EVALUACIÓN DE UNA VACUNA DE ADN CONTRA PHOTOBACTERIUM DAMSELAE

SUBSP. PISCICIDA. ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE EN EL LENGUADO

SENEGALÉS (SOLEA SENEGALENSIS KAUP)
M. Ponce, E. Zuasti, A. Crespo, C. Fernández y M. Manchado
IFAPA Centro El Toruño, Junta de Andalucía. Camino Tiro de Pichón s/n, El Puerto de Santa María 11500, Cádiz.
e-mail: marian.ponce.ext@juntadeandalucia.es

Summary
Photobacterium damselae subsp. piscicida is the aetiological agent of pasteurellosis, a bacterial disease that affects seriously soles grown in captivity provoking significant mortalities. Until moment, long-term effective
and oral protective vaccines to prevent pasteurellosis in sole are not commercially available. In this work, the HSP60 gene from P. d. piscicida was used to prepare a DNA vaccine (pPDPHSP60) that was employed to
determine the antibacterial immune response elicited by DNA vaccination in sole. Expression of pPDPHSP60 was confirmed both in transfected cells and in vivo using gut of orally vaccinated sole by RT-PCR analysis.
Expression profiles of genes involved in the innate immune system were determined in spleen from orally vaccinated sole using an OpenArray real time PCR approach. Results revealed that oral vaccination induced
coordinately the expression of genes involved in the response against bacterial infection.
Resumen
Photobacterium damselae subsp. piscicida es el agente etiológico de la pasteurelosis, una enfermedad bacteriana que afecta gravemente a los lenguados criados en cautividad produciendo importantes mortalidades. Hasta el
momento, no existen vacunas efectivas comercialmente disponibles con una larga protección y por vía oral para prevenir la pasteurelosis. En este trabajo, el gen HSP60 de P. d. piscicida se utilizó para construir una vacuna de
ADN (pPDPHSP60) y se usó para determinar la respuesta inmune antibacteriana provocada por la vacunación en lenguado. La expresión in vitro e in vivo de pPDPHSP60 fue confirmada mediante RT-PCR, tanto en células
transfectadas como en intestino de los individuos vacunados oralmente. Los perfiles de expresión de los genes implicados en el sistema inmune se determinaron en bazo de los lenguados vacunados oralmente mediante la
técnica de OpenArray PCR en tiempo real. Los resultados demostraron que la expresión de los genes implicados en la respuesta contra infecciones bacterianas aumentaba significativamente de forma coordinada.

Construcción de una vacuna de ADN contra Photobacterium damselae Diseño experimental

subsp. piscicida. Peso medio: 61.89 ± 10.36 g
Longitud media: 17.35 ± 0.86 cm
Cánula estéril

ac
0V
6
SP
06

PH
GRUPO I
SP

D
PH

pP
M n=8
PD

12 Kb
OC
1,650 bp
Nanopartículas de Vacunación oral
5 Kb
SC quitosano

2 Kb
GRUPO II GRUPO III
n=8 n=8

Nanopartículas de
quitosano con
pPDPHSP60 desnudo pPDPHSP60
encapsulado
Recientemente, el antígeno HSP60 de Ph.d.p. se ha identificado como posible candidato para el desarrollo de vacunas
de ADN contra la pasteurelosis (Ho et al., 2011). Por ello, el gen HSP60 se amplificó y secuenció a partir de ADN
genómico de una cepa de Ph.d.p. (L091106-03H) aislada por nuestro grupo. Se diseñaron cebadores específicos para la Para realizar el experimento, se distribuyeron 24 juveniles de lenguado, procedentes del centro IFAPA El Toruño,
clonación en el vector de expresión pcDNA™6.2/C-EmGFP-GW/TOPO® (invitrogen). El cebador directo contenía en tres tanques durante una semana antes de la vacunación. Posteriomente, se le administró mediante una cánula
una secuencia Kozak (verde y cursiva) justo antes del codón de inicio (rojo). Posteriormente, el plásmido estéril los siguientes tratamientos: grupo I, suspensión de nanopartículas de quitosano; grupo II: solución del
(pPDPHSP60) se purificó con el kit EndoFree Plasmid Mega purification. Se observaron dos bandas: una plásmido desnudo (30 µg); grupoIII: suspensión de nanopartículas de quitosano con pPDPHSP60 (30 µg)
correspondiente a la forma superenrrollada del plásmido (SC) y la otra correspondiente a la forma abierta circular encapsulado. A los 10 días tras el tratamiento, se sacrificaron mediante inmersión en fenoxietanol (100 ppm) e
(OC). inmediatamente se extrajo intestino y bazo.

Detección del ARNm pPDPHSP60 in vivo Análisis de expresión GENES DEL SISTEMA INMUNE INNATO

M 1 2 3 4 5 • SISTEMA DEL COMPLEMENTO (8)

M: Marcador de peso molecular (1Kb) MUESTRAS/ ENSAYOS/
CHIP MUESTRA • INTERLEUCINA Y RECEPTORES (15)
1: Control positivo (pPDPHSP60) 144 16
96 32 • QUIMIOQUINAS (6)
2: Nanopartículas
48 64
3: pPDPHSP60 desnudo 24 128 • LISOZIMAS (5)
12 256
100 bp 4: pPDPHSP60 encapsulado en nanopartículas 6 512 • INTERFERONES Y MX (9)
3 1024
5: Control negativo
1 3072 • RECEPTORES TIPO TOLL (4)

Para confirmar que el vector pPDPHSP60 encapsulado en nanopartículas era capaz de transcribirse tras la
administración oral, se aisló ARN total a partir de intestino. El análisis de transcripción se llevó a cabo mediante RT-
PCR usando cebadores específicos. En el caso de los juveniles vacunados oralmente con pPDPHSP60 encapsulado en
nanopartículas, se obtuvo un producto de amplificación de 127 pb, específico de la secuencia codificante de HSP60
de Ph.d.p., mientras que en los demás casos no hubo amplificación.
Los análisis de expresión se llevaron a cabo mediante la técnica de OpenArray PCR en tiempo real. El formato del
chip de OpenArray para los genes del sistema inmune innato fue 64 (ensayos) x 48 (muestras). El diseño de las
sondas se llevó a cabo a partir de las secuencias de genes relacionadas con el sistema inmune innato obtenidas de la
base de datos genómicos para lenguado soleaDB.

Pre-ensayo controlado con LPS y poli(I:C)

Respuesta de la vacuna de ADN
LPS Poli(I:C)
pPDPHSP60 desnudo
BAZO RIÑÓN CEFÁLICO BAZO RIÑÓN CEFÁLICO Nanopartículas
Expresión génica relativa

pPDPHSP60 encapsulado
GEN DIANA Fold-Change P-value Fold-Change P-value GEN DIANA Fold-Change P-value Fold-Change P-value en nanopartículas

lyg1 3.6 0.0002 3.0 0.0158

Lisozimas

lyg1 6.3 0.002 10.1 0.001

lyg2 5.4 0.0003 3.0 0.0028 lyg2 9.5 0.0006 9.2 0.0004
lyg3 6.0 0.0101 5.7 0.0368 lyg3 16.2 0.0004 27.8 0.0012
lyc1 50.3 0.0023 1.6 lyc1 1.5 0.4319 2.3
lyc2 89.3 0.0063 1.2 lyc2 1.1 0.9152 1.5

lyg1 lyg2 lyg3 lyc1 lyc2

BAZO RIÑÓN CEFÁLICO BAZO RIÑÓN CEFÁLICO

GEN DIANA Fold-Change P-value Fold-Change P-value GEN DIANA Fold-Change P-value Fold-Change P-value
pPDPHSP60 desnudo
Expresión génica relativa

Nanopartículas
c1q 0.4 0.0708 0.6 0.1025 c1q 1.3 0.4743 0.5 0.0203
pPDPHSP60 encapsulado
en nanopartículas
cfb 1.1 0.5584 0.9 0.9582 cfb 0.7 0.1934 6.6 0.0075
Complemento

c4a 4.0 0.0033 2.7 0.0102 c4a 0.5 0.0905 1.7 0.0545

c4b 4.6 0.0001 2.1 0.0295 c4b 0.7 0.2174 1.5 0.0301

c3 169.2 0.0067 0.5 0.0526 c3 2.1 0.4528 0.4 0.0103

c5 121.0 0.0132 0.7 0.6767 c5 1.2 0.8767 2.1 0.2233

c1q cfb c4a c4b c3 c5 c9 cfh

c9 168.2 0.0018 1.3 0.6491 c9 2.4 0.447 5.3 0.0022

cfh 98.2 0.0009 0.9 0.8557 cfh 1.7 0.4825 1.9 0.2405
En base a los resultados obtenidos en el pre-ensayo con LPS y Poli(I:C), la respuesta de la
vacuna de ADN administrada oralmente a juveniles de lenguado se evaluó en bazo. Los
Con el fin de conocer la respuestas específicas frente a estímulos bacterianos y víricos de los genes incluidos en el chip de OpenArray, se resultados de expresión tras la vacunación mostraron un aumento significativo de los
niveles de ARNm de lisozima C1 y C2 y del complemento C3, C5, C9 y factor H a los 10
analizaron en primer lugar las muestras de bazo y riñón cefálico procedentes de juveniles de lenguado inoculados con lipopolisacárido (LPS) y
días después de la vacunación. En el caso de los individuos tratados con nanopartículas
poli(I:C) que simulan estímulos bacterianos y víricos, respectivamente. Los datos de expresión demostraron que el tratamiento con poli(I:C)
incrementaba los niveles de ARNm de las lisozimas G1, G2 y G3 mientras que LPS activaba los niveles de ARNm de las lisozimas C1 y C2 y de sin plásmido y el plásmido desnudo, no se observó ninguna respuesta.
las fracciones del complemento específicamente en bazo y no en riñón cefálico.

Conclusiones
-Se ha construido una vacuna de ADN (pPDPHSP60) contra Phtobacterium damselae subsp. piscicida y se ha demostrado que induce la respuesta del sistema inmune innato en lenguado característica de
infecciones bacterianas.
-Se ha validado la técnica de OpenArray PCR en tiempo real para el estudio del sistema inmune innato en lenguado.

Bibliografía Agradecimientos
Ho, L.P., J. Han-You Lin, H.C. Liu, H.E. Chen, T.Y. Chen y H.L. Yang. 2011. Identification of antigens for the development of Este trabajo ha sido financiado por el proyecto AQUAGENET incluido dentro del
a subunit vaccine against Photobacterium damselae ssp. piscicida. Fish Shellfish Immunol. 30: 412-419. programa INTERREG IVB SUDOE (FEDER) (SOE2⁄1381P1⁄E287).