MANUAL DE MICROBIOLOGÍA

PRACTICA 7
Pruebas de diferenciación bioquímica

Introducción.
El metabolismo es toda una serie de reacciones que ocurren en los seres
vivos. Estas reacciones incluyen procesos de obtención de energía como son: la
composición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos (catabolismo) o la
captación de luz para el caso de los fotótrofos, así como de síntesis de material
celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo).
En el laboratorio es posible conocer las características metabólicas de los
microorganismos, inoculando en diferentes medios de cultivo, con sustratos que
pueden utilizar como fuente de energía, fuente de carbono y de otros nutrientes
esenciales para su crecimiento.
Como se ha observado en prácticas anteriores, algunas bacterias y
levaduras tienen características coloniales y microscópicas muy similares, lo que
no permiten decidir si dos cultivos bacterianos o de levaduras morfológicamente
similares pertenecen a una misma especie. Con algunas pruebas bioquímicas es
posible su diferenciación e incluso su identificación. Cuando el número de pruebas
es suficientemente amplio.

Objetivos.
 Realizar pruebas bioquímicas en medios de cultivo para sustratos
específicos que permitirán demostrar actividades metabólicas de bacterias
y levaduras.
 Comprender la importancia de las pruebas bioquímicas para caracterización
e identificación de estos organismos.

Materiales de laboratorio por equipo Material del Equipo

3Tubos con TSI (pico de flauta) Cinta adhesiva transparente
 MANUAL DE MICROBIOLOGÍA

3Tubos con MIO Cerillos

3Tubos con citratos de Simmons (pico Franela
de Flauta)
3Tubos con agar urea (pico de flauta) marcador indeleble o lápiz graso
3Cajas de Petri con AA Cloro
1 Asas bacteriológicas de punta y aro Colores
2 mecheros

Actividad práctica.
Técnica de inoculación en cajas de Petri
1. Sembrar por estría cruzada
2. Incubar las cajas en forma invertida a 35 C durante 24-48 hrs.

Técnica de inoculación
1. Los tubos de TSI se inocularan por estría simple en la superficie y por
picadura hasta el fondo del tubo.
2. Los tubos con medio MIO se inocularan por picadura (asa recta)
3. Los tubos con citrato de Simmons se inocularán por estría simple en la
superficie.
4. los tubos de caldo de urea se inocularan 2 a 3 veces.
5. Incubar los tubos a 35 C durante 24-48 hrs.

Evaluación de actividades metabólicas

1. Determinar la actividad de amilasas en las cajas de AA por el crecimiento y
aparición de zonas claras alrededor de las colonias. Si no es posible
observarlas a simple vista, agregar unas gotas de lugol a las cajas y
 MANUAL DE MICROBIOLOGÍA

observar la aparición de zonas claras sobre el medio que se colorea de azul

como indicativo de prueba positiva (+). Comparar los resultados con la zona
de la caja que se dejo sin inocular.
2. En un portaobjeto hacer una suspensión en una gota de agua destilada de
las colonias obtenidas en el medio AA y agregar unas gotas de peroxido de
hidrógeno al 30%. Observar la formación de burbujas que da como positiva
(+) la prueba de catalasa.
3. En los tubo con MIO es usado para la identificación de Enterobacteriaceae
en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de
indol.
 La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por
crecimiento que difunde mas allá de la línea de inoculación.
 La reacción positiva (+) a la ornitina está dada por un color púrpura
turbio a un púrpura amarillento apagado. La reacción negativa (-) esta
dada por un color amarillo claro y brillante.
 El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que
contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de Un anillo rojo en la
superficie del medio en la capa alcohólica. luego de agregar 5 gotas de
reactivo de Kovac´s, indica un resultado positivo (+).Prueba negativa (-):
no se produce color. Prueba variable o dudosa (): un color anaranjado
en la superficie.
4. En los tubos con TSI es usado para determinar la capacidad de un
organismo de atacar un hidrato de carbono específico, con producción o no
de gas, junto con la determinación de posible producción de ácido
sulfhídrico (H2S)

 Hidratos de carbono
 Fermentación de la glucosa solamente (alcalina/ácida). Un pico de flauta
color rojo y en la capa profunda amarillo
 Fermentación de glucosa y lactosa (ácida/ácida)
 MANUAL DE MICROBIOLOGÍA

 Fermentación de peptonas (alcalina/alcalina)

 Producción de gas
 Aerogénico: Una sola burbuja de gas, Burbujas en el medio,
desdoblamiento del medio, desplazamiento completo del medio del
fondo del tubo dejando un área clara, ligera muesca del medio en el
costado del tubo.
 Anaerogénico: no hay producción de gas.
 Producción de H2S
 Un color negro distribuido por toda la capa profunda, puede o no
enmascarar la acidez, un anillo negro cerca de la parte superior de la
capa profunda.
5. Todas las pruebas en tubos deberán interpretarse en comparación con
tubos control(sin inocular).

Resultados
 Reportar los resultados en el cuadro, de acuerdo al siguiente convenio: No
hay crecimiento (-), poco crecimiento (+), mayor crecimiento (++),
 MANUAL DE MICROBIOLOGÍA

crecimiento abundante (+++). Actividad sobre sustratos (+) o (-) en caso de

que no haya actividad.
 Investigar los resultados bibliograficos de cada una de las cepas y
compararlos con los obtenidos en la práctica.
 Investigar las reacciones enzimáticas y de color realizadas para la
evaluación de actividades metabólicas.
 De acuerdo a sus observaciones proponga el nombre de la especie que
corresponde a su microorganismo.

Medio de cultivo Bacteria 1 Bacteria 2 Sin inocular

Agar almidón (AA)

Crecimiento
Color del medio
con lugol
Hidrólisis de
almidón
Reacción de
catalasa

Bacteria 1 Bacteria 2 Sin inocular

Caldo Urea
 MANUAL DE MICROBIOLOGÍA

Crecimiento
Color
Hidrólisis de urea
Bacteria 1 Bacteria 2 Sin inocular
Citrato de simmons

Crecimiento
Color
Fermentación del
citrato
Bacteria 1 Bacteria 2 Sin inocular
Agar hierro triple
azúcar (TSI)

Crecimiento
Cambio de color
Producción de H2S
Producción de gas
Fermentación del
azúcar
 MANUAL DE MICROBIOLOGÍA

Bacteria 1 Bacteria 2 Sin inocular

Medio MIO
(Movilidad
, Indol Y
Ornitina)
Color
Movilidad
Conversión del
triptofano
a indol.
Presencia de la
ornitina
descarboxilasa
Cuestionario
1. ¿Cuales son las rutas bioquímicas de obtención de energía de las bacterias
aerobias, las anaerobias, las fermentadoras?¿cuál de esta es la más
eficiente?¿porqué?

2. Describa brevemente las actividades enzimáticas que se identifican en cada

uno de los medios de cultivo utilizados en esta practica. ¿Cuál es la
reacción bioquímica que cataliza cada una de ellas?

3. ¿Explique por que se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el

fondo del tubo TSI y no en la superficie?

Fichas catolográficas del material bibliográfico sugerido que se encuentran

en la biblioteca de la UMAR
 MANUAL DE MICROBIOLOGÍA

Ficha No. 2768

CLASIFICACION 571. 638293 M507
ISBN:
Título: Manual de Medios de Cultivos / Publicación patrocinada por MERCK
Autor:
Editorial: Alemania: E. MERCK, 1990
Descripción: 355 p.
TEMAS: 1. MICROBIOLOGIA - CULTIVOS - MANUALES \ 2. MICROBIOLOGIA
INDUSTRIAL - INDUSTRIA QUIMICO FARMACEUTICA - INVESTIGACION Y
DESARROLLO \ 3. MEDIOS DE CULTIVO GRANULADOS - PREPARACION -
CONSERVACION
Notas: Incluye referencias bibliográficas e índice

Ficha No. 1416

CLASIFICACION 616.014 M507p
ISBN: 968-7157-10-0
Título: Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
clínica / Jean F. Mac Faddin, Irma Lorenzo trad.
Autor: Mac Faddin, Jean F.
Editorial: México : Médica Panaméricana, 1990
Descripción: 301 p.
TEMAS: 1. BACTERIOLOGIA - LABORATORIO, REACTIVOS DE - VIRUS \ 2.
MICROORGANISMOS - OBSERVACION - MANUAL \ 3. BACTERIAS -
IDENTIFICACION - LABORATORIO
Notas: Fotocopia de original