Taller N°1

Nombre: Rosa Hidalgo P. Fecha: 20 abril 2018

Protocolos para HPLC

1. Folatos y su disponibilidad en alimentos evaluados por cromatografía líquida (hplc).
validación y aplicaciones en calidad nutricional de alimentos.
Variables Cromatografícas y condiciones del equipo
El sistema HPLC empleado (Merck-Hitachi, 7000) está equipado con una bomba
cuaternaria de gradiente, loop de inyección de 100 µl, sistema de muestreado automático.
El flujo se fija en 0,9ml/min. La fase móvil utilizada es acetonitrilo y tampón fosfato potásico
30 mM, pH 2,2. El horno se encuentra a 35°C. Dependiendo de las muestras el volumen de
inyección usado puede variar entre 25-300 µl, aunque el volumen más común es de 40 µl.
Tipo de columna y fase estacionaria
La columna usada es LiChrocart® 250-4 mm (silica gel, fase reversa) esta se encuentra al
interior del horno con temperatura ajustada a 35º C, HPLC Cartridge, con precolumna:
LiChrocart®4-4, LiChrospher® 100 RP-18 (5 µm)guard columns, a fin de evitar la entrada
de impurezas.
Detector utilizado
Detector de fluorescencia con unos valores de excitación y emisión de 280 y 350 nm
respectivamente, y detector de ultravioleta con una longitud de onda de 290 nm (LaChrom,
Merck-Hitachi).
Tratamientos previos de las muestras
Para la obtención de los folatos de los alimentos se toman 5ml de extracto de cada una de
las muestras objeto de estudio (ajustadas previamente a pH 4,9 debido a que es el óptimo
de actuación de la enzima conjugasa) y se les adiciona 1ml de solución de α-amilasa (20
mg de amilasa/ml de ascorbato 1%, A-0273 y 1ml de solución de conjugasa de riñón de
cerdo. Se les aplica nitrógeno para crear una atmósfera no oxidante, y posteriormente se
les introduce en un baño de agua durante 3 horas a 37ºC con agitación constante. Pasado
este tiempo, el pH se ajusta a 7,0, añadiendo posteriormente 1ml de proteasa (2 mg de
proteasa/ml de ascorbato 1%, P-5147. Se les aplica de nuevo nitrógeno y se introducen en
un baño a 37º C durante 1 hora, llevándose seguidamente a ebullición durante 5 minutos,
a fin de inactivar la actividad enzimática. Inmediatamente tras la ebullición las muestras son
enfriadas en hielo, tras lo cual, se filtran (filtros desechables Whatman‚ de nylon con lecho
de polipropileno, de 25 mm de diámetro y 0,45 mm de tamaño de poro). Las muestras así
preparadas deben ser purificadas. Muchos procedimientos de purificación incluyen el
intercambio iónico fuerte a través de sílice u otras resinas, de tal forma que los folatos son
retenidos en base a sus cargas y recogidos con tampones apropiados o soluciones de
elución. Es precisa la preparación de las columnas de afinidad o cartuchos (columnas
LiChrolut‚ para extracción en fase sólida intercambio fuerte de aniones –SAX–, 500 mg), ya
que se debe evitar que la columna quede seca. Para ello se lava el cartucho con hexano,
seguido de metanol, agua mili-Q y finalmente se hace pasar el tampón pH 7,0 (solución de
purificación). Se vierten entonces las muestras en los cartuchos y se les deja pasar
lentamente. Antes de que acaben de pasar las muestras se debe ir lavando con agua mili-
Q las paredes del cartucho. Posteriormente, se les añade entre 2 y 2,5mL de solución de
elución que serán recogidos en viales previamente pesados. El volumen recogido será
pesado, y esta es la muestra que será analizada en HPLC.
La mayoría de los folatos en los alimentos se encuentran en forma de poliglutamatos en los
alimentos, requieren para su análisis cromatográfico ser hidrolizados enzimáticamente a
formas mono o di-glutamatos antes de poder ser cuantificados. Además de enriquecer el
analito de forma selectiva.

2. Desarrollo de un método de HPLC para la determinación de aminoácidos en vinagre

y su validación en muestras reales
Variables Cromatograficas y condiciones del equipo
Los derivados de aminoácidos se separaron empleando un gradiente cuaternario
compuesto por las siguientes fases móviles:
• Fase Móvil A: acetonitrilo - agua Milli-Q (60:40)
• Fase Móvil B: acetato sódico pH 5.15 - acetonitrilo (80:20)
• Fase Móvil C: acetato sódico pH 5.15 - acetonitrilo (96:4)
• Fase Móvil D: acetato sódico pH 4.92 - acetonitrilo (96:4)
Los cambios de gradiente se realizaron de manera lineal y el análisis cromatográfico se
llevó a cabo a 34º C. El volumen de inyección de la muestra filtrada y diluida de vinagre fue
de 20 µL.
Tipo de columna y fase estacionaria
Columna de sílice Luna C18 en fase reversa, tamaño de partícula 5µm, 250 x 4.6 mm
“Phenomenex” (Torrance, CA, USA) (Distribuida por Jasco Analítica SPAIN, Madrid).
Detector utilizado
La detección de los distintos aminoácidos y el amonio se realizó con un detector de
fluorescencia usando una λex de 250 nm y una λem de 395 nm.
Tratamientos previos de las muestras
Las muestras de vinagre se filtraron con papel de filtro y posteriormente se diluyeron al 25%
añadiendo 500 µL de la muestra a 1500 µL de agua Milli-Q. A partir de las muestras así
diluidas se preparó la mezcla prederivatización. La mezcla prederivatización de
aminoácidos usada para la selección del gradiente más adecuado contenía una
concentración de 0.01 mM de PI, 0.1 mM de ornitina, 0.15 mM de triptófano y cisteina y
0.05 mM del resto de aminoácidos y amonio.
La muestra antes de ser ingresada al cromatógrafo se debe filtrar ya que algunos
componentes de esta pueden causar interferencia, así se evita el bloqueo de las columnas
de HPLC.
 3. Cuantificación de aminoácidos en plasma
Variables Cromatograficas y condiciones del equipo
El análisis de aminoácidos por HPLC se realizó en un analizador de aminoácidos Biochrom
20® De la solución estándar o del plasma filtrado desproteinizado fueron cargados 80 µL
en la cápsula de inyección (Pharmacia Biotech) y colocados en el automuestreador
mantenido a 4 ºC
Como fase móvil se emplearon las soluciones tampón de citrato de litio contenidas en el
Ultra Physiological Fluid Chemical Kit (Pharmacia Biotech), a un "flujo de 1 mL/min.
Tabla 1. Soluciones tampón y gradientes de fuerza iónica y temperatura utilizados en los análisis de
aminoácidos por HPLC.

Tipo de columna y fase estacionaria

Columna de intercambio catiónico de alta resolución de 200 mm x 4,6 mm (Pharmacia
Biotech) La columna contiene en su interior una resina que se presenta en aspecto de perlas
esféricas lisas con un diámetro comprendido entre 0,5 mm y 1 mm.
Detector utilizado
La detección se realizó postcolumna a 440 y 570 nm previa derivatización con ninhidrina
(Ultra Ninhydrin Reagent, Pharmacia Biotech) a 135 ºC.
Tratamientos previos de las muestras
El plasma se separó por centrifugación a 4000 rpm durante 10 min y se conservó a –80 °C
hasta el momento del análisis. El plasma se desproteinizó por adición de ácido 5-
sulfosalicílico (50 mg/mL) y se incubó por 1 hora a 4 ºC. Finalmente, el plasma
desproteinizado se centrifugó a 13200 rpm por 5 min a temperatura ambiente y se filtró por
membrana de 0,22 µm.
La muestra se centrifuga para obtener el plasma ya que la sangre contiene globulos rojos,
plaquetas y plasma, en este caso el analito de interés es el plasma. La filtración se realiza
para eliminar componentes que puedan obstruir la columna del equipo.
Protocolos para GC
1. Determinación de Metanol, Acetona y Metiletilcetona en orina.
Variables Cromatografícas y condiciones del equipo
El análisis cromatográfico se realizó en un cromatógrafo de gases Agilent Technologies
6890. La temperatura del horno es de 60°C y la valcula 70°C. Se debe inyectar 1 ml de
fase gaseosa del espacio de cabeza en el GC.;
Temperatura del inyector: 200ºC Modo de inyección: split (1:1) Presión del vial: 21,6 psi
Gas portador (He): 36 psi
Programas de temperaturas del horno: 100ºC durante 4min, calentar a 10ºC/min hasta
140ºC y mantener1 min, calentar a 10ºC/min hasta 170ºC y mantener 3 min, calentar a
10ºC/min hasta 200ºC y mantener 6 min.
Para el análisis cromatográfico por HS-GC de los patrones, blancos y muestras de orina
se añade 2 ml de cada uno en un vial para espacio de cabeza de 20 mL
Tipo de columna y fase estacionaria
Columna cromatográfica HP-PLOT-Q de poliestireno- divinilbenceno de 30m x 0.32 mm x
20 µm.
Detector utilizado
Detector FID a 200°C, flujo de hidrogeno 40 mL/min y aire 400 mL/min
Tratamientos previos de las muestras
Orina sin tratamiento previo, si se desea conservar debe realizarse a 4°C hasta el analisis.

2. Determinación de ácidos grasos en grasas y aceites de origen vegetal y

animal.
Variables Cromatografícas y condiciones del equipo
Cromatógrafo de gases equipado, muestreador automático, Flujo gas portador (Hidrogeno)
15 psi, la temperatura del inyector es de 250°C, el volumen de muestra que se debe inyectar
es de 1µL, Modo de inyección: Split (1:100)
Programa de temperatura del horno: 120 °C por 5 min, aumentar la temperatura a razón de
10 °C/min hasta 180 °C, mantener por 30 min. Aumentar nuevamente a razón de 10 °C/min
hasta 210 °C y mantener por 21 min. (Total 65 min).
Tipo de columna y fase estacionaria
Columna capilar DB-23 fase reversa, 60 m, 0.25 mm i.d., 0.25 mm de film. (50%-
cianopropil)-metilpolisiloxano.
Detector utilizado
Detector FID T°: 250°C
Tratamientos previos de las muestras
Las muestras solidas se funden a no más de 60°C, y se toman 250 mg de ella agregándole
500 µL de KOH en metanol 2M. Se le agrega 5 mL de éter de petróleo y ase agita por 2
min. Dejar reposar 1 hora para luego trasvasijar a los viales del muestreador automático e
inyectar.
El tratamiento previo de esta muestra se debe realizar ya que la muestra se encuentra
sólida y se necesita en fase liquida para realizar el analisis.

3. Determinación de cocaína en cabello como biomarcador de consumo

crónico.
Variables Cromatografícas y condiciones del equipo
Cromatógrafo de Gases Varian 450 acoplado a un Espectrómetro de Masas de Trampa
Iónica Varian 220. Automuestreador Varian CP-8400 e Inyector 1177. Helio Alta Pureza
99,99% como gas de arrastre flujo constante de 1,5 mL/min.
El inyector 1177 se utiliza con una temperatura de 250°C, volumen de inyección 1,0 µL/seg,
tiempo de inyección 2,0 seg.
Tabla 2. Parámetros para encender el horno.

Tipo de columna y fase estacionaria

Columna cromatográfica 5-ms Varian Factor Four 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm. Columna muy
inerte con un 5% de fenilmetilo que mejora la sensibilidad, la precisión y el funcionamiento
continuado del instrumento.
Detector utilizado
Espectrómetro de masas de trampa iónica Varian 220, T°: 220°C
Tratamientos previos de las muestras
Se lavaron las muestras de cabello dos veces con 5 mL de diclorometano a 35°C durante
5 minutos cada una, se recolectaron y se analizaron para verificar la ausencia de agentes
externos. Se secaron en estufa por 15 minutos a 60°C. Las pequeñas muestras se
sometieron a digestión ácida controlada a 70°C con 2 mL de HCL 0,1N durante 16 hrs.
Posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente y se filtró para luego extraer el
analito de interés, previo ajuste pH 10 con 4 mL de solución saturada de tetraborato de
sodio y 2 mL de NaOH 0,1N y adición de cocaína-D3 (estándar). Se realizó una extracción
liquido-liquido utilizando 4 mL de diclorometano y agitación durante 15 minutos. Finalmente
la fase orgánica se llevó a sequedad y se reconstituyo con 150 µL de acetato de etilo para
inyectar la muestra.Todo este tratamiento previo se realiza ya que el pelo contiene muchos
componentes y se debe extraer solo el analito de interés. Además de realizar una filtración
para eliminar posibles interferentes dentro del equipo.