BACTERIAS

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

Katherine Rojas Piñones, Patricia Vargas Quispe, Macarena Tapia Araya, Aylin Vergara Balcázar.
MEDICINA VETERIANRIA | FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS.
MICROBIOLOGÍA | LAB 12 | SECCIÓN 1 | PROF. VILMA GÓMEZ.
OCTUBRE, 2017.
 Conceptos básicos
I) INTRODUCCIÓN
Las bacterias son microorganismos unicelulares, la mayoría de vida libre, que se reproducen
por fisión binaria (Pírez, M. Mota, M., 2008), pertenecientes al reino mónera. Los
procariotas, a diferencia de los eucariotas, no poseen compartimientos intracelulares
delimitados por membranas, por lo que carecen de membrana nuclear, el ADN procariota
es circular-cerrado y su pared celular posee peptidoglicano.

Las bacterias son relativamente pequeñas (entre las 0.5

y 3 µm, pudiendo llegar en algunos tipos a 10µm.), pero
tienen un enorme impacto en nuestro mundo, ya que
algunas son causantes de enfermedades graves. Nos
pueden ofrecer muchos beneficios tales como la
descomposición y biorremediación, síntesis de
vitaminas y antibióticos, industria de alimentos
(Yogurt), equilibrio ecológico, fijación de nitrógeno,
flora natural del cuerpo entre otros. La forma de las
bacterias al microscopio está determinada por la rigidez
de su pared celular y se diferencian según su forma en:
cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica o de Figura n°1: Variadas formas
bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral). bacterianas.

Las coloraciones que se usan para teñir los preparados de bacterias se pueden dividir en:
simples, diferenciales y especiales. Las primeras, por ejemplo, el azul de metileno, nos
permiten observar la existencia de bacterias, su morfología, su agrupación, la presencia de
esporos y la existencia de otros tipos celulares. Las diferenciales (por ejemplo, la coloración
de Gram y la de Ziehl Nielseen) además de lo anterior, permiten la diferenciación de las
bacterias porque usan diferentes colorantes que se comportan distinto según el
microorganismo en cuestión, y por último, las tinciones especiales se usan para objetivar
distintas estructuras como la cápsula, el núcleo, los flagelos, los esporos, etc.

La coloración de Gram es la más usada en bacteriología. Es una coloración diferencial, dado

que las bacterias pueden clasificarse según su respuesta en Gram positivas o Gram
negativos. Las primeras se tiñen de color azul violeta y las segundas adquieren un color
rosado o rojo (Jawetz, Melnick y Adelberg.2010) Las bacterias gram-positivas y gram-
negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de
sus paredes celulares. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias
capas interconectadas de Peptidoglicano (80%-90% de la pared de la célula) así como algo
de ácido teicoico. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa
mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano (Sólo 10% - 20% de la pared de la célula)
y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y
lipoproteínas.

Figura n°2: Composición de las paredes bacterianas.

Su interés en la medicina veterinaria radica en que son responsables de millones de

muertes, causantes de epidemias y problemas de salud pública.
Algunas especies de importancia veterinaria: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus
intermedius. Son microorganísmos esféricos de 0.5-1.2 mm de diámetro, se agrupan en
racimos, aunque pueden observarse en pares, cadenas cortas e inclusive solos. Gram
positivos, no esporulados, generalmente sin cápsula, anaerobios facultativos, no móviles y
metabolismo fermentativo. Habitan en la piel y mucosas de animales y hombre (incluyendo
tracto gastrointestinal y respiratorio) (Velasco,M. Yamasaki, A., 2002)

Objetivo general.

 Identificar tipos específicos de bacterias obtenidas en animales.

Objetivos específicos:

1) Utilizar medios de cultivo para crecimiento bacteriano.

2) Realizar siembra y resiembra mediante distintos tipos de siembra.
3) Realizar frotis y tinción para la muestra problema.
4) Realizar pruebas bioquímicas y antibiograma para gram negativas.
5) Realizar pruebas bioquímicas y antibiograma para gram positivas
6) Identificar las muestras problema.
 Materiales y métodos
I) DESARROLLO
Obtención de muestra.

Para realizar el practico se realiza una selección de bacterias Gram positivas y Gram
negativas, éstas muestras fueron obtenidas de fecas de cabra la cual es Gram negativa y fue
sembrada en agar mac-conkey (M.C.K) TERMINAR

Siembra.

Para realizar la siembra se necesita un asa de argolla y placas Petri con Agar, una siembra
apropiada se debe trabajar siempre con mechero encendido para que sea un trabajo
aséptico, en esta ocasión se utilizaron dos placas con agar Mac-conkey ya que se trabajó
con dos bacterias Gram negativas encontrada en fecas de cabra y una placa de agar sangre
utilizada para bacteria Gram positiva, en las cuales se realizó la siembra en estría que tiene
la finalidad de aislar las colonias, se puede encontrar siembra en estría por agotamiento y
la que realizamos en esta ocasión, la siembra en estrías escocesas, ésta consiste en tomar
la bacteria con el asa de argolla y se realizan estrías en la cuarta parte de la superficie de la
placa, se quema el asa y se enfría, la placa se gira en 90° y se vuelve a estriar tocando 3
veces el área sembrada y cubriendo otro cuarto de la placa, luego se vuelve a girar la placa
y se vuelve a estriar, la última estría se lleva al centro de la placa. Al terminar se guardan en
la estufa de cultivo.

Resiembra y tinción de Gram.

Se realiza una resiembra de las bacterias por estrías escocesas en agares nuevos y se dejan
en la estufa de cultivo, también se realiza tinción de Gram, el cual es un frotis teñido, éste
es una técnica de observación e identificación de bacterias, donde se puede apreciar con
exactitud la morfología y disposición del microorganismo, depende del color que se
visualice la bacteria para saber si es Gram negativo el cual se visualiza de color rosa o rojo
ya que el cristal violeta no se fija en la pared de la célula, o si es Gram positivo que el cristal
violeta si penetra la pared celular. Para realizar esta tinción, con un asa se extiende la
bacteria en un portaobjetos y se seca a temperatura ambiente, luego se fija la muestra
flameando 3 veces al calor, se agrega azul violeta y esperar 1 minuto para luego enjuagar
con agua( no debe ser directamente sobre la muestra), se agrega lugol, luego de 1 minuto
se enjuaga y se agrega alcohol acetona, esperar 30 segundos, éste sirve para decolorar, se
enjuaga con agua y se agrega la safranina o fucsina básica la cual sirve para teñir a las
bacterias Gram negativo ya que estas se decoloran, esperar 45 segundos y luego enjuagar,
se lleva al microscopio para ser analizada, se recomienda hacerlo en 100x con aceite de
inmersión.
 Materiales y métodos
II) DESARROLLO
Resiembra y batería Bioquímica.
Se realiza resiembra de las bacterias por estrías por agotamiento, éste consiste en tomar
una muestra con el asa de argolla y se realiza un movimiento en zigzag por el centro del
medio de cultivo desde arriba hacia abajo. Se realizan los Gram negativos en agar X.L.D y la
bacteria Gram positiva en agar E.M.B.

Pruebas bioquímicas para Gram negativo. (Batería Bioquímica)

Determinar las características metabólicas de las bacterias para su identificación, se puede
evaluar la presencia de enzimas que degradan sustratos y por tanto se genera una reacción
colorimétrica, también puede haber producción de gas y H2S entre otras reacciones.
Para ésta prueba se realiza una siembra en picadura, el cuello del tubo de ser flameado y
con el asa de picadura previamente esterilizada a la llama, se toma una cantidad de muestra
pequeña, se lleva al fondo del tubo y se estría hacia la salida del tubo, se vuelve a flamear
el cuello del tubo y se tapa, para finalizar se dejan en la estufa de cultivo. Se necesitan 16
tubos con medios de cultivos, se utilizan 4 tubos por cada medio de agar TSI, agar LIA, Medio
MIO y agar citrato de Simmons. A continuación, se muestran la interpretación para cada
medio de cultivo.

a. Agar TSI. Determina la capacidad de los bacilos gramnegativos para

fermentar lactosa, sacarosa y glucosa, además la capacidad de producir H25(ácido
sulfúrico) y gas.
K/K: color rojo, no hay fermentación.
A/A: color amarillo, fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa, con o sin
producción de gas.
K/A+: color rojo y amarillo al fondo, fermentación solo de glucosa, producción
de H2S, producción o no de gas.

b. Agar LIA. detectar enzimas que descarboxilan o desaminan la lisina en

bacilos gramnegativos, adicionalmente detecta enzimas que producen sulfuro de
hidrógeno y gas proveniente de la glucosa

K/K: color violeta, producción o no de gas = Lisina Positiva.

R/A: color rojo superficie y amarillo al fondo, producción o no de gas =
Lisina Desaminasa.
 Materiales y métodos
III) DESARROLLO
K/K+: color violeta superficie y negro al fondo, producción de H2S, producción o
no de gas.
K/A: color violeta superficie y amarillo al fondo, fermentación de glucosa,
producción o no de gas = Lisina Negativa.

c. Medio MIO. determinar movilidad por la presencia/ausencia de flagelos, así

como las enzimas descarboxilasa de ornitina y triptofanasa.
Motilidad positiva: turbidez del medio.
Motilidad negativa: crecimiento en estría realizada.
Presencia de triptofanasa: + 3 gotas KOVAC presenta anillo de color rosa
intenso.
Presencia de descarboxilasa de ornitina: intensificación de color violeta.

d. Agar Citrato de Simmons. Determina la capacidad de utilizar el citrato como

única fuente de carbono.
Positiva: Desde color verde a azul marino y crecimiento en superficie.
Negativa: No hay cambio.

Antibiograma
 Datos obtenidos
IV) RESULTADOS
De acuerdo con los procedimientos realizados en los diferentes laboratorios (Obtención de
muestra, siembra en medios de cultivo, tinción de gram, resiembras, batería bioquímica,
antibiograma), se obtuvieron los siguientes resultados:

4.1) Crecimiento bacteriano.

Posterior a la primera siembra
en Agar MacConkey para
posibles gram negativas y Agar
Mueller-Hinton para posibles
gram positivas en estrías
escocesas, se denotaron
crecimientos diferentes:
 Fecas de caprino (A):
Forma de crecimiento
irregular.
 Fecas de caprino (B):
Forma de crecimiento
puntiforme. Figura n°X: Placas de siembra bacteriana de fecas
de caprino; A: placa rojiza, B: placas más claras.
 Lagrimal felino (C):
Forma de crecimiento
puntiforme.
4.2) Tinción de Gram.
Tomando muestras de las colonias aisladas en cada placa, se realizaron frotis en
portaobjetos para poder teñir con los compuestos de Gram y clasificar en:
 A: Bacilos Gram negativo.
 B: Bacilos Gram negativo.
 C: Estafilococos Gram positivo.

Figura n°X: Frotis de bacterias con tinción de gram; Izquierda: bacilos

gram negativos, Derecha: estafilococos gram positivos.
4.3) Resiembras.
Dos procesos de resiembra para la creación de placas madre de cada
microorganismo problema en estrías escocesas, demostrando los sgtes. colores:
 A: Fucsia.
 B: Fucsia.
 C: Transparente.
4.4) Batería bioquímica.
Los medios presentes en el laboratorio permitieron TSI, LIA, MIO, Simmons,
Catalasa, Oxidasa, EMB, XLD y MacConkey para gram negativas (Ver figura n°X) y
Coagulasa, Catalasa, Oxidasa y Baird-Parker para gram positiva. Los resultados
fueron los siguientes:
 A: Fermentador de azúcares, descarboxilador de lisina, productor de H2S,
motilidad negativa, presencia de triptofanasa, presencia de catalasa,
ausencia de oxidasa.
 B: Fermentador de azúcares, descarboxilador de lisina, productor de H2S,
motilidad negativa, presencia de triptofanasa, presencia de catalasa,
ausencia de oxidasa.
 C: Presencia de catalasa, ausencia de oxiadasa y coagulasa.

Figura n°X: Tubos de batería bioquímica; Respectivamente: TSI, LIA,

MIO, Simmons.
 PRUEBA TUBO RESULTADO INTERPRETACIÓN
A/A: Amarillo; presencia de
AGAR TSI A1 Fermentación de azúcares.
burbujas (G).
A/A: Amarillo; presencia de
AGAR TSI A2 Fermentación de azúcares.
burbujas (G).
A/A: Amarillo; presencia de
AGAR TSI B1 Fermentación de azúcares.
burbujas (G).
A/A: Amarillo; presencia de
AGAT TSI B2 Fermentación de azúcares.
burbujas (G).
K/K+: Violeta superficie y negro Descarboxilación de lisina;
AGAR LIA A1
fondo; sin burbujas. producción de H2S (+).
K/K+: Violeta superficie y negro Descarboxilación de lisina;
AGAR LIA A2
fondo; sin burbujas. producción de H2S (+).
K/K+: Violeta superficie y negro Descarboxilación de lisina;
AGAR LIA B1
fondo; sin burbujas. producción de H2S (+).
K/K+: Violeta superficie y negro Descarboxilación de lisina;
AGAR LIA B2
fondo; sin burbujas. producción de H2S (+).
MEDIO MIO + Crecimiento en estría; anillo Motilidad negativa; presencia de
A1
KOVAC rosa intenso. triptofanasa.
MEDIO MIO + Crecimiento en estría; anillo Motilidad negativa; presencia de
A2
KOVAC rosa intenso. triptofanasa.
MEDIO MIO + Turbidez del medio; anillo rosa Motilidad positiva; presencia de
B1
KOVAC intenso. triptofanasa.
MEDIO MIO + Crecimiento en estría; anillo Motilidad negativa; presencia de
B2
KOVAC rosa intenso. triptofanasa.
AGAR CITRATO DE
A1 No hay cambios. Negativo.
SIMMONS
AGAR CITRATO DE
A2 No hay cambios. Negativo.
SIMMONS
AGAR CITRATO DE
B1 No hay cambios. Negativo.
SIMMONS
AGAR CITRATO DE
B2 No hay cambios. Negativo.
SIMMONS

Figura n°X: Resultados de batería bioquímica en bacterias gram negativas.

4.5) Resiembra por agotamiento.
La última resiembra se realizó en medios que permitieran las últimas pruebas
bioquímicas, es decir, XLD y EMB para gram negativas y Baird-Parker para gram
positivas, por lo que se obtuvo el siguiente resultado de crecimiento:
 A: coloración amarillo-anaranjado en XLD; coloración verde ennegrecida en
EMB.
 B: coloración amarillo-anaranjado en XLD; coloración verde ennegrecida en
EMB.
 C: coloración negro muy oscuro.

Figura n°X: Crecimiento bacteriano gram negativo en

placa de agar XLD.

Figura n°X: Crecimiento bacteriano gram negativo en

placa de agar EMB.

Figura n°X: Crecimiento bacteriano gram positivo en

placa de agar Baird-Parker.
4.6) Antibiograma.
La medición del diámetro en milímetros de los halos alrededor de los antibióticos
arrojó los siguientes datos:

Antibiótico Gram - A Gram - B Gram + C

Amikacin (AN30) 20 mm 28 mm X
Ceftriaxone (CRO30) 32 mm 40 mm X
Ciprofloxacin (C1P5) 36 mm 56 mm X
Cefatoximel (CTXCLA) 34 mm 38 mm X
Rifampin (RA5) 16 mm 34 mm X
Penicilina (PG10) X X 25 mm
Ampicilina (AP10) X X 34 mm
Ceftazidime (CAZ30) X X 0 mm
Amoxicilina (AMC30) X X 54 mm
Clindamicina (CC2) X X 30 mm
Figura n°X: Resultados de diámetro en halos de antibiograma.

Figura n°X: Placas de gram negativa A, gram positiva C y

gram negativa B en Agar Mueller-Hinton Broth con sus
respectivos discos de antibióticos y generación de halos.
 Análisis de resultados
III) DISCUSIÓN
Los variados resultados obtenidos en todas las actividades realizadas con las muestras problema
permite generar una recopilación y análisis de datos para recrear una gama específica de posibles
identificaciones de dichos microorganismos.

Con los datos ya obtenidos es posible realizar algunas interpretaciones, como, por ejemplo:

3.1) La coloración de crecimiento bacteriano y la tinción de gram permite clasificar a dos de las
muestras como gram negativas fermentadoras de lactosa (A y B) debido a la apariencia fucsia que
presentaron en el agar MacConkey, permitiendo así la sospecha de un posible cultivo de Escherichia
coli (Becton & Dickinson, 2014).

3.2) GRAM POSITIVA

3.3) Ambas muestras gram negativas presentaron motilidad negativa, presencia de catalasa y
ausencia de oxidasa en la batería bioquímica lo que permitiría clasificarlas rápidamente como parte
de la familia Enterobacteriaceae (Rojas, Cháves & García, 2006).

3.4) GRAM POSITIVA.

3.5) La coloración obtenida en la resiembra por agotamiento en los agares XLD (amarillo-
anaranjado) y EMB (verde ennegrecido) que funcionan como medios selectivos y de diferenciación
de bacterias entéricas gram negativas, arrojaría que este microorganismo correspondería a
Escherichia coli (Becton & Dickinson, 2013).

3.6) GRAM POSITIVA.

3.7) La medición de los halos en el antibiograma permite clasificar a las muestras problema como:

Antibiótico Gram - A Gram - B Gram + C

*Amikacin Sensible Sensible X
*Ceftriaxone Sensible Sensible X
*Ciprofloxacin Sensible Sensible X
Cefatoximel Sensible Sensible X
Rifampin Resistente Sensible X
Penicilina X X Sensible
Ampicilina X X Sensible
Ceftazidime X X Resistente
Amoxicilina X X Sensible
Clindamicina X X Sensible
Figura n°X: Tabla de interpretación de diámetros en antibiograma.

Las bacterias entéricas son especialmente sensibles a los tres antibióticos marcados con el símbolo
* (Navarro, Miró & Mirelis, 2002) y las muestras problemas mostraron mayor sensibilidad ambas
ante el sensidisco de Ciprofloxacin, un antibiótico de amplio espectro.
Con respecto a las bacterias gram negativas que parecían ser dos especies diferentes, debido a la
similitud de sus datos en casi todas las pruebas se podría decir que finalmente son la misma especie,
ya que en lo único que lograron diferir fue:

 Forma de crecimiento en siembra.

 Motilidad en medio MIO de batería bioquímica (pero solo uno de los tubos).
 Reacción al antibiótico Rifampín.

Estas ligeras diferencias, se sospecha, podrían ser errores del proceso en laboratorio, como por
ejemplo la errónea realización de estrías en el caso de la siembra, el mal ingreso del asa de picadura
en el tubo en el caso de la batería bioquímica o la mala colocación del sensidisco en el caso del
antibiograma.
 Síntesis de información
IV) CONCLUSIÓN

A partir de este trabajo de investigación se pudieron concretar las siguientes conclusiones:

1. Los medios de cultivos para siembra y resiembra son muy estrictos, ya que no todos sirven
para la mismas muestras problema, para Gram – se utilizó XLD, EMB y MCK, para Gram + se
utilizó Müller-Hinton, Nutritivo y Barid-Parker.
2. Los métodos de siembra son diversos y definidos, con la siembra por estrías escocesas
logramos aislamientos de UFC y con la siembra en estrías por agotamiento logramos hacer
un trabajo más exhaustivo.
3. Definición de Gram –, Gram + y morfología bacteriana mediante frotis y tinción de la
muestra problema.
4. Pruebas bioquímicas para Gram- mediante batería bioquímica (enterobacterias), catalasa,
oxidasa y agar MCK. Antibiograma con cinco antibióticos diferentes siendo solo Gram – A
resistente a uno de estos.
5. Pruebas bioquímicas para Gram + mediante oxidasa, catalasa, agar Barid-Parker y
coagulasa. Antibiograma con cinco antibióticos diferentes siendo resistente solo a uno de
estos.
6. Identificación de las muestras problema gracias a los resultados de las diferentes pruebas
bioquímicas realizadas en la investigación.
 Material utilizado
V) BIBLIOGRAFÍA

 Pírez M., Mota M. Morfología y estructura bacteriana. 2008

 Velasco, M., Yamasaki, A. Bacterias de interés veterinario. 2002.
 Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología médica. 2010. 25 edición.
