Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
00 Determin-BM PDF
00 Determin-BM PDF
00 Determin-BM PDF
ARTIEULOS TECh¡leo5
Métodos directos
Métodos groviméiricos
Métodos espectrofofométri cos
Méiodos microscópicos de recuenio celulqr en cómoros
Microscopío de epifl uorescencio Noronio de ocridino, DAPI, queloto de europio, Mg-'A'NS
CTC, SFDA
FISH
Métodos de siembro
Métodos indirectos
Polisocóridos
Lípidos
ATP
Métodos en continuo
Fig. 1. Esquemo de los disiintos métodos de deferminoción de lo biomoso
,f
IICNOI,OGIA I)IIL AGUA
ARTICULOS TECNTCOS
sidera como uno de los mejores mé- mente inactivas, y las vivas, ya que
todos para la estimación de la bio- el ADN conserva sus propiedades La epifluorescencia
masa. La epifluorescencia es debida incluso en células muertas.
a un agente fluorocromo, a la adi- El quelato de europio, al igual
ción de algún anticuerpo marcado que el naranja de acridina o el DA- es un método
con fluorescencia (inmunofluores- PI, es un colorante específico de
cencia) o a una autofluorescencia ácidos nucleicos. Otros fluorocro-
natural debida a la existencia de al- mos como las sales de magnesio
gún componente celular autofluo- del ácido 1 -anilino-8-naftalensul-
rescente. fónico (Mg-ANS) tiñen principal-
Cuando la epifluorescencia se mente componentes celulares co-
debe a un agente fluorocromo, el mo proteínas, lípidos o membranas
procedimiento consiste en la tinción celulares. En cambio, el comporta-
de las bacterias con dicho agente y miento de estos agentes fluorocro-
posterior recuento mediante mi- mos es el comentado anteriormen-
croscopía óptica con iluminación de te, sobrestiman el número de célu- cífica, y puede realizarse in situ.
epifluorescencia. Los sustratos las viables al no distinguir células También puede llevarse a cabo me-
fluorescentes o fluorocromos que se vivas de muertas. diante hibridación de sondas fluo-
han empleado para la observáción En el segundo grupo quedarían rescentes de ADN o ARN (Fluores'
directa de bacterias se clasifican en englobados fluorocromos como el cent in situ hybridization, FISH),
dos grupos. En el primero de ellos cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil te- cadavezmás utilizadas en Ecolosía
quedarían englobados aquellos trazolio (CTC, Rodríguez et al., Microbiana.
fluorocromos que tras ser adsorbi- 1992) ó el 5- (y 6-) diacetato de
dos actúan específicamente sobre sulfofluoresceína (SFDA, Tsuji et 2.5 Mé¡odos de siembro
ácidos nucleicos u otros componen- al., 1995). Ambos fluorocromos, a El recuento de microorganis-
tes celulares. El segundo incluiría a diferencia con los anteriores, dis- mos viables se fundamenta en la
todos aquellos que tras ser sustratos tinguen bacterias metabólicamen- capacidad de dichas células via-
de una determinada actividad meta- te activas de las que no lo son ne- bles de desarrollar una colonia vi-
bólica, son convertidos en molécu- diante la observación microscópi- sible en un medio de cultivo apro-
las fluorescentes. ca del producto fluorescente resul- piado. En los recuentos.n piu.u
AI primer grupo pertenecen los tado de Ia actividad metabólica pa- por vertido, un volumen de 0,1- I
principales fl uorocromos utilizados ra la que son específicos. En el ca- ml de la suspensión microbiológi-
para la estimación de la población so del CTC 1a actividad metabólica ca se mezcla con el medio de culti-
total de una muestra: el naranja de es la respiratoria y en el del SFDA vo fundido y parcialmente enfria-
acridina y el 4,6-diamidino-2-feni- es la actividad esterasa. La epi- do en una placa de Petri. En los re-
lindol (DAPI). Estos fluorocromos fluorescencia basada en fluorocro- cuentos en placa por siembra en
permiten distinguir células de partí- mos como eI CTC y el SFDA pon- superficie, se extiende un volumen
culas e identificar bacterias no sólo drá de manifiesto aquellos micro- de aproximadamente 0,1 ml de la
por su color, sino también por su organismos en los cuales estén suspensión sobre la superficie del
forma y tamaño. presentes dichas actividades meta- medio de cultivo. Los resultados
El naranja de acridina colorea bólicas, pero sin cuantificarlas. de los recuentos en placa se expre-
tanto el ADN como eI ARN de las Salvando este obstáculo se en- san como unidades formadoras de
células emitiendo a una longitud de cuentran las medidas bioquímicas colonia (UFC) por unidad de volu-
onda aproximada de 470 nm. Los de determinación indirecta de la men de la suspensión microbioló-
ácidos nucleicos de hebra simple se biomasa, que sí cuantifican activi- gica. Para que el recuento sea esta- a)
colorean de un color naranja-rojo dades metabólicas. dísticamente srgnificativo, el núl- O
fluorescente, mientras que los de La epifluorescencia es un méto- mero de colonias deberá estar c\
doble hebra adoptan un color verde do simple y rápido. No obstante, su comprendido entre 30 Y 300 colo- LIJ
M
fluorescente. EI fluorocromo DAPI reproducibilidad está cuestionada y nias. En el caso de muestras mttY cO
_l
es un colorante específico del ADN necesita un equipamiento relativa- diluidas se puede emplear 1a filtra- F-
y su pico de excitación se encuentra mente caro. ción de membrana, en la que tras la
próximo a la región ultravioleta La fluorescencia mediante anti- filtración de la muestra es el filtro
(365 nm). A pesar de las ventajas el que es colocado finalmente so- rr)
cuerpos marcados con agentes fluo- O
que supone el uso de estos fluoro- rescentes está basada en las propie- bre el agar (Atlas, 1992). C\
cromos, no permiten distinguir en- dades inmunológicas de las células. Otro tipo de recttentos los consti-
tre las células muertas, metabólica- Es una técnica muy sensible y espe- tuyen aquellos que emPlean tln me-
ret
ARTIEULCIS TEeNTCOS
dio de cultivo líquido como es el ca- mar biomasa viva son los ácidos nu- análisis más sensibles necesitan del
so de la estimación del número más cleicos, las proteínas, Ios polisacári- uso de cromatografía líquida
probabie (NMP). dos,los lípidos y el ATP. (HPLC) o gaseosa (GC). Todas es-
El recuento de microorganismos tas técnicas son laboriosas. muy
viables se fundamenta en el desarro- 3.1 .l . Ácidos nucleicos largas y necesitan de un equipa-
llo de una colonia visible a partir de El ADNI y el ARN son dos com- miento caro (Figura 2).
cada organismo viable. El principal ponentes de las bacterias cuya sínte-
problema de este método es que no sis es proporcional a Ia tasa de creci- 3.1.4. Lípidos
todas las bacterias presentes en una miento. Mientras que las concentra- Los lípidos son un componente
muestra pueden crecer en el medio y ciones de ARN varían considerable- fundamental de las membranas ce-
las condiciones de cultivo seleccio- mente con el estado fisiológico ce- lulares. Su determinación para la es-
nado. Suelen ser, por tanto, métodos lular, la cantidad de ADN es relati- timación de la biomasa de una po-
infraestimativos y estadísticamente vamente más constante. blación bacteriana ofrece muchas
cuestionables (I .azarova y Manem, La cantidad de ADN se determi- ventajas sobre otros métodos. La
r99s). na mediante espectrofotometría, principal ventaja es su alto conteni-
tras su extracción y purificación. do específico y que se encuentran en
3. Méfodos indirectos de Existen diversas técnicas, si bien cantidades relativamente constan-
determinqción de lo presentan la desventaja de que los tes. Otra ventaja muy importante es
biomqsq procedimientos de purificación son que los lípidos no forman parte de
E,stos métodos se basan funda- complejos, con diversas interferen- las reservas ceiulares y se degradan
mentalmente en la determinación cias y bastante costosos. rápidamente durante la lisis bacte-
de algún componente celular espe- riana. Aproximadamente, entre un
cífico, en la cuantificación de algu- 3.1 .2. Proteínas 90-98Vo de los lípidos de las mem-
na actividad enzimática (métodos Existen varias técnicas para el branas celulares está en forma de
bioquímicos) o en la medida de análisis de proteínas totales de una fosfolípidos (Lazarova y Manem,
consumo de sustrato o de la forma- muestra biológica. Algunos están 1 995).
ción de algún producto (métodos muy extendidos y se caracterizan Las técnicas de análisis se basan,
cinéticos). También se incluyen en por su sensibilidad, rapidez y sim- fundamentalmente, en la extracción
este apartado algunos métodos fisi- plicidad. Es el caso de las técnicas celular de los fosfolípidos con un di-
coquímicos. de Lowry et al. ( 195 1 ) y Bradford solvente orgánico, su posterior hi-
Los métodos bioquímicos y ciné- (1916). drólisis ácida para liberar el fosfato
ticos determinan, más que la viabili- La principal desventaja de la de- y, por último, 1a determinación co-
dad de las bacterias la actividad ya terminación de proteínas es que su lorimétrica de éste. Son técnicas re-
que dependen más del estado meta- cantidad en las células está sujeta a lativamente sencillas, reproducibles
bólico de los microorganismos que fuertes variaciones debido, funda- y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fos-
de1 número de individuos. mentalmente, a cambios en las con- fato; Findlay et al., 1989).
diciones fisicoquímicas y al estado
3. l. Componenles celulares fisiológico celular. 3.1.5. Trifosfato de
específicos adenosina o ATP
Cualquier componente celular 3.1 .3. Polisacárídos El ATP presenta las ventajas de
seleccionado para 1a estimación de La mayoría de ias células proca- ser un componente bioquímico cen-
la biomasa viva de una muestra de- riotas contienen ácido murámico tral presente en todos los microor-
be responder a tres criterios filnda- (un peptidoglicano) como compo- ganismos y específico de los micro-
mentales: nente de la pared celular. E,xisten organismos vivos, circunstancias
O o Estar presente únicamente en cé- varias técnicas para 1a determina- ambas que permiten relacionarlo
O lulas vivas. ción del ácido murámico en mues- con la biomasa viva.
C\l
o Ser rápidarrente degradado lras que conlengan microorganis- Una de las técnicas más utiliza-
U cuando las células mueran. mos. Todas ellas se basan en la con- das para medir ATP se basa en la re-
M
CO ¡ Ser relativamente constante el.l versión del ácido murámico a lac- acción luciferina-luciferasa, proce-
l
F- concentración respecto a c¿1u.1- tato, segLrida del análisis enzrmáÍi- so responsable de la luz emitida por
bios en ei estado fisiológico celu- co o químico de la concentración las luciérnagas y qlle ha sido am-
lal y entle distintas especies. de lactato. El ácido murámico se pliamente estudiado. En este meca-
LO
Hasta el nromento, no exi\tc nrn- extrae de 1as células mediante una nismo de luminiscencia se sabe que
O
C\ gún componente celular que cunpla hidró1isis aicalina y se purifica intervienen luciferina (fenol hetero-
w estos tres requerimientos" Sin en- posteriormente mediante cromato- cíclico, LH2), luciferasa (enzima,
E), ATP, cationes de n-iagnesio y
rug bargo, los ntás adecuados para esti- grafía de intercambio iónico. Otros
-
:" ,i
#
Por cada molécula
i :3--i* I r .f
.- de luciferina oxtdada
se emtte un cuanto
q &i
Io conversión enzimática la fluores-
ceína. La fluoresceína puede ser vi-
orígeno en un proceso de oxidorre- aumentar las de ADP y AMP (Uh- sualizada como un proclucto intra-
clLrcción que ocurre en doble etapa: linder y White, 1983). celular mediante el en-rpleo de la
rrricroscopía de epi lluorescencia o
lH
""j +\TP:tr ---_>
+ E-LH,-AMP + PPi (1) cuanti ficada mediante espectrofo-
E,-LH,-AMP+O, _- _____-_--> L + H,O + bioluminiscenciu (2) tometría tras ser extraída con disol-
ventes orgánicos.
Ya que por cada molécr¡la de lu- 3,2. Métodos bioquímicos EI principio en el que se basa la
cil'erina oxidada se emite un cuanto Las medidas de alguna actividad técnic¿r del FDA es en el car¿'rcter hi-
cle 1r-rz, la detenninación del ATP en enzimática pueden considerarse co- drofóbico del diacetato de lluores-
biológica puede hacer-
Llnx mLrestra mo una alternativa a los métodos ceína, lo que le permite penetrar a
se mediante extracción por ebulli- tradicionales. Los ensayos enzimá- través de la brcapa lipídica que for-
ción en tampón Tris (hipocloruro de ticos son sirnples de realizar y sus ma la membrana celular. Una vez en
tr'i s-hi droximetil-aminoetano) del resultados se obtienen rápidamente. el interior celulal', es convertido me-
ATP, incubación con lr,rciferina-lu- Adcm¿is. el equiparniento lrecesiu'io diante la actividad esterasa en fluo-
cif'crasa y posteriol medida de la luz no es ni costoso ni complejo. La ma- resceína, mo1écula de carácter hi-
pt'oducida en un fotómetro con re- yoría de las medidas de actividad drofílico que puede ser almacenada
gistro. enzimática se realiza mediante 1a intracelul¿irmente dada 1a baja per-
I-a mayor desventaja de esta téc- convelsión de sustratos específicos neabilidad de la membrana a ésta.
uica es 1a necesidad de procesar 1a a productos coloreados que son Ya que las células muertas se carac-
ttlue stra con rapidez, ya que el estado cuanti ficados fotométricamente. terizan por presentar abundantes
fisiológico de las célLrlas cambia r¿'r- La principal desventaja de los orificios en sus r.nembranas, el FDA
pidantente tras la toma de muestra. métodos bioquímicos es la varia- sólo tefiirí célulls vivas.
La lelación entre el ATP, el ADP ción de las actividades enzimáticas El FDA se ha empleado princi-
Y el AMP y el contenido total de de- celulares con los cambios fisiológi- palnentc en la determinación de la
sox i n'ibonucleótidos lefleja la carga cos y qlre, una vez que ios microor- actividad de hongos y bacterias en
ene r-uética de las células [(ATP + 0,5 ganisrnos rllueren, ]as enzimas libe- mllestras de suelos. Sin embargo, se
ADP)/(AMP + ADp + ATp)1. Esta radas pueden seguir actirras. Entre ha encontrado que no todas las espe- O
relacitin puede duplicalse en sólo las distintas medicl¿ts de actividad cies plesentes en el suelo son sensi- O
O
ttnos segundos. Aigur-ros autores sLl- C\
enzimática cabe destacar l¿i activi- bles a esta técnica, ya sea porcllte el
gielcn que la carga energética es un cl¿rd esterasa y 1a actrvidad deshidlo- FDA no penetra adecuadamettte en U
M
t'alor ntucho ntás preciso qLre el genasa. las células o porqLle no es bien rete- CO
conte nido absolr-rto de ATP ya que la l
nido. Tratanclo de ntinin-rizat estos t-
contposición celular de desoxir.ribu- 3.2.1 Actividad esterasa problemas, en el campo de la ePi-
nttclctiticlos varía con el estado fi- El diacetato cle I'luoresceín¿t lluorescencia se han utilizado deli-
siolrir ieo cle los nlicloolglrnisrlo.: (FDA) es uu courpllesto que puede vados clel FDA como el diacetato clc r)
O
duriurte e l cr.ecimiento tlacteriano el ser hiclr'oliz¿ido por enzimas tales 6-calboxifluoresceína (CFDA) y el C\
pool energético clisrlinuye, al clis- coJro proteasas. lipasas y ester¿I- diacetato de -5- (y 6-) strlfofluores-
mlnLrir la conccntración de ATp y sas, sienclo e1 producto cle dicha ceína (SFDA). este últitro Inencio- ffiffi
ffi
1'I.]CNOI-OGIA DEI- AGUA
ARTTCUTOS TECzuTCOS
3,2.2. Activídad
deshidrogendscl (DHA)
En una muestra biológica, la de-
terminación de 1a actividad del sis-
tema de transporte electrónico pue-
de realizarse por medida de la acti-
vidad deshidrogenasa. Todos los
microorgani smos aerobios poseen
un sistema de transporte de electro-
nes activo, en el que el más impor-
tante aceptor terminal de electrones
es el oxígeno. En la corriente princi-
pal de este transporte electrónico
Figuro 1.3 Visión ol microscopio ópiico {I OOOx) de uno muestro de fongo octivo trotodo según el protocolo de lo
participan, entre otras, las deshidro- INT-deshidrogenoso.
genasas piridín-dependientes que
necesitan NAD o NADP como co-
enzima y las deshidrogenasas fla- la cuantificación de la actividad res- metabolizanlama-
tes en la muestra
vín-dependientes que contienen fl a- piratoria de la muestra. teria orgánica con 1a consecuente
vín-adenín-dinucleótido (FAD) ó El TTC presenta el inconvenien- disminución del nivel de oxígeno,
flavín mononucleótido (FMN) co- te de su elevada sensibilidad al oxí- que es consumido, y el aumento de
mo grupo prostético. Las deshidro- geno (Chung y Neethling, 1989). El la concentración de CO' que es pro-
genasas son enzimas de oxido-re- INT no tiene esta limitación y su uso ducido. El dióxido de carbono es ad-
ducción que participan en el trans- está cada vez más extendido. Sin sorbido en una solución de potasa,
porte de electrones desde un sustra- embargo, su precisión y correlación por lo que la disminución de la pre-
to orgánico a un aceptor final de con la cantidad de biomasa viva no sión en este sistema cerrado es debi-
electrones mediante la transferencia está suficientemente demostrada da al volumen de oxígeno consumi-
de hidrógeno. La determinación de (Singh etal.,1994). do por los microorganismos, lo cual
la actividad deshidrogenasa pttede puede ser medido mediante un sen-
hacerse midiendo la capacidad de 3,3. ffétodos cínéticos sor de presión y registrado. La re-
los microorganismos para reducir La base de estos métodos es la presentación en el tiempo del oxíge-
un indicador o colorante redox. En- medida del consumo de sustrato o no disuelto (mg.l ') informa del
tre estos colorantes se encLtentran de la formación de producto en en- consumo de oxígeno, siendo la pen-
sales de tetrazolio tales como el clo- sayos en discontinuo. El ejemplo diente de la recta de ajuste óptimo la
mro de 2,3,5-trifeniltetrazolio más típico en microorganismos ae- tasa de consumo de oxígeno (OUR)
(TTC) o el cloruro de 2-(p-iodofe- robios es la determinación de la en mg O' l-r.h-1.
ni l) -3- trofenil )-5 -f'enil tetrazo-
(p -n i DBO, que indica la biodegradabili- Una adaptación del respirómetro
lio (lNT). Ambas se caracterizan dad de un sustrato en disolución a de Warburg para medir el biogás
por ser soh-rbles en agua en su forma través del consumo de oxíseno del producido en procesos anaerobios
oxidada y por formar depósitos ce- medio. puede encontrarse en James et al.
I ulares insolubles de TTC-fonnazán ( 1 ee0).
La respiración
endógena es
directamente
=t =.
. .:¡,,:: proporcional a la
.
concentración de
.
microorganismos
b---
Arargfrait*s Tg€N¡CQ5
O
O
c\
CO
mL.* tpss pRsmssrff F{nusrRHffi$
::)
27 .0OO eiemplares d istri bu idos gratu¡tamente
o '
eritre el sector industiial
v)
O
C\
ffi
EPI Control OJD ' Distribución nominqtivo
Solicite información y un eiemplar de muestra
Elsevier lnformación Profesional, S.A.
Entenca,2B Entlo. - 08015 Barcelona -f el.:292 4638