SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO.
ACCIÓN DE LAS BACTERIAS SOBRE LOS CARBOHIDRATOS,
PROTEÍNAS Y SUSTANCIAS NITROGENADAS.

1. INTRODUCCION:
Una gran cantidad de microorganismos sin requerimientos, como por ejemplo
muchos pseudomonas del suelo y del agua, pero tambien Escherichia coli, se
 desarrollan perfectamente en un caldo de cultivo con una composicion una
composición especifica. Muchos microorganismos necesitan ademas uno u otro
de los oligoelementos, vitaminas o suplementos antes indicados. Si el medio
de cultivo esta compuesto por sustancias quimicas definidas, se habla de un
medio de cultivo sintetico o definido. Se pretende conseguir definir para
cada microorganismo los nutrientes minimos para establecer un medio minimo,
que contenga unicamente los componentes necesarios para el crecimiento. Las
especies mas exigentes requieren un gran numero de complementos. Para
Leuconostoc mesenteroides se ha desarrollado un medio sintetico que
contiene mas de 40 componentes. (Hans-Günter Schlegel, 1997)
El conocimiento de la diversidad de los microorganismos se debe a dos
procedimientos. Algunos microorganismos han despertado nuestro interes por
la formacion de colonias, agrupaciones llamativas o por modificaciones en
el medio. Muchos de estos microorganismos aparentes a simple vista pueden
someterse a un aislamiento directo. Para estos organismos pudieron
establecerse facilmente los medios de cultivo y las condiciones de
crecimiento que permitiesen su desarrollo. No obstante, muchos tipos
fisiologicos distintos de microorganismos pudieron investigarse solo cuando
se desarrollo la tecnica del cultivo de enriquecimiento de WINOGRADSKY Y
BEIJERINCK.
(Jawetz, Melnick y Adelberg, 2001)

2. OBJETIVOS:
 Preparar medio de cultivo ( 50 ml de agar nutritivo)
 Observar el metabolismo de las bacterias en diferentes sustratos
 Sembrar distintos tipos de medios de cultivos y observar la acción de
las bacterias

3. TECNICAS
3.1 TECNICAS PARA TIPO SEMBRADO:
3.1 Siembra por estriamiento por cuadrantes
Con el asa con el microorganizmo sembramos cuatro cuadrantes a partir del
centro hacia afuera cormando estrias en cuatro cuadrantes

Para este sembrado también

utilizamos el asa con el microorganismo, estriamos en un lado de la placa y
luego en el lado adyacente y asì sucesivamente hasta completar los cuatro
cuadrantes

3.2 METABOLISMO DE BACTERIAS

3.2.1 DEGRADACION DE CARBOHIDRATOS

a. Lectura de tubos con caldo glucosado con indicador de campana de
Durham, sembrados con cepas de Echerichia coli y pseudomonas.

b. Para observar la producción de acetil carbinol, leer los cultivos

pasado las 48 horas en medio VP – RM con E. coli y Enterobacter
 3.2.2 ACCION DE PROTEINAS Y OTRAS SUSTANCIAS NITROGENADAS

a. Licuefacción de la gelatina: Semabrar cepas de Pseudomonas y E. coli e

incubar 48 horas

b. Produccion de Indol: Leer cultivos en caldos pectonados incubados por

48 horas de cepas de E. coli y Enterobacter

c. Produccion de 𝐻2 𝑆 : Leer cultivos de caldo pectonado incubados por 48

horas de Citrobacter freundii y Proteus vulgaris

d. Hidrolisis de la ùrea: Leer cultivos en un medio con urea de cepas de

Proteus y E. coli

e. Reduccion de nitratos a nitritos: Emplear un medio liquido nitrado,

sembrar E. coli y Pseudomonas, a las 24 horas se adiciona el reactivo de Gries

4. RESULTADOS:

4.1 Lectura de degradación de carbohidratos: E. coli produce acidez

tornandoce de color amarillo la solución indicando acidez, Escherichia coli, el
catabolismo de carbohidratos se lleva a cabo principalmente por las enzimas de la
vía de Entner-Doudoroff degradándolos hasta piruvato generando acidez. A pesar de
que la presencia de esta vía se consideraba limitada a unas cuantas bacterias
Gram negativas, ahora se reconoce que se encuentra presente en un grupo muy
diverso de organismos. En shigella hay acidez pero no hay gas y en Pseudomonas no
hay acidez ni gas poe que no produce fermentación.
 4.2 Lectura de acción de
proteínas y otras
sustancias nitrogenadas

a. Licuefaccion de
gelatina:
El resultados para E. coli fue gelatinasa negativo debido a que no
metabolizò la gelatina, es decir que no tiene la enzima gelatinasa,
a diferencia de Pseudomonas que nos dio como resultado gelatinasa
positivo
debido a que
este presenta
la enzima
gelatinasa
haciendo que
el medio no
se

solidifique

E. coli
Pseudomonas
b. Produccion de Indol:
Para leer el Indol se utiliza el reactivo Kovnes, E. coli debe dar
como resultado indol positivo, formandoce un color rojo en la superficie
y Enterobacter arrojò como resultado Indol negativo.

Imagen referencial

c. Produccion de 𝐻2 𝑆 :

En la lectura de cultivos de caldo pectonado utilizamos como indicador el

acetato de plomo en Citrobacter freundii nos dio como resultado 𝐻2 𝑆 negativo
y Proteus vulgaris nos dio positivo indicando la presencia del acido
sulfidrico, la tira se torno de color negro al formar sulfuro de plomo

d. Reduccion de nitratos a nitritos:

Con esta prueba se investiga la capacidad
de las bacterias para reducir los nitratos
convirtiéndolos en nitritos o en nitrógeno,
es decir se estudia la presencia de
nitrato reductasa y nitrito reductasa.
Se utiliza el medio de cultivo caldo
nitratos. Para revelar la presencia de
nitritos en el medio se emplearán dos
reactivos: reactivo A (ácido
 sulfamínico al 0.8% en ácido acético glacial 5N) y reactivo B (α-naftilamina al
0.5% en ácido acético glacial 5N) que se añadirán tras la incubación.

La lectura nos dio como resultado a E. coli nitrato reductasa positivo

tornandoce color rojo y Pseudomonas dio nitrato reuctasa negativo sin
reducirse.

ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRE LAS

BACTERIAS

Debido a su pequeño tamaño y a su estilo de vida

individual, las células procarióticas sufren los
cambios ambientales de un modo mucho más directo e inmediato
que las células de los organismos pluricelulares. A lo
largo de miles de millones de años, las bacterias han venido
estando sometidas a diversas presiones ambientales, y
han respondido evolutivamente creando numerosos
mecanismos de adaptación. Actualmente, las únicas
formas de vida existentes en determinados ambientes
extremos son exclusivamente procarióticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo
que es la vida "normal", encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo a pH
muy ácidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y salinas, o reproduciéndose a
temperaturas de más de 100ºC y a grandes presiones...En este capítulo y en el siguiente
veremos algunas de estas notables adaptaciones.

Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en función de su

fondo genético, en relación con los nutrientes, y en unas hipotéticas condiciones ideales
(óptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta
los factores ambientales, es decir, una serie de agentes físicos y químicos que

modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de

dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;

condicionan la distribuición de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitats

naturales;

permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de

parámetros para:

 la mutagénesis,
 la esterilización y desinfección,
 la quimioterapia.

No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental.
Así, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en
cambio ser neutras o beneficiosas para otra.

Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los
efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden
simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de
reproducción.

PROCEDIMIENTO:
 1) Sembrar cepas de micrococcus y E coli en placas de agar
2) Colocar discos esteriles en la superficie embebidos en:
a) Alcohol 70%
b) Formol 10%
c) Fenol 1%
d) lejía

RESULTADOS

El que actuò mejor como desinfectante es el formol seguido de la lejía, el fenol

y el alcohol no presentaron reacción alguna, los productos o biocidas utilizados
para reducir el número de miocroorganismos viables o carga biológica, en un producto
o superficie hasta obtener una concentración que se considera adecuada para su uso o
aplicación ulterior. Los desinfectantes no son necesariamente esporicidas, pero son
esporostáticos, o sea que inhiben la germinación o la proliferación.
 ANTIBIOGRAMA Y ESPECTRO ANTIBIÓTICO

Dos descubrimientos importantes señalaron el comienzo de una nueva era en la

quimioterapia y revolucionaron el tratamiento de las enfermedades infecciosas. El
primero fue el descubrimiento en 1935 de los efectos curativos del colorante rojo de
Prontosil en las infecciones por estreptococos. Este fue el precursor de las
sulfonamidas. El segundo descubrimiento fue el que dio inicio a la edad de oro de la
antibioticoterapia, nos referimos al descubrimiento de la penicilina y su posterior
desarrollo. Esta fue descubierta por Fleming en 1929 y en 1940 Florey, Chain y
colaboradores demostraron y publicaron un informe acerca de su enorme potencia y la
posibilidad de su extracción de los sobrenadantes del cultivo del hongo Penicilium
notatum. El conocimiento actual sobre los mecanismos de duplicación de la bacteria y
sobre los mecanismos de resistencia, hace esperar que cada vez más los nuevos
antimicrobianos sean sustancias puramente sintéticas con gran especificidad por un
sitio de acción previamente elegido y con una adecuada resistencia a la inactivación
por los mecanismos de resistencia antibiótica.

Clasificación de antibiotico según el espectro de acción

- Amplio: aquellos antibióticos que son activos sobre un amplio número de

especies y géneros diferentes.

- Reducido: antibióticos solo activos sobre un grupo reducido de especies.

El término antibiótico de amplio espectro se refiere a un antibiótico que actúa

contra una amplia gama de bacterias patógenas, tanto contra bacterias grampositivas
como gramnegativas. En cambio un antibiótico de espectroreducido solo es eficaz
contra familias específicas de bacterias.

El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la

susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de
antibióticos. Las técnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de
microbiología para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los
microorganismos responsables de las infecciones.
Se considera como antimicrobiano cualquier sustancia con capacidad de matar o al
menos de inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible de
utilización como tratamiento en los pacientes. Pueden ser naturales, sintéticos o
semisintéticos (modificación química de un compuesto natural). La historia moderna
de los antibióticos comienza con el descubrimiento de sustancias presentes en unos
microorganismos capaces de matar a otros microorganismos. La utilización de
antibióticos supuso un avance enorme en la esperanza de vida de las personas que
padecían procesos infecciosos, aunque también supuso un aumento en los niveles de
resistencia antibiótica.

PROCEDIMIENTOS:

a. ANTIBIOGRAMA

(1)Utilizar placas Petri con un medio de cultivo adecuado a las necesidades

nutritivas del germen a estudiar.
(2)Emplear como inòculo una suspensión en suero fisiológico de germenes
previamente de un cultivo puro, utilizandoce E. coli.
(3)Sembrar el inoculo por la superficie de la placa, luego colocar los
discos con distintos antibioticos e incubar

b. ESPECTRO ANTIBIOTICO
(1) Colocar un disco de un antibiótico en el centro de la placa
(penicilina)
(2)Sembrar por estriamiento apartir del borde del disco en forma radial.

RESULTADOS:

a. ANTIBIOGRAMA

La penicilina actuó contra este microorganismo formandose

un anillo alrededor del disco, utilizamos también amoxicilina y azlocina, se
formo un anillo muy tenue.
b. ESPECTRO ANTIBIOTICO

Utilizamos como
antibiótico
penicilina, sembramos
Citrobacter, E coli y
pseudomonas, dio como
resultado que la penicilina es
de amplio espectro por que no
dejó crecer a su alrededor
a ninguna de estas bacterias a
su alrededor.
 BIBLIOGRAFIA:

o Microbiología médica, Jawetz, Melnick y Adelberg, 2001

o Microbiologia General, Hans-Günter Schlegel, 1997