CONSEJO COI/T.20/Doc.

nº 25
2006
OLEÍCOLA
INTERNACIONAL ESPAÑOL
Original: INGLÉS

Príncipe de Vergara, 154 – 28002 Madrid – España Telef.: +34 915 903 638 Fax: +34 915 631 263 - e-mail: iooc@internationaloliveoil.org - http://www.internationaloliveoil.org/

MÉTODO GLOBAL PARA LA DETECCIÓN

DE ACEITES ESPURIOS EN LOS ACEITES DE OLIVA

1. OBJETIVO

El presente método se utiliza para detectar la presencia de aceites vegetales espurios en los
aceites de oliva, como los aceites vegetales alto linoleicos (soja, cola, girasol, etc.) y
algunos aceites vegetales alto oleicos (avellana, girasol alto oleico y aceites de orujo de
oliva). El nivel de detección depende del tipo de aceite espurio y de la variedad de
aceituna. En el caso del aceite de avellana, el nivel de detección suele oscilar entre un 5%
y un 15%. El método no permite identificar el tipo de aceite espurio, indicando solamente
si el aceite es o no auténtico.

2. PRINCIPIO

Se purifica el aceite mediante extracción en fase sólida (SPE) utilizando cartuchos de gel
de sílice. La composición en triglicéridos (TG) se determina mediante cromatografía
líquida de alta resolución en fase inversa, utilizando un detector de índice de refracción y
empleando propionitrilo como fase móvil. Los ésteres metílicos de los ácidos grasos
(FAMEs) se preparan a partir de aceite purificado mediante metilación en frío con una
solución metanólica de KOH (Método A en COI/T.20/Doc. nº 24), analizándose los ésteres
por cromatografía de gases con columna capilar de alta polaridad (COI/T.20/Doc. nº 17).
La composición teórica en triglicéridos se calcula a partir de la composición en ácidos
grasos con un programa informático, suponiendo una distribución 1,3-random, 2-random
de los ácidos grasos en el triglicérido, con restricciones en el caso de los ácidos grasos
saturasos en posición 2. El método de cálculo es una modificación del procedimiento
descrito en COI/T.20/Doc. nº 20. Se calculan distintos algoritmos matemáticos a partir de
la composición teórica y la composición real en triglicéridos (HPLC) y los valores
resultantes se comparan con los contenidos en una base de datos creada para los aceites de
oliva auténticos.
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3. MATERIAL Y REACTIVOS

3.1. Purificación del aceite

3.1.1. Matraces cónicos de 25-ml.
3.1.2. Tubos de ensayo de tapón roscado con junta PTFE de 5-ml.
3.1.3. Cartuchos de gel de sílice, 1 g (6 ml), para extracción en fase sólida (por ejemplo,
Waters, Massachusetts, USA).
3.1.4. n-hexano, de calidad analítica.
3.1.5. Mezcla disolvente de hexano/éter dietílico (87:13, v/v).
3.1.6. n-heptano, de calidad analítica.
3.1.7. Acetona, de calidad analítica.

3.2. Análisis HPLC de los triglicéridos

3.2.1. Microjeringas (50 μL) y agujas para inyección HPLC
3.2.2. Propionitrilo, extra puro o de calidad HPLC (por ejemplo, ROMIL, Cambridge,
Reino Unido), utilizado como fase móvil.
3.2.3. Columna HPLC (25 cm x 4 mm i.d.), con fase RP-18 (tamaño partículas 4μm).

3.3. Preparación de los ésteres metílicos de los ácidos grasos

(Ver Método A en COI/T.20/Doc. nº. 24)
3.3.1. Metanol con un contenido en agua inferior al 0.5%.
3.3.2. Heptano, de calidad analítica.
3.3.3. Solución metanólica 2N de hidróxido potásico. Disolver 1.1 g de hidróxido
potásico en 10 ml de metanol.
3.3.4. Tubos roscados de de 5-ml con tapón provisto de junta PTFE.

3.4. Análisis GC de los FAMEs

(Ver método para la determinación de los ácidos grasos insaturados trans por
cromatografía de gases con columna capilar, COI/T.20/Doc. nº 17).
3.4.1. Microjeringas (5 μL) y agujas para inyección GC.
3.4.2. Hidrógeno o helio como gas portador.
3.4.3. Hidrógeno y oxígeno para detector FID.
3.4.4. Nitrógeno o helio como gas portador auxiliar.
3.4.5. Columna capilar de sílice fundido (50-60 m x 0.25 – 0.30 mm i.d.) recubierta con
fase de cianopropilpolisiloxano o cianpropilfenilsiloxano (SP-2380 o similar) con
película de 0.20-0.25 μm de grosor.

4. APARATOS

4.1. Aparatos de vacío para extracción en fase sólida.

4.2. Evaporador rotatorio.

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4.3. Equipo HPLC constituido por:

4.3.1. Desgasificador para la fase móvil.
4.3.2. Válvula de inyección Rheodyne con bucle de 10 μL.
4.3.3. Bomba de alta presión.
4.3.4. Horno termostático para columna HPLC que permita mantener temperaturas
subambiente (15-20 ºC), (por ejemplo, tipo Peltier).
4.3.5. Detector de índice de refracción.
4.3.6. Sistema de adquisición de datos informatizado con programa integrador.

4.4. Equipo de cromatografía de gases con columna capilar, descrito en COI/T.20/Doc.

nº. 17, provisto de:
4.4.1. Inyector Split.
4.4.2. Detector de ionización de llama (FID).
4.4.3. Horno con temperatura programable.
4.4.4. Sistema de adquisición de datos informatizado con programa integrador.

4.5. Ordenador PC con el programa Microsoft EXCEL, versión 2000 or XP.

5. PROCEDIMIENTO

5.1. Purificación del aceite

Colocar un cartucho de gel de sílice SPE en un aparato de elución a vacío y lavar

bajo vacío con 6 ml de hexano. Liberar el vacío para evitar que se seque la columna
y colocar un matraz cónico bajo el cartucho. Cargar en la columna una solución de
aceite (0.12 g, aproximadamente) en 0.5 ml de hexano, pasarla a través de la
columna y eluirla con 10 ml de la mezcla disolvente (3.1.5) de hexano-éter dietílico
(87:13 v/v) bajo vacío. Homogeneizar el disolvente eluido y transferir
aproximadamente la mitad de su volumen a otro matraz cónico. Evaporar por
separado ambas soluciones hasta sequedad en un evaporador rotatorio bajo presión
reducida a temperatura ambiente. Para el análisis de los triglicéridos, disolver uno
de los residuos en 1 ml de acetona (ver primer párrafo del punto 5.2) y transferirlo
a un tubo roscado de 5-ml. Disolver el otro residuo en 1 ml de n-heptano y
transferirlo a un segundo tubo roscado de 5-ml para preparar los ésteres metílicos
de ácidos grasos.

Nota: La purificación del aceite puede realizarse utilizando una columna de gel de sílice, tal
como se describe en el método IUPAC 2.507.
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5.2. Análisis HPLC de los triglicéridos

Poner en marcha el sistema HPLC, manteniendo la columna a 20ºC y utilizando

propionitrilo como fase móvil a un caudal de 0.6 ml/min. Cuando la línea base se
estabilice, inyectar el disolvente; si aparecen distorsiones en la línea base en la
región comprendida entre 12 y 25 min, utilizar otro tipo de acetona o una mezcla de
propionitrilo/acetona (25:75) para disolver la muestra.

Nota: Algunos tipos de acetona producen distorsiones de la línea en la mencionada región.

Inyectar una alícuota de 10 μl de la solución de aceite purificado en acetona (5%).

La operación dura aproximadamente 60 min. La temperatura del horno y/o el
caudal han de ajustarse para conseguir un cromatograma similar al presentado en la
Figura 1, en el que la trilinoleína (pico 1) es eluida a los 15.5 min, obteniéndose
una buena resolución entre las parejas LLL/OLLn (picos 1 y 2) y OLL/OOLn
(picos 4 y 5).

La altura del pico 2 (OLLn+PoLL) ha de alcanzar como mínimo un 3% de la escala

completa.

5.3. Preparación de los ésteres metílicos de ácidos grasos.

Añadir 0.1 mL de una solución 2N de hidróxido potásico en metanol a la solución

de aceite purificado en 1 mL de n-heptano. Tapar el tubo de ensayo y cerrarlo bien.
Agitarlo enérgicamente durante 15 segundos; dejarlo reposar hasta que la capa
superior resulte nítida (5 minutos). La solucion de n-heptano queda lista para ser
inyectada en el cromatógrafo de gases. La solución puede conservarse a
temperatura ambiente durante un máximo de 12 horas.

5.4. Análisis GC de los ésteres metílicos de ácidos grasos

Se ha de utilizar el procedimiento descrito en el método para la determinación de
los ácidos grasos insaturados trans (COI/T.20/Doc. nº 17).
Programar el sistema GC con una temperatura de horno a 165ºC. La temperatura de
horno recomendada es: isoterma a 165ºC durante 0 min, aumentándola a 200ºC, a
razón de 1.5ºC/min. Se recomienda que la temperatura del inyector esté entre 220ºC
y 250ºC para minimizar la formación de ácidos grasos trans (ver método COI). La
temperatura del detector será de 250ºC. Se ha de utilizar hidrógeno o helio como
gas portador, con una presión en la cabeza de la columna de aproximadamente 130
kPa. Volumen de inyección 1μL en modo de inyección Split.
Se ha obtener un perfil GC similar al mostrado en la Figura 2. Se ha de prestar
especial atención a la resolución entre C18:3 y C20:1 (el pico C18:3 tiene que
aparecer antes que el pico C20:1). Para conseguirlo, ha de optimizarse la
temperatura inicial y/o la presión de la cabeza de la columna. Ajustar las
condiciones del inyector (temperatura, relación de Split e inyección volumen) para
minimizar la discriminación de los ácidos palmítico y palmitoleico.
La altura del pico C20:0 ha de ser de un 20% de la escala total para cuantificar los
isómeros trans. Si el pico C18:0 está distorsionado, reducir la cantidad de muestra.
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5. INTEGRACIÓN DE LOS PICOS CROMATOGRÁFICOS

5.1. Cromatograma HPLC

El la Figura 1 se presenta un cromatograma HPLC típico de los triglicéridos de un

aceite de olive purificado. Para la integración de los picos, se han de trazar tres líneas
base: la primera entre el inicio del pico 1 y el final del pico 3; la segunda entre el
inicio del pico 4 y el valle anterior al pico 8; la tercera entre el valle anterior al pico 8
y el final del pico 18.
El área total es la suma de las áreas de todos los picos (identificados y no
identificados) desde el pico 1 al pico 18. El porcentaje de cada pico viene dado por

TAGx (%) = 100 (Ax + AT)

Los porcentajes se han de expresar dos decimales.

5.2. Cromatograma GC

En la Figura 2 se presenta el cromatograma GC de los ésteres alquílicos de los ácidos

grasos. Se han de calcular los porcentajes de los siguientes ácidos grasos:

Palmítico; P (C16:0) = éster metílico + éster etílico

Esteárico; S (C18:0) = ester metílico
Palmitoleico; Po (C16:1) = suma de los ésteres metílicos de los dos
isómeros cis
Oleico; O (C18:1) = suma de los ésteres metílicos de los dos
isómeros cis + éster etílico + isómeros trans
Linoleico; L (C18:2) = éster metílico + éster etílico + isómeros trans
Linolénico; Ln (C18:3) = éster metílico + isómeros trans
Araquídico; A (C20:0) = éster metílico
Eicosenoico (gondoico);G (C20:1) = éster metílico

Los ésteres etílicos e isómeros trans no han de aparecer en el cromatograma GC.

El área total (AT) es la suma de todos los picos que aparecen en el cromatograma
desde el C14:0 al C24:0, exceptuando el correspondiente al escualeno. El porcentaje
de cada pico se calcula como sigue:

FAx (%) = 100 (Ax + AT)

Los resultados han de expresarse con dos decimales.

Para los cálculos de los programas informáticos, no se precisa una normalización al

100%, ya que se realiza automáticamente.
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4 8 1 1 1

0.

Volts 6 1

0. 5 9 1 1
1
1
1 7
2 1
2a 3

0.

0 5 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6
Minutes

Figura 1: Cromatograma HPLC de los TG de un aceite de oliva virgen de

“Chemlali”. Principales componentes de los picos cromatográficos:

(1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; (4) OLL; (5) OOLn+PoOL;
(6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; (8) OOL+LnPP; (9) PoOO;
(10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP;
(13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; (17) SOO;
(18) POS+SLS.
 COI/ T.20/Doc. no. 25
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Cuadro 1: Datos de repetibilidad relativos a la determinación de los TG del aceite de

oliva virgen con una temperatura de la columna de 20ºC y utilizando propionitrilo
como fase móvil.
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5

RSDr (%)

RSDr (%)

RSDr (%)
Media(%)

Media(%)

Media(%)

Media(%)

Media(%)
RSDr (%)

RSDr (%)
Picos
ECN TAGs
HPLC

1 LLL 0.020 7.23 0.066 5.18 0.095 4.10 0.113 0.95 0.34 1.05
42 OLLn+
2 0.085 7.44 0.24 1.78 0.26 2.25 0.35 2.02 0.50 2.83
PoLL
3 PLLn 0.023 15.74 0.039 5.51 0.057 5.62 0.082 4.35 0.12 6.15
4 OLL 0.47 1.52 1.53 0.42 2.62 0.98 3.35 1.05 4.37 1.13
OOLn+
5 1.07 2.01 1.54 0.46 1.61 0.71 1.72 1.07 1.77 2.40
PoOL
44 PLL+
6 0.11 12.86 0.24 4.37 0.65 1.32 1.35 0.73 2.28 1.24
PoPoO
POLn+
7 PpoPo+ 0.42 5.11 0.49 2.89 0.55 2.01 0.85 1.83 1.09 1.96
PpoL
OOL+
8 6.72 0.63 8.79 0.31 11.21 0.42 13.25 0.33 15.24 0.23
LnPP
9 PoOO 1.24 2.86 1.49 0.95 1.63 0.85 2.12 0.45 2.52 0.56
SLL+
10 2.70 0.65 4.05 0.70 6.02 0.65 9.86 0.53 11.53 0.31
46 PLO
PoOP+
SpoL+
11 0.64 4.42 0.69 3.02 0.79 1.23 1.53 0.89 1.70 1.66
SOLn+
SpoPo
OOO+
48 12+13 PLP+ 49.60 0.07 48.15 0.06 42.93 0.06 33.25 0.10 24.16 0.06
PoPP
14 SOL 0.82 1.72 0.92 1.56 1.05 1.32 1.25 1.05 1.60 1.77
15 POO 22.75 0.25 21.80 0.20 21.05 0.30 20.36 0.35 20.17 0.14
16 POP 3.05 0.46 4.56 0.42 4.98 0.52 5.26 0.41 5.57 0.38
17 SOO 6.87 0.21 5.56 0.33 4.86 0.43 4.12 0.72 3.09 0.69
50
POS+
18 1.73 1.23 1.65 1.10 1.54 0.99 1.49 1.10 1.41 1.00
SLS
n = 3 replicados
RSDr = Desviación estándar relativa de la repetibilidad
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Figura 2: Cromatograma GC de los ésteres alquílicos de los ácidos grasos

obtenidos a partir de un aceite de orujo de oliva mediante
transesterificación en frío con una solución metanólica de KOH.
 COI/ T.20/Doc. no. 25
Pág. 9

ANEXO 1

DETECCIÓN DE ACEITES ESPURIOS

EN LOS ACEITES DE OLIVA
MEDIANTE LA RELACIÓN R42/R44

_____

1. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

1.1 Composición en triglicéridos

Utilizar el método de normalización interna, es decir, considerar que la suma de las

áreas de los picos correspondientes a los triglicéridos con ECN comprendido entre
42 y 52 es igual a 100. Calcular el porcentaje relativo de cada triglicérido mediante
la siguiente fórmula:

% de triglicérido = área del pico x 100/suma de las áreas de todos los picos.

Los resultados se expresan con dos decimales como mínimo.

1.1.1. Triglicéridos con ECN42

Los triglicéridos con ECN42 se calculan con las ecuaciones que figuran en el
método COI/T.20/Doc. nº 20 y se relacionan a continuación según el orden previsto
de elución en la cromatografía de HPLC (normalmente sólo se observan tres picos).

LLL
PoLL e isómero de posición LPoL

OLLn e isómeros de posición OLnL y LnOL

PoPoL e isómero de posición PoLPo
PoOLn e isómeros de posición OPoLn y OLnPo

PLLn e isómeros de posición LLnP y LnPL

PoPoPo
SLnLn e isómero de posición LnSLn
PPoLn e isómeros de posición PLnPo y PoPLn

La composición de triglicéridos con ECN42 se obtiene sumando los nueve

triglicéridos, incluidos sus isómeros de posición. Los resultados se expresan con
dos decimales como mínimo.
COI/ T.20/Doc. no. 25
Pág. 10

1.1.2. Triglicéridos con ECN44

Los triglicéridos con ECN44 se calculan con las mismas ecuaciones matemáticas y
se relacionan a continuación según el orden previsto de elución en la cromatografía
de HPLC.

LLO e isómero de posición LOL

PoLO e isómeros de posición OPoL y LOPo
PoPoO e isómero de posición PoOPo
LnOO e isómero de posición OLnO
LnOP e isómeros de posición OPLn y PLnO
PLnP e isómero de posición LnPP
LLP e isómero de posición LPL
PoLP e isómeros de posición LPoP y LPPo
PoPoP e isómeros de posición PoPPo
LLnS e isómeros de posición LSLn y LnLS
PoLnS e isómeros de posición LnPoS y LnSPo

La composición de triglicéridos con ECN44 se obtiene sumando los once

triglicéridos, incluidos sus isómeros de posición. Los resultados se expresan con
dos decimales como mínimo.

1.2 Composición de ácidos grasos

La composición de triglicéridos se calcula a partir de la composición de los ácidos

grasos C16 y C18 –palmítico, esteárico, oleico, linoleico y linolénico– según el
método COI/T.20/Doc. nº 20.

2. EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS

Se compara el contenido teórico calculado y el determinado por HPLC. Se calculan

a continuación las siguientes relaciones:

r ecn42 = ecn42 hplc/ecn42 theor

r ecn44 = ecn44 hplc/ecn44 theor

La autenticidad de todos los aceites de oliva, vírgenes o refinados (exceptuando los

aceites de orujo de oliva), se determina mediante la relación R:

R= r ecn42/recn44
 COI/ T.20/Doc. no. 25
Pág. 11

El aceite de oliva es auténtico cuando:

En aceites con una relación ác. oleico /ác. linoleico ≤ 5 R ≤ 0.95

En aceites con una relación ác. oleico /ác. linoleico > 5 < 15 R ≤ 1.05
En aceites con una relación ác. oleico /ác. linoleico ≥ 15 R ≤ 1.10

3. APLICACIÓN DEL PROGRAMA INFORMÁTICO

3.1 Cargar EXCEL en el ordenador.

3.2 Abrir el archivo EXEMPLA.xls, que contiene tres ejemplos de cálculo.

Los datos para el cálculo sólo pueden introducirse en las celdas azules. No teclee
ningún dato en ninguna parte del programa, salvo en las áreas indicadas.

3.3 La introducción de datos en el programa comienza en la muestra # tecleando el

código de la muestra en la franja amarilla.

3.4 A continuación, introducir los datos de los ácidos grasos en la fila correspondiente
a FA found.

Los ácidos grasos se presentan según la siguiente secuencia:

P = 16:0 = palmítico; M = 16:1 = palmitoleico; S = 18:0 = esteárico;
O = 18:1 = oleico; L = 18:2 = linoleico; T = 18:3 = linolénico.

Los demás ácidos grasos NO son necesarios. Introducir solamente los

especificados, que son normalizados automáticamente y aparecen en la fila FA
corr.

3.5 Introducir los datos relativos a los ECN42 HPLC, denominados T42, en la celda
correspondiente, bajo HPLC42.

3.6 Introducir los datos relativos a los ECN44 HPLC, denominados T44, en la celda
correspondiente, bajo HPLC44.

3.7 Tanto si el aceite de oliva contiene aceites espurios como si no los contiene, el
programa concluye con la siguiente mención: auténtico – adulterado.
 COI/ T.20/Doc. no. 25
Pág. 12

sample# 2144
INTRODUCE FATTY ACID ANALYSIS(FOUND) Legend
P M S O L T Tot P=16:0
FA found 8,96 0,63 3,05 25,00 3,50 0,54 41,7 M=16:1
FA corr 23,13 1,64 7,10 58,59 8,26 1,28 100,0 S=18:0
O=18:1
INTRODUCE TGC ANALYSIS VALUES RESULTS L=18:2
GLI HPLC GLI HPLC r42 0,26 T=18:3
T42 0,18 T44 2,21 r44 0,43
r42/r44 0,60
O/L 7,09

CONSIDERATIONS LIMITS
IF O/L> 15 r42/r44 < = 1,10
IF O/L> 5< 15 r42/r44 < = 1,05
IF O/L< = 5 r42/r44 < = 0,95

CONCLUSIONS
The sample is: GENUINE

EXEMPLA.xls
 COI/ T.20/Doc. no. 25
Pág. 13

ANEXO 2

DETECCIÓN DE ACEITES ESPURIOS EN LOS ACEITES DE OLIVA

COMPARANDO ALGORITMOS MATEMÁTICOS CON UNA BASE DE DATOS
CREADA A PARTIR DE ACEITES DE OLIVA AUTÉNTICOS

_____

1. CÁLCULO

1.1. Composición de triglicéridos

Picos de los TG con ECN42

LLL = pico 1
OLLn = pico 2+hombro 2a (Nota 1)
PLLn = peak 3

Nota 1. En algunos aceites, y con condiciones cromatográficas muy buenas, el hombro puede
presentarse en un pico por separado. En este caso, el área tiene que sumarse a la del pico
2.

Picos de los TG con ECN44

OLL = pico 4
OOLn = pico 5 + hombro posterior, de haberlo (En la Figura 1, hombro no
presente).
PLL = pico 6
POLn = pico 7 + hombro posterior, de haberlo (En la Figura 1, hombro no
presente)

Picos de los TG con ECN46

OOL = pico 8

1.2. Composición de ácidos grasos

En la Figura 2 se presenta un cromatograma GC de los ésteres alquílicos de los

ácidos grasos obtenidos mediante transmetilación en frío con una solución
metanólica de KOH a partir de aceite de oliva purificado.
Se han de calcular los porcentajes de los ácidos P, Po, S, O, L, Ln, A, y G.
COI/ T.20/Doc. no. 25
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2. ALGORITMOS MATEMÁTICOS PARA LA DISCRIMINACIÓN DE LOS

ACEITES.

2. 1. Parámetros para la clasificación de los aceites en grupos

LLLTheor.
ΔOOL = OOLTheor. - OOLHPLC
ΔLLL = LLLHPLC - LLLTheor
Ln = % linolenic acid
ΔECN44p = (PLL + POLn)HPLC – (PLL+ POLn)Theor

La muestra de aceite se clasifica en uno de los ocho grupos en función de su valor

LLLTheor:

a) ≤ 0.018 %
b) > 0.018 - ≤ 0.040 %
c) > 0.040 - ≤ 0.090 %
d) > 0.090 - ≤ 0.15 %
e) > 0.15 - ≤ 0.25 %
f) > 0.25 - ≤ 0.35 %
g) > 0.35 - ≤ 0.55 %
h) > 0.55 %

En cada grupo, los aceites se clasifican en subgrupos en función de los valores de

ΔOOL o ΔLLL.

2.2. Parámetros para la comparación con la base de datos

2.2.1. Límite legal: ΔECN42 = ECN42HPLC – ECN42Theor.

Sólo a efectos informativos, ya que este límite no se utiliza para comprobar la
autenticidad del aceite.

2.2.2. Criterios previos para los grupos a, b y h. R1exp = LLLHPLC/OLLnHPLC

If R1exp ≤ límite, el aceite es auténtico.

2.2.3. 1er criterio:

K1 = (LLLHPLC+OLLnHPLC)*(OLLTheor+OOLnTheor) / (LLLTheor +OLLnTheor)*(OLLHPLC+OOLnHPLC)

Si K1 ≤ limitlw, el aceite es auténtico

Si K1 > limitup, el aceite no es auténtico

Para los grupos b, c, y d, existe un límite intermedio. Si K1 está comprendido entre

los límites intermedio y superior, y L3 (ver más adelante) es superior a 0.50, el
aceite no es auténtico.
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2.2.4. 2º criterio: ΔR1 = [LLL / OLLn]HPLC – [LLL / OLLn]Theor.

Si ΔR1 ≤ limitlw., el aceite es auténtico
Si ΔR1 > limitup, el aceite no es auténtico

2.2.5. 3er criterio: ΔR3 = [OLL / OOLn]HPLC – [OLL / OOLn]Theor.

Si ΔR3 ≤ limitlw., el aceite es auténtico
Si ΔR3 > limitup., el aceite no es auténtico

2.2.6. 4º criterio: L4 = [ΔLLL - ΔOLLn] / LLLTheor.

Si L2 ≤ limitlw., el aceite es auténtico
Si L2 > limitup., el aceite no es auténtico

2.2.7. 5º criterio: L3 =  [ΔLLL - ΔOLLn] / OLLnTheor

Si R2 ≥ límite, el aceite es auténtico
Si R2 < límite, el aceite no es auténtico

2.2.8. 6º criterio: R2 = [ΔOLL * LLLTheor ] / [ΔLLL * OLLTheor ]

siendo ΔLLL = LLLexp - LLLtheor

ΔOLLn = OLLnexp - OLLntheor
ΔOLL = OLLexp - OLLtheor

2.3. Determinación de los límites

Para cada subgrupo, los límites de algunos parámetros se obtienen con la ecuación:

límite versus valor ΔECN44p

En el caso de los criterios 1, 2, 3, 4 y 5, existen límites inferiores y superiores

(limitlw y limitup), mientras que para el 6º criterio sólo hay un límite.

Los valores de cada criterio se comparan secuencialmente con los límites superior e
inferior. Los valores entre ambos indican que se ha de comparar el siguiente
parámetro. En la Figura 3 se presenta el diagrama de flujo del procedimiento
secuencial.

Los criterios se comparan en el orden mencionado, salvo en el caso de los grupos g

y h, donde ΔR3 se compara tras L3.

3. APLICACIÓN DEL PROGRAMA INFORMÁTICO.

3.1. Cargar EXCEL en el ordenador.

3.2. Abrir el archivo GLOBAL.XLS contenido en el disquete.

3.3. Activar “Macro” si procede.

3.4. Pulsar en “Press to initiate calculation”.

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3.5. Introducir los datos solamente en las celdas amarillas (Figura 4)

3.5.1. En “Sample code”, teclear la descripción de la muestra

3.5.2. En “Oil category”, teclear:

“EV” en el caso de aceites de oliva vírgenes comestibles (categorías extra y virgen)
“L” en el caso de aceite de oliva lampante
“R” en el caso de aceite de oliva refinado y aceite de oliva (mezcla de aceite de
oliva refinado y aceite de oliva virgen).
Este código es necesario para calcular el límite oficial de ΔECN42.

3.5.3. En “Introd. FAMEs-GC”, teclear la composición de ácidos grasos. El programa

normaliza automáticamente los porcentajes en relación a la suma de los ocho ácidos
grasos. Si aparece la mención ¡Warning¡, revisar los datos relativos a los ácidos
grasos.

3.5.4. Teclear los datos relativos a los triglicéridos en las celdas correspondientes. Revisar
los datos.

3.6. El programa calcula la composición teórica de triglicéridos a partir de la

composición de ácidos grasos normalizada.

3.7. Utilizando los porcentajes reales y teóricos de triglicéridos, el programa calcula los
valores de los algoritmos matemáticos correspondientes a la muestra de aceite y los
valores de los límites.

3.8. El comando “Press control+letter” que aparece en la franja roja indica el intervalo
LLLTheor en el que se clasifica el aceite.

3.9. Para ver los resultados, pulsar simultáneamente “control” y las letras clave
especificadas; aparece entonces la hoja de resultados para la muestra de aceite
(Figura 5).

3.10. Leer los resultados en las franjas rojas.

“The oil is correct” indica que el aceite es un aceite de oliva auténtico o que el
nivel de adulteración es bajo.
“The oil is not correct” indica que el aceite no es un aceite de oliva auténtico.
Para cada criterio, los valores de los algoritmos están en negrita También se indican
los límites superior e inferior y los valores de otros parámetros.

3.11. Pulsar en “Press to print the results” para imprimir los resultados. Se imprimirán
dos hojas: los datos reales y los valores y límites de la muestra.

3.12. Pulsar en “Press for a new calculation” para reinicializar el programa. Todos los
datos serán borrados.
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Experimental determinations
TAGs and FAMEs

Theoretical TAGs

Classificationvs LLLtheoretic
R2 < Lim R2 ≥ Lim
6th
Classificationvs ΔOOL Non Genuine Oil Criterion

LwLim< L3 ≤ UpLim
ΔECN42

L3 > UpLim L3 ≤ LwLim

5th
Criterion
R1 ≤ Lim Previous
Criterion
LwLim< L4 ≤ UpLim
R1 > Lim

L4 > UpLim L4 ≤ LwLim

K1 ≤ LwLim 1st K1 > UpLim 4th
Criterion Criterion
ΔR3 > UpLim
LwLim< K1 ≤ UpLim
LwLim< ΔR3 ≤ UpLim
ΔR1 ≤ LwLim 2nd ΔR1 > UpLim 3rd
Criterion Criterion

LwLim<ΔR1 ≤ UpLim ΔR3 ≤ LwLim

Genuine Oil

Figura 3: Diagrama de flujo para el procedimiento secuencial.

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EXPERIMENTAL DATA

Fill only yellow cells

Sample Code VOO + VHO

Oil Category R Refined Olive Oil

Area % (GLC) C16:0 C18:0 C16:1 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 Sum

FAMEs-Comp. Corr. 9,62 2,94 0,41 79,39 6,52 0,49 0,33 0,30 100,00

Introd. FAMEs-GC 9,62 2,94 0,41 79,37 6,52 0,49 0,33 0,30 99,98

HPLC Experimental Data

ECN42 ECN44 ECN46

LLL OLLn PLnL OLL OOLn PLL POLn OOL

0,12 0,19 0,04 1,55 1,28 0,22 0,47 12,57

Press CTRL+b to see criteria for LLL theor. 0,018 - 0,040

Figura 4: Hoja de datos para el programa de cálculo.

Criteria for LLL theor. 0,018 - 0,040

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Calculation Parameters
Sample Code VOO + VHO
Oil Category R Refined Olive Oil

ΔECN42 = 0,14 0,35 Proceed to the Early Criterion

Early Criterion R1 exp.

Parameter Value Límit
R1 exp. 0,63 0,40 Proceed to the Criterion 1

Criterion 1 K1
Parameter Value Higher Limit Lower Limit
K1 1,15
L3 0,41 1,35 0,95

Proceed to the Criterion 2

Criterion 2 ΔECN44p vs ΔR1

Parameter Value Higher Limit Lower Limit
ΔR1 = 0,46
ΔOOL = -0,69
ΔECN44p 0,26
0,51 0,37 Proceed to the Criterion 3

Criterion 3 ΔECN44p vs ΔR3

Parameter Value Higher Limit Lower Limit
ΔR3 = 0,26
ΔOOL = -0,69

0,50 0,25 Proceed to the Criterion 4

Criterion 4 L4
Parameter Value Higher Limit Lower Limit
L4 = 2,52
ΔOOL = -0,69

6,00 4,00
The oil is correct
Criterion 5 L3
Parameter Value Higher Limit Lower Limit
L3 = 0,41
ΔOOL = -0,69

0,60 0,40

Criterion 6 R2
Parameter Value Límit
R2 = 0,168
ΔOOL = -0,69

0,100

Figura 6: Hoja de resultados