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Laboratorio de Microbiologia
Laboratorio de Microbiologia
1. OBJETIVO GENERAL:
Introducir al estudiante de medicina en los mtodos de identificacin de microorganismos patgenos
responsables de las principales enfermedades infecciosas humanas.
2. OBJETIVOS ESPECFICOS:
4.1. ACTITUDINALES:
a. Cumplir las normativas de bioseguridad
b. Escoger las pruebas de laboratorio adecuadas de acuerdo al tipo de infeccin
c. Compartir conocimientos y experiencias durante el proceso de aprendizaje
4.2. COGNITIVOS:
a. Identificar los diferentes microorganismos como bacterias, parsitos, hongos y virus
causantes de enfermedades
b. Conocer los principales mtodos de anlisis inmunolgico
c. Revisar los principales mtodos, medios de cultivos y coloraciones empleados para la
identificacin de microorganismos infecciosos
4.3. PROCEDIMENTALES:
a. Ejecutar correctamente la toma y recogida de muestras para anlisis microbiolgicos
b. Reconocer a travs del microscopio, los principales microorganismos patgenos a travs de
tinciones y montajes bsicos
c. Realizar siembras en los medios de cultivos comunes
d. Observar las caractersticas de crecimiento y multiplicacin de los microorganismos
3. CONTENIDOS
PARALELO 1,2,3,4
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Dcima segunda semana
12. Micosis.Toma de muestras y observacin de hongos: montajes y preparaciones
Dcima tercera semana
13. Tcnicas bsicas de inmunologa: aglutinacin, floculacin, micro-ELISA
Dcima cuarta semana
14. Investigacin de hematozoario: frotis, tincin e identificacin microscpica
Dcima quinta semana
SEGUNDA EVALUACIN: Dcima sexta semana
TERCERA EVALUACIN (PRCTICA): Dcima sptima semana
4. METODOLOGA, RECURSOS:
6.1. Mtodos didcticos
a. Charla de fundamentacin terica
b. Explicacin prctica y observacin
c. Realizacin de prcticas de pruebas de laboratorio
d. Lectura e interpretacin de resultados
6.2. Recursos
a. Uso del manual de prcticas de Laboratorio Microbiologa
b. Uso de Atlas de Microbiologa
c. Equipos de Laboratorio de Microbiologa (Microscopio, incubadora,
esterelizadora, etc.)
d. Medios de cultivo
e. Reactivos varios
f. Muestras biolgicas varias
7. EVALUACIN:
CRONOGRAMA DE EVALUACIONES:
a. 1ra. Evaluacin: Sptima semana
b. 2da. Evaluacin: Dcima sexta semana
c. 3era. Evaluacin: Dcima sptima semana
SISTEMA DE CALIFICACIN:
EVALUACIONES PARCIALES PRCTICA Y TERICA: 30 puntos
10 puntos de cada prueba parcial (dos parciales) ms 10 puntos entre examen prctico al
microscopio (6 puntos) y trabajos (consultas, reportes, otros) (4 puntos)
Nota final: 20 puntos
Primera parte: 10 puntos con un examen final del rea de Prcticas en la semana 18 de la
rotacin
Segunda parte (examen integrador de la Macrorea de Morfofuncin): semana 18
de la rotacin
8. BIBLIOGRAFA:
TEXTOS DE REFERENCIA:
Forbes-Sahm-Weissfeld, Diagnstico Microbiolgico (Bailey & Scott), 11 a edicin,
Editorial Mdica Panamericana, Argentina, 2004
ngel M., G. y M. ngel R., Interpretacin Clnica del Laboratorio, 6. edicin, Editorial
Mdica Panamericana, Bogot, 2.001
lvarez, M. V., et al, Manual de Tcnicas en Microbiologa Clnica, Asociacin Espaola de
Farmacuticos Analticos, Salamanca, 1.995
Henry, J. B., Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio, 9. Edicin, Editorial
Salvat Mdica, Mxico, 1.993
OPS/OMS, Manual de Tcnicas Bsicas en Bacteriologa Clnica, 1.995
TEXTOS RECOMENDADOS:
Atlas y apuntes de Microbiologa de la Dra. Celia Bowen disponibles en la pgina web
ftp.puce.edu.ec
Francisco Javier Prez Pazmio-Elena Granda Moreno, Manual de Prcticas de Laboratorio
de Microbiologa, para estudiantes de Medicina
PRCTICA No. 1
TEMA: Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiologa
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EL MECHERO DE BUNSEN
La llama ms utilizada en el laboratorio es la producida por la combustin de un gas
(propano, butano o gas ciudad), con el oxgeno del aire.
La combustin completa (con exceso de oxgeno) produce agua y dixido de carbono,
una llama poco luminosa y de gran poder calorfico.
La combustin incompleta produce, adems de dixido de carbono y agua, carbono,
nonxido de carbono y otros productos intermedios, da origen a llamas de bajo poder
calorfico y altamente luminosas (debido a la incandescencia de las partculas de
carbono que se producen).
Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir
diversos tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos.
Esencialmente constan de un tubo, llamado can, a cuya base llega la entrada de gas a
traves de un pequeo orificio (chicl).
En esta zona existen unas aberturas, regulables mediante una anilla (virola), que
permiten la entrada del aire al can.
La expansin del gas a travs del pequeo orificio succiona el aire exterior
produciendose, de este modo, una mezcla gas-oxgeno que asciende por el can hasta
la boca del mismo que es donde se produce la llama.
Sosteniendo con unas pinzas una cpsula de porcelana en la parte superior de la llama
producida con la entrada de aire cerrada, se observa un ennegrecimiento producido por
el depsito de carbn, lo que indica que la combustin es incompleta.
Sosteniendo con unas pinzas una cpsula de porcelana en la parte superior de la llama
producida con la entrada de aire abierta, se observa el depsito de pequeas gotitas de
agua, lo que indica la combustin completa del gas a dixido de carbono y agua.
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Al abrir el paso de aire, la combustin es completa y en la llama se aprecian dos zonas
claramente separadas por un cono azul plido.
En el exterior del cono la combustin es completa, existe un exceso de oxgeno y se
producen altas temperaturas (zona oxidante).
En el interior del cono los gases todava no se han inflamado y en el cono mismo hay
zonas donde la combustin no es todava completa y existen gases no oxidados a
dixido de carbono y agua por lo que se tiene una zona reductora de la llama
PRCTICA No. 2
PRCTICA No. 3
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impida tanto un contagio de la persona que procesa la muestra, as como una posible
contaminacin del cultivo donde se va a trabajar.
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PRCTICA No. 4
TEMA: Tcnica para la realizacin del antibiograma (ver pg. 23 del manual de
prcticas Lab. Microbiologa del Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de
prctica correspondiente colocado en la pgina ftp.puce.edu.ec)
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DISCOS DE ANTIBITICOS USADOS PARA GRMENES GRAM
POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE
AMBULATORI
GRAM POSITIVOS GRAM NEGATIVOS
Oxacilina (ox) Ampicilina (am)
Eritromicina (E) Cefuroxima (cxm)
Clindamicina (cc) Ampicilina + sulbactam (sam)
Cefoxitin (fox) Gentamicina (gm)
Sulfas (sxt) Norfloxacina (nor)
Ciprofloxacina (cip) Nitrofurantona (fm)
Vancomicina (va) Sulfas (sxt)
PRCTICA No. 5
PRCTICA No. 6
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productos finales del metabolismo oxidativo o aerbico de los hidratos de
carbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas
bacterianas.
2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas)
La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy
comnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de
estafilococos (positivos).
2. PARTE EXPERIMENTAL :
2.1.Tcnica o procedimiento: Estudio microbiolgico del esputo
Nota: Se utilizan tres medios de cultivo para el esputo que son: agar Macconkey,
agar sangre y caldo de tioglicolato. En la prctica haremos con agar sangre y caldo
de tioglicolato
a. Siembra en agar sangre (para identificacin de bacterias gram-negativas y
gram-positivas):
Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y esperamos a que adquiera
la temperatura ambiente
Encendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las muestras
de esputo cerca del mismo
Tomamos un cotonete de algodn estril y tomamos un poco de muestra
de esputo en una lado del agar, luego tomamos el asa lo esterelizamos
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en el mechero y luego de enfriar lo pasamos por el agar, justo en el sitio
por donde paso el cotonete, estriamos en tres direcciones alrededor de la
caja
Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35- 37C y
dejamos por 24 a 48 horas en la misma
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin se realiza la lectura de la
siembra y la interpretacin de la misma
b.Siembra en caldo de tioglicolato
Con el cotonete de algodn que se tom la muestra de esputo y se sembr en agar
sangre, introducir un poco de la misma en el caldo e incubar de 35 a 37C durante
48 horas.
Este medio se usa para determinar el efecto del oxgeno sobre el crecimiento
microbiano. Un tubo con medio semislido contiene tioglicolato para reducir el
potencial redox del medio. As slo hay oxgeno en la superficie y no en el resto del
tubo.
2.2.2.Coagulasa
Prueba en tubos (coagulasa libre):
1.- colocar aspticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de
un tubo estril.
3.- mezclar por rotacin suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.
4.- colocar el tubo en la incubadora de 4 a 24 horas. Observar la formacin de un
coagulo visible.
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halo de inhibicin alrededor del disco.
Materiales Reactivos
Asas microbiolgicas Placas coloreadas por
mtodo de gram
Incubadora a temperatura Agar sangre
35-37 C
Mechero de Bunsen Caldo de tioglicolato
Cajas petri Muestras de esputo
Hisopos estriles Perxido de hidrgeno
Microscopio Plasma de conejo
Placas portaojetos Discos de bacitracina
Tubos de ensayo
Palillos de dientes
PRCTICA No. 7
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2. Mtodo para el anlisis de orina macroscpico y qumico:
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urinarios, transforman el nitrato absorbido con la alimentacin en nitrito. Este
es detectado por una coloracin del rosa al rojo de la zona reactiva. El ensayo
se basa en el principio de la prueba de Griess y es especfico para el nitrito.
(indicio de IVU)
Protenas: El test se basa en el principio del error proteico de indicadores de
pH y reacciona de manera especialmente sensible a la albmina.
Glucosa: La deteccin de glucosa se efecta segn el mtodo especfico de la
glucosa-oxidasa-peroxidasa.
Cuerpos cetnicos: La deteccin se realiza en el principio de la prueba de
legal y reacciona ms intensamente al cido acetilactico que a la acetona.
Las cetonas son un subproducto del metabolismo de las grasas, presente con
inanicin y diabetes.
Urobilingeno: Es un producto de degradacin de la bilirrubina. El test se
basa en que una sal de diazonio estable produce con el urobilingeno, casi
instantneamente un colorante azico rojo
Bilirrubina: En la orina es un producto de degradacin de la hemoglobina.
La deteccin se basa en la copulacin de una sal de diazonio con bilirrubina
para formar un colorante azoico. Incluso los ms leves matices rosa ya deben
ser considerados como positivos.
Hemoglobina: Es un indicio de hemlisis. La mioglobina cataliza la
oxidacin del indicador por el hidroperxido orgnico contenido en el papel
reactivo. Puntos verdes aislados hasta acumulados en la zona reactiva
amarilla indican la presencia de eritrocitos intactos. La hemoglobina as
como los eritrocitos hemolizados o la mioglobina son indicados por una
coloracin verde homognea de la zona reactiva.
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por lo menos 10 campo de gran aumento y expresarlo como clulas por
campo. En el informe puede utilizarse un margen razonable.
g. Reportar:
h. Las clulas epiteliales (bajas) y altas si estn presentes en gran nmero o
como fragmentos (clulas transicionales)
i. Bacterias, levaduras, microorganismos. Una bacteriuria detectable a
pequeo aumento puede expresarse por lo menos como 2 +.
j. Los cristales se cuantifican bajo pequeo aumento. La presencia de cristales
anormales debe confirmarse qumicamentey correlacionarse con la historia
del paciente
k. Grandes cantidades de moco
OBSERVACIN: Para el siguiente literal por favor revisar el atlas para segundo
nivel ubicado en el internet cuya pgina es ftp.puce.edu.ec
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3.2.1. Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y realizamos el mismo
procemiento anterior hasta el literal 4.1.6, variando la tcnica de
estriado
3.2.2. Para el contaje de las colonias que crecieron, contamos las mismas
como U.F.C. (unidad formadora de colonias) en uno de los cuatro
cuadrantes de la caja de agar sangre, multiplicamos por cuatro y
obtenemos el U.F.C contenido en 0.001 ml que nos proporcion el asa
calibrada a ese volumen, luego efectuamos una regla de tres, ejemplo:
350 U.F.C 0.001 ml
X 1 ml
X= 350.000 U.F.C./ml
3.2.3. El resultado obtenido se lo compara con los rangos de valores
normales siguientes:
Menos de 10.000 U:F:C/ml se considera contaminacin
Entre 10.000 y 100.000 U.F.C./ml se considera sospecha de
infeccin
Mayor a 100.000 U.f.c./ml se considera infeccin
B. Materiales y reactivos:
Materiales Reactivos
Asas calibradas 0.001 ml Agar Mc conkey
Incubadora a temperatura 35-37 C Agar sangre
Mechero de Bunsen Muestras de orina
Cajas petri
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PRCTICA No. 8
II. Procedimiento
A. Con un asa estril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.
B. Incubar a 35 C por un mnimo de 48 horas.
C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a un tubo.
D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.
III. Resultados
Ensayo positivo: el reactivo permanece rojo.
Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.
Si el resultado es negativo continuar la incubacin de la bacteria por 24 horas ms.
2. ENSAYO DE VOGES-PROSKAUER
I. Principio
El piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del cido
pirvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para
formar como productos finales cidos lctico, actico o frmico. Otros metabolizan
el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales
acetona (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-
Proskauer (VP) detecta estos productos metablicos. En presencia de oxgeno e
KOH, la acetona se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del
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ensayo se aumenta por el agregado de -naftol antes del agregado de KOH.
II. Procedimiento
A. Con un asa estril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VP
B. Incubar a 37C por un mnimo de 48 horas
C. Transferir 2.5 ml de la suspensin a otro tubo
D. Agregar 0.6 ml del reactivo de -naftol
E. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOH
F. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutos
G. Observar la formacin de un color rosado a rojo
III. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutos
Ensayo negativo: no hay desarrollo de color
3. PRUEBA DE LA UREA
I. Principio
La urea es una diamida del cido carbnico, cuya hidrlisis por accin de la ureasa
da 2 molculas de amonaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza
independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la
capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinizacin del
medio. Es una actividad caracterstica de especies de Proteus y se usa para
diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rpido) de Providencia (-
); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-)
II. Procedimiento
A) Con un asa estril se toma abundante material y se inocula por puncin
B) Se incuba a 37C y se efectan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos
negativos se observan
diariamente por 4 a 7 das para detectar reacciones tardas que dan ciertos
miembros de la
familia, registrando los resultados da por da.
III. Resultados
Ensayo positivo: aparicin de color rojo en el medio por una alcalinizacin del
mismo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color.
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indicador de la presencia del aldehdo se usa el reactivo de Erlich. Es
especialmente til en la identificacin preliminar de Escherichia coli, y para
diferenciar Edwardsiella (+)de Salmonella (-).
II. Procedimiento
1) Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que
contiene triptofano.
2) Incubar a 37C por 18 a 24 horas.
3) Transferir 2 ml de la suspensin de caldo a un segundo tubo.
4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.
5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el
reactivo.
6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.
III. Resultados
Ensayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo,
segundos despus
de agregar el reactivo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.
5. AGAR KLIGLER
I.Principio
El agar de Kligler contiene dos azcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%).
Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la puncin como la estra aparecern
de color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estra permanecer cida
(amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve alcalina (roja). Los
organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o
producirn productos alcalinos y el medio permanecer rojo. La produccin de
SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.
II. Resultados
A. Estra cida/fondo cido (amarillo/amarillo): fermentacin de glucosa, lactosa
(E. coli)
B. Estra alcalina/fondo cido (rojo/amarillo): fermentacin de glucosa solamente
(Shigella spp.)
C. Estra alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas
aeruginosa)
D. Precipitado negro en el fondo: produccin de SH2 (Salmonella spp)
E. Burbujas o roturas: produccin de gas (E. coli, Salmonella spp.)
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acidificacin es necesaria para que ocurra la decarboxilacin. Este ltimo proceso
de lugar a la formacin de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje
del indicador al color violeta.
La prueba de la lisina ayuda en la diferenciacin de Edwardsiella (+), y Salmonella
(+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-)
y Enterobacter agglomerans (-)
II. Procedimiento
A. Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los
aminocidos
B. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estril.
C. Incubar a 37C
D. Efectuar las lecturas da por da hasta 4 das, registrando los resultados da por
da
III. Resultados
Ensayo positivo: medio turbio y prpura a prpura amarillento
Ensayo negativo: color amarillo
Tubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo
es un fermentador
de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo)
8. FENILALANINA DESAMINASA
Las desaminasas catalizan la prdida de NH3 en un aminocido originando un
cido carboxlico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen cido
fenilpirvico que con Fe3Cl en solucin cida produce un color verdoso ( resultado
positivo) y cuando es negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo).
9. MALONATO
El fundamento es igual al citrato, para ver si se utiliza al malonato como fuente de
carbono.
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PRCTICA No. 9
1. MARCO TERICO:
1.1.Parsitos
NEMATODOS: Gusanos redondos
Ascaris lumbricoides: Se observan huevos miden aprox. 45-75 x 30-50 mm,
presenta una clula rodeada por tres capas, producen una patologa de dolor de
estmago y desnutricin.
Uncinarias: Tienen una forma elptica, estn cubiertas de una membrana lisa,
transparente y fina, mide de 60 - 40 x mm producen anemia.
Enterobius vermiculares (Oxyurus):Los huevos son ovoides con una cara convexa
y una plana, presenta una membrana interna y delicada y otra gruesa hialina y
mamelonada, mide de 50-60 x 20-30 mm. Produce prurito en la regin perianal,
insomnio, cambios de conducta.
PROTOZOARIOS: Amebas
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Iodamoeba btschlii: Su quiste se caracteriza por la presencia de una vacuola de
yodo, no es una ameba patgena.
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1.2.Rotavirus:
PRCTICA No. 10
AISLAMIENTO.
1. Sembrar una asada de materia fecal sospechosa en el tubo de caldo de
tetrationato. Inocular con asa por emulsin.
2. De la misma manera sembrar otra asada de la misma muestra en el tubo de
caldo nutritivo.
3. Etiquetar con los datos respectivos
4. Levar a la incubadora a 37C durante 24 horas. Colocar los tubos en gradilla, de
tal manera que se mantengan en posicin vertical para evitar que el lquido se
derrame.
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5. A las 24 horas retirar los tubos de la incubadora.
6. Disponer sobre la mesa el medio selectivo (agar entrico Hektoen) para
resembrar el cultivo del caldo de tetrationato.
7. Resembrar en cada placa el inculo correspondiente
8. Tapar las placas. Etiquetar con los datos correspondientes
9. Llevar las placas a la incubadora. Colocarlas en posicin invertida. Mantenerlas
durante 24 horas.
10. Al da siguiente:
11. Retirar las placas de la incubadora.
12. Efectuar anlisis macroscpico de cada una para valoracin de la prueba
presuntiva
13. Efectuar anlisis microscpico por el mtodo de Gram de cada una de las
placas para confirmacin de la morfologa de los bacilos entricos
gramnegativos
PRCTICA No. 11
PRCTICA No. 12
TEMA: MICOSIS (ver pg. 52 del manual de prcticas Lab. Microbiologa del
Dr. F. Prez y mirar atlas con el nmero de prctica correspondiente colocado en
la pgina ftp.puce.edu.ec)
PRCTICA No. 13
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Durante la prctica los estudiantes se realizarn voluntariamente pruebas de ASTO,
VIH, y VDRL para poder observar la reaccin Ag-Ac. Estas pruebas tienen los
siguientes fundamentos:
VIH:
La prueba VIH 1&2 es un inmunoensayo rpido de un solo uso basasdo en
inmunocromatografa. Emplea reactivos nicos para la deteccin rpida y segura de
anicuerpos a VIH1 y VIH2 en suero y plasma humano sin instrumental.
ASTO:
Es una prueba rpida por el mtodo de aglutinacin utilizando partculas de ltex para
la deteccin de anticuerpos anti-estreptolisina del grupo O (ASO) en suero humano.
Los anticuerpos ASO son encontrados en el suero del paciente en respuesta a una
infeccin con Streptococo hemoltico del grupo A, C o G (ver el mtodo de
aglutinacin en el atlas).
PRCTICA No. 14
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