Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos.

 
Gonzalo Greif . 
Unidad de Biología Molecular. Institut Pasteur Montevideo. 
 
1. Un poco de historia  
2. Secuenciación por método de Maxxam y Gilbert 
3. Secuenciación por método de Sanger 
a. Avances en el método de Sanger (1986‐1996) 
b. Proyecto Genoma Humano 
4. Algunos Métodos de secuenciado masivo  
a. Pirosecuenciación  
b. Secuenciado por hibridización (Illumina) 
c. Otro métodos 
d. Aplicaciones 
 
1. Un poco de historia. 

Pasaron  15  años  desde  el  descubrimiento  de  la  estructura  de  doble  hélice  del  ADN  en  1953 
hasta la determinación de la primera secuencia de ADN de forma experimental. Algunas de las 
razones que provocaron esta demora fueron: 

1. Las propiedades químicas similares de las diferentes moléculas de ADN  dificultaban su 
aislamiento. 
2. El largo de las moléculas de ADN, mucho mayores que las cadenas polipeptídicas de las 
proteínas, hacían inabordable la secuenciación completa. 
3. No se conocían ADNasas específicas. La secuenciación de proteínas se basaba en el uso 
de proteasas que cortaban en determinados aminoácidos. 

Sin  embargo,  algunas  moléculas  de  ARN  no  ofrecían  estas  dificultades,  en  particular  las 
moléculas  de  ARN  de  transferencia  eran  pequeñas  y  se  podían  purificar  individualmente. 
Además  se  conocían  ARNasas  base‐específicas  y  se  desarrollaron  métodos  análogos  a  los 
utilizados para proteínas. La primer secuencia de un ácido nucleico fue obtenida por Holley y 
sus colaboradores  en  1965 y correspondía al ARN  de  transferencia  de  alanina  de Escherichia 
coli. 

Un  evento  importante  en  el  desarrollo  de  los  métodos  de  secuenciación  de  ADN  fue  el 
descubrimiento  de  las  enzimas  de  restricción  de  tipo  II  en  1970.  Estás  enzimas  reconocen  y 
cortan el ADN en secuencias específicas (en general entre 4 y 6 bases de largo). Estas enzimas 
proporcionaron  un  método  general  para  fragmentar  largas  moléculas  de  ADN  en  pequeñas 
piezas  para  luego  ser  separadas  por  electroforesis  en  geles  de  agarosa.    A  mediados  de  la 
década  del 70, Frederick Sanger publica el método “más‐menos” (“plus‐minus” method) que 
permitía  la  secuenciación  de  fragmentos  de  ADN  utilizando  la  enzima  ADN  polimerasa  de  E. 
coli.  A  fines  de  esta  misma  década,  Maxxam  y  Gilbert  publican  un  método  alternativo  de 
secuenciación de ADN (método químico) y el mismo Frederick Sanger publica el método que 
luego  se  convertiría  en  el  más  utilizado  durante  los  siguientes  30  años  (método  enzimático), 
como veremos en el punto 3.    
 Méto
odos de secuenciación dee ácidos nuclleicos. 2 
Gonzalo
o Greif
 
2
2. Secuenciación químicca. 

El  método  de  seecuenciación n  química  propuesto 

p po or  Maxxam  y  Gilbert,  fue 
f publicad
do  en 
febreero  de  1977  en  el  Volumen  74  (nº  2)  de  la  reevista  PNAS,  10  meses  antes 
a que  Sanger 
S
publicara el métoodo de secueenciación enzzimática quee veremos en n la siguientee sección. 

En  eel artículo deescriben el procedimientto de esta m manera: “Desarrollamos u una nueva téécnica 

para  secuenciar u una moléculla de ADN. EEl procedimiento determ mina la secue encia  nucleo
otídica 
de  unn  ADN  marccado  radioactivamente  en  e un  extrem
mo,  cortándoolo  con  agen
ntes  químico
os”  en 
cada  una de  las b bases. El  corrte parcial de cada basee, genera un  set de fragm
mentos marrcados 
desdee  el  extrem mo  marcado o  hasta  la  base  dóndee  fueron  clivados.  Utilizando  gelees  de 
poliaccrilamida y sseparando dichos fragmeentos por tamaño, es po osible determ minar la secu
uencia 
de essta molécula. 

El  método  prop puesto  estab ba  limitado  por  la  cap
pacidad  de  resolución  de  los  gelees  de 
poliaccrilamida,  y  en  este  prim
mer  artículo  muestran  laa  posibilidad
d  de  secuenciar  100  basses  de 
ADN.  

 El  método utiliizaba 4 reaccciones químiicas. Una reaacción 
quíímica  produ uce  cortes  específicame
e ente  en  Citoosinas 
(18
8M  hidracinaa,  2M  NaCl.  Una  reaccción  con  50 0  mM 
metil‐sulfato corta en Adeeninas y Guaaninas; si lueego de 
dim
este tratamientto químico se calienta la reacción a 9 90ºC a 
pH  neutro,  enttonces  se  obtiene 
o un  patrón 
p de  bandas 
inteenso para lass guaninas y tenues paraa las adeninaas. Por 
el  contrario,  el 
e tratamien nto  posterior  a  un  pH  ácido 
proovoca un pattrón inverso  (bandas inteensas de adeeninas 
y  tenues 
t de  guaninas).  El 
E último  tratamiento  (18M 
hid
dracina) prod duce el clivajje tanto en ccitosinas commo en 
tim
minas. 

En  la Figura 1,  se muestra e

el patrón de
e bandas obttenido 
durrante  la  secu d un  fragmento  de  64  bases 
uenciación  de 
(moostrado en eel artículo de 1977). 

ura  1.  Se  muestran 

Figu m los  cuatro  carrriles  del  gel  de
poliacrilamida  con 
c cada  unaa  de  las  reaccciones  de  cliivaje.
Interpretación:  La  secuencia  se  lee  de  abajo  hacia  arrriba.
Una  banda  inteensa  en  la  primera 
p colummna  y  una  banda
ten
nue en la segu unda correspo onden a una A Adenina, mientras
quee la situación inversa correesponde a un na Guanina en n esa
possición.  Una  b
banda  que  apparece  en  la  tercera  y  cu uarta
columna  en  la  misma  posición  indica  una  C.  y  una  banda
sólo presente en n la última columna corresp ponde a una TT. 

 
 odos de secuenciación dee ácidos nuclleicos. 3 
Méto
Gonzalo
o Greif
 
33. Secuenciación enzimática. 

En dicciembre de 1 1977 se publica el trabajo de Sanger,, Nicklen y Co oulson que ppropone un n nuevo 

méto odo para detterminar la ssecuencias d de bases en  una molécula de ADN.   Sanger y Co oulson 
habíaan  ya  publiccado  dos  años  antes,  un n  método  de 
d secuenciaación  (métod do  más‐men nos)  a 
partirr del cual haabían logradoo obtener do os secuenciaas de 70 basees del bacteriófago φX174. La 
dificu
ultad  en  la  interpretació
ón  de  los  resultados  y  aalgunos  erro dían  ocurrir  en  la 
ores  que  pod
secueencia  hiciero olaboradores  siguieran  trabajando  para  mejoraar  los 
on  que  Sangger  y  sus  co
méto odos de secuenciación dee ácidos nucleicos. 

Así,  eel  método  propuesto 

p por  Sanger  en 
e 1977  se  convirtió 
c en  el  método  más  utilizad
do  de 
dad.  La  incorporación  de  mejoras  en 
secueenciación  dee  ácidos  nuccleicos  hastaa  la  actualid e los 
aspecctos tecnológicos y meto odológicos (aautomatización, método os de detecciión, electrofforesis 
undamental,,  la  secuencciación  del  genoma  humano 
capilaar,  etc.)  perrmitieron,  como  hito  fu
(finalizado  en  el  año  2003)  por  este  méétodo.  En  19980  Fredericck  Sanger  ob
btuvo  su  seggundo 
premmio Nobel en Química por la invención de este méétodo (ver re ecuadro). Reecién en 2005 5, con 
la aparición de lo os secuenciadores 454 se e dio un cam mbio en la te ecnología de  secuenciación de 
ácidoos nucleicos. Aun así, muchas de las n nuevas tecno ologías de seecuenciación masiva utilizan el 
principio  de  nucleótidos  term minadores,  descrito 
d mo  veremos  más  adelan
por  Sanger,  com nte  en 
los seecuenciadorees de Illumin na. 

Fred
derick Sange
er (1918‐) 

Frederick  Sanger  nació  en n  Rendcombee,  Inglaterra  en 

e 1918.  De  padre  médico,  se 
esperaba quee Fred siguierra sus pasos, ssin embargo een la Universidad de Cambridge 
ó  su  formación  en  Cambridge 
decidió  realiizar  una  carrera  en  Cienccias.  Continuó
realizando un n Ph.D. con A Albert Neuberger, en metab bolismo de am minoácidos. LLuego 
continuó trab bajando con C C. Chibnall ideentificando loss aminoácidoss de la insulin
na, en 
el  transcursoo  de  la  investigación,  Sanger  imaginó ó  las  formas  en  las  cuálees  se 
ordenan los aaminoácidos e en la proteínaa. 

 Fuee la primera p
persona en ob btener la secuencia de amin noácidos de u una proteína ((la insulina). PProbó 
que  las  proteínass  eran  molécu
ulas  ordenadaas  y,  por  analogía,  los  gen
nes  y  el  ADN  que  codifica  estas 
protteínas  deberían  tener  un  orden  o  secu
uencia.  Por  esste  trabajo  obtuvo  su  prim mer  premio  N Nobel 
(19558).  

En 1
1962, Sanger ccomienza a trrabajar en el laboratorio dee Biología Molecular, también en Cambrridge, 
dón
nde  Francis  Crick,  John  Keendrew  y  otro os  trabajabann  con  problemmas  relacionaados  con  el  ADN. 
A
Resoolver como obtener la secu uencia de ADN era la exten nsión natural  de su trabajoo anterior. Fuee así, 
com
mo  estudiando o  primero  la  forma 
f de  secuenciar  ARN  (una  moléculla  más  pequeeña)  logró  obttener 
una  técnica  apliccable  luego  all  ADN  (el  méttodo  de  secuenciación  porr  dideoxinucleeótidos).  En  1980, 
1
obtuuvo  por  ello  su  segundo  premio  Nobel  también  en  e Química  compartido 
c co
on  Walter  Giilbert 
(méétodo de secue enciación química) y Paul B Berg (ADN reccombinante).

En 11992, el Wellccome Trust y  el Medical Research Coun ncil establecieeron el Sangerr Institute, un

no de 
los ccentros de seccuenciación d
dónde se llevó
ó adelante el p
proyecto Geno oma Humano.  

En 1
1985 se retiró y se dedica p
principalmente
e al cuidado d
de su jardín. 

ntes:http://www..dnaftb.org/23/bio.html/ http://w
Fuen nger.html 
www.sanger.ac.ukk/about/people/biographies/fsan

Lectu das: Nobel Lecture (Frederick Sanger, 1980). 
uras recomendad
 Méto
odos de secuenciación dee ácidos nuclleicos. 4 
Gonzalo
o Greif
 
El  méétodo  enzim mático  de  Saanger,  utilizaa  una  ADN  polimerasa 
p e 
e inhibidores  que  finalizzan  la 
caden na  de  ADN  que  está  siendo  sintetizada  en  luggares  especííficos,  particcularmente  utiliza 
dideooxinucleótido os (es decir nnucleótidos  que en su caarbono 3´ no o contienen el grupo hid droxilo 
–Figuura 2‐ ). La incorporación de una basee con estas ccaracterísticaas en un mollécula nacien nte de 
ADN  impide  que e  una  nuevaa  base  pueda  incorporasse  y  la  sínte
esis  de  ADN
N  es  interrummpida 
(Figura 3). 

Figura 22. Estructura de un nucleótido (ej. dATP) y un di‐deoxinucleó
ótido (ddATP).

Figura 3. Esquema de m mecanismo de ssíntesis de ADNN (1), y (2) impo
osibilidad de continuar elongacción de cadenaa 
nacientee luego de la inccorporación dee un didoxinucleeótido. 

En  el  artículo  ejeemplifican,  de 

d forma  claara,  que  sucede  cuándo  utilizan  di‐d deoxiTimina  en  la 
reaccción: “Debido o a que el ddT no contie ene grupo 3’ hidroxilo, la cadena no o puede conttinuar 
exten ndiéndose,  entonces 
e la  terminación
t   ocurre  espeecíficamentee  en  las  possiciones  dónde  dT 
debería haberse incorporado. Si un cebad dor y un mollde son incub bados con ADN polimeraasa en 
preseencia  de  unaa  mezcla  dee    ddTTP  y  dTTP,  así  co
omo  los  otrros  tres  deooxiribonucleo osidos 
trifossfato  (uno  de  ellos  marcado  radiiactivamentee  con  32p),,  se  obtiene  un  mezccla  de 
 Méto
odos de secuenciación dee ácidos nuclleicos. 5 
Gonzalo
o Greif
 
mentos todoss con el mism
fragm mo extremo 5´ y con residuos ddT en n el extremo o 3´. Si esta m
mezcla 
es fraaccionada poor electroforresis desnatu
uralizante enn geles de accrilamida el  patrón de bandas 
muesstra la distrib
bución de los residuos TTimina en el  ADN sintetizzado. Utilizanndo terminaadores 
d los  cuatrro  nucleótidos  en  reaccciones  indep
para  cada  uno  de  pendientes,  y  corriendo  cada 
mezccla en paralelo en el gel,  se obtiene u
un patrón dee bandas a p partir del cuaal se puede leer la 
secueencia de basees” (Figura 4
4 y 5).   

Figura  4. Esta imagen
n se  encuentra  en la  Nobel Leecture de F. Saanger de  1980.  En  la  misma  se 
s ejemplifica  el
e
pio del método de dideoxinucleeótidos terminadores.  
princip

Figura 5. Esta imagen co orresponde a laa segunda figura del artículo de Sanger (PNASS, 1977).

Se  trata  de  un  autorad
diografía  dóndee  se  muestra  laa  migración  dee  las  cuatro  differentes
mezclas  (una  para  cad da  dideoxinucleeótido  terminaador  utilizado)..    A  la  derech ha  de  la
imagen se leen las secueencias de ADN (en este caso u un fragmento del bacteriófago o φX174.
Las lecturas se realizan  de abajo (fraggmentos más pequeños) haciaa arriba (más ggrandes),
de acuerd ón de las bandas. La resolución
do a la aparició n del gel, permiite separar bandas de 1
nucleótiddo de diferenciaa en tamaño. 

Las seecuencias ob
btenidas con este método alcanzaban
n hasta 200 bases de larggo. 
   
 odos de secuenciación dee ácidos nuclleicos. 6 
Méto
Gonzalo
o Greif
 
aa. Avances yy mejoras en
n el método de Sanger (1
1977‐1996).
 
I.. Secuenciaciión con term
minadores flu uorescentes ((dye‐terminaator sequenccing). 
 
En  19 986  Hood  y 
y colaborado ores,  en  colaaboración  con  Applied  Biosystems  (ABI)  publiccan  el 
primeer reporte de e automatizaación de la ssecuenciación de ADN, q que establece e la secuenciación 
con terminadoress fluorescenttes como variante del m método de Saanger. Está vaariante utilizza una 
molécula fluoresccente diferente unida a  cada dideoxinucleótido,  y permite reealizar la reaacción 
en un n único tuboo (Figura ). Assimismo, la ssecuencia puuede ser leídda a través de un computtador. 
Las  ssecuencias  obtenidas, 
o co
on  esta  nueeva  variante  eran  de  un
n  largo  de  entre 
e 500  y  1000 
nucleeótidos. 
 
a.  b.  c.   
 
 
Figura 6. En estaa figura se ejem mplifica como en lugar de 4 carriles (uno
paara  cada  base) (a),  se  corren  todas  las  reacciones  en  un  único 
ú carril
deel gel (cada colo
or representa u una base) (b) y se desarrollan aalgoritmos
paara convertir essas señales en ““electroferograamas” que reprresentan la
se
ecuencia  de  ADDN  (c).  La  flech
ha  a  la  izquierd
da  indica  la  dirrección  de
lectura 5’‐3’. 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
III. Secuenciacción automáttica. 

La  em
mpresa  Appllied  Biosysteems,  fue  la  pionera 
p y  líd umentos  de  secuenciación.  El 
der  en  instru
primeer  secuenciaador  automáático  (ABI  37 70A)  aparecce  en  1987,  y  con  él  se  logra  conocer  la 
secueencia del primer gen porr Craig Venteer y sus coleegas del National Institutte of Health (NIH, 
USA). La aparición de los secuenciadores automático os permitió laa instalación n de facilidad des de 
secueenciación. El primero dee ellos fue el NIH, dóndee se instalaro on 6 secuencciadores ABII3700. 
En  19
992,  Venter  funda  el  Institute  for  Genomic 
G Ressearch  (TIGR R)  y  expandee  la  capacidad  de 
secueenciación con 30 equiposs.   
 
Con eesta plataforrma  instalad da, se  demueestra  el  poder de  la secuenciación aautomática ccon el 
desarrrollo de la eestrategia EST (expressed d sequence ttag) para el d descubrimien nto de geness. Esta 
estrategia  consiste  en  hacer  copias  de  ADN 
A a  partirr  del  ARN  mensajero 
m ceelular  (ADNcc=ADN 
copiaa)  y  clonarlaas  de  forma  aleatoria  para  luego  seecuenciar.  En E 1991,  con n  esta  estraategia, 
Venteer reporta 337 genes hu umanos no conocidos.  La base de daatos de EST  contiene hoy más 
de 433 millones dee secuencias correspondientes a 1300 organismo os diferentes. 
 
 
 
 
 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. 7 
Gonzalo Greif
 
 
b. Proyecto Genoma humano: 
 
La secuenciación del genoma humano se volvió un objetivo realizable una vez establecidas las 
metodologías  de  secuenciación  de  ADN.  La  discusión  formal  comenzó  en  1985  en  Estados 
Unidos. En 1990, se presentó un proyecto de 5 años en el congreso de Estados Unidos (Human 
Genome  Project).  Se  estimaba  que  el  proyecto  duraría  15  años  y  el  costo  rondaría  los  3  mil 
millones  de  dólares.  El  proyecto  establecía  el  objetivo  de  mapear  y  secuenciar  diferentes 
organismos  modelo  además  de  humano.  Entre  ellos  E.  coli,  S.  cerevisiae,  C.  elegans,  D. 
melanogaster  y  el  ratón  (Mus  domesticus).  El  proyecto  se  convirtió  en  un  esfuerzo  de 
colaboración internacional entre diversos centros de secuenciación en Estados Unidos, Europa 
y Japón. Cada centro se focalizó en regiones particulares del genoma, que permitieran obtener 
un mapa. En 1994 se publicó un mapa detallado del genoma humano que incluía el mapeo de 
5840 loci con una media de espaciado de 0,7 cM (1 centiMorgan = 106 bases). 
 
En  1998,  el  proyecto  público,  compitiendo  ahora  con  la  empresa  Celera  (propiedad  de  Craig 
Venter) adopta los secuenciadores capilares de Applied Biosystems (ABI3700).  

En  1999  el  proyecto  Genoma  humano  había  secuenciado  más  de  mil  millones  de  bases  y  se 
publicó la secuencia completa de un cromosoma humano (el cromosoma 22). 
 
Para  el  mismo  tiempo,  Celera,  comenzó  a  Cobertura (Coverage):
secuenciar el genoma humano con la estrategia 
de    “whole  genome  shotgun  sequencing”  La  cobertura  es  el  número  promedio  de 
desarrollada  por  C.  Venter  (explicada  más  secuencias  que  representan  a  un 
adelante).  La  secuenciación  comenzó  en 
determinado  nucleótido  en  la  secuencia 
setiembre de 1999 y en junio de 2000 se realizó 
un  ensamblaje  inicial  de  las  secuencias  total reconstruida.  Puede  ser  calculada  a 
obtenidas.  Los  datos  de  Celera  permitieron  el  partir del largo original del genoma (G), el 
ensamblaje  del  genoma  humano  con  una  número  de  secuencias  (N)  y  el  largo 
cobertura  de  5X  (ver  Cobertura).  Además  se  promedio de las secuencias (L) como: 
aumentó la cobertura 3X con los datos públicos.  
   Cobertura = N x L/G 
El  25  de  junio  de  2000,  en  la  Casa  Blanca,  el 
presidente  Clinton  junto  a  Francis  Collins  Ejemplo.  Un  genoma  hipotético  de  2000 
(responsable  del  proyecto  público,  NIH)  y  Craig  bases, secuenciado con 24 secuencias de 
Venter,  anunciaron  públicamente  la  versión  350  bases  de  promedio  de  largo  tiene 
borrador  del  genoma  humano  realizada  tanto  una cobertura de: 
por el esfuerzo público como privado (Figura 7). 
 24 x (350/2000) = 4,2 X. 
En febrero de 2001, se publicaron los borradores 
del consorcio público y del privado en Science y  Este  valor  significa  que  el  genoma  fue 
Nature (Figura 8). Finalmente en el año 2004 se  secuenciado  4,2  veces.  Cuánto  mayor 
publicó la versión final del genoma humano.  cobertura,  menor  posibilidades  de 
errores en la secuencia final. 

 
 
 
 
 
 
 Méto
odos de secuenciación dee ácidos nuclleicos. 8 
Gonzalo
o Greif
 
 
Figura 7. Fo
oto de lanzam
miento de borrrador del geno
oma 
humano en Washington
n (Clinton, Ven
nter, Collins). 

Figura 8. Tapas de revisttas Nature y S
Science de 200
01 con 
los borraddores del genooma humano.  

Whole genome Sho
otgun sequen
ncing y Craig V
Venter: 

El método de Whole Genome Sh hotgun consisste en la fragm mentación al aazar del ADN  de todo el geenoma, 

clonarlo  en  plásmiidos  y  secuen
nciar  ambas  hebras 
h (el  passo  de  clonado
o  luego  fue  eliminado). 
e Una  vez 
obten nidas, las secu
uencias se alin
nean y ensam mblan para forrmar contigs b basándose en n las secuenciaas que 
solapaan (Figura 9). El método fue utilizado po or Sanger en 1 1982 para enssamblar el faggo lambda (48 8,5 kb), 
sin  emmbargo  Venter  fue  el  prim
mero  en  utilizarlo  para  seecuenciar  un  genoma  de  mayor  tamañ ño  (H. 
influeenzae, 1,8Mb) y proponerlo o como estrateegia para secu uenciar el genoma humano o. 

 
ra 9. Esquemaa de secuenciaación con la eestrategia de SShotgun. Secu
uenciación de fragmentos 
  erados al azarr y ensamblaje de la secuen ncia utilizando
o procesamiennto informáticco. 

En 1995, Venter y ssu grupo decid den utilizar nuuevas herram
mientas compuutacionales assí como los méétodos 
mejorrados  de  seccuenciación  para  realizarr  la  primer  secuencia  de
e  un  organissmo  de  vidaa  libre 
(Haemmophilus  influ
uenzae).  En  TIGR  analizar  más 
m de  50  geenomas  micro
obianos.  Ventter  y  alguno  de 
d sus 
colabo
oradores,  commenzaron  entonces  la  seccuenciación  de 
d genomas  de 
d mayor  tam maño  (mosca,  rata, 
ratón).  

En 20006 se fundó  el J. Craig Venter Institutee (JCVI) por laa unión de varias organizacciones (TIGR,  TCAG, 

JCVSFF, etc.). Se trata de una orgganización lídeer en genómica a nivel muundial con máás de 400 cienntíficos 
trabajjando. 

 
 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. 9 
Gonzalo Greif
 
4. Algunos Métodos de secuenciado masivo  

Pasaron  cerca  de  30  años  desde  la  publicación  del  método  de  Sanger,  hasta  que  apareciera 
una  nueva  tecnología  de  secuenciación  de  ácidos  nucleicos  que  no  fuera  el  método  de 
dideoxinucleotidos terminadores. La  principal característica  de  estas  nuevas metodologías  es 
la  posibilidad  de  secuenciado  masivo  de  forma  paralela,  esto  significa  que  el  número  de 
secuencias  obtenidas  durante  una  corrida  supera  muchas  veces  el  máximo  de  96  secuencias 
por corrida que se obtienen con los secuenciadores capilares de última generación que utilizan 
el método de secuenciado de Sanger. 
 
A  partir  del  desarrollo  del  método  de  pirosecuenciación  (primer  método  de  secuenciado 
masivo  utilizado,  2005),  surgen  nuevas  alternativas  de  secuenciación  que  utilizan  el  mismo 
principio  de  dideoxinucleotidos  terminadores  en  sus  protocolos,  aunque  con  mejoras 
innovadoras. 
 
Estos nuevos métodos de secuenciado masivo no ofrecen lecturas tan largas como el método 
clásico  de  Sanger,  aunque  en  pocos  años  se  ha  mejorado  sustancialmente  el  largo  de  las 
secuencias obtenidas y en algunos casos alcanzan longitudes comparables a Sanger. 
 
a. Pirosecuenciación: 
 
El primer método de secuenciado masivo o “next generation sequencing” (NGS), fue publicado 
en 2005 en Nature, y llevado al mercado por la empresa 454  (luego adquirida por Roche). El 
resumen  de  este  artículo  explica:  “Describimos  un  método  escalable,  un  sistema  de 
secuenciación  altamente  paralelizable  con  un  rendimiento  significativamente  mayor  que  los 
instrumentos de electroforesis capilar. El aparato permite secuenciar 25 millones de bases, con 
99%  de  precisión  en  una  corrida  de  4  horas”  (este  rendimiento  es  100  veces  superior  a  la 
cantidad de bases secuenciadas en ese tiempo en un secuenciador de 96 capilares).  
 
En  el  primer  artículo,  publican  la  secuenciación  de  novo  del  genoma  de  Mycoplasma 
genitalium alcanzando cubrir el 96% del genoma y con una precisión de 99,96% en una corrida. 
 
El método consiste en 4 pasos: 
1. Fragmentación del ADN (o ARN). 
2. Ligación de oligonucleótidos (adaptadores) en cada uno de los extremos. 
3. Amplificación clonal (mediante PCR en emulsión). 
4. Secuenciado por síntesis usando un protocolo de pirosecuenciación optimizado en un 
soporte sólido y en escala de picolitros.  
 
Más  en  detalle,  luego  de  fragmentar  el  ADN,  se  ligan  oligonucléotidos  adaptadores  a  cada 
extremo  del  ADN.  Estas  secuencias  adaptadoras  comunes  a  todos  los  fragmentos  serán 
utilizadas, tanto para ligar cada fragmento a las esferas, como secuencias donde se unirán los 
cebadores  de  la  PCR  y  además  presenta  la  secuencia  donde  se  unirá  el  cebador  de 
secuenciación. Una vez ligados los adaptadores, se ligan a las beads (esferas que contienen el 
complementario a uno de los adaptadores en su superficie), por un método de dilución límite, 
de modo de obtener un único fragmento unido a una esfera. Se busca, entonces, obtener en 
cada bead un único fragmento de ADN, el mismo es amplificado mediante PCR en emulsión. 
 
 
 
 Méto
odos de secuenciación dee ácidos nuclleicos. 10
Gonzalo
o Greif
 
PCR een emulsión (emPCR): 

La  PCR  en  emu ulsión  permite  realizar  en  un  úniico  tubos  miles 
m de  reacciones  dee  PCR 
indeppendientes. U Una vez obteenida la libreería de fragmmentos que sserán secuen nciados, se u unen a 
esferas  que  conttienen  uno  de  los  adapptadores  preesentes  en  los 
l fragmentos,  de  mod do  de 
obtenner  un  único  fragmento o  por  esferaa.  Luego  la  población  de 
d esferas  (cada  una  co on  un 
fragm
mento de AD DN) es emulssionada en u una mezcla d de agua y acceite, de modo tal de ob btener 
micellas  de  aceite
e  independientes  –cadaa  uno  de  elloos  con  una  única  esferaa  y  con  todo
os  los 
reacttivos  necesaarios  para  llevar  adelante  la  reaccción‐.  El  re
esultado  finaal,  son  milees  de 
microoreactores dónde se llevaa adelante laa reacción dee PCR de form ma independ diente (Figurra 10). 

 
Figuraa  10.  Esquema  de  la  PCR  en n  emulsión.  (11)  Se  liga  a  caada  bead  un  fragmento 
f meddiante  las  secu uencias 
complementarias  a  uno 
u de  los  adaaptadores  que  se  encuentran  en  la  superficie  de  las  mism mas.  (2)  Se  realiza  una 
emulsión  (agua‐aceitte)  de  tal  form
ma  que  en  cadaa  gota  de  aceitte  encontremo os  una  única  beead  unida  a  unn  único 
framgeento  y  encontrramos  además  todos  los  reacctivos  necesario os  para  llevar  adelante 
a la  PCR
R  (dNTPs,  Polimmerasa, 
cofactores). (3) Luegoo se realiza unaa PCR convencional, pero en ccada tubo de reeacción se realiizan simultáneaamente 
miles  de  reacciones  en  paralelo.  (4
4)  Luego  de  n  ciclos  de  reaccción,  se  obtiene    una  amplificcación  clonal  de 
d cada 
fragmeento unido a un na bead. 

 
Luego o  de  finalizada  esta  reeacción,  se  rompe  la  emulsión 
e y  se  recuperaan  las  beadss  que 
preseentaron  amp plificación.  Las 
L mismas  son  deposittadas  en  la  placa  de  seecuenciación.  Esta 
placaa (picoTiter pplate), tiene  1,6 milloness de pocillos, y en cada u
uno de ellos  sólo puede eentrar 
un beead (Figura 1 11). En cada pocillo suced derá una reaacción de seccuencia, por lo cual en la placa 
podemos  decir  que  tenem mos  1,6  millones  de  secuenciado
s res  de  1  capilar, 
c o  16000 
1
secueenciadores d de 96 capilarees aproximad damente. 
 Méto
odos de secuenciación dee ácidos nuclleicos. 11
Gonzalo
o Greif
 

Figuraa 11. Pico‐Titre plate. Arriba: esquema de dep
posición de esfeeras en los pociillos. Abajo: miccrografía electrrónica 
de los pocillos y ejem
mplo de carga dee una placa.

 
Reaccción de secuenciación: 
   
Este  método  no  utiliza  nucleó ótidos 
terminadores.  En n  este  caso,  se  realizan  ciclos 
dónde se ofrece  en cada poccillo una base por 
vez,  secuenciaalmente.  Durante  la 
incorporación  dee  una  base  en  una  molécula 
nacieente  de  AD DN  se  liberaa  pirofosfatto,  el 
pirofoosfato  liberrado  se  co onvierte  en n  luz 
mediante  dos  procesos 
p enzzimáticos.  La 
L luz 
emitida en cada p pocillo, dóndde se incorpo oró la 
base  ofrecida,  es  monittoreada  po or  la 
deteccción  lumino ométrica  de  la  liberación  del 
pirofoosfato  durante  la  reaccción  de  sín ntesis 
(Figura ). Una cám mara CCD colecta los dattos de 
cada base, en cad da ciclo y en cada posició ón.  Figuraa 12. Esquema de reacción de pirosecuenciacción
 
En  ell  caso  de  ho
omopolimero os  (tractos  de 
d secuenciaa  con  el  missmo  nucleóttido),  el  larggo  del 
homo opolimero ess determinado a partir d de la cantidaad de pirofossfato liberad do (proporcio onal a 
la can
ntidad de bases incorporrada).  
 
Ejemplo:  
En  el  primer  cicloo  se ofrece  la base A,  en  todos  los  pocillos.  En  aquellos  qu ue  se  incorpoora  se 
obserrva la emisió ón de luz (deependiendo  la cantidad d de A incorpo orada, será la intensidad d de la 
luz emmitida). Lueggo de obtenidas las imágenes, se reemueve la baase, y se ofreece la base TT y se 
obserrvan los pocillos que inco orporan T. Se vuelve a eliminar la baase no incorp porada y se o ofrece 
la base G, y luego o la C para tterminar el p primer ciclo. Luego de 100 ciclos finaliza la corriida. El 
 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. 12 
Gonzalo Greif
 
tamaño  promedio  de  cada  lectura  es  de  400  bases  y  en  una  corrida  se  obtienen  cerca  de  1 
millón de secuencias (es decir 400 millones de bases/10 horas de corrida). 

b. Illumina: 

La  segunda tecnología de secuenciación masiva  que salió al mercado (2006) fue la de Solexa 

(luego  adquirida  por  Illumina).  En  esta  tecnología,  se  utilizan  nucleótidos  terminadores 
marcados con moléculas fluorescentes al igual que en la Secuenciación de Sanger. Además de 
la  paralelización  masiva  (es  decir  la  capacidad  de  realizar  millones  de  secuencias  en  cada 
corrida), la diferencia con el método convencional es la posibilidad de eliminar la fluorescencia 
una vez obtenida la imagen, y desbloquear carbono 3’ de modo que pueda aceptar una nueva 
base  para  continuar  la  reacción  de  secuenciación,  haciendo  que  la  incorporación  de  un 
nucleótido terminador sea reversible. En este caso, las longitudes obtenidas son menores que 
los secuenciadores 454 (en la actualidad hasta 150 bases), sin embargo la capacidad de realizar 
secuencias en paralelo es mucho mayor que en 454 (hasta 250 millones de secuencias). Como 
resultado es posible obtener hasta 6 x 1012 en una sola corrida. Para dimensionar este número, 
el genoma humano tiene aproximadamente 3 x 109 bases de largo. 
 
Al  igual  que  el  método  de  secuenciación  de  Roche,  los  primeros  pasos  consisten  en  la 
fragmentación del ADN y ligación de adaptadores. Luego hay un paso de amplificación (en este 
caso, la amplificación es en una superficie sólida: “flow cell”, dónde también se dará luego la 
reacción de secuenciación). 
 
Amplificación y Reacción de secuenciación: 
 
 
En  el  primer  paso,  la  librería  se  deposita  en  la  flow  cell  por  complementariedad  con  los 
adaptadores  (1).  Luego  se  produce  la  amplificación  en  puente  (2  y  3)  en  sucesivos  ciclos 
(4,5,6,7,8) hasta obtener un cluster con la amplificación clonal del fragmento inicial (8) (Figura 
13). 
 
1   2 3 4 5 6 7 8
 
 
 
 
 
Figura 13. Amplificación en puente. Ver descripción en el texto. 

 
En  la  reacción  de  secuenciación,  se  bloquea  uno  de  los  adaptadores  (1),  y  se  comienza  la 
reacción de  secuenciación desde el  otro extremo  (2) mediante un cebador  específico (Figura 
14). 
 
  1 2
 
 
 
  Figura 14. Reacción de secuenciación de Illumina. 
  Ver descripción en el texto. 
 
 
 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. 13 
Gonzalo Greif
 
 
 
 
Durante  la  reacción,  a  diferencia  de  la  pirosecuenciación,  se  ofrecen  los  cuatro  nucleótidos 
terminadores marcados cada uno con un fluorocromo diferente (1), al igual que el método de 
Sanger. Luego de un lavado (2), se obtienen las imágenes y se obtiene la primera base de cada 
cluster (3). Luego, se elimina el fluorocromo y se desbloquea el Carbono 3, permitiendo que un 
nuevo  nucleótido  pueda  extender  la  cadena  de  ADN  naciente  (4).  Otra  vez  los  cuatro 
nucleótidos terminadores marcados son ofrecidos  a los clusters,  comenzando  un  nuevo  ciclo 
(Figura 15). 

1 2 3 4
Figura  15.  Reacción  de  secuenciación  de  Illumina.  Primer  ciclo  de  secuenciación  (1),  incorporación  de 
dideoxinucleótidos marcados (2), adquisición de imagen (3), y lavado, desbloqueo, y eliminación de marcado (4).

Los  últimos  modelos  de  Illumina  permiten  secuenciar  en  paralelo  más  de  3000  millones  de 
clusters con largos desde 35 a 150 bases (www.illumina.com). 

c. Otros métodos: 

Desde 2005 hasta la fecha, otras tecnologías de secuenciación masiva han sido desarrolladas y 
otras  se  encuentran  en  desarrollo  y  constituyen  una  nueva  generación  de  secuenciadores 
(Tabla 1). Es imposible en este capítulo el desarrollo en profundidad de cada una de ellas, por 
lo tanto en la siguiente tabla se muestran otras tecnologías y las fuentes dónde obtener mayor 
información de cada una de ellas. 

Algunas de estas tecnologías (SMRT, Helicos) proponen la secuenciación a partir de una única 
molécula de ADN en tiempo real. Una de ellas (Pacific Biosciences) en teoría no tiene límite en 
cuánto al largo de las secuencias generadas y eventualmente podría secuenciar cromosomas 
enteros en una única lectura (www.pacificbiosciences.com).  

Otras,  como  Oxford  nanopore  e  Ion  Torrent  (recientemente  lanzada  al  mercado)  ofrecen 
novedosas  soluciones  y  no  requieren  marcación  fluorescente  ni  cámaras  registradoras  de 
imágenes.  En particular, Ion  Torrent  (ver  recuadro J.  Rothberg),  se  basa  en  el  registro de  los 
cambios  de  pH  producidos  durante  la  incorporación  de  bases  durante  la  síntesis  de  ADN.  Se 
trata  de  micropHímetros  que  reducen  notablemente  los  costos  de  secuenciación 
(www.iontorrent.com) y prometen ser herramientas útiles en el área de diagnóstico. 
 odos de secuenciación dee ácidos nuclleicos. 14
Méto
Gonzalo
o Greif
 
Plataforma  Teecnología  Longgitud de read
ds  Añoo  Web 
www.ap
ppliedbiosystems.co
om
SOLiD (Applieed Biosystemm)  Ligación
n  50 basses 2007 
www
w.helicosbio.com
Genetic 
G Anaalysis  Systeem  true  Siingle  Moleccule  25 a 55 bases  2008 
(H
Helicos)  Sequencing 
www.paacificbiosciences.com
SMRT (Pacificc Biosciencess)  Single  Molecule  Real 
R >1000 bases  D 
ND
time  (en teo
oría sin límite) 
www
w.iontorrent.com
Io
on Torrent  Micro ppHímetros  >200 bbases  2011 
www.nanoporetech.com
Oxford Nanop
O pore  Label free, electrical  ND   ND
D 
Tabla 1. Información sobre otras teccnologías de seecuenciación maasiva en el merrcado o cerca de
e salir. 

                                   Jonathan M M. Rothbergg, Ph.D. (19 963 ‐ ) 

      Fundador y CEO de Ion TTorrent. 
 
 
Rothberg naació en 1963 3 en  New Haaven, Conneccticut. Se graaduó en inge eniería química con opcióón en 
Ingeniería B Biomedica en n Carnegie M Mellon University, y realizzó luego su m maestría y dooctorado en la 
Universidad d de Yale. 
 
El Dr. Rothb berg es el piionero en el desarrollo d de tecnologíías de secuenciación masiva. Según  cuenta en laa 
página web (www.ionto orrent.com), la primera id dea sobre el secuenciado o masivo en paralelo surge luego quee 
su  hijo  fuerra  internado o  en  cuidado
os  intensivoss  y  se  cuestio
onara  la  imp
portancia  deel  genoma  humano  en  laa 
salud.  Subssecuentemen nte,  funda  454 
4 Life  Scieences,  lanzan ndo  al  mercado  el  primer  secuenciaador  masivo o.  
Dirigió la seecuenciación del primer ggenoma hum mano de un individuo (secuenciando exitosamentte el genomaa 
del Dr. Wattson). Ademáás inició el p primer proyecto de secueenciado massivo de un AD DN antiguo ((Neanderthaal 
Genome Pro oject, en colaboración co on el Dr. Paabo). 
 
La contribución de Roth hberg al secuenciado maasivo incluyee el desarrollo del primeer sistema dee clonado no o 
bacterial (emPCR).  
 
En  2007,  Rothberg  com menzó  un  nu uevo  negocio,  a  raíz  de  un  comentario  de  su  hijo. 
h Rothberg  funda  Ion
n 
Torrent y deesarrolla el cconcepto de secuenciació ón con pHím metros. 

Además es ffundador de e otras empreesas, vinculaadas a la tecn
nología y me
edicina. Es también fundaador de The 
Rothberg In
nstitute for C
Childhood Dissease. 

Fuente: http://www.ionto
orrent.com/teeam/jonathan‐rothberg/ 

 
 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. 15 
Gonzalo Greif
 
 

d. Aplicaciones 

La  producción  de  un  gran  número  de  lecturas  a  bajo  costo  permite  la  aplicación  de  las 
plataformas  de  secuenciado  masivo  en  muchas  aplicaciones,  y  es  imposible  describir  todas 
ellas aquí. La primera aplicación obvia es la secuenciación de genomas (ver recuadro Genoma 
Humano  y  Secuenciación  masiva)  y  la  precisa  anotación  de  genes  (sitios  de  splicing, 
poliadenliación, secuencias 5’ y 3’ UTR, etc). Dentro de las primeras aplicaciones encontramos 
la  secuenciación  de  ARN  (ej.  descubrimiento  de  ARN  pequeños,  nuevas  variantes  génicas, 
nuevos  genes,  etc.)  y  amplicones  de  PCR  (secuenciado  de  ARNr16S  y  su  aplicación  en 
metagenómica  como  veremos  en  el  siguiente  párrafo).  Asimismo,  la  posibilidad  de 
cuantificación de transcriptos que ofrece esta tecnología (RNA‐seq), la vuelve una alternativa a 
los experimentos de microarreglos. La secuenciación para identificar marcadores epigenéticos, 
identificar interacción ADN‐proteína,  determinar estructura de cromatina (ChIP‐Seq, Methyl‐
seq, DNase‐seq) son aplicaciones cada vez más utilizadas.  
 
La metagenómica es el estudio genómico de microorganismos por la extracción directa de ADN 
de  una  comunidad  microbiana.  La  aparición  de  la  secuenciación  masiva  ha  facilitado  a  los 
investigadores  la  tarea  de  identificación  y  caracterización  de  diferentes  microogranismos,  en 
diferentes ambientes.  
 
En  la  sección  de  lecturas  recomendadas  se  ofrecen  revisiones  bibliográficas  de  cada  una  de 
estas aplicaciones para que el lector profundice en ellas. 
   
Genoma Humano y Secuenciación masiva:

Como ya vimos antes, la secuencia del genoma humana se publicó en 2004. La secuenciación de este 
genoma  tuvo  un  costo  aproximado  de  3000  millones  de  dólares  y  cerca  de  20  años  de  trabajo.  En 
octubre de 2007, se publica el primer genoma de un único individuo (J. Craig Venter), realizado por el 
método de shotgun y secuenciación Sanger. El costo de este genoma fue aproximadamente 70 millones 
de dólares y una duración de 4 años.   

El primer genoma humano secuenciado con la tecnología 454 fue el del Dr. James Watson, a un costo 
de 1 millón de dólares y en dos meses (2008).  El costo ha continuado bajando y se han reportado la 
secuenciación de un genoma humano por menos de 100.000 dólares. 

Varios proyectos tienen como objetivo la secuenciación de más individuos, entre el ellos “The Cancer 
Genome Atlas” y “1000 Genome project”.  

Hace tan solo 10 años, 2 dedos eran suficientes para contar el  número de genomas secuenciados. En 
2009,  alcanzaban  los  dedos  de  ambas  manos.  Hoy,  es  difícil  de  saberlo  exactamente,  pero  un 
relevamiento  realizado  por  la  revista  Nature,  indica  que  cerca  de  30.000  genomas  humanos  estarán 
secuenciados para finales de 2011. 
 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos. 16 
Gonzalo Greif
 
Lecturas recomendadas: 
 
1. Sanger  F.  Coulson  R.  A  rapid  method  for  determining  sequences  in  DNA  by  primed 
synthesis  with  DNA  polymerase.  J.  Mol.  Biol.,  94,  441‐448  (1975).  Método  “más‐menos” 
de Sanger. 
2. Maxam A. and Gilbert. A new method for sequencing DNA. PNAS, 74 (2), 560‐564, (1977). 
Articulo dónde se describe método químico de secuenciación de ácidos nucleicos. 
3. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. DNA sequencing with chain‐terminating inhibitors 
4. PNAS,  74  (12),  5463‐5467  (1977).  Artículo  de  Sanger  dónde  describe  el  método  de 
secuenciación utilizando dideoxinucleótidos. 
5. Sanger,  F.    Determination  of  nucleotide  sequences  in  DNA.  Nobel  lecture,  8  December 
1980. 
6. Venter,  C.  et  al.  The  Diploid  Genome  Sequence  of  an  Individual  Human.  PLOS  Biology,  5 
(10), (2007). Publicación de genoma de Craig Venter. 
7. International  Human  Genome  Consortium.  Finishing  the  euchromatic  sequence  of  the 
human genome. Nature 431, 931–945 (2004). 
8. Margulies, M. et al. Genome sequencing in microfabricated high‐density picolitre reactors. 
Nature 437, 376–380 (2005). Los autores describen el desarrollo de la primer tecnología 
de  secuenciado  masivo,  y  realizan  el  ensamblaje  de  novo  del  genoma  de  Mycoplasma 
genitualium utilizando pirosecuenciación. 
9. Bentley, D. R. et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator 
chemistry.  Nature  456,  53–59  (2008).  Artículo  de  los  desarrolladores  de  Illumina, 
reportando el uso de esta tecnología para la secuenciación de un cromosoma humano. 
10. Wang,  Z.,  Gerstein,  M.  &  Snyder,  M.  RNA‐Seq:  a  revolutionary  tool  for  transcriptomics. 
Nature  Rev.  Genet.  10,  57–63  (2009).  Review  sobre  uso  de  tecnologías  de  secuenciado 
masivo para análisis de transcriptomas (RNA‐seq). 
11. Park,  P.  J.  ChIP–seq:  advantages  and  challenges  of  a  maturing  technology.  Nature  Rev. 
Genet. 10, 669–680 (2009). Revisión sobre ChIP‐seq. 
12. Morozova,  O.,Hirst,  M.,  Marra,  M.  Applications  of  New  Sequencing  Technologies  for 
Transcriptome  Analysis.  Annu.  Rev.  Genomics  Hum.  Genet.  10,135–51  (2009).  Revisión 
NGS. 
13. Petrosino,  J.  F.,  Highlander,  S.,  Luna,  R.  A.,  Gibbs,  R.  A.  &  Versalovic,  J.  Metagenomic 
pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem.  55, 856–866 (2009). Se trata de 
un review sobre metagenómica.  
14. Zhou, X., Ren, L., Meng, Q., Li, Y., Yu, Y., Yu, J. The next‐generation sequencing technology 
and application. Protein Cell, 1(6), 520–536 (2010). Revisión NGS. 
15. Metzker,  M.L.  Sequencing  technologies  —  the  next  generation.  Nature  Reviews  Genetics 
11, 31‐46 (2010). Revisión NGS.  
16. Human  genome:  Genomes  by  the  thousand.  Nature  467,  1026‐1027  (2010).  Revisión 
secuenciadores instalados y genomas secuenciados. 
17. Zhanga, J., Chiodinic, R., Badra, A., Zhang G. The impact of next‐generation sequencing on 
genomics. Genet. Genomics. 38(3), 95–109 (2011). Revisión NGS. 
 
Otros recursos interesantes: 
 
1000 Genomes Project: http://www.1000genomes.org 
The Cancer Genome Atlas: http://cancergenome.nih.gov 
The Exome Project: http://www.nhlbi.nih.gov/resources/exome.htm 
Human Microbiome Project: http://nihroadmap.nih.gov/hmp 
Personal Genome Project: http://www.personalgenomes.org 
Craig Venter Institute: www.jcvi.org