PROCARIOTAS

 El DNA dúplex se replica por una progresiva separación

de las dos hebras paternas, acompañado de una síntesis
de sus hebras complementarias, dando lugar, de forma
semiconservadora, a dos hebras hijas de doble hélice .
 El punto de separación de las dos hebras donde la síntesis
tiene lugaar ha recibido el nombre de ojo de replicación,
y termina en dos puntos extremos que se denominan
horquillas de replicación,
 Los estudios mediante autorradiografías han demostrado
que la replicación es siempre bidireccional.
 Además, dichos experimentos, junto con algunas
evidencias genéticas, han establecido que el DNA
procariótico y el de los bacteriófagos sólo poseen un
único origen de replicación (punto donde se inicia la
síntesis del DNA).
REPLICACIÓN EN PROCARIOTES
 La replicación del DNA es un proceso complejo en el que intervienen gran
variedad de enzimas y otras proteínas:
1. Proteínas iniciadoras. Se fijan al punto de origen y separan las dos hebras del
DNA para iniciar la replicación
2. DNA Helicasa. Desenrolla el DNA en las horquillas de replicación
3. SSP. Proteínas que se fijan a la hebra sencilla de DNA e impiden la nueva
unión de las hebras antes de su replicación
4. DNA Girasa. Se desplaza delante de la horquilla de replicación y actúa como
topoisomerasa para liberar el estrés giratorio creado sobre la doble hélice de
DNA por el avance del desenrollamiento necesario para la replicación
5. DNA Primasa. Sintetiza una cadena corta de RNA para que actuara como
cebador (primer) para iniciar la actividad de la polimerasa
6. DNA Polimerasa III. Sintetiza la nueva cadena de DNA a partir del extremo 3’-
OH provisto por el cebador
7. DNA Polimerasa I. Elimina los cebadores de RNA y los remplaza con DNA
8. DNA Ligasa. Enzima que une covalentemente los fragmentos de Okazaki
contiguos sellando los rompimientos dejados en la cadena de nucleótidos.
Proteínas Requeridas para la
Replicación de DNA en E. coli
 Proteína DnaA: Factor de iniciación
 Proteína DnaB: Helicasa 5' → 3' (fusión del DNA)
 Proteína DnaC: Chaperona de la DnaB
 HU: Proteína tipo histona (de unión al DNA)
 PriA: Ensamble del Primosoma, Helicasa 3' → 5'
 PriB: Ensamble del Primosoma
 PriC: Ensamble del Primosoma
 DnaT: Asiste durante la liberación de la DnaC
 Proteína DnaG: Primasa, Síntesis del cebador de RNA
 SSB: Proteínas de unión al DNA de hebra simple
 DNA girasa (Topoisomerasa II): Desenrollamiento del DNA
 DNA polimerasa III: Síntesis de DNA. Holoenzima de elongación
 DNA polimerasa I: Elimina el cebador de RNA, rellena espacios con
DNA
 DNA ligasa: Une covalentemente los fragmentos de Okazaki
 Tus: Terminación
Iniciación de la Replicación en
Procariotes
 La replicación del DNA es un proceso complejo en el que
intervienen por lo menos nueve diferentes proteínas.
1. Proteína DnaA, reconoce la secuencia de origen, promueve la
separación inicial de la doble hélice
2. Proteína DnaB, Helicasa, desenrolla las dos hebras del DNA
3. Proteína DnaC, requerida para la unión de DnaB en el origen
4. HU, proteína tipo histona que facilita el inicio
5. Primasa (Proteína DnaG), sintetiza el cebador de RNA
6. SSB, proteínas de unión al DNA que impiden re-apareamiento
de las hebras antes de su replicación,
7. RNA Polimerasa, facilita la actividad de la DnaA
8. DNA girasa, Topoisomerasa II, libera la tensión torsional
9. Dam metilasa, metila C en las secuencias 5’-GATC del oriC
Complejo de Pre-replicación
 El Complejo de Pre-replicación (pre-RC) es un complejo
proteico que se estructura en el punto de origen de la
replicación (Ori) durante la fase de inciación de la
replicación del DNA.
 Las proteínas involucradas en la formación del pre-RC son
indispensables para que el proceso de replicación se
realice adecuadamente.
 En los procariotes, el pre-RC esta compuesto de los
siguientes factores :
 Un factor de iniciación de la replicación, tal como la proteína
llamada dnaA
 Una Helicasa y sus cofactores, tales como la dnaB y la dnaC
 Una Primasa, tal como dnaG, la cual genera el cebador de RNA
que requiere la Polimerasa para funcionar en la replicación del
DNA.
 Una holoenzima de la RNA Polimerasa, la cual es en realidad un
complejo enzimático que realiza efectivamente la replicación.
 La necesidad de desenrollar la hebra paterna del
DNA en la horquilla de replicación produce grandes
problemas a nivel topológico.
 Sin embargo, en organismos procarióticos, los
superenrollamientos negativos en el DNA , que
serían indispensables para evitar el super-
enrollamiento que sería inhibitorio de la replicación
de la molécula de DNA, se pueden realizar por la
acción de una topoisomerasa del Tipo II (DNA
girasa) a expensas de la hidrólisis de ATP.
 Este proceso es esencial en la replicación del DNA
procariótico, como lo demuestra la detención de la
replicación del DNA en presencia de inhibidores de
la DNA girasa.
 Uno de los requerimientos casi universales para todas las DNA
polimerasas es el extender la hebra de DNA a partir de un
extremo 3'-OH libre.
 Como consecuencia de este hecho, se ha observado que los
fragmentos de Okazaki poseen en sus extremos 5' segmentos de
RNA de 1 a 60 nucleótidos (esta longitud varía según la especie),
que son complementarios a la hebra de DNA molde y que han
funcionado como cebadores para el inicio de la actividad de la
DNA polimerasa.
 E. coli posee dos enzimas que catalizan la formación de estos
cebadores de RNA: la RNA polimerasa, la enzima que media la
transcripción, y otra de menor tamaño, la primasa (60 kD), que es
el producto monomérico del gene denominado dnaG.
 El DNA ya replicado, maduro, no contiene ningún fragmento de
RNA. Los cebadores de RNA se eliminan durante el proceso de la
replicación y los huecos monohebra que dejan son llenados con
DNA.
 El inicio de la replicación esta afectado por la metilación del DNA y por
interacciones con la membrana plasmática bacteriana. El DNA de oriC es
metilado por la metilasa Dam, que metila la adenina en el N6 dentro del
palíndrome 5’-GATC.
 La región oriC de E. coli está enriquecida en este tipo de secuencias GATC:
tiene 11 en sus 245 pares de bases.
 Inmediatamente después de la replicación el DNA es semimetilado: las hebras
parentales tienen las secuencias oriC metiladas, mientras que las hebras de
nueva síntesis no las tienen.
 Las secuencias oriC semimetiladas son secuestradas a traves de una
interacción con la membrana plasmática, que se produce a través de un
mecanismo todavía desconocido.
 Al cabo de un tiempo, oriC es liberado de la membrana plasmática y debe ser
metilado nuevamente de manera completa antes de que pueda unirse otra
vez a la proteína DnaA
• Molde de DNA preexistente
• Cebador (“primer”)
– Pequeño fragmento de RNA (>5 nucleótidos) con el grupo 3’-OH libre,
unido al DNA molde (sintetizado por la primasa del primosoma)
• Precursores activados – Los cuatro Desoxiribonucleótidos 5’-
trifosfato
• DNA-polimerasas
– Catalizan la formación de enlaces fosfodiéster dirigida por un molde de
DNA (actividad polimerasa 5’ → 3’) y la corrección de errores
(exonucleasa 3 → 5’)
– Requieren Mg2+ y un cebador con su extremo 3’-OH libre
– Tres tipos en E. coli:
• DNA polimerasa I (Pol I): Elimina el cebador mediante una actividad
exonucleasa 5’ - 3’ y sintetiza DNA en su lugar
• DNA polimerasa II (Pol II): Función desconocida (quizá similar a la Pol I)
• DNA polimerasa III (Pol III): Síntesis de la nueva cadena de DNA a partir del
cebador
 DNA polimerasas en E. coli
 Las principales ADN polimerasas en E. coli son las DNA Pol I, DNA Pol II y
DNA Pol III, y cada una de ellas está especializada en diversas funciones
según cuál sea su papel en la replicación.
 la DNA Pol I, que es poco procesiva (añade entre 20 y 100 nucleótidos por
acontecimiento de unión), es la encargada de la eliminación de los cebadores y el
"relleno" del espacio que dejan con DNA (actividad exonucleasa 5' → 3' y actividad
polimerasa 5' → 3').
 La DNA Pol II está encargada de la reparación de DNA (actividades polimerasa 5' → 3' y
exonucleasa 3' → 5'),
 la DNA Pol III que es muy procesiva es la principal encargada de la elongación del DNA
(actividad polimerasa 5' → 3') durante la cual también puede realizar tareas de
corrección (actividad exonucleasa 3' → 5').
 Las DNA polimerasas pueden añadir hasta 1000 nucleótidos por segundo.
Esto es debido a su naturaleza procesiva, es decir, el número de nucleótidos
que las polimerasas son capaces de añadir cada vez que se asocian al molde
de DNA que van a copiar. Dado que la adición de los nucleótidos es un
proceso que dura unos milisegundos, la velocidad de catálisis va a depender
del tiempo que la DNA polimerasa permanece unida al ADN, esto es, de su
procesividad.
 Además de su actividad polimerasa, la Pol I tiene dos actividades
hidrolíticas independientes:
◦ 1. Puede actuar como exonucleasa 3' - 5'.
◦ 2. Puede actuar como exonucleasa 5' - 3'.
 La reacción exonucleasa 3' - 5' difiere químicamente de la reacción de
pirofosforolisis sólo en que el aceptar de nucleótidos es el H20 en lugar
del PPi. Esto es ventajoso, porque la concentración de pirofosfato
intracelular es prácticamente nula.
 La función exonucleasa 3' - 5' es activada por un nucleótido terminal en
3', desapareado, con un grupo OH libre.
 Cuando la Pol I incorpora, por error, un nucleótido equivocado
(desapareado) en el extremo de la hebra de DNA que está creciendo, la
actividad polimerasa se inhibe y la actividad exonucleasa 3' - 5' elimina
el nucleótido erróneo.
 A continuación, la actividad polimerasa reanuda la replicación del DNA.
 De esta manera la Pol I tiene la capacidad de releer la hebra de DNA que
está sintetizando y corregir sus propios errores.
 La actividad de exonucleasa 5‘- 3' también elimina los cebadores de
RNA de los extremos 5' y rellena los huecos resultantes con DNA
sintetizado de nuevo. Esta parece ser la actividad real en que participa la
Pol I.
En las bacterias existe un solo origen de replicación, denominado Ori C, y
a partir de este único punto de origen, la replicación progresa en dos
direcciones, de manera que existen dos puntos de crecimiento (PC) u
Horquillas de Replicación. Entre ellas se encuentra la Burbuja de
Replicación en donde queda comprendida toda la maquinaria que realiza
la replicación del DNA en los dos puntos de crecimiento.
El cromosoma bacteriano se denomina Replicón, por ser sólo una unidad
de replicación.
La replicación en bacterias se ajusta al modelo semiconservador.
Iniciación en Procariotes
 El genoma de E. coli está contenido en una sóla molécula circular
de DNA formada por 4.6 x 106 pares de nucleótidos.
 La replicación del DNA se inicia en un solo lugar, el origen de
replicación. En E. coli, este sitio es conocido como oriC.
 Se conoce como el origen mínimo de replicación, la secuencia de
DNA más corta que puede cumplir eficientemente esta función.
 Se trata de una secuencia de 245 pb, muy conservada entre las
enterobacterias y que contiene 3 regiones características:
 1. Cuatro copias de la secuencia 5' -TTAT(C/A)CA(C/A)C-3’, 2 en un
sentido y otras 2 en sentido contrario en posiciones muy conservadas,
designadas Rl a R4, que sirven para la unión de la proteína DnaA.
 2.Tres zonas de 13 nucleótidos, cada una rica en pares AT (5 '-
GATCTNTTNTTTC-3' ), se localizan a la izquierda de las anteriores y
favorecen la desnaturalización local del ADN. N representa a cualquier
nucleótido.
 3. Once copias de la secuencia 5 -GATC3', que es el sitio de
reconocimiento de la metilasa codificada por el gen dam. La Dam metilasa
reconoce esta secuencia y metila la citosina. Al parecer el grado de
metilación es importante para la unión del DNA a la membrana de la
bacteria.
 En las bacterias existe un solo origen de
replicación, denominado Ori C, y a partir
de este único punto de origen, la
El origen de replicación en
replicación progresa en dos direcciones,
E. coli tiene 245 pb de de manera que existen dos puntos de
longitud, tres secuencias crecimiento (PC) u horquillas de
casi idénticas repetidas en
tándem y cuatro lugares replicación. El cromosoma bacteriano se
de unión para la proteína denomina replicón, por ser una unidad
Dna A
de replicación. La replicación en
bacterias se ajusta al modelo
semiconservador.
El Ori C, origen de replicación, en E. coli es una secuencia de 245 pb que contiene una
secuencia de 13 pb, GATCTNTTNTTT, repetida tres veces en tándem. Además, esta
región contiene cuatro zonas de unión (consenso TTATCCACA) para la proteína DnaA,
que se encarga de separar las hebras del DNA para comenzar la replicación.
Iniciación en Procariotes
 Los eventos que ocurren en oriC tienen el orden siguiente: la proteína DnaA
se une secuencialmente a las secuencias de 9 nucleótidos R1-R4, de
manera que al oriC pueden quedar unidas de 10 a 20 moléculas de DnaA.
 Este proceso requiere la hidrólisis del ATP y provoca dobleces de hasta 90°
en el ADN. De esta forma, el ADN se enrolla alrededor del multímero de
DnaA provocando la separación de las 2 cadenas en la zona de 13
nucleótidos ricos en AT que se abren de manera secuencial, primero, la más
cercana a R1 y después las otras.
 En esas condiciones DnaA guía la translocación, hacia la zona abierta, de
un complejo formado por DnaB y DnaC, formando el llamado complejo de
preiniciación.
 En presencia de la ADN girasa (topoisomerasa II) y de SSB, la DnaB que
posee actividad de helicasa 5' → 3' procede a alargar la abertura del ADN,
para lo cual requiere la hidrólisis del ATP.
 De esta manera queda formada una estructura en forma de burbuja u ojal,
donde las hebras sencillas de DNA molde están recubiertas por SSB.
 Los extremos del ojal forman las horquillas de replicación; en cada una de
las horquillas se inicia la replicación de las dos hebras del DNA, y, como en
la medida que avanza el proceso las horquillas se van separando, la
replicación toma carácter bidireccional
Replisoma
 Una vez iniciada la replicación
bidireccional en el origen, los dos
replisomas se mantienen unidos y
anclados en un punto de la membrana
interna de la bacteria, y el DNA sustrato
es alimentado a través de esta factoría
replicativa, cuyo conjunto ha sido muy
adecuadamente llamado Replisoma.
 El punto de anclaje se encuentra en el
centro de la alargada célula bacteriana.
mers son las frecuencias repetidas de 13 pb
(repetidas 3 veces) y de 9 pb (repetidas 4 veces)
que forman el sitio de iniciación (OriC) para la
replicación de DNA

Copias múltiples (20-40) de la proteína DnaA se fijan en los mers-9 del sitio de
origen e inician la fusión (separación de las cadenas del DNA) en los segmentos
13-mers. La proteína DnaC acarrea a la proteína DnaB (proteína hexamérica con
actividad de helicasa) para que se fije en cada una de las cadenas separadas del
DNA en el oriC, formando el complejo de pre-iniciación. La actividad de Helicasa de
las moléculas de la DnaB desenrollan el DNA en direcciones opuestas, formando
las dos horquillas de replicación.
 Modelo del inicio de la replicación
en el origen, oriC, de E. coli.

(1) Alrededor de 20 moléculas de la proteína

DnaA, cada una de ellas con un ATP ligado, se
unen secuencialmente a las cuatro
repeticiones de 9 pares de bases. El DNA se
enrolla alrededor de este complejo.

(2) Las tres repeticiones de 13 pares de bases

ricas en A-T se desnaturalizan poco a poco
de forma secuencial e inician la fusión del
DNA. En ello participa la proteína, tipo histona,
HU

(3) Hexámeros de proteína DnaB (Helicasa) se

unen a cada hebra con ayuda de la proteína
DnaC y de la hidrólisis de ATP. La actividad de
Helicasa de la DnaB desenrolla aún más el DNA
y forma las horquillas de replicación como
preparación para el cebado y la síntesis de
DNA.
Modelo de Replicación en E. coli
 DNA Pol III
• A diferencia de lo que ocurre con la DNA Pol I, que sólo
debe añadir unos 5-10 nucleótidos de los lugares en
que se ha eliminado el cebador, es importante que la
DNA Pol III sí sea muy procesiva, y por esa razón suele
formar parte de un complejo denominado holoenzima
DNA Pol III que le da una mayor procesividad.
• Este complejo consta de diversas subunidades
polipeptídicas encargadas cada una de una función, y
que constituyen en su conjunto un dímero asimétrico:
una mitad se encarga de la síntesis de la hebra
adelantada y la otra mitad de la hebra rezagada.
 HOLOENZIMA DNA
POL III
El centro catalítico lo componen las
subunidades α que corresponden a
dos copias de la DNA Pol III, la
subunidad ε con actividad
correctora exonucleasa 3' → 5' y la
subunidad θ cuya función podría ser
la de ensamblar las otras dos; las
subunidades τ mantienen la
estructura dimérica; el complejo γ lo
conforman las subunidades γ y δ
cuya función es la de aumentar la
procesividad de la DNA Pol III; la
subunidad β (abrazadera) sujeta la
DNA Pol III al DNA y aumenta
notablemente su procesividad.
El DNA molde y el DNA sintetizado en la
cadena retrasada deben sufrir un
plegamiento, de tal forma que la DNA
polimerasa de las cadenas conductora y
retrasada, en los procariotes, puedan
funcionar como un complejo dimérico.

De este modo las proteínas de replicación

pueden utilizarse de manera armónica en
la replicación de ambas cadenas.

Las topoisomerasas mantienen esta

estructura y evitan que el DNA se
superenrolle por delante de la horquilla
de replicación.

Además, existen unas proteínas llamadas

proteínas de unión al DNA de hebra
sencilla (SSB), que se fijan a la hebra de
DNA; de esta manera protegen y
estabilizan la forma monocatenaria de la
hebra en replicación, para que no se
acople por complementariedad de bases
con ella misma.
 Selectividad de estructura. La fijación de un desoxinucleótido
trifosfato (dNTP) a la polimerasa induce un cambio en la conformación
de la enzima que genera una estrecha bolsa donde cabrá estrechamente
el nuevo par de bases constituido por la nueva base y su base
correspondiente en el molde de DNA.
 Tal modificación conformacional sólo es posible cuando el dNTP entrante
puede formar un par de bases tipo Watson-Crick con su correspondiente
base en el molde de DNA. Este mecanismo asegura la exactitud de la
replicación.
 Lectura de pruebas. La cadena creciente de polinucleótidos abandona
ocasionalmente el sitio activo de Polimerasa y migra al sitio con
actividad de Exonucleasa. En dicho sitio, el último nucleótido agregado
es suprimido por hidrólisis. Debido a que las bases mal apareadas
inducen este traslado del sitio de polimerasa al sitio de exonucleasa, este
proceso funciona como una manera, muy adecuada, de proveer una
prueba de la exactitud de la secuencia de bases del DNA que esta siendo
sintetizado.
 (a) El replisoma del DNA de E. coli, contiene dos holoenzimas
de la Pol III, y sintetiza tanto la hebra conductora como la hebra
retrasada. El molde de la hebra retrasada debe formar un lazo
para permitir que la holoenzima extienda la hebra retrasada,
iniciada por el primosoma.

(b) La holoenzima Pol III libera el molde de la

hebra retrasada cuando se encuentra con el
fragmento de Okazaki previamente sintetizado.
Ello probablemente sirve de señal para que el
primosoma inicie la síntesis de un nuevo RNA
cebador para la hebra retrasada.

(c) La holoenzima Pol III se une de nuevo al molde

de la hebra retrasada y extiende el RNA cebador,
formando un nuevo fragmento de Okazaki.
Obsérvese que, en este modelo, la síntesis de la
hebra conductora está siempre más avanzada que
la de la hebra retrasada
La Helicasa rompe los puentes de hidrógeno de la doble hélice permitiendo el avance de la horquilla de
replicación.
La DNA Girasa (Topoisomerasa) impide que el ADN se enrede debido al superenrollamiento producido
por la separación de la doble hélice.
Las proteínas SSB se unen la hebra discontínua de ADN, impidiendo que ésta se una consigo misma.
La DNA Polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de
forma discontínua en la hebra rezagada.
La Primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la síntesis de la cadena complementaria a la
cadena rezagada, junto con la Helicasa forma el Primosoma.
La DNA Ligasa une los fragmentos de Okazaki.
En procariotes, la síntesis de las dos
cadenas, conductora y retrasada, se
encuentra coordinada, existiendo un
replisoma que contiene un dímero activo
formado por dos moléculas de DNA pol III
DNA Replicación. Alargamiento

 El DNA de doble cadena en la horquilla de replicación es desenrollado

por la actividad de la Helicasa (generalmente la proteína DnaB)
 La Topoisomerasa, DNA girasa, utiliza la hidrólisis del ATP para producir
un desenrollamiento negativo del DNA justamente adelante de la
horquilla, lo cual alivia el torque creado por la replicación.
 Puesto que la cadena retrasada forma un asa antes de entrar al sitio
activo de la Polimerasa III, tanto la cadena retrasada, como la
conductora se mueven en la misma dirección. Según la Helicasa
progresa, se debe sintetizar un nuevo cebador en la cadena retrasada.
 Cuando se termina la síntesis de un fragmento de Okazaki, la
Polimerasa libera la cadena. En ese momento el Primosoma sintetiza
otro cebador y se inicia la sintesis de un nuevo fragmento de Okazaki.
 La Pol III se asocia nuevamente a la cadena retrasada justamente
después del nuevo cebador e inicia la síntesis de un nuevo fragmento de
Okazaki.
 La Pol I y la DNA Ligasa, suprimen el cebador y cierran los huecos entre
los segmentos de Okazaki.
Replicación. Finalización.
 La replicación termina cuando la horquilla de replicación
encuentra el extremo de la otra horquilla de replicación que ha
progresado en el cromosoma circular. Esto sucede en una región
llamada ter (t) de terminación.
 La Región ter está compuesta de dos secuencias de 20 pares de
bases, invertida una con respecto a la otra y separadas entre sí
por un segmento de unas 20 pares de bases.
 Cada una de las secuencias ter impide la progresión de la
horquilla de replicación que progresa en sentido contrario cuando
una proteína de 36 kD, llamada de unión a ter (Tus), está ya fijada
en esta región del cromosoma. Este mecanismo asegura que el
cromosoma sea replicado en su totalidad sin sobrereplicación.
 La manera como se separan las dos hélices de DNA hijas no ha
podido ser determinada, aunque se supone que está involucrada
en el proceso la actividad de una Topoisomerasa IV