PRACTICA # 3

TINCIONES DIFERENCIAL DE GRAM Y TINCIONES SELECTIVAS

La tinción propuesta por el médico Danés Christian Gram en 1984, es una de las tinciones
diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de 24
horas en Gram positivas y Gram negativas. El fundamento radica en la diferente estructura
de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de
peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de
peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacárida externa. (ver figura N° 1).

Gram + Gram -

Peptidoglicano Peptidoglicano

Membrana plasmática Membrana plasmática

Espacio periplásmico
Lipopolisácarido y
proteína

Figura N° 1. Composición de la pared celular

Tras la tinción con el colorante primario (cristal violeta), se tiñe por igual a todas las
bacterias; pero la combinación con el colorante es más permanente en los Gram positivos.

Para establecer la diferencia entre estos dos grupos (ver figura Nº 2), se aplica un disolvente
del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen
firmemente; pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo
tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy difícil su observación
por lo que es preciso tratarlos con otro colorante, como la safranina. Este colorante no
modifica el color de los microorganismos que habían retenido el color primario; pero tiñe a
los microorganismos decolorados.

Figura Nº 2. Diferencia entre Gram negativas y Gram positivas

Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la composición
química y estructuras de las paredes celulares (capa de peptidoglicano), que facilitan la
retención o eliminación del colorante después del proceso de decoloración.

Otras tinciones que permiten mayor información son la negativa y la selectiva. La tinción
negativa facilita las observaciones de la morfología y tamaño de las bacterias sin alteración
por efecto del calor así, como de estructuras especiales, como la capsula de algunas especies
bacterianas. La capsula también llamada: Glicocálix es una estructura externa a la célula,
formada de polisacáridos o polipéptidos, que confiere de protección a las bacterias contra la
desecación y fagocitosis.

La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con
tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como las
capsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un fondo
oscuro.

Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas
de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localización son de
importante criterio para su clasificación taxonómica.

Además, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son
microorganismos patógenos de gran toxicidad, su detección en microbiología alimentaria y
médica adquiere gran interés.

OBJETIVOS

- Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas y Gram negativas de

acuerdo a la tinción de Gram.
- Comprender la importancia de las tinciones para la caracterización e
identificación de las bacterias.

MATERIALES

Probeta de 100 mL
Beacker de 100 mL
Mecheros bunsen
Microscopio compuesto
Portaobjetos
Cristal violeta
Safranina
Lugol
Alcohol-acetona
Tinta china
Fenol o metanol al 95%
Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

- Realización del frotis

1. Colocar una pequeña gota de solución salina en el centro de un portaobjetos limpio.

2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad
del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de solución salina.
Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea
que quede bastante extendida para facilitar su secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los
dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión
bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.
3. Esperar hasta que la suspensión se seque o se evapore.

- Fijación de las bacterias al portaobjetos

4. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar
enfriar el portaobjetos entre los pases. En este caso hay que tener mucha precaución
de no calentar demasiado el portaobjeto, pues las células pueden deformarse o
romperse.
5. Con metanol: Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca.
Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar
de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore
completamente.

Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al
microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.

- Tinción del frotis bacteriano (Tinción de Gram)

Método convencional

1. Fijar la preparación con calor.

2. Cubrir el frotis con cristal violeta por un minuto.
3. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza
inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de
manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él,
 pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la máxima cantidad de agua
de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la
mesa de trabajo. En ningún caso se debe frotar el portaobjeto.
4. Cubrir el frotis con lugol por 60 segundos.
5. Lavar la preparación como se menciono en el paso 2.
6. Cubrir con alcohol-acetona, hasta que se vea que sale el color pálido. No sobre
decolorar.
7. Lavar la preparación.
8. Cubrir con safranina por 30 segundos.
9. Lavar con agua de chorro y escurrir.
10. Dejar secar a temperatura ambiente.
11. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento, en este
caso utilizar el aceite de inmersión. (100X).

Método recomendado por la Sociedad Americana de Microbiología (ASM).

1. Fijar la preparación con metanol.

2. Cubrir el frotis con cristal violeta por 30 segundos.
3. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza
inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de
manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él,
pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la máxima cantidad de agua
de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la
mesa de trabajo. En ningún caso se debe frotar el portaobjeto.
4. Cubrir el frotis con lugol por 60 segundos.
5. Lavar la preparación como se menciono en el paso 2.
6. Cubrir con alcohol-acetona, hasta que se vea que sale el color pálido. No sobre
decolorar.
7. Lavar la preparación.
8. Cubrir con safranina por 60 segundos.
9. Lavar con agua de chorro y escurrir.
10. Dejar secar a temperatura ambiente.
11. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento, en este
caso utilizar el aceite de inmersión (100X).

PROCEDIMIENTO:

El docente proporcionará a los alumnos cultivos sólidos de: Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis.

El estudiante preparará los frotis de cada cultivo solido, para realizar la Tinción de Gram.

- Preparación del frotis. (Figura N° 2)

 1. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero, hasta que se ponga al
rojo vivo.
2. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean
destruidos.
3. Colocar una gota de solución salina en un portaobjetos, (previamente limpio con
alcohol- acetona).
4. Acercar la placa al mechero para tomar cuidadosamente una colonia y colocarla en la
gota de solución salina del portaobjeto, extenderla de forma circular.
5. Dejar secar a temperatura ambiente.
6. Preparar el frotis con los reactivos de Gram.

Figura 2. Preparación del frotis

- Grupo 1: Realizará la tinción de Gram con el método convencional. (Leer teoría

arriba descrita)
- Grupo 2: Realizará la tinción de Gram con el método recomendado por ASM. (Leer
teoría arriba descrita).

- Tinción negativa para observación de capsulas

a) Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto
una gota del cultivo liquido de Klebsiella sp. (Figura N°3). Si se trata de un cultivo solido,
hacer una suspensión del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar
cuidadosamente con la tinta china.

b) Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjetos perpendicular

en ángulo de 45° sobre la muestra.

c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa
fina de mezcla.

d) dejar secar al aire libre.

 Figura N° 3. Técnica de Tinción Negativa

- Observación al microscopio:

1. Limpiar los objetivos y el ocular del microscopio.

2. Colocar el portaobjeto en la platina y enfocar al microscopio, desde el primer objetivo

hasta el objetivo 100X. No olvidar que al enfocar con este objetivo, se le coloca una gota de
aceite de inmersión al cubreobjeto (encima de la preparación).

3. Escriba y dibuje lo que ha observado.

Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con el algodón para

eliminar el exceso de aceite.

- Resultados:

1. Reportar las observaciones del frotis (morfología, color).

Escherichia coli
Forma
 Clasificación

Staphylococcus aureus
Forma

Clasificación

Pseudomonas aeruginosa
Forma

Clasificación

Enterococcus faecalis
Forma

Clasificación
CUESTIONARIO

1. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros
ejemplos de tinción diferencial.

2. ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes de en la tinción de Gram?

3. Explique qué reacción de Gram darán los cultivos de levaduras?¿estos resultados

tendrán la misma importancia que para las bacterias?

4. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica ¿Qué tipo de

información se obtiene?