Malalties genètiques Tema 7 Aitana Clàudia Irene Irina

TEMA 7: ENFERMEDADES LIGADAS AL CROMOSOMA X. DMD.

Enfermedades ligadas al cromosoma X recesivas. Distrofia muscular de Duchenne. Identificación del gen.
Heterogenidad alélica y clínica. Distrofias musculares de Duchenne y de Becker. La proteína distrofina y el complejo
DPC. Diagnóstico molecular. Terapia.

LA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

Veremos los siguientes puntos en esta lección:
- Distrofina es el gen humano mas grande que se conoce (y en todos los organismos).
- Se producen deleciones génicas y hay una relación con la patología.
- Heterogenidad alélica y clínica.
- Deleciones y diagnóstico (PCR multiplex, MLPA).
- La distrofina y el complejo proteico del que forma parte en el sarcolemma
- Terapia

0. IMPORTANCIA
- Enfermedad grave, sin tratamiento
- Altamente prevalente
- El gen se aisló por clonación posicional. Fue el primero!
Eso permitió:
- Diagnóstico y consejo genético
- Estudio de la patofisiología
- Investigación sobre nuevas terapias
Clonación posicional quiere decir que no teniendo idea de cual era le gen responsable de la
patología lo identificaron gracias a identificar donde estaba y luego fueron a por él. Si no sabemos
cual es el gen responsable de la patología, como podemos buscar el gen responsable? Por
ligamiento, es decir, buscando dos marcadores en el cromosoma que flanqueen el gen. Para
hacer el análisis de ligamiento se necesitan familias grandes.

1. LA ENFERMEDAD
- Inicio antes de los 6 años
- Incapacidad para caminar o correr; caídas;
- Inestabilidad y caminar vacilante
- Las piernas y otros músculos aumentan de tamaño. Pseudo-hipertrofia
- Después harán el proceso inverso
- Los músculos de la cintura y de los hombros se debilitan desde el principio
- Los de las piernas y antebrazos lo hacen más tarde
- Los de la cara, manos y ojos suelen preservarse
- La muerte suele producirse en la adolescencia
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Malalties genètiques Tema 7 Aitana Clàudia Irene Irina

Más características clínicas:

- Retardo mental leve
- Creatina quinasa sérica elevada
- Algún tipo de problema cardíaco

2. PATRÓN DE HERENCIA
• Incidencia: 1/3500 nacimientos de varones
• Tasa de mutación: 10-4 (x10 respecto a otras enfermedades), debido al gran tamaño del gen.
• Ligada al X recesiva. Letal en varones
• Se calcula: 1/3 son mutaciones de novo, 2/3 tienen madres portadoras.
La frecuencia no varia en el tiempo sino que se mantiene. Si la mutación está en el hombre
no se transmite porque es una enfermedad en la que no hay característica biológica
suficientemente buena como para que el individuo enfermo tenga hijos, por lo tanto 1/3
genes desaparecen. Si la tasa de alelos mutados se mantiene constante, para compensar
el 1/3 de mutaciones que se pierden tienen que haber 1/3 de mutaciones que son de novo.

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Herencia ligada al X (sexo) recesiva:
Los genotipos que tenemos de herencia ligada al
sexo, son:
• Varones:
Si el único cromosoma X que tienen, tiene el gen
normal (verde, mayúscula) son sanos, y si tienen el
gen mutado (rojo, minúscula) son enfermos.
• Mujeres:
En el caso de las mujeres, las que tienen las dos copias sanas son sanas, las que tienen dos
copias mutadas son enfermas, aunque es poco frecuente que sean homozigotas enfermas. Las
que tienen una mutación en un cromosoma, en uno de los alelos, serán homozigotas sanas con
cierta variabilidad en el fenotipo.

Entonces, las mujeres portadoras, en su gran mayoría:

- No manifiestan sintomatología clínica a nivel de músculo esquelético.
- Algunas, un 8% presentan debilidad muscular significativa.
- El 70% tienen la Creatina Quinasa Sérica elevada, este es un marcador interesante.
- Desarrollan algún tipo de anomalía cardíaca.

Las mujeres enfermas:

La probabilidad de que tengan los dos alelos mutados es muy rara, entonces las mujeres
enfermas no suelen estarlo por tener las dos copias mutadas. Lo que suele ocurrir en las mujeres
enfermas es que tienen algún tipo de anomalía cromosómica diferente. Por ejemplo:

- Las mujeres con Síndrome de Turner, que es una cromosomopatía que consiste en tener solo 1
cromosoma X (cariotipo: 45, X) y son mujeres que son normales pero con algunos problemas
en la reproducción. Al tener solo 1 cromosoma X, si además de ser Turner este cromosoma
tiene el gen mutado de DMD, presenta al enfermedad.

- Otra posibilidad son algunas niñas con translocación X-autosoma en las que el punto de ruptura
está siempre en Xp21.2, que es la zona donde está el gen de la distrofina. Estas niñas, al tener
la translocación X-autosoma, se observa que se inactiva el X intacto y queda activo el X roto por
la translocación, con lo cual el X que queda activo es el X que tiene una rotura en medio del gen
de la distrofina y por tanto el gen de la distrofina no funciona y presentan la enfermedad. Por
que pensamos que el cromosoma que se inactiva es el X intacto y no el que tiene la rotura, por
que en todos los casos se ve que se inactiva el X intacto? Pensaríamos que es aleatorio, pero
esto no pasa, el problema es que si se inactiva el cromosoma roto habría un montón de genes
autosómicos que quedarían inactivados y quedarían con la mitad de la dosis, por tanto eso es
incompatible con la funcionalidad de la célula, por tanto no podría darse la situación en la que
se inactive el cromosoma roto. Esto en los casos que se ha visto, pero a lo mejor hay otros
casos en los que la translocación implique un trozo de cromosoma más pequeño que no impida
la movilidad, pero estas no serán Duchenne.

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Por tanto, como hemos dicho, la herencia ligada al X recesiva, tiene las siguientes características
generales:
- Incidencia muy superior en varones.
- Padre afecto transmite el alelo mutado a todas las hijas.
- Ellas lo transmiten a 1/2 de sus hijos varones.
- El alelo mutado nunca pasa de padre a hijo varón.
- El alelo mutado puede pasar por una serie de mujeres portadoras. Todos los varones afectos de
un pedigrí están emparentados a través de mujeres.
- Las mujeres heterozigotas suelen ser sanas pero pueden llegar a manifestar la patología en
grados variables de severidad.

Entonces, si DMD, es una patología ligada al X y recesiva, este pedigrí puede ser de DMD?

No puede ser DMD porque el individuo (padre) se habría muerto sin descendencia. Este pedigrí si
que es el pedigrí de una enfermedad ligada al X y recesiva, pero teniendo en cuenta como es la
historia natural de la enfermedad, en el caso de Duchenne este pedigrí no podría ser.

Un pedigrí de Duchenne podría ser este otro.

Es decir que no solo basta con saber como se transmite la herencia sino que también se tiene que
saber la situación de los individuos.

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3. EL GEN
El gen de la distrofina:
- Es posiblemente el gen más grande del genoma (el más grande de todos los genes de todas
las especies). Con la información que tenemos es el más grande, aunque probablemente no
sea así, pero si es seguro uno de los más grandes que existen.
- Abarca una región de 2,5 Megabases.
- Está distribuido en 79 exones.
- El cDNA tiene una longitud de 14 kb.
- La tasa de recombinación intragénica es muy elevada. Esto es simplemente por la longitud, hay
muchas zonas en la que puede haber entrecruzamiento y puede haber recombinación.
- La tasa de mutación también lo es, que también viene dada por la longitud que tiene, y además
puede haber un hotspot.
- Codifica una proteína muy grande denominada distrofina.

Es decir que es una enfermedad monogénica, codificada por un único gen, que es el de la
distrofina, el gen DMD.

Aquí tenemos el gen DMD, representado en el

Browser del Genoma, y vemos que tenemos varias
formas de representarlo, por que hay distintas
formas o versiones diferentes? Podría ser splincing
alternativo pero no lo es.
Lo que se ve es: los exones son las barras (y los
intrones son planos), y además los exones
codificantes son más grandes y los exones no
codificantes son mas pequeños. La transcripción
va de izquierda a derecha (al revés de lo que
pensaríamos, se ve en las flechitas que indican la dirección de la transcripción), por tanto lo que
estamos viendo aquí son promotores alternativos, esto es muy común y permite: a veces formar
isofomas distintas, ya que si tenemos otro promotor, todos los exones que hay delante de este
promotor no aparecerán en la proteína; o en algunos casos, aunque no hay diferencias en la zona
codificante, permite que haya zonas reguladoras distintas, entonces el gen se puede expresar en
distintos tejidos. (también hay un poco de splicing alternativo que se puede ver en la imagen, pero
lo importante son los promotores alternativos).

Clonación del gen responsable del gen responsable de la DMD:

Hacemos una exploración del gen de la distrofina. Ahora sabemos más cosas, pero vamos a
hablar de los años 80, en los que había que buscar el gen. Y una de las características de este
gen es que fue uno de los primeros que fue hallado por clonación posicional, es decir, primero
se identificó donde estaba y después ya se pudo clonar. Esto ocurrió en los años 80, y fue hallado
por 2 grupos:
- El grupo de Toronto: Ray et al. Nature 318:672-675
- El grupo de Harvard: Monaco et al. Nature 316:842-845

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Clonación posicional:
La idea de la clonación posicional es que:
1. No utiliza información de la secuencia de la proteína sino que utiliza la localización genética,
es decir, el lugar donde está el gen, el locus donde está el gen.
2. En aquella época se hacían mapas físicos de la región genómica correspondiente pero hoy
en día tenemos prácticamente todo en la página web del Genoma Humano.
3. El gen ha de contener mutaciones en los afectos y no en los individuos sanos, esta
prueba del algodón sigue siendo válida, cuando llegas al gen tienes que demostrar que hay
mutaciones causantes de patología en los enfermos y no en los sanos. Además tenemos que
demostrar que cuando introducimos el gen normal WT revertimos el fenotipo mutante y así
ya queda completamente comprobado que es ese gen.

Básicamente en la clonación posicional, a partir de una enfermedad, y a partir de un Mapa

Genético (locus en cromosoma), se llegaba a un sitio en el cromosoma en el cual había que
buscar que había en esa región, y a partir de ahí encontrar un gen que tuviera mutaciones en
individuos enfermos y no en los sanos.
Hoy todo eso ha cambiado, porque usando la información del Genoma Humano que tenemos
desde hace casi 20 años, lo que tenemos es que cuando tenemos la enfermedad, hacemos un
mapage genético (ya veremos como), llegamos a una región, y aquí tenemos todos los genes y
entonces buscamos el gen que interese que esté en individuos enfermos y no en los sanos. Si
podemos ir directamente a una región del genoma donde suponemos que está la enfermedad, nos
ahorramos todo el trabajo de hacer análisis de ligamiento, y podemos ir directamente a buscar esa
región y los genes. Y lo que tenemos com atajo es cuando tenemos alguna anomalía citogenética,
igual que pasaba en el caso de Duchenne.

Localización genética del gen DMD en Xp21.2:

En el caso de DMD, se usaron distintas técnicas, entonces se estudió:

1. Por un lado se estudiaron los puntos de ruptura de translocaciones en niñas DMD:

t(X;1)(p21.2;p34)
t(X;5)(p21.2;p35.3)
t(X;21)(p21.2;p12)
t(X;9)(p21.2;q21.3)
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 Con eso se intentaba mapar y encontrar
exactamente el punto de ruptura. Y siempre
encontraban que la parte de déficit era en 21.2 o
cerca del cromosoma X.
2. También se hicieron análisis citogenéticos de
los cromosomas X de niños DMD:
Aprovechando los niños que tenían
deleciones suficientemente grandes para
poder detectarlas, y a partir de estas
deleciones también se pudo llegar al gen. En
todos ellos faltaba la banda Xp21.2.
3. En algunos casos se hizo análisis de ligamiento en familias con niños DMD:
Se encuentra ligamiento con marcadores de la zona Xp21.2.

Pero básicamente cualquiera de las aproximaciones tenía en cuenta la región donde quedaba el
gen, que era este gen 21.2. Básicamente lo que se hizo para encontrar la secuencia completa del
gen fue clonarlo, y para clonarlo físicamente se utilizaron 2 estrategias:

• Estrategia de Toronto: consistió en clonar el

punto de ruptura de la translocación (no lo va
a contar porque nos llevaría mucho tiempo).

• Estrategia de Harvard: lo que hicieron fue

clonar el fragmento del cromosoma X
ausente en la deleción del niño B.B. Tenemos
a la izquierda el gen de la distrofina para el
niño BB, al cual le faltaba un trozo, y a la
derecha tenemos el gen de la distrofina
normal. Entonces lo que se hizo fue clonar la región que falta, pero como vas a clonar lo que no
hay? clonar es una cosa física, necesitas conseguir un trozo de DNA, meterlo en un vector y
poder multiplicarlo en bacterias y tener gran cantidad. Entonces para clonar tienes que tener y
puede parecer absurdo, porque para clonar este gen hay que clonar algo que no hay.
Pero lo interesante fue que lo que hicieron fue mezclar el DNA del individuo BB, en gran
exceso, con el DNA normal (pag. siguiente). Por tanto había un DNA normal y un DNA de un
individuo que tenía la deleción. El truco fue que cuando fraccionaron los cromosomas del
individuo normal se hizo mediante digestión con un enzima, de manera que quedaron extremos
cohesivos. Entonces se mezclaron, se desnaturalizó la mezcla para que se hibridarán los
trozos de DNA tanto de un cromosoma como del otro, ya que los DNAs son todos iguales y se
pueden unir como sea. Pero que ocurre? Como había tanto exceso de DNA del individuo BB
con DMD, casi todo el DNA normal se pegaba con el DNA del individuo Duchenne. De esta
manera en estos trozos de doble cadena así generados, había fragmentos que tenían un
extremo cohesivo, que permitía que se pudiera clonar, pero unidos formando un dúplex parcial
con un trozo de DNA que no tiene un extremo cohesivo clonable, y así estos dúplex no eran
clonables. Lo único que se clonaba era cuando se unía un DNA del individuo normal con su
complementario que tienen que ser provenientes del mismo DNA del individuo sano (porque
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 solo los del individuo sano tienen extremo clonable).
Pero como estos estaban en clara minoría, era muy
poco probable que se unieran entre ellos, porque había
muchos más del DNA del individuo BB. Y quienes
podían unirse? Podían unirse los que no tenían un
complementario en el DNA del cromosoma de BB. Por
tanto, los trozos de la región que nos interesa, aunque
había mucho más DNA del individuo BB que del sano,
los trozos de esta región no tenían complementario en
el individuo BB, y por lo tanto estos trozos de DNA
normal de la región que nos interesa no podían unirse
con los trozos del individuo BB y terminaban uniéndose
entre ellos, y así esto era lo que se podía clonar.

Funciones de la proteína:
Hay funciones que ocurren en distintos tejidos
del gen de la distrofina. Tenemos distintos
promotores alterntivos (puestos en el
sentido normal) que producen proteínas
distintas, algunas simplemente con pequeños
cambio en la región 5’, es decir, tenemos los
promotores alternativos sin cambios en la
proteína simplemente para tener proteínas
que puedan activarse a distintos tejidos como
el cerebro, el músculo o el cerebelo (células de Purkinje). Por tanto tenemos estos promotores que
tienen señales distintos que son específicos de tejidos distintos. Pero al final estos promotores
alternativos suelen siempre hacer un splicing de alguna manera alternativo porque cada uno tiene
un splicing diferente en el primer exón, pero todos terminan su sitio de splicing en el exón 2. Esto
es lo más común y todas estas proteínas tienen la misma función, estas proteína, estas distrofina
concreta, son las que están tanto en músculo como en cerebro y en cerebelo.
Pero hay otros promotores específicos mucho más cortos que dan isoformas más cortas que
tienen funciones distintas en retina, en riñón y en distintos tejidos. Esto son isoformas que se
consiguen gracias a promotores específicos.

4. LA PROTEÍNA
Nos vamos a quedar con la proteína
normal, que es la de la imagen, y que tiene
una serie de dominios. Lo importante es
que tiene un extremo aminoterminal que se
une a la actina y un extremo carboxiterminal
se une a la proteínas del complejo DPC y esto es lo que permite que se anclen las proteínas de
mecanismos específicos (actina) a la estructura del sarcolemma de la membrana celular. La
distrofina tiene que ser ese puente entre la actina y todo lo que es el complejo DPC.

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La distrofina tiene en medio una serie de repeticiones pero que tampoco son demasiado
regulares, lo importante es que existan los dos extremos. Cuando hay trozos en esta región de en
medio que no están bien, se pueden hacer re-arreglos que no abarcan la proteína completa,
mientras haya los dos extremos la proteína puede ser funcional. Por tanto muchas terapias están
dirigidas a tener problemas por en medio pero mantener bien los extremos.

Hay otras proteínas de la familia de la distrofina:

- Distrofina.
- Utrofina.
- DRP2 (distrophin-related protein 2).
- alfa y beta distrobrevina.
Pero la que más nos interesa y tenemos como modelo es la distrofina.

Funciones: (creo que las funciones están como encadenadas).

- La distrofina es necesaria dentro de la célula muscular para dar soporte estructural.
- Ancla elementos del citoesqueleto a la membrana plasmática (sarcolemma).
- En ausencia de distrofina, la membrana se hace permeable.
- La célula muscular revienta, y esto evidentemente hace que el músculo no funcione.
- Además se genera una respuesta inmune que agrava más la patología.
Es decir, que no solamente sirven para anclar la actina con el exterior, sino que además sirve para
dar estabilidad de las membranas, y cuando no hay proteína todo se termina destruyendo y se
produce la muerte.

Complejo DPC en el músculo:

Tenemos el complejo DPC (que se une por a
la distrofina por el extremo carboxiterminal). El
complejo DPC (Dystrophin Associated Protein
Complex) está formado por muchas proteínas.
Tenemos la distrofina que se une a la actina
por el extremo aminoterminal y se une a DPC
por el extremo carboxiterminal.

El complejo DPC se divide básicamente en 3

grandes grupos:

1. Complejo de sarcoglicanos: este

complejo está formado por proteínas de
membrana, del sarcolemma. Este
complejo es específico de músculo y
mutaciones en estos genes causan un tipo
de patología que es parecida a la distrofia
muscular de Duchenne, que es lo que se
llama distrofia de cinturas.
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 Tenemos los sarcoglicanos (SGs):
- SGα
- SGß
- SGγ
- SGδ
Todos ellos cuando están mutados
producen estas distrofias de cinturas. En
esta tabla aparecen distintas distrofias de
cintura o LGMD (limb-girdle muscular dystrophy), hay una larga lista. Pero lo importante es
que las que están en el recuadro son miembros del complejo DPC que hemos comentado, es
decir, que muchas de estas mutaciones causan distrofias.

2. Complejo distroglicanos: son dos proteínas,

una de membrana y una en el espacio
intracelular. Tenemos los distroglicanos α y ß:
DGα y DGß. Estos:
- Tienen expresión ubicua.
- Es una conexión entre matriz extracelular
y la distrofina.
- Tienen un rol en transducción de señal
mediada por la matriz extracelular.
- Forman parte estructural de anclaje de la
distrofina a todo el sistema.

3. Complejo citoplasmático: tenemos:

- α-DB: α-distrobrevna
- Syn: sintrofina
- nNOS: sintasa de óxido nítrico neuronal.

Los ratones deficientes en la sintrofina

son normales, en cambio los ratones
mutantes en la α-distrobrevina presentan
distrofia muscular.
Además la α-DB está implicada en la
transducción de la señal intracelular.

No entraremos en tanto detalle, tenemos que saber que hay un complejo de proteínas que
permiten el anclaje de la distrofina a la membrana y por tanto que lleva a la actina a tener un punto
de apoyo.
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Distrofina y utrofina:
- Misma familia.
- Tamaño parecido. Primero se pensaba
que la utrofina era distrofina, pero luego
se descubrió que no era distrofina y
vieron que tenía un tamaño parecido. La
diferencia es que la utrofina es mucho mas ubicua (la u de utrofina viene de ubicua).
- Estructura modular parecida, con módulos parecidos, sobretodo los que están más en la
región carboxiterminal, es decir que en algunos lugares parte del complejo DPC está formado
por utrofina. En algunas terapias se intentó utilizar utrofina para una terapia génica experimental
pero no ha tenido éxito.
- Utrofina: DPC de la membrana postsináptica de la placa motora.
- Utrofina: puede llegar a substituir a la distrofina.

5. LAS MUTACIONES
Ahora pasamos a las enfermedades genéticas, que cuando las analizas lo que haces es estudiar
sus mutaciones, es decir, genes que en personas sanas o no tienen mutaciones o tienen
pequeños cambios puntuales pero que no afectan a la proteína, son polimorfismos, pero en
principio el gen o es exactamente igual al gen patrón que tenemos o tiene cambios que no
representan alteración. Pero además están las mutaciones que si que causan alteración.
Estas mutaciones pueden ser de distinto tipo:
- Mutaciones puntuales.
- De pauta de lectura

En el caso de la DMD:
- La gran mayoría de las mutaciones son deleciones. El gen DMD tiene muchas deleciones, un
65% de las mutaciones que causan la patología son deleciones.
- También hay unos casos de duplicaciones. Un 5%.
- El resto son mutaciones puntuales.

Deleciones del gen DMD que causan DMD:

Tenemos un esquema del cDNA de la proteína
y encima las distintas deleciones que hay.
Como se ve, hay muchísimas deleciones. Hay
deleciones muy grandes y hay deleciones muy
pequeñas, hay deleciones en la región 5’ y
deleciones en la región 3’. Además parece que
hay un poco más en la región 3’, un 70%, que
en la región 5’, un 30%.

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Pero lo que vemos es que en casos diferentes, muchas veces el inicio y el final de la zona
mutacional es el mismo, y esto nos hace ver que hay puntos calientes de mutación (en este caso
en el sentido de deleción) que hará que suela ocurrir esta deleción en esta zona. Esto es una de
las características, que hay zonas específicas donde se dan deleciones, es decir, no todos los
pacientes tienen la misma deleción, si se mira tienen distintos tamaños, pero si que hay puntos
específicos donde suelen acumularse los orígenes o finales de esta deleción.

DISTROFIA MUSCULAR DE BECKER (DMB)

- Esta distrofia muscular es una enfermedad ligada al X y recesiva.
- Es menos grave que la DMD.
- Incidencia 1/30.000 niños varones.
- La debilidad muscular comienza a edad mucho más avanzada.
- La progresión es muy variable y en algunos casos bastante lenta.
- Algunos pacientes BMD mantienen la marcha durante décadas.
Es como una forma de Duchenne pero más suave, y no se tardó mucho en descubrir que la causa
eran mutaciones en el mismo gen, son dos mutaciones causadas en el mismo gen. Es decir que el
gen de la distrofina cuando está mutado puede causar tanto DMB (más suave) como DMD (más
grave). De hecho algunas de las terapias que se están ensayando, tienden no a curar la
enfermedad (no se puede, no hay cura), sino que lo que se trata es de convertir la DMD en DMB,
Becker seria el objetivo de la terapia, a pesar de que sigue siendo una situación complicada.

Como se vio que había mutaciones de distinto

tamaño, lo que se pensó es que las
deleciones, que son bastante frecuentes en
Duchenne, podían ser que no ocurrieran en
Becker y que en Becker las mutaciones fueran
todas puntuales o que si fueran deleciones
fueran deleciones más pequeñas. Pero
cuando se pusieron a estudiar molecularmente
a los pacientes se vio que no era el caso, los
pacientes con Becker también tenían
deleciones, y algunas pequeñas y otras
grandes como en Duchenne, es decir, que el
tamaño de las deleciones no era la razón por la cual se daba Duchenne o Becker.

Se vio que las deleciones de Becker eran deleciones que solían estar en pauta, mientras que las
de Duchenne no. Lo que pasaba en Becker era que había trozos de en medio que se perdían y
así se perdían unos cuantos exones (manteniendo la pauta) que codificaban para una zona
interior de la distrofina, pero mantenía intactos los extremos, y esto hacia que el fenotipo fuera
mucho más suave. En cambio en las de Duchenne las mutaciones estaban fuera de pauta, por lo
tanto a partir de la deleción la proteína ya no seguía una pauta correcta, con lo que no se
formulaba el extremo final y no servía para anclar la actina al complejo DPC, y por lo tanto esto
hacía que la situación fuera mucho más grave.
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Esto nos lleva a describir un tipo de heterogeneidad, que es la heterogeneidad alélica con
heterogeneidad clínica. Como sabemos existen dos tipos de heterogeneidad:
- Heterogeneidad génica o de locus: una misma
enfermedad puede estar causada por distintos genes
= muchos genes para una única enfermedad. Ejemplo
típico: retinitis pigmentosa, hay muchos genes que
causan la misma enfermedad, todos provocan la
degeneración de las células fotorreceptoras y para la
que los clínicos definen una misma entidad clínica.
- Heterogeneidad alélica: (la que hay en DMD y DMB)
Un único gen con distintos alelos que según el tipo de
mutación que tengan, causan la enfermedad 1, la
enfermedad 2, etc.
Lo que tenemos en este caso es una heterogeneidad alélica, donde el gen DMD produce varias
patologías, en este caso 2 patologías, Duchenne y Becker.

Después algunos genetistas decidieron cambiarlo un poco y entonces:

- Heterogeneidad alélica: se usa cuando un gen tiene más de un alelo, más de una mutación
distinta, que es el caso absolutamente general. Entonces dejaron heterogeneidad alélica para
decir que hay más de una mutación en un gen.
- Heterogeneidad alélica con heterogeneidad clínica: un único gen causa más de una
enfermedad. Por tanto el gen de la distrofina tiene heterogeneidad alélica con heterogeneidad
clínica.

Como decíamos:
Las deleciones de Becker no rompen la pauta de lectura, entonces la proteína es más corta, pero
tiene los extremos wt que sirven para hacer la función.
Las deleciones de Duchenne rompen la pauta de lectura, por lo tanto hay una proteína truncada,
ya que cuando se rompe la pauta de lectura, a partir de esta deleción la proteína ya no tiene nada
que ver con la proteína original y por tanto faltan los dominios C terminal y la proteína no se puede
unir al complejo DPC.

En la primera imagen vemos ejemplos de distrofina en pacientes con Becker y con Duchenne, y
vemos que tanto con la tinción hematoxilina-eosina como con la immunohistoquímica, la situación
de DMB es una situación intermedia entre el WT y el DMD. Además vemos que el DMD la
distrofina es prácticamente
indetectable.

En la segunda imagen
vemos a un control, un
varón DMD y a una mujer
portadora, que también tiene
una situación un poco
intermedia.

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6. EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO
Para terminar vamos a ver algunas ideas del diagnóstico genético, pero no vamos a entrar mucho.
El diagnóstico genético, definición: ensayar la presencia de una determinada mutación en el DNA
de un individuo con riesgo de ser portador.

Modalidades:
- Prenatal
- Portadoras de mutaciones ligadas al X
- Portadores de mutaciones autosómicas recesivas
- Presintomático de mutaciones dominantes

Objetivos generales:
- Proporcionar información a los individuos para que puedan tomar decisiones informadas.
- Reducir la ansiedad.
- Dar opciones de embarazo a parejas con riesgo.
- Y TAMBIÉN aplicar tratamientos más eficaces y/o prevenir la enfermedad.

Que quede claro que el diagnóstico no dede ser un fin en sí mismo, tiene que haber una finalidad
concreta, si hay una patología ver si se puede utilizar este diagnóstico para aplicar algún
tratamiento o para tener una solución.

DIAGNÓSTICO MOLECULAR:
Basado en el análisis de DNA. Depende del conocimiento disponible sobre el gen. Básicamente
hay dos tipos de diagnóstico molecular:
- DIRECTO: buscar la mutación. Hoy en día en la mayoría de los casos es lo que se hace.
- INDIRECTO: deducir la herencia de la mutación con marcadores vecinos. Puede ser muy
importante especialmente en situaciones en que no haya análisis directo, puede ser buscar en
un cromosoma o incluso el análisis de un gen candidato como el de Duchenne, entonces a
veces puede ser útil utilizar este método.

¿Cómo buscamos la mutación en un niño afecto de DMD? En el caso de Duchenne debemos

tener en cuenta que:
1. Buscamos deleciones +/- grandes.
2. El gen es muuuuuy grande.
3. Hay puntos calientes de deleción.

Hay 2 técnicas clásicas y una técnica más nueva:

1. PCR múltiple.
2. Southern.
3. MLPA.

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1. PCR múltiple:
Es un tipo de sistema en el que se trata de ir
probando funciones de PCR (no escolte bé si
ha dit això) para poder amplificar distintos
exones en la misma tongada. Un gen com
muchos exones es muy útil.
En la imagen vemos un paciente P y un
control C, y vemos como hay exones que no
aparecen.

2. Southern:

Tenemos la posibilidad de hacer lo mismo con Southern.

El Southern hoy en día no se utiliza mucho porque es
caro, lleva mucho tiempo, pero como forma para ver las
mutaciones o incluso las nuevas uniones entre fragmentos
que se han generado por la mutación de los que había en
medio es interesante, es decir, no solo se ve cuando te
falta un fragmento sino que también se ve como aparece
un fragmento nuevo con la unión de lo que había en los
extremos de la reacción enzimática. Vemos que la madre y
el individuo 2 lo tiene, es decir que en la madre no aparece el puntito pero tendríamos que
ponérselo para indicar que es portadora. En cambio el individuo 1 que es la abuela no lo tiene, por
tanto es una mutación de novo que apareció en el individuo 2.

- Ventajas del Southern:

• es cuantitativo ⇒ permite diagnosticar portadoras.
- Limitaciones del Southern:
• se requiere 10 microgramos DNA (x10-x100 respecto a PCR).
• laborioso.
• lento.

3. MLPA:
El MLPA o Multiplex Ligation Probe Amplification se utiliza en muchos casos.
- Técnica diagnóstica más nueva para analizar dosis génicas.
- Permite el análisis simultáneo de 45 fragmentos genómicos.
- Basada en la PCR, requiere 20 ng DNA.
- Aplicada actualmente en muchos laboratorios.

Consiste en sondas que se pegan al DNA y que una vez están pegados se ligan. Tiene que haber:

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1. Desnaturalización.
2. Hibridación.
3. Ligación.
4. Amplificación.

Entonces podemos amplifica todos los exones, hacer sondas para cada exón y podemos estudiar
varios exones simultáneamente. (ya lo hemos visto y no ha explicado toda la técnica pero he
puesto las diapos).

• Sondas MLPA:

• Hibridación:
1. La mezcla de sondas de MLPA se
mezclan con el DNA genómico
desnaturalizado.
2. Las dos partes de cada sonda se hibridan a secuencias adyacentes.

• Ligación:
3. Las sondas se ligan con una ligasa
termoestable.

• Amplificación:
4. Se utiliza una pareja de cebadores (primers)
universales para amplificar todas las sondas
ligadas.
5. Los productos de amplificación de cada
sonda ligada tienen una longitud diferente
(entre 130 y 480 pb).

• Separación y cuantificación:

Cada pico es el producto de amplificación de una

sonda concreta.
Las muestras se tienen que comparar con un
control.
Las diferencias en las alturas de los picos o en
sus áreas indican diferencias de dosis de las
secuencias diana de las sondas.

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Diagnóstico molecular indirecto:

Cuando por alguna razón no se sabe cuál es el gen pero si la localización genética o el gen es muy largo, el
diagnóstico se puede hacer de forma indirecta. La idea es en vez de mirar el gen concreto se mira cómo se
heredan los marcadores cercanos (marcadores muy polimórficos, y se utilizan marcadores de tipo STR:
simple tándem repeat = microsatélites).

Ejemplo gen CBS (cistationina beta-sinatasa), que está alterado en la homocistinuria. En la imagen vemos
dos polimorfismos a banda y banda del gen. En este caso es una enfermedad autosómica recesiva, y
tenemos dos mutaciones, la 1 (viene del padre) y la 2 (viene de la madre). La mutación es desconocida. Se
puede intentar hacer un diagnóstico indirecto con marcadores flanqueantes. Miramos marcadores que estén
cerca del gen de la mutación en el cromosoma materno y paterno. Sabemos que la niña tiene las dos
mutaciones, el padre tienen un alelo sano y uno con la mutación m1, y la madre tiene un alelo sano y uno
con la mutación m2. Entonces miramos un marcador y con este marcador (D21S1411) podemos llegar a
decidir si el feto es sano o afecto. Con esto sabemos que el feto será portador sano. El feto tiene 2/3: hereda
el 2 del padre y el 3 de la madre. Como vemos que los alelos que están asociados a la mutación son el 1 de la
madre y 2 del padre, el feto tiene el 2 del padre y por lo tanto es portador. Evidentemente esto es válido si
NO hay recombinación. Por esto decimos que miramos un marcador a lado y lado del gen, y la probabilidad
de recombinación es muy baja (0’3%).

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ANÁLISIS DE LIGAMIENTO

Otras formas que tenemos de identificar la mutación en el gen responsable de una enfermedad cuando no
tenemos ninguna idea de cuál puede ser. Cuando apareció una enfermedad y no se sabe que gen era y no
había ningún candidato una posibilidad era traducir el genoma y ver que había en ese sitio, y si había una
señal citogenética (como en Duchenne) se podía hacer de esta manera. Pero cuando no había ninguna señal
citogenética lo único que les quedaba hace unos años era análisis de ligamiento (se necesitan familias muy
grandes).

Hoy en día se pueden utilizar análisis de ligamento o secuenciación de exoma, o se pueden utilizar las dos
cosas simultáneamente. El análisis de exomas te da la secuencia de todos los exones de todos los genes, y si
lo puedes acompañar de un análisis de ligamiento, cuando tienes una región a mirar del genoma miras el
resultado.

Una de las primeras enfermedades que se encontró gracias al análisis de ligamiento fue la enfermedad de
Huntington (con el gen de la huntingtina). Lo que hicieron fue estudiar un pedigrí americano y un
venezolano, y se ve que la herencia es autosómica dominante. Aquí tenemos el pedigrí en el que vemos un
sitio polimórfico. ¿Vemos que hay algún tipo de alelo (A, B, C) relacionado con la enfermedad? El C. Como es
dominante, con un solo alelo es suficiente para causar la enfermedad. Tenemos que tener una fuerza
estadística para poder decir que lo damos por bueno. Tenemos que hacer un análisis de ligamiento para que
nos dé un número para poder decir que sí es bueno.

Aquí hay algunos casos en los cuales estas

personas tienen genotipo de riesgo (AC), no
tienen enfermedad y además hay un caso
evidente que muestra que la penetrancia es
incompleta. Observamos penetrancia incompleta
en el individuo 2 1. Lo que pasa es que en esta
enfermedad la penetrancia es completa si se
considera toda la vida. Esta persona murió joven y
no se le desarrolló, es lo que se llama una
penetrancia reducida. En Huntington es
penetrancia completa. Aquí se habla de penetrancia dependiente de edad.

Se hace un análisis de ligamiento que da un lord score que supera el valor de 3. Entonces, se puede sumar el
pedigrí venezolano y el americano.

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El análisis de ligamiento es: ¿Este marcador de la punta de cromosoma 1 está ligado a la enfermedad? ¿En
otro también? Para cada marcador vamos preguntando si está ligado o no a la enfermedad. Con esto
llegamos a una única región genómica con un valor de Lod Score superior a 3 y allí se ha encontrado el gen
huntingtina.

Fracción de recombinación (Theta θ): primero tenemos que establecer la fase, que es el conjunto de alelos
(para distintos loci) que vienen de un mismo progenitor. Queremos saber cuáles son los 2 alelos de 2 loci
distintos que vienen del padre y los que vienen de la madre. Esto es establecer la fase. Hablamos de 2 loci
que los llamamos D (disease) y M (marcador), y de cada locus tenemos 2 alelos: D y d, M y m. Aquí podemos
suponer que los alelos “D” y “M” vienen del padre y los alelos “a” y “m” vienen de la madre. Estudiamos
distintas situaciones:

Situación 1: si los 2 loci están en distintos cromosomas segregarán independiente al formar los gametos, es
decir, si dos genes están en dos cromosomas
distintos cada uno irá por su lado. En esto caso
la fracción de recombinantes (Dm o dM) será de
un 50%. La probabilidad de recombinantes es 25
+ 25 = 50% y la probabilidad de no
recombinantes (mantendrán la fase parental) es
50%. La fracción de recombinación es θ = 0’5. En
este caso es igual de probable que recombinen
como que no recombinen. Si tenemos un valor
de theta de 0’5 quiere decir que los genes no
están ligados, no están en el mismo cromosoma.

Situación 2: si los 2 loci están en el mismo cromosoma y a una distancia muy pequeña, irán juntos al
mismo gameto. Aquí no hay recombinación. La fracción de recombinación es prácticamente nula y por lo
tanto θ = 0. Aquí asumimos que están tan cerca que no hay posibilidad de entrecruzamiento entre ellos y por
tanto no hay recombinación.

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Situación 3: si los 2 loci están en el mismo

cromosoma, a cierta distancia puede
producirse recombinación meiótica entre
ellos. Se puede producir una recombinación
meiótica entre ellos. La proporción (fracción)
de recombinantes (Dm o dM) no será nula. Si
la distancia es relativamente pequeña será 0
< θ < 0’5.

Por recombinación estamos entendiendo dos cosas un poco distintas: por un lado estamos pensando en el
entrecruzamiento (intercambio de material durante la meiosis) pero también hablamos de recombinación
cuando no hay ninguna relación física entre los cromosomas, simplemente se cambia la fase parental. Por lo
tanto, en este sentido recombinante es cuando se han mezclado los alelos que venían del padre o de la
madre independientemente que estén en cromosomas distintos o en el mismo. Si están en el mismo
cromosoma la recombinación tiene que ver con la interacción física, intercambio de material entre
cromosomas.

Una relación entre theta y cM:

Tenemos un locus en un cromosoma y un marcador a cierta distancia. Si esta distancia implica que haya un
1% de probabilidad de recombinación el valor de θ es 0’01. Si el marcador está más lejos la probabilidad de
recombinación puede ser 0’2 (20 veces más). Si me sigo alejando, puedo llegar a 0’5, pero ya es
independencia, es tan probable que haya recombinación como no. Si me sigo alejando del loci verde todos
los loci rojos tendrán un valor de 0’5.

Por lo tanto, θ es la fracción de

recombinación y vale como una
distancia pero a distancias muy
cortas. Si lo convierto en cM lo
puedo asumir como una distancia
real, física a lo largo de todo el
cromosoma.

Para tener una idea, 1cM mide

aproximadamente 1 megabase.

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Análisis de ligamiento:

Hay que hacer una comparación

de probabilidades.

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Como establecer la fase:

En principio esta enfermedad es autosómica dominante. El gen de la enfermedad es D. Padre sano es dd y

madre es Dd. Hijos: Dd, dd, Dd. Huntington es una de las pocas enfermedades donde es exactamente igual
ser Dd que DD. Miramos el primer marcador y hacemos el análisis. Miramos si los 3 hijos son recombinantes
o no, y para hacerlo tenemos que establecer la fase. No puedo establecer la fase de la madre, porque no sé
si las fases son D con 1 y d con 2 o D con 2 y d con 1. Entonces, no recombinan porque si la fase es D1 y d2, a
los hijos les queda D1, d2 y D1. Pero como no sé la fase no lo puedo saber. Sí sé lo que cada hijo heredó de la
madre, y entonces son los 3 NR o los 3 son R (porque si la fase es D2 y d1, entonces los tres hijos
recombinan). Hay muestras de los abuelos,
pero el abuelo no sirve para la fase. La abuela
es un individuo no informativo (d2 d2). Sin
embargo en este contexto la abuela es
informativa porque gracias a la abuela sé que
d2 de la madre ha tenido que venir de ella y
por lo tanto D1 ha venido del abuelo. Ahora sí
que sé cuál es la fase (D va con 1, y viene de
la fase paterna y d va con 2 y es de la fase
materna), y los 3 hijos son no recombinantes
porque mantienen la fase del abuelo (D con
1) y la fase de la abuela (d con 2).

Entonces ahora esto lo podemos poner con una barra en el medio, y así ya he limitado la fase. Entre el
marcador y el locus de la enfermedad veo que los 3 son NR, por lo tanto puedo pensar que el gen de la
enfermedad y el marcador están muy cerca, que están ligados. Tengo que demostrar que este resultado es
significativamente cierto, es decir, que el haber encontrado 3 NR no se debe a una casualidad sino que
realmente gen y marcador están ligados.

Vamos a hacer un cálculo. Hemos dicho que los valores de θ son valores arbitrarios. Vamos a empezar por
fase conocida y vamos a calcular para θ = 0. Solo miraremos las meiosis maternas (son las que importan). En
verde tenemos marcado la parte del pedigrí que solo lo usamos para establecer las fases. La madre puede
hacer óvulos D1 o d2, pero no puede hacer óvulos que tengan D2 ni d1 porque hemos fijado θ = 0, es decir,
que la probabilidad de recombinación sea
0. Por lo tanto solo consideramos estas
dos posibilidades y cada una tiene una
probabilidad de ½. La probabilidad de
cada uno de los hijos de haber recibido la
combinación de alelos es de 1/2. Por lo
tanto, la probabilidad conjunta para estos
datos bajo la hipótesis θ = 0 es 1/8.

Y tenemos que comparar esto con la

probabilidad de estos resultados bajo la
hipótesis de azar (θ = 0’5).

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Probabilidad para θ = 0’5.

Es lo mismo pero la madre puede hacer

las 4 combinaciones haplotípicas con la
misma probabilidad (1/4).

Probabilidad conjunta: 1/64.

Entonces, para hacer análisis de ligamiento tenemos que hacer la siguiente fórmula:

Una meiosis totalmente informativa

vale 0’301. Este es el valor en una
meiosis totalmente informativa. Aquí
teníamos 3 meiosis por lo tanto ya
podíamos calcular directamente que
0’301 x 3 = 0’903.

Luego hay distintas situaciones que pueden hacer que no vayan bien (individuos que no son totalmente
informativos) pero en principio si todo está bien es 0’301, por lo tanto con 3 meiosis es 0’903. Si sabemos
que cada meiosis informativa vale 0’301, ¿cuántas meiosis necesitamos para tener un valor de LOD SCORE
de 3? 10. Si no tenemos 10 meiosis no empecemos ya el análisis de ligamiento porque no vamos a llegar a
ningún lado, y como seguro va a haber algún fallo nuestro consejo es siempre empezar con 20 meiosis.

Como el LOD SCORE (Z) es aditivo podemos sumar familias. Entonces, si tenemos una familia que no nos da,
podemos sumar muchas familias distintas para tener meiosis suficientes. Problema: debemos estar seguros
que no haya heterogeneidad genética (como en el caso de la retinitis pigmentosa). Si es una enfermedad
dominante lo ideal es buscar ramas de la misma familia, porque así estamos seguros que están causados por
el mismo gen.

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ANÁLISIS DE LIGAMIENTO:
Hasta ahora hemos considerado Θ = 0.
Ahora veremos como hacer para Θ ≠ 0.

Por ejemplo, Θ = 0,1.

La enfermedad es una autosómica
dominante. Los abuelos nos permiten
saber la fase. En este caso el abuelo está
fallecido pero es una información que no
nos interesa, porque la abuela al ser
homozigota para d y para 2, sabemos que
d2 viene de la abuela y por lo tanto nos
permite conocer la fase.
Así pues tenemos 3 hijos NR porque
tienen la misma fase de la madre, y 1 hijo
sí es R.
Para calcular el resultado donde hay más
NR que R, se debe a que gen y marcador están muy cerca.
Vemos que hay 4 gametos posibles (4 tipos de óvulos que puede generar la señora) dado que Θ ≠
0, pero lo que ocurre es que no todos los gametos tienen la misma probabilidad, sino que las
probabilidades asociadas son distintas. La probabilidad de recombinación es 0,1 (10%) x 1/2. Lo
más probable es que no haya recombinación: 1- Θ = 0,9 (90%) x 1/2.

La probabilidad para los NR es 1/2 x (1-Θ).

La probabilidad para los R es 1/2 x Θ.
Probabilidad conjunta para estos datos
bajo la hipótesis es el conjunto de
probabilidades (ver imagen).

Ahora tenemos que hacer el cociente de

probabilidades que es dividir la
probabilidad de los datos con Θ = 0,1 /
probabilidad de los datos con Θ = 0,5.
Hago el cálculo y me termina dando Z =
0,067.
Vemos que cuando hay recombinación, es
decir, con valores distintos de 0 es un
valor muy lejos del 3 y del -2.
De aquí podemos sacar la fórmula general
(ver imagen, morado): el 3 y el 1 es
referido al pedigree en el cual había 3 NR y
1 R.
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Gracias a la fórmula puedo hacer la tabla

de Lod Score, es decir: tabla en la cual
arbitrariamente pongo valores de Θ.
Esto lo puedo graficar y me sale una curva.
De aquí veo un valor de Zmax que es 0,227.
Este valor puede estar o no. También
puedo calcular el valor de Θmax que es
donde es Zmax.
Θmax es la mejor estimación sobre la
distancia genética del gen marcador según
estos datos. Es previsible porque es la
fracción de recombinación (si tenia 4 hijos, de los cuales 3 eran NR y 1 era R, evidentemente la Θ
más probable es 0,25).
Lo que es importante es con qué fuerza yo digo que esto es así: lo digo con una fuerza
relativamente baja (0,227), es decir, no es significativo porque no llega al valor de 3.

La otra pregunta que nos podemos hacer

es: qué quiere decir que para Θ = 0 → Z =
− ∞ : es la forma que tiene el cálculo de
decirnos que esto es imposible. Tu le
preguntas “cuál es la probabilidad de que Θ
= 0, y lo que viene a decir el programa es
“si hemos dicho que ha habido un
recombinante, esto no puede ser cierto”.
Esto quiere decir que por lo menos hay una
recombinación, y no se admite que no haya
ninguna recombinación. Si tenemos una
recombinación Θ ≠ 0.

Como Θ = 0, si hay una recombinación al menos, queda un 0 en el numerador → log 0 = - ∞

Si no hay recombinaciones Θ0 = 1, y el numerador es ≠ 0.
Si no hay recombinaciones, Zmax está en Θ = 0.
Básicamente si todo sale bien y no hay muchas indefiniciones, lo que debería ocurrir es 1 de 2
situaciones: si no hay ninguna recombinación es cuando Zmax tiene que estar en Θ = 0. Si hay
recombinación, para Θ = 0 → Z = − ∞.

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1) El padre enfermo pasa el 1 o el 2. El padre pasa 1 a los sanos y 2 a los enfermos. Ahora bien,
hay uno sano al cual el padre le ha pasado el 2. Hay incertidumbre pero parece que la
enfermedad va con el 2 y se obtiene el resultado.
2) Cuando sumamos los abuelos, esa hipótesis de que la enfermedad iba con el 2 se va en orris
porque la enfermedad viene de la abuela, y esta es 1/1.
Al sumar familias puede pasar que vayas sumando y llegues a 3 o bien que no se mantenga.

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