Obtención y Caracterización de Extractos Leucocitarios de Origen Bovino

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN
Obtencin y caracterizacin de dializados de

extractos leucocitarios de origen bovino
Tesis que para obtener el grado de Maestra en

Ciencias en Inmunologa
PRESENTA:
QFB Hctor Avalos Flores
DIRECTORES: Dra. Jeanet Serafn Lpez

Dra. Sonia Mayra Prez Tapia
Mxico, D.F. 2010

El presente trabajo se realiz en el Laboratorio de
Inmunologa Molecular II de la Escuela Nacional de
Ciencias Biolgicas del Instituto Politcnico Nacional,
bajo la direccin de la Dra. Jeanet Serafn Lpez
y la Dra. Sonia Mayra Prez Tapia.
As mismo, se cont con el apoyo del proyecto

Factor de Transferencia y de los proyectos.
SIP 20082261 y 20100333.
El sustentante fue becario PIFI y becario CONACYT

con nmero de registro 216198.
AGRADECIMIENTOS:
A Dios Nuestro Seor, por haberme permitido concluir sta meta, pero sobretodo, por
haber puesto en mi camino a tanta gente buena e interesante, ellos enriquecieron mi
pensamiento y mi vida.
A la Dra. Jeanet. Muchas gracias por haber contribuido de manera substancial en mi

formacin humana y cientfica. Sus consejos, paciencia y gran generosidad, fueron de
gran importancia durante todo este tiempo. Estoy contento de haberla tenido como mi
gua. La estimo mucho.
A la Dra. Mayra. Gracias por su paciencia y tiempo, pero principalmente por el enorme e
incondicional apoyo que siempre tuve cuando toqu su puerta.
A mis sinodales. Gracias por sus comentarios y crticas, siempre objetivas y

enriquecedoras. Sin lugar a dudas, ustedes formaron una parte importante de ste
esfuerzo en conjunto.
A todos mis profesores del posgrado, ya que con sus conocimientos y dedicacin, me
permitieron acercarme un poquito ms a esta amplia y maravillosa rea del conocimiento
llamada inmunologa. Es un orgullo para m el haber tenido la oportunidad de aprender
tanto de ustedes.
Al Dr. Eduardo San Juan y a la Dra. Martha Moreno Lafont, por su valiosa asesora en la
estadstica aplicada en este trabajo.
A la Dra. Myrna Vicencio y al grupo de Veterinaria del CEIEPAA, por su importante apoyo
en el facilitamiento de las muestras utilizadas en el proyecto.
A July de la Fuente y Roco Eretza, por su disponibilidad oportuna y amable siempre que
necesit de su asistencia.
A mis compaeros de laboratorio: Moiss, Yam Puc, Georgina, Violeta, Jessica, Too,
Marisol, Jos, Adrian, Estelita, Said, Nata, Frank, Edith, Edgar, ya que su compaa y apoyo,
fueron fundamentales para la culminacin del presente trabajo. Me llevo numerosos
recuerdos, todos ellos divertidos y agradables, y esto slo ha sido posible con ustedes a mi
lado.
A Violeta Dejanira, ya que contigo la palabra AMISTAD, tom un valor altamente

significativo para m (p <0.001) . Gracias amiga, por tantas risas, aventuras y diversin.
A todos los que con un consejo, una idea o tan slo una sonrisa, hicieron ms agradable mi
estancia en sta aventura. MIL GRACIAS ! ! ! . . . .
DEDICATORIAS:
A mis padres, Hctor y Lilia.
Gracias por que siempre han estado a mi lado, compartiendo mis alegras, triunfos, cadas
y fracasos. Los quiero mucho y siempre sern el mejor ejemplo de que con trabajo,
constancia, cario, gratitud y alegra, se puede lograr lo que uno se proponga.
A mi hermanita linda.
Eres la persona que ms quiero por tu sinceridad, inteligencia, positivismo y buen nimo.
Realmente ha sido grandioso tenerte como hermana.
A las personas que todava no conozco, pero que estoy seguro, formarn una parte
fundamental de mi vida. Espero tener la dicha de encontrarlos en el momento propicio . . .
"El principio fundamental de la vida
es no dejarse abatir ni por los
hombres ni por los acontecimientos"
(Marie Curie)
NDICE GENERAL
PAGINAS
NDICE GENERAL i
NDICE DE FIGURAS ii
NDICE DE TABLAS iv
ABREVIATURAS v
RESUMEN vii
ABSTRACT viii
INTRODUCCIN 1
Antecedentes histricos 1
Caractersticas generales y composicin de los DLE 3
Posibles mecanismos de accin de los DLE 4
Antecedentes del estudio de los DLE en modelos biolgicos 8
Uso y aplicacin de los DLE en la clnica 8
Uso e investigacin del calostro y DLE bovinos 10
Caractersticas y propiedades de los DLE bovinos 11
Perspectiva actual sobre el uso de los DLE bovinos 13
JUSTIFICACIN 15
HIPTESIS. 16
OBJETIVO GENERAL 17
OBJETIVOS PARTICULARES 17
MATERIALES Y MTODOS 18
RESULTADOS 31
DISCUSIN 54
CONCLUSIONES 68
PERSPECTIVAS 69
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 70
ANEXOS 77
i
NDICE DE FIGURAS
PAGINAS
Figura 1: Diagrama de obtencin de los diferentes dializados. 22
Figura 2: Esquema de inmunizacin para la DTH. 29
Figura 3: Leucocitos en el calostro bovino 40X. 32
Figura 4: Corrimiento electrofortico de muestras de calostro teidas 33

con azul brillante de Coomassie 0.2%.
Figura 5: Corrimiento electrofortico de muestras de dializados de 34

calostro y dializados de extracto de calostro teidas con azul
brillante de Coomassie 0.2% .

calostro y dializados de extracto de calostro teidos con
nitrato de plata.

extractos leucocitarios de sangre perifrica teidos con
nitrato de plata.
Figura 8: Barrido UV de los dializados obtenidos de las diferentes 39

vacas.
Figura 9: Barrido UV de los distintos dializados segn el tipo de 40

muestra.
Figura 10: Rangos de longitud de onda del espectro UV-VIS. 41
Figura 11: Barrido UV-VIS de 220-750 nm de las muestras Dcal de los 43

diferentes bovinos (v1, v2, v3).
ii
Figura 12: Barrido UV-VIS de 220-750 nm de las muestras DEcal de 44
los diferentes bovinos (v1, v2, v3).
Figura 13: Barrido UV-VIS de 220-750 nm de las muestras DLEsp de 45

los diferentes bovinos (v1, v2, v3).
Figura 14: Barrido UV-VIS de 220-750 nm de la muestra de DLEsp 46

humano.
Figura 15: Determinacin de TNF- en CMSP humanas estimuladas con 47

los dializados.
Figura 16: Produccin de TNF- por donador. 49
Figura 17: Reconocimiento de antgenos de M. tuberculosis 50

por suero de vacas infectadas con M. paratuberculosis.
Figura 18: Respuesta de DTH medida a 48 h. 52
iii
NDICE DE TABLAS
PAGINAS
Tabla 1: Actividades inmunolgica de los DLE. 7
Tabla 2: Padecimientos en los cuales se han empleado los DLE con 9

fines inmunoprofilcticos o inmunoteraputicos.
Tabla 3: Glosario de trminos. 18
Tabla 4: Nmero de clulas totales en el calostro bovino. 31
Tabla 5: Produccin normalizada de TNF- por donador. 48
Tabla 6: Valores significativos de la respuesta de DTH a las 24 h 52

haciendo una comparacin entre los diferentes dializados.
Tabla 7: Valores significativos de la respuesta de DTH a las 48 y 72 h 53

Tabla 8: Valores significativos de la produccin de TNF- haciendo 80

una comparacin entre los diferentes dializados con clulas
del donador 1.
Tabla 9: Valores significativos de la produccin de TNF- haciendo 81

una comparacin entre los diferentes dializados con clulas
de los donadores 2 y 3.
iv
ABREVIATURAS
Ab Anticuerpo (Antibody)
Ag Antgeno
AIF Adyuvante incompleto de Freund
AMPc Adenosin monofosfato cclico
BCA Acido bicinconnico (Bicinchoninic acid)
BSA Albmina srica bovina (Bovine seric albumin)
CD Antgenos de diferenciacin (Cluster differentiation)
CIF Factor inhibidor de calostro (Colostrum inhibitor factor)
CMN Clulas mononucleares
CMNSP Clulas mononucleares de sangre perifrica
DLE Dializado de extracto leucocitario (Dialyzable leukocyte extract)
DTH Hipersensibilidad retardada (Delayed type hipersensitivity)
DS Desviacin estndar
DTT Ditiotreitol
EAE Encefalitis autoinmune experimental
ELISA Inmunoensayo enzimtico (Enzyme-linked immunosorbent assay)
FT Factor de transferencia
HEK Clulas humanas embrionarias de rion (Human embryonic kidney cells)
HSV Virus del herpes simple (Herpes simple virus)
iNOS Oxido ntrico sintasa inducible (Inductible nitric oxide synthase)
IFN Interfern gamma
KLH Hemocianina de molusco (Keyhole limpet hemocyanine)
IMREG Inmunorregulador (Immune regulator)
LIF Factor inhibidor de la migracin de leucocitos (Leukocyte inhibitory factor)
LPS Lipopolisacrido
MHC Complejo principal de histocompatibilidad
(Major histocompatibility complex)
MIF Factor inhibidor de la migracin (Migration inhibitory factor)
MTSE Extracto soluble de Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium
tuberculosis soluble extract)
NADP Nicotinamida adenina dinucletido fosfato
PBS Regulador de salina fosfatos (Phosphate buffered saline)
PMN Polimorfonucleares
PPD Derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosis (Purified
protein derivative)
v
RIC Respuesta Inmune celular
RANTES Regulador normal en la activacin de T expresado y secretado
(Regulated on activation normal T expressed and secreted)
RM Regulador de muestra
SDS Dodecil sulfato de sodio (Sodium dodecil sulfate)
sc Subcutneo
SDSPAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio
(Sodium dodecil sulfate- poliacrilamide gel)
ss Solucin salina
TCR Receptor de clulas T (T cell receptor)
Th Linfocito T cooperador (T helper)
TLR Receptor tipo Toll (Toll-like receptor)
TNF- Factor de necrosis tumoral alfa
TGF- Factor de crecimiento transformante beta
UA Unidades de absorbancia
UV-VIS Ultravioleta visible
VIH Virus de la inmunodeficiencia humana
WB Inmunoelectrotransferencia (Western blot)
vi
RESMEN
Los dializados de extractos leucocitarios (DLE), contienen molculas por debajo de

12 kDa y transfieren respuesta inmune celular (RIC) de un organismo inmunocompetente
a otro. Por otra parte, es conocido que los dializados tienen la capacidad de regular a
otros elementos de la respuesta inmune de manera antgeno inespecfica; sin embargo,
no existe en la literatura evidencia suficiente que sustente que los dializados obtenidos de
calostro y de sangre perifrica de bovino sean semejantes en cuanto a su composicin y
efecto biolgico.
El objetivo de este trabajo fue demostrar la presencia de molculas de bajo peso

molecular capaces de transferir RIC utilizando dializados obtenidos a partir de calostro y
de sangre perifrica de bovinos. Adems se determin si stos inducen la produccin de
TNF- en clulas mononucleares de sangre perifrica humana (CMNSP). Para ello, se
obtuvieron dializados de extracto de calostro, de sangre perifrica y de calostro. Todas los
DLE se sometieron a electroforesis y se tieron con nitrato de plata para detectar pptidos
de bajo peso molecular. Por otro lado, se determin la huella espectral en el UV-VIS de
cada una de las muestras y se evalu la capacidad que tienen estos dializados de transferir
respuesta celular (DTH) en un modelo murino. Se determinaron los niveles de TNF- en
CMNSP estimuladas in vitro con los diferentes DLE.
Los resultados indican la presencia de pptidos de bajo peso molecular en los

dializados de sangre perifrica pero no en los de calostro. Los perfiles de absorcin UV-VIS
son distintos entre cada tipo de muestra y slo se present transferencia de respuesta
inmune celular con uno de los tres dializados de sangre de bovino, mientras que no hubo
transferencia de DTH con los DLE de calostro. Por otra parte, las CMNSP estimuladas con
los diferentes DLE fueron capaces de inducir la produccin de TNF- cuando stas se
compararon con el control sin estmulo. Sin embargo, se encontr diferencia estadstica
significativa (p<0.001) entre los DLE de bovino y el DLE humano, siendo ste ltimo el
dializado que induce una mayor cantidad de la citocina.
vii
ABSTRACT
Dializable Leukocyte Extracts (DLE) are immunomodulators that contents low

molecular weight peptides (<12kDa) that transfer the ability to express cell-mediated
immunity from sensitized donors to non-immune recipients. Also, they modulate the
immune response on an antigen-independent manner. However, there is no sustained
evidence that supports the similarities between DLE obtained from colostrum or bovine
blood regarding chemical composition and biological effect.
In this work, small molecules present in DLE derived from bovine colostrum and
bovine peripheral blood mononuclear cells were characterized along with the capacity to
transfer immune response. Thus, DLE from bovine colostrum and peripheral blood were
obtained from healthy cows according to Lawrence procedure. Electrophoretic runs were
performed using all of the extracts and the evidence of low molecular weight peptides
within the DLE was proved by silver stain, in addition UV-VIS spectroscopy was carried out
and the spectral profile of every sample was studied. Also the footpad swelling assay was
used and transference of immune response was mainly achieved with the bovine blood
dialyzates. Lastly DLE were assessed for their capability to stimulate TNF- production
using an in vitro model.
Our results indicate that small peptides are found within the DLE obtained from bovine
blood. Conversely, this result was not confirmed in DLE derived from colostrums. DLE had
significant differences in the profiles of UV-VIS absorption while transfer of delayed type
hypersensitivity was only achieved with one of three peripheral blood dialyzates. On the
other hand, colostrum dialyzates were not able to confer DTH response to naive mice.
Aside, mononuclear cultured cells were stimulated with all of the bovine dialyzates and
produced TNF- when compared with untreated control cells. However, statistical
significance (p<0.001) was seen when bovine DLE was compared with human DLE. Also, a
remarkable production of the cytokine was observed with human DLE in contrast to
bovine.
viii
ENCB-IPN 2010
INTRODUCCIN
ANTECEDENTES HISTRICOS
En 1942, Landstainer y Chase transfirieron respuesta inmune celular (RIC) de un donador

inmune a otro no inmune utilizando clulas del exudado peritoneal de cobayos sensibilizados con
tuberculina o con cloruro de picrilo (Landstainer y Chase 1942). Las clulas de los animales
sensibilizados eran transferidas a los receptores no sensibilizados y stos expresaban la RIC de los
donadores. Tambin observaron que, al eliminar los linfocitos de estas suspensiones celulares, se
perda la posibilidad de transferencia, pero sta poda restaurarse al reponer las clulas, siempre y
cuando stas estuvieran ntegras y viables (Chase 1945).
A mediados de la dcada de los cincuentas, Lawrence fue el primero en demostrar que las
respuestas de hipersensibilidad tarda cutnea (DTH) a tuberculina o a la sustancia M estreptoccica,
podan ser transferidas pasivamente con un extracto soluble de leucocitos, obtenido a partir de
donadores que haban dado una DTH positiva, a receptores normales que previamente haban dado
una prueba cutnea negativa (Lawrence 1955, Wilson y Fudenberg 1983). A la sustancia responsable
de esta actividad biolgica Lawrence la nombr Factor de Transferencia (FT). Cuando se describi este
fenmeno an no se conoca el mecanismo responsable de la DTH, por lo que el FT recibi poca
atencin; adems, en esa poca se crea que todo fenmeno inmunolgico era producido por
anticuerpos, pero los anticuerpos tienen un peso molecular de 150 a 1,000 Kilodaltones (kDa) y el
factor soluble encontrado por Lawrence pesaba menos de 20 kDa, por lo que quedaba descartada la
posibilidad de que el fenmeno se debiera a anticuerpos (Fudenberg y Pizza 1993). Ms tarde,
Lawrence demostr que era posible transferir RIC empleando un factor soluble, que previamente
pasaba por una membrana de dilisis con un corte molecular de 12 kDa.
Obtencin y caracterizacin de dializados de extractos leucocitarios de origen bovino

1
ENCB-IPN 2010
Esto llev a pensar que los dializados de extractos de leucocitos contenan solamente una
especie molecular, el denominado FT; sin embargo, se lleg a sugerir que en los dializados tambin se
podran encontrar especies moleculares incompletas, muchas de ellas con actividad biolgica; entre
ellas se propusieron prostaglandinas, timosina, hipoxantina, nicotinamida, quimioatrayentes etc.
(Kirkpatrick 1992, Fudenberg y Pizza 1993, Burger y col. 1976).
En 1979, Petersen y col. desarrollaron un modelo murino en el cual estudiaron la respuesta

celular antgeno especfica a travs de la determinacin de la transferencia de DTH, empleando un
dializado de extracto leucocitario (DLE) obtenido de esplenocitos de ratones sensibilizados con PPD,
ferritina o peroxidasa de rbano, entre otros. Dicho extracto fue suministrado posteriormente a
animales no sensibilizados y despus de 24 horas stos presentaron DTH positiva slo contra los
antgenos con los cuales haba sido inmunizado el donador. Como control negativo utilizaron DLE
obtenido de ratones no inmunizados, que al aplicarlo a ratones no inmunizados, no presentaron DTH
contra ninguno de los antgenos estudiados (Petersen y col. 1979).
Algunos aos despus, Borkowsky demostr que los factores de transferencia contenidos
dentro de los dializados, eran capaces de unirse especficamente al antgeno que les daba origen, pero
no as a los anticuerpos contra el mismo antgeno (Borkowsky y Lawrence 1981).
Para 1985, Kirkpatrick realiz un estudio de DTH empleando antgenos sintticos para
inmunizar ratones y obtener los DLE de stos. Al igual que en el trabajo de Petersen, los animales solo
presentaron una DTH positiva con el antgeno con el cual el donador haba sido inmunizado
(Kirkpatrick y col. 1985). Tiempo despus, el mismo Kirkpatrick confirm los trabajos de Borkowsky
donde se demostraba que algunas molculas dentro del DLE eran capaces de unirse al mismo antgeno
empleado para inmunizar a los animales de donde se obtuvo el DLE, es decir las molculas de FT eran
antgeno especficas. Kirkpatrick emple DLE de ratones sensibilizados con ferritina, los cuales incub
sobre superficies cubiertas con ferritina, al recuperar el sobrenadante, ste perda su capacidad de
transferir la DTH contra el antgeno; esta actividad poda ser recuperada si se eluan de la superficie las
molculas de FT empleando urea 8M o acetonitrilo (Kirkpatrick y col 1985, Kirkpatrick y Rozzo 1992).

2
ENCB-IPN 2010
CARACTERISTICAS GENERALES Y COMPOSICIN DE LOS DLE
Los DLE son todas aquellas molculas que se obtienen del rompimiento de leucocitos, y su
posterior dilisis por debajo de los 12 kDa. De estos dializados, los componentes que transfieren una
respuesta inmune especfica son los FT, que tienen un peso molecular comprendido entre 3.5 y 6 kDa.
Aunque los trminos DLE y FT han sido empleados indistintamente para referirse a un mismo producto,
cabe mencionar que nicamente el FT purificado se ha empleado en investigacin bsica. Todos los
protocolos clnicos desarrollados desde 1940 emplean DLE aunque se refieran a l como FT (Fudenberg
y Pizza 1993). De manera general, los componentes de los dializados de extractos de leucocitos han
quedado agrupados en dos fracciones principales:
La fraccin antgeno especfica o antgeno dependiente que corresponde a molculas de

naturaleza peptdica con un peso molecular de 3.5 a 6 kDa. En ella encontramos el FT, que est
constituido por pptidos pequeos con capacidad de transferir respuesta de tipo
hipersensibilidad tarda.
Tericamente, esta fraccin podra contener FT especfico para cada antgeno encontrado
durante la vida del individuo (Fudenberg y Pizza 1993, Lawrence y Borkoswsky 1983, Kirkpatrick
2000).
La fraccin antgeno inespecfica o antgeno independiente, comprendida por molculas por

debajo de 3.5 y por arriba de 6 kDa. Dentro de dicha fraccin, Gottlieb purific dos potentes
molculas inmunorreguladoras que son activas a concentraciones de menos de 1 microgramo
por mililitro. Estas molculas son conocidas como IMREG I e IMREG II. Ambas molculas poseen
la misma actividad biolgica; pueden amplificar y modular, pero no transferir respuestas de
hipersensibilidad tarda (Gottlieb 1991).

3
ENCB-IPN 2010
POSIBLES MECANISMOS DE ACCIN DE LOS DLE
Desde que se comenzaron a emplear como agentes inmunomoduladores, los efectos benficos
de los DLE han sido innegables; sin embargo, hasta el da de hoy no se ha dilucidado el mecanismo de
accin y esto se debe principalmente al poco conocimiento de todos sus componentes,
particularmente aquellos que son antgeno especfico como el FT (Shifrine y Scibienski 1975, Li 1985).
Para esto, se han desarrollado diversas hiptesis acerca del mecanismo de accin del DLE de acuerdo
con los trabajos realizados tanto in vitro, in vivo y ex vivo desde su descubrimiento.
Inicialmente se propuso que los DLE, (especficamente el FT) funcionaban simplemente

amplificando una sensibilizacin ya existente. Tambin se postul que los dializados contenan
fragmentos antignicos altamente inmunognicos. La primera alternativa se descart al realizar
experimentos controlados empleando ratones a los que se les administraron antgenos sintticos. Los
dializados obtenidos a partir de estos ratones fueron capaces de transferir una respuesta de
hipersensibilidad tarda cuando se aplicaron en ratones no sensibilizados que no tuvieron contacto con
los antgenos sintticos, ya que los antgenos que se elaboraron, no se encuentran en el medio
ambiente de manera natural (Kirkpatrick y col. 1985). Por otra parte, la segunda hiptesis no ha sido
totalmente descartada (Dwyer 1995).
No obstante lo anterior y con el conocimiento que se tiene actualmente sobre el sistema

inmunolgico, se han propuesto otras hiptesis: una de ellas es que el FT forma parte del TCR. Si esto
es cierto, entonces el FT sera necesario para la activacin de los linfocitos, y por lo tanto podra unirse
a las molculas de histocompatibilidad de clases I y II en las clulas presentadoras de antgeno, para
luego interaccionar con el TCR del linfocito T e iniciar su activacin (Kirkpatrick 1992, Dwyer 1995).

4
ENCB-IPN 2010
Otra hiptesis propone, que la porcin ribonucleotdica del FT se une por complementariedad a
un receptor de DNA que se encuentra en la superficie de la clula (Cech 1987) y una vez que se forma
el complejo FTreceptor, ste se internaliza en el interior de la clula (Shifrine y Scibienski 1975,
Fudenberg y Pizza 1993). Una alternativa ms, sera que el FT pudiera ser cortado, de forma que una
porcin del pptido permaneciera en la superficie celular y as formara parte del receptor (Kirkpatrick
1992, Kirkpatrick 2000, Dwyer 1995). Por otra parte, tambin se seala que el FT puede bloquear o
inhibir la supresin de poblaciones de linfocitos T, responsables de la inmunidad celular y por lo tanto
modular la misma (Alvarez-Thull y Kirkpatrick 1996, Borkowsky y Lawrence 1983).
En 1996, Alvarez-Thull y Kirkpatrick propusieron que el principal mecanismo inmunolgico del

FT es la activacin de los linfocitos T cooperadores tipo 1 (Th1). Para ello, desarrollaron un estudio en
el cual estimularon ratones BALB/c con FT especfico contra el virus Herpes simple (HSV) tipo I. Una
semana despus colectaron los bazos de estos ratones e in vitro estimularon los esplenocitos con HSV.
Posteriormente, en los sobrenadantes encontraron IFN y una baja o nula produccin de IL-4 e IL-10
(Alvarez-Thull y Kirkpatrick 1996). Apoyando esta idea, se ha encontrado que los DLE inducen la
proliferacin y activacin de linfocitos T CD4+ (De la Fuente Granada 2006), CD8+ (Berrn-Prez 2007),
y adems regulan la produccin de osteopontina y RANTES (Prez 2001). As mismo, en 2004 Fabr y
col. encontraron que los DLE favorecen un perfil de citocinas Th1, con un incremento en la produccin
de IFN-, IL-12 e iNOS y aumentan la sobrevida de los animales empleando un modelo murino de
infeccin con M. tuberculosis. Importante de mencionar, es el hecho de que los DLE, administrados en
combinacin con el tratamiento antifmico, aceleran la disminucin de las reas neumnicas as como
las unidades formadoras de colonias (Fabr y col. 2004).
Tratando de averiguar un poco ms sobre el efecto biolgico de los dializados, el grupo de

Ojeda, en 1996, realiz un estudio en el que se estimularon monocitos y clulas endoteliales con
productos de las paredes celulares de diferentes microorganismos seguidos por un tratamiento con
DLE, encontrando que los dializados suprimieron la produccin de TNF-, indujeron la liberacin de
IL-8 en los monocitos y aumentaron los niveles de AMPc (Ojeda y col. 1996).

5
ENCB-IPN 2010
Tambin se increment la produccin de IL-6 e IL-8 por parte de las clulas endoteliales; los
autores proponen que el efecto del DLE sobre los mediadores proinflamatorios es similar a la accin
del AMPc, el cual aumenta la concentracin de estas citocinas, sugiriendo de esta manera que uno de
los mecanismos de accin de los DLE, es a travs del incremento del AMPc en clulas endoteliales y
monocitos (Ojeda y col. 1996).
Posteriormente, siguiendo esta lnea de investigacin sobre el efecto de los componentes

bacterianos y el tratamiento con DLE, los mismos autores, confirmaron por citometra de flujo que los
dializados fueron capaces de aumentar la expresin de TLR2 y TLR4 (Ojeda y col. 2005).
Por otra parte, Robledo (2006) analiz si dentro de los DEL se encontraban ligandos para TLR2 y
TLR4. Para ello se emple un modelo de clulas HEK 293 transfectadas con TLR2 y TLR4, las cuales se
estimularon con diferentes concentraciones de DLE. Se encontr que slo existen ligandos para TLR2
pero no para TLR4, por lo que se sugiere que en los DLE no hay endotoxina o de lo contrario se hubiera
hallado alguna respuesta para TLR4. De hecho, este mismo autor propone que la activacin de
linfocitos T puede ser mediada por clulas presentadoras de antgeno profesionales (macrfagos y
clulas dendrticas) y que stas se activan con la mezcla de molculas contenidas dentro de los DLE. En
este caso y debido a la forma de obtencin de los dializados, podran existir molculas con un peso
menor de 10kDa capaces de activar directamente la inmunidad innata va TLRs y estimular la
produccin de citocinas proinflamatorias (Robledo 2006).
Otros trabajos mencionan que los dializados inducen un aumento de la capacidad de respuesta
de los linfocitos a mitgenos (Petersen y col. 1979., Burger y col. 1976), al igual que se ha reportado el
incremento de la cadena alfa del receptor para IL-2 (CD25) en clulas T CD4+. Para ello se utiliza DLE
obtenido a partir de una membrana de dilisis de 3,500 Da y posteriormente el dializado se aplica a
clulas mononucleares perifricas humanas (Prez-Tapia y col. 1999). Adems, tambin se ha
reportado el incremento de clulas T CD4+ CD25+ y de NKT en un ensayo ex vivo a las 24 h de haber
aplicado el DLE en personas sanas (Rodrguez 2004).

6
ENCB-IPN 2010
Con respecto a la citocinas que pueden ser moduladas por los dializados, Garca (2007)
encontr que la administracin de DLE de origen humano en clulas mononucleares de sangre
perifrica humana, induce la produccin de TNF- alcanzando un pico mximo de produccin a las 24 h
despus de su estimulacin. Tomando como base estos experimentos se ha tratado de implementar un
modelo in vitro que permita medir la actividad biolgica de los DLE (Garca 2007). De acuerdo con los
efectos que se han observado y resumiendo de manera general, algunas posibles hiptesis acerca de la
de accin de los DLE sobre el sistema inmune son:
TABLA 1. Actividades inmunolgicas de los DLE.
REPORTADO POR AO ACTIVIDAD MODELO

INMUNOLGICA
Lawrence 1955 El FT acta como adyuvante In vivo, voluntarios humanos

Kirkpatrick y Gallin 1974 Actividad quimiotctica para neutrfilos In vitro e in vivo monos Rhesus
y monocitos
Petersen y 1979 Aumento en la capacidad de respuesta In vitro, clulas mononucleares
Kirkpatrick mitgenos por parte de los linfocitos humanas
Kirkpatrick y col. 1995 Produccin de IFN- In vivo, ratones sensibilizados con
DLEs especficos
Alvarez-Thull y 1996 Secrecin de IFN- e IL-12, especficas de In vitro, esplenocitos de ratn
Kirkpatrick antgeno
Prez-Tapia 2001 DLE humano modula la expresin de In vitro, clulas mononucleares
osteopontina y RANTES humanas
Robledo 2006 Presencia de ligandos para TLR-2 en el In vitro, clulas HEK 293
DLE humano
De la Fuente 2006 Aumento en la activacin y proliferacin In vitro, clulas mononucleares
Granada de clulas mononucleares humanas
Garca 2007 DLE humano induce la produccin de In vitro, clulas mononucleares
TNF- humanas
Garca 2009 Las clulas mononucleares son las que In vitro, clulas mononucleares
responden al estmulo con DLE humanas
De la Fuente 2009 El DLE m modula la produccin de IL-6, In vivo, modelo murino de EAE
Granada IFN, TNF-, TGF- tratados con DLE
El DLE tiene efectos sobre la respuesta
Valderrbano 2009 inmune humoral, favorece la formacin In vivo, en un modelo murino
de centros germinales

7
ENCB-IPN 2010
ANTECEDENTES DEL ESTUDIO DE LOS DLE EN MODELOS BIOLGICOS
Para el estudio de los DLE in vivo se han propuesto diversos modelos biolgicos, como el de
rata, hmster, cobayo, perro etc. (Petersen y col. 1980). No obstante, algunos reportes indican
variaciones en los resultados obtenidos e incluso ausencia en la transferencia de RIC con estos
modelos (Williams y Kauffman 1980), por lo que esto dio paso al uso de modelos ms sencillos y
controlados con los que se permite estudiar la transferencia de inmunidad de manera clara y fcil. Fue
entonces que surgieron los modelos murinos, los cuales han sido empleados exitosamente por diversos
investigadores (Kirkpatrick y col. 1995, Petersen y col. 1980).
Rozzo y Kirkpatrick prepararon DLE murinos a partir de cepas de ratones genticamente

respondedoras a ciertos antgenos ( (BALB/c (H-2d), C57BL/10 (H-2d), B10.M (H-2f) ) y de cepas
genticamente no respondedoras a los mismos antgenos (B10.M (H-2q), CBA (H-2k) y SWR/J (H-2q) ).
Los DLE provenientes de ratones altamente respondedores fueron capaces de transferir la respuesta
de DTH a cepas no respondedoras; sin embargo, los dializados obtenidos de las cepas no
respondedoras no fueron capaces de transferir DTH a las cepas no respondedoras ni a las altamente
respondedoras. Con estos resultados, los autores propusieron que los DLE provenientes de un fenotipo
altamente respondedor son los mejores en inducir una respuesta positiva de DTH en receptores
genticamente no respondedores y que la produccin del factor de transferencia est regulado o
restringido por el MHC en los genes Ir, pero la actividad no est restringida en los receptores (Rozzo y
col. 1988).
USO Y APLICACIN DE LOS DLE EN LA CLNICA
De manera general, en la clnica se han utilizado los DLE como agentes inmunoprofilcticos o
como inmunomoduladores (Wilson y Fudenberg 1983). Respecto a la va de administracin, los DLE
pueden ser aplicados de distintas formas, incluyendo la oral, la subcutnea y la intramuscular
(Kirkpatrick 1995, 1996) pero para lograr una accin rpida se utiliza la va intravenosa (Fudenberg y
Pizza 1993).

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ENCB-IPN 2010
En este ltimo caso, se han realizado estudios comparativos entre las diferentes rutas de
administracin demostrndose que los efectos del DLE son los mismos sin importar la va de
administracin usada (Kirkpatrick y col. 1995).
Otro aspecto importante de mencionar en torno a los DLE, es que adems de transferir una RIC
antgeno especfica de un individuo a otro, la administracin de los DLE carece de reacciones
secundarias y no es txico. Finalmente, hasta la fecha no han habido reportes de reacciones adversas o
de hipersensibilidad debidas al uso de los DLE (Kirkpatrick 1996, Fudenberg y Pizza 1993).
La siguiente tabla comparativa ilustra los diversos padecimientos en los cuales se ha utilizado la
inmunoterapia con factor de transferencia de manera exitosa.
TABLA 2. Padecimientos en los cuales se han empleado los DLE con fines
inmunoprofilcticos o inmunoteraputicos.
I. INMUNODEFICIENCIAS II. ENFERMEDADES III. ENFERMEDADES

SEVERAS INFECCIOSAS AUTOINMUNES
A. Infecciones provocadas por hongos

1. Candidiasis mucocutnea
A.Defectos congnitos 2. Histoplasmosis diseminada A. Enfermedades autoinmunes
1. Sndrome de Wiskott-Aldrich 3. Coccidioidomicosis diseminada no rgano especfico
2. Ataxia telagiectasia 1.Lupus eritematoso
3. Sndrome de inmunodeficiencia B. Infecciones provocadas por virus crnico discoide
severa combinada 1. Citomegalovirus 2. Sndrome de Behcet
4. Sndrome parcial de Di George 2. Herpes zoster
5. Disgamaglobulinemia con defectos 3. Sarampin
en inmunidad celular 4. Otros (especialmente aquellos comunes
en inmunodeficiencias)
C. Infecciones provocadas por micobacterias

3
B. Defectos de etiologa desconocida 1. Tuberculosis
1. Sarcoidosis 2. Lepra
2. Enfermedad de Hodking 3. Mycobacterium fortuitum
D. Infecciones provocadas por protozoarios

1. Leishmaniasis cutnea
*Tabla modificada de Wilson y Fudenberg (1983).

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ENCB-IPN 2010
USO E INVESTIGACIN DEL CALOSTRO Y DLE BOVINOS
Es importante sealar que los DLE pueden ser utilizados intraespecficamente en diversas
especies de mamferos y aves. Esto se ha comprobado con DLE de vaca, en pollo, ratn y humano sin
encontrarse efectos adversos en la administracin de los dializados. En dicho estudio se emplearon las
tcnicas de DTH y de LIF para evaluar la respuesta inmune celular in vivo e in vitro, respectivamente
(Fudenberg y Pizza 1993). As mismo, se report que en Estados Unidos y China se han utilizado DLE (y
por lo tanto FT) para uso humano, a partir del calostro de vaca en el primero y de bazo de cerdos
inmunizados en el segundo (Fudenberg y Pizza 1993). Tambin hay reportes en donde se informa que
con DLE de bazo de porcino se puede tratar la miastenia grave (Fudenberg y Pizza 1993, Yang y col.
1991).
Para el ao de 1987, Duhamel y col. observaron grandes poblaciones de linfocitos T y B en las

secreciones mamarias de bovinos que estaban lactando. Quizs por primera vez, los investigadores
sugirieron que esto podra ser un evento esencial en la transferencia de inmunidad celular a travs del
calostro. La creencia de que los anticuerpos contenidos en el calostro eran la principal fuente de
proteccin inmunitaria estaba ahora en duda (Duhamel y col. 1987). Tiempo despus se demostr que
las poblaciones celulares en el calostro bovino eran linfocitos T y B; aunque tambin se encontraron
neutrfilos, monocitos y clulas plasmticas (Acosta-Altamirano y col. 2006). En 1988, Wilson y su
grupo demostraron algunas de las propiedades de los derivados de calostro, como la transferencia de
inmunidad celular y el incremento de respuesta de DTH, en animales a los que se les administraba el
extracto de calostro bovino. Para realizar sus experimentos, utilizaron agentes infecciosos exclusivos
de las aves de corral para inocular al ganado antes del parto, con el fin de analizar el efecto del DLE
bovino en las aves. Se prepar un extracto dializado de linfocitos de calostro de vaca y se inyect en
aves de corral que no haban tenido contacto con agentes patgenos, y se dej un grupo control que
no recibi el extracto. Luego observaron que las aves a las que se les inyect el extracto dializado
demostraron reactividad in vivo e in vitro a los agentes patgenos especficos utilizados para inocular al
ganado.

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ENCB-IPN 2010
Por otra parte, el grupo de aves que no recibi el extracto dializado no tuvo reaccin en ningn
ensayo concluyendo que los factores de transferencia podran funcionar entre especies ampliamente
divergentes, cuando estos son probados contra su antgeno especfico (Wilson y col. 1988, Fudenberg y
Pizza 1993).
CARACTERSTICAS Y PROPIEDADES DE LOS DLE BOVINOS
Los DLE bovinos pueden obtenerse a partir de leucocitos provenientes de sangre perifrica,
bazo y ganglios linfticos lisados que posteriormente se dializan (Franco-Molina y col. 2006). Tambin
se ha reportado la obtencin de DLE a partir de calostro bovino (Fudenberg y Pizza 1993). En este
ltimo caso se sospecha que los DLE de origen bovino contienen una alta cantidad de FT, el cual tiene
un peso molecular de 1.1 3 kDa y se encuentra formando parte de un mezcla compleja con otras
biomolculas. El FT es lbil al calor pero estable al fro. De hecho, su actividad biolgica de
transferencia persiste intacta despus de varios aos de almacenaje a temperaturas de -20C a -70C
(Wilson y col. 1982). Por otra parte, algunos estudios indican que el factor contiene nucletidos de
purina enlazados a pptidos pequeos (Fudenberg y Pizza 1993).
En cuanto a la actividad biolgica de los DLE bovinos, se ha reportado que estos poseen accin
bactericida contra diversos patgenos como: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria
monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella typhi. Para demostrar esto, Franco-Molina y
col. (2006), realizaron ensayos antimicrobianos en donde aplicaron DLE bovinos directamente a los
cultivos bacterianos y luego se determin la concentracin mnima inhibitoria (0.290.62 U/ml). Pero,
cabe sealar que este grupo de investigacin define una unidad de DLE bovino como el producto de la
dilisis de 1X108 clulas de bazo de vaca (Franco-Molina y col. 2006).

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ENCB-IPN 2010
Por otro lado, tambin se ha sugerido que los DLE bovinos tienen un efecto citotxico dosis-
dependiente en clulas de cncer de mama (MCF-7, BT-474, A-427) al utilizar un modelo in vitro en el
que las lneas tumorales se cultivaron en presencia de los dializados bovinos durante 72 h
encontrndose una concentracin de inhibicin al 50% de 0.06 U/ml. Adems, en este mismo modelo
se encontr que los dializados inhibieron la expresin de RNAm de genes antiapoptticos como p53 y
bcl-2 entre otros (Franco-Molina y col. 2006).
Es importante sealar que en todos estos reportes, los experimentos desarrollados fueron in
vitro; sin embargo, existen autores que al emplear los DLE bovinos in vivo, sealan que existe una
transferencia exitosa de RIC cuando se administran al ganado vacuno (Klesius y col. 1978).
Con respecto a los ensayos clnicos en humanos, Louie y col. (1987) trataron a ocho pacientes
que tenan VIH y que adems padecan de coccidiomicosis con DLE bovino especfico para
Cryptosporidium parvum. Cuatro de los ocho pacientes mejoraron clnicamente, mientras que los tres
restantes no mostraron mejora clnica. Interesantemente, un ltimo paciente del grupo no fue
afectado por Cryptosporidium parvum durante un perodo de 2 aos luego que termin el ensayo.
Recordemos que el sistema inmune de un paciente con VIH est altamente deteriorado por la infeccin
y sin embargo los DLE de bovinos inmunes a Cryptosporidium parvum fueron especficos y capaces de
mejorar la funcin inmunitaria en algunos pacientes. Por otra parte, la capacidad inmunomoduladora
de los DLE de origen bovino se pone de manifiesto en estudios in vivo en donde se demuestra un
aumento en la sobrevida de ratones BALB/c tratados con DLE, a los que posteriormente se les indujo
choque endotxico con LPS. Se observ un incremento en la sobrevida de hasta 90% y se determin
que el mecanismo responsable consisti en una regulacin negativa de citocinas pro-inflamatorias
(Franco-Molina y col. 2004).

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ENCB-IPN 2010
PERSPECTIVA ACTUAL SOBRE EL USO DE DLE BOVINOS
Segn algunas compaas comerciales, la obtencin de DLE a partir de calostro bovino es mejor
y ms barata en comparacin con la de tejidos humanos, como sangre perifrica. Esto debido a que se
eliminan varios pasos en el proceso de elaboracin, ya que algunos de los componentes de los DLE se
encuentran varias veces ms concentrados. Este ltimo hecho es reportado a manera de observacin
por Fudenberg (Fudenberg y Pizza 1993), por lo que actualmente, estas compaas ofrecen productos
tipo Factor de Transferencia a los cuales se les atribuyen numerosas propiedades benficas.
Dichos fabricantes emplean DLE bovino a partir de calostro, o incluso calostro bovino desecado
y suplementado con otros componentes para la elaboracin de sus productos. Un ejemplo de esto, es
el Transfer Factor PlusTM, producido por 4Life Research, USA. El producto es un concentrado patentado
de factores de transferencia (Transfer Factor XF TM) derivado del calostro bovino.
El calostro es la primera secrecin lctea de los mamferos despus del parto. Se constituye de
diversos componentes celulares y humorales cuya funcin principal radica en proteger al recin nacido
de los potenciales patgenos que pudieran estar en el medio ambiente, hasta que dicho animal
establezca sus propios patrones de defensa. En vacas, cabras, caballos y otras especies animales,
ocurre una transferencia pasiva de elementos del sistema inmune tales como: anticuerpos, clulas del
sistema inmune y diversas molculas, como lisozima, lactoferrina, etc. (Stewalgen y col. 2009).
Tambin se han encontrado diversas citocinas como: IL-1, IL-6 e IFN entre otras (Hagiwara y col.
2000). Ya desde hace tiempo se sabe que el consumo de calostro bovino por parte de humanos, tiene
importantes beneficios en la salud y desde la segunda mitad del siglo pasado, ha sido posible obtener
preparaciones estandarizadas y estables de calostro. Este calostro se administra en forma de
preparaciones concentradas, las cuales estn disponibles comercialmente, y se aplican en combinacin
con terapias estndar. La dosis de aplicacin vara desde los 10 a los 20 g diariamente. Esto ha
redituado en diversos beneficios clnicos para los pacientes (Struff y Sprotte 2008., Kelly 2003).

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ENCB-IPN 2010
Adems, grupos de investigacin en la Repblica Mexicana han empleado y promovido el uso

de DLE bovinos en diversas patologas y padecimientos (Franco-Molina y col. 2004, 2006). Mientras
que otros investigadores los han empleado como alternativa de tratamiento en el caso de otitis media
(Jones y col. 1981). Por ltimo, Wilson seala que el DLE humano y el DLE bovino tienen ciertas
semejanzas (Wilson y col. 1982); sin embargo, se conoce poco de las caractersticas fsicas (peso
molecular, huella espectral) y de las caractersticas biolgicas de los dializados de extractos derivados
de calostro, y de sangre perifrica de bovino, en comparacin con el extracto dializado humano. As
tambin, existe evidencia limitada en cuanto al estudio de estos extractos en modelos de transferencia
de inmunidad celular in vivo por lo que en el presente trabajo se pretende esclarecer las propiedades
qumicas y biolgicas de los DLE bovinos provenientes de calostro y de sangre perifrica

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ENCB-IPN 2010
JUSTIFICACIN
Dado que existen diversas fuentes para obtener dializados de extractos leucocitarios, el
presente trabajo pretende dar a conocer si los dializados obtenidos a partir de calostro y de leucocitos
de sangre perifrica bovina, exhiben las mismas propiedades biolgicas y fisicoqumicas. Esto es
relevante, debido a que actualmente no se cuenta con estudios en donde se aborde la caracterizacin,
anlisis y comparacin entre los dializados bovinos y los de origen humano. Por lo que encontrar
probables semejanzas entre estos biolgicos, permitira tener una mayor comprensin del fenmeno
de transferencia de inmunidad. De esta manera, se estara determinando la factibilidad de utilizar
otras especies animales como posibles donadores de dializados de extractos leucocitarios con actividad
antgeno especfica.

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ENCB-IPN 2010
HIPTESIS
Los DLE de origen bovino, provenientes de calostro y de sangre perifrica poseen
caractersticas fisicoqumicas y efectos biolgicos in vitro e in vivo semejantes,
entre ellos mismos.

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ENCB-IPN 2010
OBJETIVO GENERAL
Demostrar la presencia de molculas dializables con un peso molecular menor a 12 kDa

obtenidas de leucocitos de sangre perifrica y de calostro, capaces de transferir inmunidad celular
e inducir la produccin de TNF-.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Obtener dializados a partir de:

Extractos leucocitarios de sangre perifrica
Extractos de calostro desnatado
Calostro
2. Analizar los pesos moleculares de los pptidos de los dializados

obtenidos en el objetivo anterior.
3. Analizar la huella espectral en el UV-VIS de los tres diferentes

dializados en estudio.
4. Determinar la produccin de TNF-, en clulas mononucleares de

sangre perifrica humana.
5. Demostrar la transferencia de inmunidad empleando los dializados,

y midiendo como variable de la respuesta inmunolgica la DTH.

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ENCB-IPN 2010
MATERIALES Y METODOS
1. OBTENCIN DE DIALIZADOS DE EXTRACTOS LEUCOCITARIOS

Y DE CALOSTRO
Dado que la fuente de obtencin de los DLE es muy diversa, se estableci un glosario de trminos
que permitieran comprender el origen y el proceso aplicado en cada una de las muestras analizadas en
este estudio:
TABLA 3. Glosario de trminos.
(a) Dializados obtenidos en este trabajo (b) Testigos utilizados en los ensayos
a)
NOTACIN SIGNIFICADO CARACTERSTICAS
Dcal Dializado de calostro Calostro sin lisar que fue dializado
DEcal Dializado de extracto de calostro Calostro lisado que fue dializado
DLEsp bov Dializado de extracto leucocitario Extracto de clulas linfoides de sangre
de sangre perifrica de bovino perifrica lisadas y dializadas
b)
NOTACIN SIGNIFICADO CARACTERSTICAS
DLEsp hum Dializado de extracto leucocitario Extracto de clulas linfoides de sangre
de sangre perifrica humana perifrica lisadas y dializadas
DLE mur Dializado de extracto leucocitario Extracto de clulas linfoides de bazo,
de bazo murino lisadas y dializadas
OBTENCIN DE LAS MUESTRAS BIOLOGICAS.
Todas las muestras fueron gentilmente proporcionadas por el Centro de Enseanza,

Investigacin y Extensin en Produccin Animal en Altiplano (CEIEPAA) UNAM, ubicado en
Tequisquiapan, Qro. En estas instalaciones se mantiene un registro del estatus general de las vacas de
las cuales se obtuvieron los extractos. Se conoce la fecha de inseminacin, enfermedades, vacunas
aplicadas, y tambin la fecha probable de parto de cada animal. En esta ltima instancia, un equipo
calificado de veterinarios realiz el trabajo de parto en el animal y recolect una pinta de sangre. El
calostro se obtuvo durante las primeras 24 h posparto., y las muestras fueron transportadas en
cadena fra y se almacenaron en refrigeracin hasta su procesamiento.

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PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Calostro bovino
Proceso de desnatado
Procedimiento sujeto a revisin para patente.

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Sangre perifrica
Obtencin de leucocitos de sangre perifrica
OBTENCION DE DEcal y DLEsp

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OBTENCION DE Dcal

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Leucocitos de sangre
perifrica en Calostro
solucin salina desnatado
Calostro
desnatado
10 ciclos de lisis por choque trmico
Dilisis con un corte de 12 kDa Dilisis con un corte de 12 kDa
Dializado de extracto leucocitario

de sangre perifrica (DLEsp) Dializado de
calostro
Dializado de extracto de calostro (Dcal)
(DEcal)
Concentracin y determinacin de protenas
Envasado
Control de calidad Congelacin
FIG. 1 Diagrama de obtencin de los diferentes dializados

Se emplearon calostro desnatado bovino y leucocitos de sangre perifrica bovina para elaborar DEcal y DLEsp
respectivamente. Para el Dcal se parti de calostro desnatado el cual se dializ directamente, sin lisis previa.

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ENCB-IPN 2010
2. DETERMINACIN DLE PESO MOLECULAR DE LOS PPTIDOS

CONTENIDOS EN LOS DIALIZADOS
CUANTIFICACIN DE PROTENAS
DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR
El clculo del peso molecular de los pptidos de los dializados se realiz por electroforesis en
geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida

Primero se vaci una mezcla del gel de resolucin al 15% (10 ml) (ver apndice I) en medio de
una placa de vidrio y una de slice para obtener geles de 1.5 mm de grosor, empleando cmaras de pre-
paracin de geles Mighty Small Dual Gel Caster (Hoefer Scientific Instruments, CA, USA). Tras el llenado
de las placas, inmediatamente se adicion isobutanol saturado con agua para proporcionar al gel una
superficie plana. Una vez solidificado el gel, se elimin el exceso de isobutanol lavando con agua
destilada.

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ENCB-IPN 2010
Despus, sobre el gel de resolucin se vaci la mezcla del gel concentrador al 5% (ver apndice
I) e inmediatamente se coloc el peine con dientes, se dej solidificar y el paquete de placas con los
geles se pas a una cmara de corrimiento Mighty Small II SE 250 (Hoefer Scientific Instruments, CA,
USA). Por ltimo, se retir el peine y la cmara se llen con regulador de corrimiento. Se colocaron
4 L del marcador de bajo peso molecular (Rainbow GE Healthcare Piscataway NJ, USA) y en los pozos
se colocaron 30 g de cada una de las muestras: Dcal, DEcal, DLEsp bov, DLEsp hum y Cal comercial
(muestra de calostro bovino disponible en el mercado, el cual dice contener factor de transferencia).
Todas las muestras se corrieron en condiciones reductoras. Para ello, se prepar el regulador de
muestra (RM) con ditiotreitol (DTT) (Sigma- Aldrich St. Louis MO, USA), y una cantidad de una solucin
madre de dodecil sulfato de sodio (SDS) (GE Healthcare Piscataway NJ, USA) al 10%. Esta mezcla
reductora se mezcl con la muestra volumen a volumen y se incub en bao mara a ebullicin durante
un minuto. El corrimiento electrofortico se desarroll aplicando una intensidad de corriente
constante de 20 mA por placa hasta que la marca del colorante lleg al borde inferior.
Tincin de protenas con azul Coomassie y con nitrato de plata

Despus del corrimiento, los geles se tieron con azul brillante de Coomassie al 0.02% (Sigma-
Aldrich St. Louis MO, USA) dejndose en presencia del colorante por toda una noche. Al da siguiente
se destieron poco a poco utilizando una solucin a base de metanol y agua. Este procedimiento se
realiz hasta que se visualizaron las bandas y se apreci un fondo claro ver (apndice I).
En el caso de la tincin argntica, se utiliz el estuche comercial de tincin Silver Stain Kit
(GE Healthcare Piscataway NJ, USA). Brevemente, los geles se sumergieron en 125 ml de solucin de
fijacin durante media hora, despus sta fue sustituida por 125 ml de solucin de sensibilizacin
durante 30 min; pasado este tiempo, el gel se lav varias veces con 250 ml de agua Millipore. A
continuacin, los geles se dejaron con la solucin de nitrato de plata por 20 min y despus se lavaron
un par de veces con 250 ml de agua Millipore.

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Para visualizar los pptidos, los geles se sumergieron en una solucin de carbonato de sodio
hasta la visualizacin de las bandas. Finalmente, para detener la reaccin se adicion solucin de paro
durante 10 min y despus se procedi a la digitalizacin de las imgenes por medio de un escner.
3. ENSAYOS DE ESPECTROSCOPIA UV
El anlisis espectrofotomtrico arroja informacin como composicin de aminocidos aromticos,

presencia de enlace peptdico y de grupos prostticos en una mezcla de protenas o de pptidos. Por
otra parte, la espectroscopia UV es una tcnica que permite obtener un panorama general de la
identidad qumica de una mezcla de molculas. En dicho ensayo se evalan las regiones del espectro
UV-VIS en las cuales las molculas son capaces de absorber radiacin y alcanzar elevados estados de
excitacin. Esta propiedad se debe principalmente a la composicin, estructura, momento espacial y
concentracin que experimenta una mezcla de molculas en solucin.
Se evaluaron las siguientes muestras: Dcal, DEcal, DLEsp bov, DLEsp hum y Cal comercial. La
concentracin de las muestras se ajust a 100 g/ml y se tomaron 4 L de las mismas para leer en el
espectrofotmetro. Se ley dentro de dos intervalos de longitud de onda, el primero desde 220 hasta
350 nm y el segundo abarc desde 220 hasta 750 nm.
Posterior a la lectura, se elaboraron grficas para cada tipo de dializado, y as se obtuvo la huella
espectral de cada uno de los dializados por separado, luego se analizaron los datos y se hicieron las
grficas correspondientes. Todas las mediciones se realizaron en el espectrofotmetro Nanodrop
ND-1000 (Termo Scientific Wilmington DE, USA).

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4. DETERMINACIN DEL EFECTO BIOLGICO in vitro

DETECCIN DE LA PRODUCCIN DE TNF- POR ELISA

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5. DETERMINACIN DEL EFECTO BIOLGICO in vivo
INMUNODETECCIN DE ISOTIPO DE ANTICUERPO DETECTADO
De acuerdo a la informacin proporcionada por los mdicos veterinarios del CIEEAPAA-UNAM,

las vacas estaban infectadas con Mycobacterium paratuberculosis y debido a que se realizaran
pruebas de transferencia de inmunidad, se decidi averiguar si realmente estas vacas presentaban una
respuesta inmune contra antgenos de micobacterias. Para ello, se utiliz la tcnica de Western blot
(WB) empleando un extracto soluble de M. tuberculosis (MTSE) como antgeno y suero de las vacas de
las cuales se obtuvieron las muestras de sangre perifrica y calostro. De esta forma se evalu la
reactividad de las vacas ante antgenos de micobacterias y con ello se estableci que eran
seropositivas. Aunque este procedimiento no sea la mejor manera de estudiar la respuesta celular en
las vacas, s permiti saber que stas ya tenan inmunidad humoral especfica para antgenos de
micobacterias y para que esto haya ocurrido, tuvo que haber una participacin previa de la respuesta
celular. Con este dato, se propuso el uso de un extracto proteico soluble de micobacterias en los
ensayos biolgicos de transferencia de inmunidad.
Para realizar el WB, primero se prepar un gel SDS-PAGE al 10% utilizando un peine ciego. El
gel se carg con 256 g de MTSE diluido 1:2 con el regulador de muestra y sometida a condiciones
reductoras. El gel cargado se corri a 20 mA durante 120 min y al trmino del corrimiento
electrofortico, se prepar el dispositivo para transferir las protenas del gel a una membrana de
nitrocelulosa (Hybond-ECL GE Healthcare Buckinghamshire UK). La cmara se llen con regulador de
transferencia y se corri a 50 V por 4 h.
Una vez realizada la transferencia, se recuper la membrana de nitrocelulosa y se dej secar.

Se efectuaron cortes para obtener tiras de 0.5 cm y se seleccionaron 4 de stas para el ensayo. Las tiras
se depositaron en una charola con solucin de bloqueo (leche descremada Svelty al 5% ms Tween 20
al 0.01%) (Sigma- Aldrich St. Louis MO, USA) y se incub 1 h a temperatura ambiente.

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Posteriormente, se lavaron 12 veces con PBS (Solon, Ohio). Luego, las tiras se incubaron con los
sueros provenientes de cada una de las vacas (anticuerpo primario) a una dilucin 1:50, durante toda
la noche a 4C.
Terminada la incubacin, las tiras se lavaron 10 veces con PBS y luego se dejaron en contacto
con el anticuerpo secundario anti-Igs totales de vaca marcado con peroxidasa (Zymed-Invitrogen Sn
Francisco, USA) a una dilucin 1:1000 por 1 h a 37C en obscuridad. Al trmino de la incubacin, se
elimin el exceso de anticuerpo lavando las tiras 7 veces con PBS-Tween y luego 10 veces con PBS.
Finalmente, se revel con el sustrato de la enzima: perxido de hidrgeno (Sigma- Aldrich St. Louis MO,
USA) y carbazolona (The Research Organics Cleveland Ohio, USA) como cromgeno.
PRUEBA DE HIPERSENSIBILIDAD CUTNEA TARDA (DTH)
La hipersensibilidad celular es una manifestacin de la respuesta inmune celular y en ella

participan los linfocitos T, los macrfagos y las citocinas producidas por estas clulas. Por lo tanto, esta
forma de respuesta no puede transferirse con el suero.
Otra caracterstica muy particular de esta manifestacin del sistema inmune es la especificidad
antignica, es decir, las poblaciones de leucocitos T sensibilizados con cierto antgeno slo responden
contra el antgeno con el cual tuvieron contacto.
Se emplearon ratones hembras de la cepa BALB/c (Harlan, Mxico) de aproximadamente el

mismo peso y de una edad comprendida entre 6-7 semanas. Se formaron 13 grupos de 7 ratones cada
uno y se trataron como se describe en la FIG. 2. El DLE murino (DLE mur) se obtuvo a partir de bazos de
ratones inmunizados con MTSE (el antgeno que se us en la DTH), ms adyuvante incompleto de
Freund (AIF) (Sigma- Aldrich St. Louis MO, USA). Los ratones que mostraron previamente una DTH
positiva y se emplearon para elaborar el dializado.

28
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Este dializado se incluy en el ensayo como control de transferencia, ya que segn la literatura
y con base en experimentos anteriores, se observ que la transferencia de inmunidad es ms notable y
eficiente cuando se emplean dializados que fueron obtenidos a partir de la misma especie que el
receptor; adems, la sensibilizacin del donador es crucial al momento de obtener buenas respuestas
de transferencia de inmunidad. EL DLE mur se administr siguiendo el mismo esquema de
inmunizacin que los dems dializados y se consider dentro de los grupos de prueba. Para el caso de
los grupos control, se inmuniz a los ratones con 20 g de MTSE ms adyuvante incompleto de Freund
(control positivo) 100 L de solucin salina (Pisa Guadalajara, Mx) (control negativo) por va
subcutnea en la base de la cola, los das 0 y 7. Los grupos prueba recibieron 10 g de cada uno de los
dializados por va subcutnea (sc) en la base de la cola (FIG. 2).
FIG . 2 Esquema de inmunizacin para la DTH

Se formaron 13 grupos de 7 ratones cada uno. Los grupos 1-11 fueron inoculados con10 g de cada uno de los dializados 24 h antes del reto antignico. El
grupo 12 fue inmunizado con 20 g de Ag ms AIF durante los das 0 y 7 antes del reto. El grupo 13 fue el grupo control al que solo se le administr
solucin salina antes del reto. Despus de 48 h se retaron todos los grupos y se hizo la lectura de DTH en los tiempos sealados. Las flechas en verde
sealan a los grupos testigo, la flecha amarilla a los grupos prueba y la flecha caf denota el reto.

29
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A los grupos testigo y de prueba el reto que consisti en la administracin subcutnea de 5 g

del extracto soluble de micobacterias en un volumen de 20 L en la pata trasera derecha de cada uno
de los ratones (testigo positivo del reto). Como testigo negativo del reto, se aplicaron 20 L de solucin
salina al 0.85% estril y libre de pirgenos en la pata izquierda trasera.
Transcurridas 24 h despus del reto, se procedi a efectuar la prueba de DTH tomando 3

lecturas continuas de la induracin del cojinete plantar de cada una de las patas a 24, 48 y 72 h y se
obtuvo un promedio. El instrumento de medicin fue un micrmetro tipo vernier digital calibrado
(Quick Mini Micrometer, Mitutoyo Maplewood NJ, USA).
Para obtener la variacin de la induracin ( grosor) del cojinete plantar de cada uno de los
grupos, se aplic la siguiente frmula:
( grosor) = (t48) (t0)
Donde:
(t48) = (promedio de induracin cojinete derecho)t48 - (promedio de induracin cojinete izquierdo)t48
(t0) = (promedio de induracin cojinete derecho)t0 - (promedio de induracin cojinete izquierdo)t0
ANLISIS ESTADSTICO
Para el anlisis estadstico del ensayo de DTH, se emple la prueba de ANOVA bifactorial de
mediciones mltiples y como anlisis comparativo se emple la prueba de Student Newman Keuls.
Para la estadsitica de la determinacin de TNF- se utiliz la prueba de anlisis de varianza (ANOVA)
unifactorial en rangos por Tukey. Toda la estadstica se desarroll con ayuda del programa Sigma Stat
versin 3.5. Los valores de p0.05, se consideraron estadsticamente significativos.

30
ENCB-IPN 2010
RESULTADOS
1. Obtencin de dializados de extractos leucocitarios y de calostro
Siguiendo los procedimientos descritos en la metodologa y una vez realizado el proceso de

desnatado, se procedi a estudiar si haba clulas en el calostro y se encontraron los resultados que se
muestran en la tabla 5.
Dado que la cantidad de clulas totales halladas en el calostro, no son leucocitos en su

totalidad sino que tambin se observaron clulas epiteliales, se propuso evidenciar la presencia de los
leucocitos en el calostro por lo que se emplearon 2 procedimientos:
Tincin de Wright Giemsa, que tie selectivamente a los leucocitos.
Cuenta leucocitaria total, empleando lquido de Turk.
TABLA 4. Nmero de clulas totales en el calostro bovino.

Se tom una alcuota de 500 l de calostro desnatado y se diluy 1:100 en azul tripano.
Se realiz el conteo celular y la viabilidad fue del 80%.
VACA CLULAS / ml
1 75 X 106
2 82 X 106
3 69 X 106
Por la tincin de Wright-Giemsa se observ una cantidad notable de clulas linfoides, (FIG. 3)
mientras que por la tcnica de Turk se encontr que la cuenta leucocitaria, en promedio, era de
46X106 leucocitos/ml de calostro, en cada vaca.

31
ENCB-IPN 2010
(2)
(1)
(4)
(3)
FIG. 3 Leucocitos en el calostro bovino 40X

Se hizo un frotis con una gota de calostro desnatado y se ti con colorante de Wright.
Se observan: (1) polimorfonucleares, (2) linfocitos, (3) clulas mononucleares y (4) corpsculos de grasa

32
ENCB-IPN 2010
2. Determinacin del peso molecular de los pptidos contenidos

en los dializados
Con el fin de visualizar a los pptidos componentes proteicos de los dializados y determinar
su peso molecular, se realizaron diversos geles de SDS-PAGE al 15 %. La FIG. 4 muestra la separacin
electrofortica que se obtuvo cuando el calostro desnatado (Cal D), se someti a lisis (Cal DL) y
posteriormente a dilisis para quedar como dializado de extracto de calostro (DEcal).
MPM 1) 2) 3)
46kDa
30kDa
21.5kDa
14.3kDa
6.5kDa
3.4kDa
FIG. 4 Corrimiento electrofortico de muestras de calostro teidas con azul brillante de Coomassie 0.2%
Se colocaron 5 g de Cal D (carril 1), Cal DL (carril 2) y DEcal (carril 3), fueron sometidas a la separacin en un gel de SDS-PAGE al 15%.
(MPM) Marcador de peso molecular.

33
ENCB-IPN 2010
Se observaron bandas en un intervalo de peso molecular de 14.3 a 46 kDa, (para el presente

trabajo, se considera alto peso molecular al intervalo recin mencionado) en el calostro desnatado sin
lisar (1) y en el lisado (2). Sin embargo, en el dializado de calostro no fue posible apreciar ninguna
banda. Con el fin de verificar si esto tambin ocurra en los otros dializados, se procedi a hacer el
corrimiento electrofortico de todas las muestras de calostro, incluyendo un derivado comercial de
calostro (Cal comercial) y tambin dializado de calostro (Dcal).
Como se puede notar en la FIG. 5, ni el dializado de calostro, ni el dializado de extracto de

calostro de cualquiera de las 3 vacas, muestran ninguna banda de bajo peso molecular. Es importante
sealar que tampoco el derivado comercial de calostro mostr bandas de bajo peso donde se propone
que se encuentran las molculas tipo factor de transferencia.
MPM 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)
46kDa
30kDa
21.5kDa
14.3kDa
6.5kDa
3.4kDa
FIG. 5 Corrimiento electrofortico de muestras de dializados de calostro

y dializados de extracto de calostro teidas con azul brillante de Coomassie 0.2%
Se colocaron 30 g de Dcal v1 (carril 1), Dcal v2 (carril 2), Dcal v3 (carril 3), DEcal v1 (carril 4), DEcal v2 (carril 5), DEcal v3 (carril 6), y
Cal comercial (carril 7), fueron sometidos a la separacin en un gel SDS-PAGE al 15%. (MPM) Marcador de peso molecular. Dentro del
crculo se aprecia tenuemente la presencia de bandas de alto peso molecular en el derivado comercial.

34
ENCB-IPN 2010
Pensando en que los pptidos de bajo peso molecular no podan ser detectados por el azul
Coomassie, se realiz otro gel con las mismas muestras y se utiliz la tincin argntica, que es ms
sensible (100 veces ms que la tincin con azul Coomassie o sea 0.20.6 ng de protena por banda) en
la deteccin de protenas.
Como se aprecia en la FIG. 6, al igual que con la tincin con azul Coomassie, no fue posible
observar pptidos de bajo peso molecular en ninguno de los dializados provenientes de calostro, a
pesar de la alta sensibilidad de la tincin con nitrato de plata. Sin embargo, fue posible observar
bandas en un intervalo aproximado de 25 a 40 kDa en la muestra de calostro bovino comercial (Cal
comercial), el cual dice tener factor de transferencia.
MPM 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)
46kDa
30kDa
21.5kDa
14.3kDa
6.5kDa
3.4kDa
FIG. 6 Corrimiento electrofortico de muestras de dializados de calostro

y dializados de extracto de calostro teidos con nitrato de plata
Se colocaron 30 g de Dcal v1 (carril 1), Dcal v2 (carril 2), Dcal v3 (carril 3), DEcal v1 (carril 4), DEcal v2 (carril 5), DEcal v3 (carril 6), y
Cal comercial (carril 7), fueron sometidos a la separacin en un gel SDS-PAGE al 15%. (MPM) Marcador de peso molecular. Dentro del
crculo se aprecia la presencia de bandas de alto peso molecular en el derivado comercial.

35
ENCB-IPN 2010
Prosiguiendo con los experimentos, se decidi efectuar el corrimiento electrofortico de los

diferentes dializados de extractos leucocitarios de sangre perifrica (DLEsp) representados en la FIG. 7.
En este caso se observan bandas de bajo peso molecular (alrededor de 6.5 kDa) en las muestras de
bovino, mientras que esto no se observ para el dializado humano.
MPM
1) 2) 3) 4)
46kDa
30kDa
21.5kDa
14.3kDa
6.5kDa
3.4kDa (
FIG. 7 Corrimiento electrofortico de muestras de dializados de extractos

leucocitarios de sangre perifrica teidos con nitrato de plata
Se colocaron 30 g de DLEsp v1 (carril 1), DLEsp v2 (carril 2), DLEsp v3 (carril 3) y DLEsp hum (carril 4),
fueron sometidos a la separacin en un gel SDS-PAGE al 15%. (MPM) Marcador de peso molecular.

36
ENCB-IPN 2010
3. Ensayos de espectroscopia UV
Al analizar los resultados, y haciendo una comparacin de los espectros de absorcin de cada
uno de los dializados obtenidos de las diferentes vacas, se observ un comportamiento similar entre
muestras de DEcal y Dcal. Sin embargo, esto no ocurri cuando se compararon dichos dializados con el
producto comercial de calostro (4), ya que ste ltimo present una mayor concentracin del
compuesto o de los compuestos que absorben a 255 nm. Esto se repiti para todas las vacas (FIG. 8a,
b, c).
Por otra parte, los DLEsp de bovino en todas las vacas (3) y de humano (5), se comportaron de
manera muy diferente, notndose que el dializado proveniente de humano exhibi una mayor
capacidad de absorcin, comparada con la de bovino (FIG. 8b, c). No obstante, se observ lo contrario
para el DLEsp de la vaca 1 comparado con el DLE humano (FIG. 8a). Todos los dializados dejaron de
absorber luz UV cuando se acercaron a los 350 nm.
Analizando los resultados de los todos los dializados de la vaca 2, se determin que existe una
clara diferencia entre estos y los que provienen de la vaca 1. Lo mismo sucedi con la vaca 3.
Adems de estudiar los DLE por vaca, se determin la huella espectral de los stos comparando
el mismo tipo de dializado aunque estos provinieran de diferentes vacas. Asi mismo, se decidi
incorporar una muestra de BSA, para poner de manifiesto el patrn de comportamiento de una
protena tpica, que exhibe un pico mximo de absorcin a 230 nm y as poder establecer si los
dializados estudiados se comportaban de manera parecida.
En la FIG. 9a, se observa que todas las muestras de dializado de calostro presentan una
tendencia a manifestar una huella espectral parecida, y esto se nota ms entre el Dcal de la vaca 1 y de
la vaca 2.

37
ENCB-IPN 2010
Por otra parte, los resultados de los dializados de extracto de calostro, sealan que stos
absorbieron radiacin UV de manera mucho ms parecida entre s, de hecho se observ una fuerte
tendencia a presentar una huella espectral bastante similar (FIG. 9b), desde el punto de vista de la
espectroscopia.
Finalmente, se demostr que los DLEsp entre cada una de las vacas actuaron de manera muy
distinta entre ellos, haciendo difcil una comparacin, FIG. 9c.

38
ENCB-IPN 2010
a) Vaca 1
(3)
UA (4)
(5)
(1)
(2)
b) Vaca 2
(4)
UA
(5) (3)
(2)
(1)
c) Vaca 3
(4)
UA (5)
(3) (1)
(2)
(1) Dcal, (2) DEcal, (3) DLEsp, (4) Cal comercial, (5) DLEsp hum
FIG. 8 Barrido UV de los dializados obtenidos de las diferentes vacas.
Se colocaron 4 l de las muestras ajustadas a 100 g/ml se leyeron en un espectrofotmetro y se tomaron
las lecturas de absorcin UV a diferentes longitudes de onda comprendiendo un rango de 220 a 350 nm

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ENCB-IPN 2010
a) (4) Dcal
(3)
UA
(2)
(1)
b) (4) DEcal
(1) (3) (2)

UA
c) DLEsp
(1)
(4)
(5)
UA (2)
(3)
(1) vaca 1, (2) vaca 2, (3) vaca 3, (4) BSA, (5) DLEsp hum
FIG. 9 Barrido UV de los distintos dializados segn el tipo de muestra

Se tomaron las lecturas de absorcin UV de cada uno de los grupos de muestras a diferentes longitudes de onda comprendiendo un rango de 220 a 350 nm.
a)Dcal v1 a v3, b)DEcal v1 a v3 y c)DLEsp v1 a v3. En todas las lecturas se incluy una muestra de BSA (albmina srica bovina) para referenciar el pico de absorcin
mxima para el enlace peptdico (230 nm). Se tomaron lecturas de absorcin UV a diferentes longitudes de onda comprendiendo un rango de 220 a 350 nm.

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ENCB-IPN 2010
El estudio de espectroscopia tambin abarc el rango visible, con esto se pretendi visualizar el
comportamiento de la huella espectral de los dializados a lo largo de todo el espectro UV-VIS. La regin
visible queda comprendida entre 400750 nm y es la nica detectable por el ojo humano. En la FIG. 10,
se muestran las regiones del espectro UV-VIS en donde absorben algunos aminocidos y otros
componentes biolgicos como los grupos prostticos.
Las transiciones que se presentan en sta zona (400-750 nm), corresponden a transiciones
electrnicas de muy baja energa. Todos los compuestos coloreados, como las antocianinas, las
xantofilas y los carotenos, absorben dentro de estos rangos de longitud de onda. Tambin en este
rango se encuentran las coenzimas y cofactores como: NADPH, nucletidos de guanosina, hipoxantina
etc. (FIG. 10).
FIG. 10 Rangos de longitud de onda del espectro UV-VIS.

(Tomado de: www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologa Universidad de Zaragoza, Espaa)

41
ENCB-IPN 2010
En la FIG. 11, se muestran los resultados de cada uno de los dializados de calostro, los cuales
tienen una huella espectral caracterstica y propia. A partir de los 300 y hasta los 700 nm, fue posible
notar que las muestras presentaron una gran diversidad de componentes, lo que corrobora una vez
ms que los dializados son una mezcla compleja.
Para el caso de los DEcal (FIG. 12), se observ un comportamiento bastante similar entre ellos.
Al comparar esta muestra y las de Dcal, pudimos notar que los picos comprendidos entre 350 y 700 nm
son mayores que para el calostro que solo se dializ.
Tambin se observ un perfil de 2 picos de absorcin entre los 220 y 300 nm en todas las
muestras, pero esto fue ms evidente para el DEcal 3, que mostr un pico mayor, en comparacin con
el DEcal 2 y DEcal 1. Tambin se observ una ligera tendencia de compartir un pico de absorcin entre
250 y 300 nm, en todas las muestras de dializado de calostro y dializado de extracto de calostro (FIGS.
11 y 12).
En los dializados de sangre perifrica de bovino se pudo distinguir cada una de las huellas con
mltiples picos entre 300 y 700 nm, en donde son menos compactos que para los derivados de
calostro, (FIG. 13).
Finalmente, la huella del DLEsp hum (FIG. 14) no guarda relacin aparente con los dializados
bovinos, sean de calostro o de sangre perifrica. As mismo, el DLEsp hum fue el nico que present un
perfil de absorcin particular a 250 nm, sin importar el lote.

42
ENCB-IPN 2010
Dcal v1
Dcal v2
UA
Dcal v3
nm
FIG. 11 Barrido UV-VIS de 220-750 nm de las muestras Dcal de los diferentes bovinos (v1, v2, v3)
Se colocaron 4 l de las muestras ajustadas a 100 g/ml fueron ledas en un espectrofotmetro y se tomaron

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ENCB-IPN 2010
DEcal v1
DEcal v2
UA
DEcal v3
nm
FIG. 12 Barrido UV-VIS de 220-750 nm de las muestras DEcal de los diferentes bovinos (v1, v2, v3)

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ENCB-IPN 2010
DLEsp v1
DLEsp v2
UA
DLEsp v3
nm
FIG. 13 Barrido UV-VIS de 220-750 nm de las muestras DLEsp de los diferentes bovinos (v1, v2, v3)

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ENCB-IPN 2010
DLEsp hum
UA
nm
FIG. 14 Barrido UV-VIS de 220-750 nm de la muestra de DLEsp humano

Se colocaron 4 l de la muestras ajustada a 100 g/ml se ley en un espectrofotmetro y se tomaron

46
ENCB-IPN 2010
4. Ensayo biolgico in vitro
Deteccin de la produccin de TNF-
Como ya se tena el antecedente de que las clulas mononucleares de sangre perifrica humana
responden al DLEsp humano produciendo TNF- a las 24 h (Garca 2009), se decidi realizar un ensayo
en el que se probaron los tres lotes de dializados bovinos en clulas mononucleares de sangre
perifrica humana (CMSP) de donadores sanos. La FIG. 15, muestra la produccin de TNF- (pg/ml) de
uno de los donadores, y este resultado es representativo de tres experimentos en donde se emplearon
las clulas de otros donadores.
Produccin de TNF-
***
70
60
50
pg / ml
40
30
20
10
0
1
v1
v2
v3
v1
v2
v3
SE
S
v
LP
hu
p
p
al
al
al
al
al
al
Es
Es
Es
c
c
Dc
Dc
Dc
p
DE
DE
DE
Es
DL
DL
DL
DL
FIG. 15 Determinacin de TNF- en CMSP humanas estimuladas con los dializados

Se aplicaron 125g/ml de cada uno de los dializados (Dcal v1-3, DEcal v1-3, DLEsp v1-3, DLEsp hum) a CMNSP humanas (5X105) cultivadas
en medio RPMI con 10% de SFB. Para el testigo positivo se emplearon 0.02 g/ml de LPS. El estmulo se dej durante 24 h y despus se
colect el sobrenadante y se determin la produccin de TNF- por ELISA.. La significancia estadstica se establece con respecto del testigo
negativo, sin estmulo (SE) ***, p<0.001, (prueba ANOVA/Tukey). La lnea vertical representa la desviacin estndar (DS).

47
ENCB-IPN 2010
Los dializados de bovino, tanto de calostro como de sangre perifrica, presentaron diferencia
significativa (p<0.001) con respecto del testigo negativo que no recibi estmulo. Sin embargo, cuando
stos se compararon con el DLE humano, se encontr que eran diferentes estadsticamente y que no
inducen la produccin de TNF-, como lo hace el DLE humano. Este resultado se obtuvo con todos los
dializados de bovino a excepcin del DEcal 2 (ver tablas 8 y 9 en el apndice II).
En la tabla 5, muestra el porcentaje de produccin de los donadores. En sta se observa cmo

las clulas de cada donador responden de manera variable y diferente a cada uno de los dializados con
los cuales tuvieron contacto.
TABLA 5. Produccin normalizada de TNF- por donador.

Valores de la produccin de TNF- en trminos de porcentaje de produccin por dializado en cada uno de los tres donadores.
Se normaliz con respecto al testigo positivo (LPS=100%) para cada donador.
DONADOR 1 DONADOR 2 DONADOR 3

MUESTRA: TNF- % TNF- % TNF- %
(pg/ml) produccin (pg/ml) produccin (pg/ml) produccin
Dcal 1 3.66 6.11 3.70 2.21 4.82 3.91
Dcal 2 7.00 11.69 5.05 3.01 9.72 7.90
Dcal 3 6.22 10.39 4.48 2.67 5.84 4.74
DEcal 1 1.49 2.48 5.81 3.47 6.06 4.92
DEcal 2 22.27 37.21 35.46 21.19 49.36 40.13
DEcal 3 10.39 17.36 6.04 3.61 8.41 6.83
DLEsp 1 9.17 13.32 6.62 3.95 19.55 15.89
DLEsp 2 9.57 15.99 4.80 2.86 9.51 7.73
DLEsp 3 4.30 7.18 5.60 3.34 49.15 39.95
DLEsp hum 23.22 38.80 59.18 35.37 15.85 12.88
Sin estmulo 0.16 0.26 0.09 0.05 1.13 0.91
LPS 59.84 100 167.3 100 123.0 100

48
ENCB-IPN 2010
Como se puede observar, el DEcal 2 sobresale de entre los dems dializados en cuanto a que
ste induce una mayor cantidad de TNF-. sto se repite para los tres donadores. Adems, para
visualizar el comportamiento de las diferentes muestras entre cada uno de los donadores, se realiz
una grfica en donde se observa de manera general el comportamiento que siguen las muestras, el
cual es bastante parecido entre los distintos grupos de dializados y vara entre donador (FIG. 16).
Donador 1
Produccin de TNF- Donador 2
Donador 3
200
180
160
140
pg / ml
120
100
80
60
40
20
0
Dcal v3
Dcal v3
Dcal v3
DLEsp v3
DLEsp v3
DLEsp v3
DEcal v3
DEcal v3
DEcal v3
SE
SE
SE
DLEsp hum
DLEsp hum
DLEsp hum
LPS
LPS
LPS
FIG. 16 Produccin de TNF- por donador

Se cultivaron 5X105 de CMNSP provenientes de 3 donadores, en medio RPMI con 10% de SFB, stas recibieron un estmulo durante 24h con
125g/ml de cada uno de los siguientes dializados: Dcal v3, DEcal v3, DLEsp v3 y DLEsp hum. El estmulo se dej durante 24h y despus se
colect el sobrenadante. Posteriormente se determin la produccin de TNF- por ELISA. Como testigo positivo se utiliz LPS (0.02 g/ml)
mientras que para el testigo negativo se dejaron las clulas sin estmulo (SE).

49
ENCB-IPN 2010
5. Ensayo biolgico in vivo
Verificacin de la respuesta inmune celular
En la FIG. 17, se muestran los resultados del WB y se observa que los sueros de las 3 vacas
reconocen protenas de M. tuberculosis, por lo tanto es factible utilizar un extracto proteico soluble de
micobacterias, como antgeno de prueba, en los ensayos de DTH.
M 1 2 3 4 5
200 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
15 kDa
FIG. 17 Reconocimiento de antgenos de M. tuberculosis

por suero de vacas infectadas con M. paratuberculosis.
Los componentes antignicos del MTSE se separaron por electroforesis en geles SDS-PAGE al 10% y se transfiri a una a
membrana de nitrocelulosa. Los sueros de bovinos fueron utilizados a una dilucin 1:50, mientras el anticuerpo
secundario marcado con peroxidasa fue utilizado a una dilucin 1:1000. Carril (M) corresponde al marcador de peso
molecular, carriles (1), (2) y (3) corresponden a los sueros de las vacas 1, 2 y 3 respectivamente. Carril (4) corresponde a
una mezcla de sueros positivos y el carril (5) es el control del anticuerpo secundario.

50
ENCB-IPN 2010
Prueba de hipersensibilidad cutnea tarda (DTH)
Para comparar si los diferentes dializados transferan respuesta celular, se hizo un ensayo de
DTH y se tomaron lecturas a las 24, 48 y 72 h. La comparacin de los diferentes dializados se hizo con
respecto a la salina. Se presenta el tiempo de 48 h ya que en ste se registr el mayor grado de
inflamacin en el sitio del reto antignico.
En la FIG. 18 se observa que el cambio en el grosor de los cojinetes plantares de los grupos de
Ag, DLE mur y DLEsp hum present diferencia significativa notable (p<0.001). Esto mismo ocurri con
el DLEsp 3, (p<0.01). En cuanto a los dializados de calostro y de extracto de calostro, stos
incrementaron los valores de la induracin en los ratones, desde las 24 hasta las 48 h, pero se observ
una disminucin a las 72 h. En ninguno de estos tiempos se encontr diferencia estadstica, por lo
tanto el Dcal y DEcal no transfirieron inmunidad.
En cambio, slo uno de los tres dializados de sangre de bovino (DLEsp 3) present diferencia
significativa, mientras que los otros dos (DLEsp 1 y 2) mantuvieron la induracin en el cojinete de los
ratones desde las 48 hasta las 72 h.
Por otra parte, se encontraron diferencias significativas al momento de comparar los distintos
grupos entre ellos mismos. Los resultados se muestran en las tablas 6 y 7.

51
ENCB-IPN 2010
RESPUESTA DE DTH (48h)

grosor del cojinete plantar (mm)
0.14 ***
0.12 ***
0.1
0.08 ** ***
0.06
0.04
0.02
0
DE v1
DE v2
v1
v2
v3
Dc 1
Dc 2
v3
Ag
ur
DL m
SS
v
lv
hu
m
p
p
al
l
al
al
al
ca
ca
Es
Es
Es
E
c
Dc
p
DE
Es
DL
DL
DL
DL
FIG. 18 Respuesta de DTH medida a 48 h

Se emplearon 7 ratones hembra BALB/c para cada una de las muestras a probar. Los grupos Dcal v1-3, DEcal v1-3, DLEsp v1-3, DLEsp hum y
DLE mur recibieron 10g/100l de cada uno de los respectivos dializados por va subcutnea el da 7 del esquema de inmunizacin. Por otra
parte el testigo positivo (Ag) fue inmunizado con 20g/100l de MTSE los das 0 y 7, y el testigo negativo (SS) recibi 100l los mismos das.
Todos los grupos de ratones se retaron con 20l de MTSE a una concentracin de 4g/L en una de las patas mientras que la otra recibi
20 l de SS el da 9. Se graficaron las diferencias de grosor del cojinete plantar a las 48 h, donde = (grosor en mm de pata inoculada con Ag
grosor en mm de pata inoculada con SS). La prueba estadstica (ANOVA/Student Newman Keuls) seala diferencias entre los distintos grupos
de dializados con respecto de SS. ***, p<0.001; **, p<0.01. La lnea vertical representa la desviacin estndar (DS).

52
ENCB-IPN 2010
TABLA 6. Valores significativos de la respuesta de DTH a las 24h

***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.05 NS:No significativo, (-): ya analizado (prueba ANOVA/Student Newman Keuls).
DEcal 1
DEcal 2
DEcal 3
DLEsp 1
DLEsp 2
DLEsp 3
1
DLEmur
DTH
DLEsp
hum
Dcal
Dcal
Dcal
mur
t = 24 h
Ag
SS
Dcal 1 X - - - NS - - - - - - - -
DEcal 1 NS X - - NS - - - - - - - -
NS NS X NS ** NS - - NS NS - - -
DLEsp 1
NS NS - X * - - - - - - - -
Dcal 2
DEcal 2 - - - - X - - - - - - - -
NS NS - NS ** X - - NS NS - - -
DLEsp 2
*** *** * *** *** ** X NS ** *** - NS -
Dcal 3
** * NS NS *** NS - X NS NS - - -
DEcal 3
NS NS - NS * - - - X NS - - -
DLEsp 3
NS NS - NS * - - - - X - - -
DLEsphum
*** *** *** *** *** *** NS 0.004 *** *** X * -
DLEmur
*** * NS * *** NS - NS NS * - X -
Ag
SS NS NS ** NS NS * *** *** * NS *** *** X

53
ENCB-IPN 2010
TABLA 7. Valores significativos de la respuesta de DTH a las 48 y 72 h

***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.05 NS:No significativo, (-):ya analizado
(prueba ANOVA/Student Newman Keuls).
DEcal 1
DEcal 2
DEcal 3
DLEsp 1
DLEsp 2
DLEsp 3
1
DLEmur
DTH
DLEsp
hum
Dcal
Dcal
Dcal
mur
t = 48 h
Ag
SS
Dcal 1 X NS - - - - - - - - - - -
DEcal 1 - X - - - - - - - - - - -
* * X NS NS NS NS - - - - - -
DLEsp 1
Dcal 2 NS NS - X NS NS - - - - - - -
DEcal 2 NS NS - - X NS - - - - - - -
DLEsp 2 NS NS - - - X - - - - - - -
Dcal 3 NS NS - NS NS NS X - - - - - -
* * NS NS NS NS NS X - - - - -
DEcal 3
*** *** NS ** *** *** ** NS X - - - -
DLEsp 3
*** *** ** *** *** *** *** ** NS X - - -
DLEsphum
*** *** *** *** *** *** *** *** *** ** X - -
DLEmur
*** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** X -
Ag
SS NS NS NS NS NS NS NS NS ** *** *** *** X
DEcal 1
DEcal 2
DEcal 3
DLEsp 1
DLEsp 2
DLEsp 3
1
DLEmur
DTH
DLEsp
hum
Dcal
Dcal
Dcal
mur
t = 72 h
Ag
SS
Dcal 1 X NS - NS - - - - - - - - -
DEcal 1 - X - - - - - - - - - - -
*** *** X - *** ** *** * * NS - - -
DLEsp 1
Dcal 2 - NS - X - - - - - - - - -
DEcal 2 NS NS - NS X - - - - - - - -
DLEsp 2 NS NS - NS NS X NS - - - - - -
Dcal 3 NS NS - NS NS - X - - - - - -
NS * - NS NS NS NS X NS - - - -
DEcal 3
NS * - NS NS NS NS - X - - - -
DLEsp 3
** *** - ** * NS * NS NS X - - -
DLEsphum
*** *** *** *** *** *** *** *** *** *** X - -
DLEmur
*** *** *** *** *** *** *** *** *** *** NS X -
Ag
SS NS NS NS NS NS NS NS NS ** *** *** *** X

54
ENCB-IPN 2010
DISCUSIN
El primer paso que se realiz en este trabajo, fue la obtencin de los dializados de
extracto de calostro y de sangre perifrica bovina. Para este ltimo caso, se sigui un
proceso de elaboracin similar a los reportes mencionados por otros autores (Candanosa
de ME y col. 1997, Jones y col. 1981). Sin embargo, las formas de preparar DLE de origen
bovino varan segn el tejido linfoide y el mtodo de obtencin, ya que algunos
investigadores han empleado ganglios linfticos y bazo en lugar de sangre perifrica
(Franco-Molina y col. 2004). De esta forma, una vez obtenidos los dializados se prosigui
con el siguiente objetivo, el cual fue determinar la concentracin de protenas presentes
en los dializados. Para ello, se emple el mtodo del cido bicinconnico (BCA) el cual
puede detectar una mayor cantidad de protenas en comparacin con otros como el de
Bradford (Garca 2007). Esto es debido a que el fundamento del BCA se basa en la reaccin
de los iones cpricos sobre la protena para producir cobre reducido, el cual a su vez
interacciona con el cido bicinconnico en cantidades equimolares formando un complejo
prpura que puede ser medido a 562nm. El BCA detecta el enlace peptdico, por lo que
tericamente se necesitan al menos 3 aminocidos de cualquier tipo para tener dos
enlaces peptdicos y estos puedan formar un complejo estable con el cobre. De esta forma
y con base en el fundamento del mtodo de BCA, podra sugerirse que en los DLE se
encuentran algunos tripptidos.
Una vez concluida esta parte, el siguiente paso fue determinar el peso molecular
de los pptidos de los dializados. En este caso, la literatura establece por consenso que
las molculas tipo FT tienen un peso molecular comprendido entre los 3,500 y 5,000 Da
(Kirkpatrick y Gallin 1974). No obstante, en este trabajo se demostr que el corrimiento
electrofortico de los extractos de calostro y de los dializados de calostro no presenta
bandas detectables por electroforesis.

55
ENCB-IPN 2010
Una posible explicacin para este hallazgo, es el hecho de que los factores de
transferencia se producen en cantidades del orden de picomoles y tienen bajo peso
molecular (Kirkpatrick y Rozzo 1992). Entonces, asumiendo que los FT presentes en el
calostro pudieran estar relacionados con la calostrinina (9-12 aminocidos), o pensando
que tienen la mitad de longitud que sta, sera enormemente difcil detectarlos debido a
su tamao tan pequeo, por lo que un sistema electrofortico no podra ofrecer la
capacidad de resolucin necesaria para observarlos, a no ser de que stos se encuentren
aislados en grandes cantidades y con un notable grado de pureza, cosa que no se efectu
en el presente estudio. Por ello, para analizar de manera indirecta su presencia dentro de
los dializados se recurre a modelos biolgicos.
Tampoco se descarta el hecho de que los pptidos contenidos en los dializados,

presenten grupos qumicos que no reaccionan con los reactivos de las tinciones de plata o
Coomassie. Particularmente en este ltimo caso, se sabe que el mecanismo de tincin del
azul Coomassie consiste en la interaccin electrosttica de los grupos qumicos del
colorante con los residuos de arginina, histidina, lisina, tirosina, triptfano y fenilalanina
(Syrovy y Hodny 1991). Con respecto a la tincin argntica, es conocido que la deteccin
de protenas depende de la unin de los iones de plata a las cadenas laterales de los
aminocidos, principalmente con grupos sulfhidrilo y carboxilo (Oakley y col. 1980).
Por si fuera poco, la cuantificacin de los pptidos en los dializados, se hizo

considerando la suma global de cada una de las molculas con enlaces peptdicos, (y el
calostro es rico en estos componentes) por lo que existe la posibilidad de que ocurra un
fenmeno de enmascaramiento o dilucin de los FT. Afortunadamente, se ha reportado
que de manera general, los FT son potentes y bastan cantidades del orden de femtomoles
para transferir una reaccin de hipersensibilidad (Kirkpatrick 1992).

56
ENCB-IPN 2010
A pesar de todo esto, el actual trabajo se centr ms en la obtencin y

caracterizacin de los DLE bovinos, como mezclas complejas de molculas, que en el FT
bovino como entidad discreta con capacidad de transferir inmunidad celular (Wilson y col.
1982). Adems, recordemos que los FT son slo una parte, quizs pequea, que compone
el complejo universo de los DLE (Lawrence y Borkowsky 1983, Dwyer 1995).
En contraste con los resultados conseguidos con el calostro, se ha demostrado la

presencia de bandas de un peso molecular aproximado de 6,000 a 6,500 Da, empleando
dializados de sangre bovina. Si bien existen algunos estudios en donde se aborda la
determinacin del peso molecular de los componentes de los DLE por electroforesis,
nuestro trabajo es el primero en mostrar la presencia de pptidos de bajo peso molecular
en DLE bovinos de sangre perifrica.
Respecto de este ltimo hallazgo, el grupo de LoBuglio estudiando los DLE, inform
sobre la presencia de una banda en geles de poliacrilamida. De acuerdo con este
investigador, la banda encontrada corresponde a un factor de transferencia humano,
obtenido de leucocitos de sangre perifrica, especfico para la hemocianina de molusco.
No obstante, el mtodo de obtencin del factor de transferencia de LoBuglio, tuvo
modificaciones con respecto al de Lawrence (que fue el que se sigui en este trabajo), y es
que despus del paso de la lisis, centrifugaron para eliminar los detritos celulares,
posteriormente colectaron el sobrenadante y lo sometieron directamente a fracciona-
miento cromatogrfico sin dializar previamente. Esto es importante de sealar, porque en
realidad partieron de un lisado crudo el cual contena muchas impurezas, y aunque se
haya empleado la cromatografa de filtracin en gel, la calidad del FT obtenido
seguramente fue menor que la de los procedimientos usuales. De hecho, en el trabajo
nunca se menciona el peso molecular aproximado de la banda, ni tampoco se muestra el
gel (LoBuglio y col. 1976).

57
ENCB-IPN 2010
Para 1992, Stephen Rozzo y Kirkpatrick desarrollaron una estrategia experimental

completa, cuyo objetivo fue la purificacin y aislamiento de factores de transferencia
especficos empleando tcnicas de cromatografa en fase reversa y electroforesis. Sus
resultados los llevaron al aislamiento de la fraccin AIII, la cual estaba presente en los
dializados, y se prob que sta fue la responsable de los fenmenos de transferencia.
Dicho de otra forma, esta fraccin era un factor de transferencia especfico obtenido de
dializados de extractos de clulas inmunes a la ferritina (Kirkpatrick y Rozzo 1992).
Posteriormente, dicha fraccin fue sometida a electroforesis en geles SDS-PAGE y se
demostr la presencia de una sola banda. Este resultado se corrobor tambin con la
cromatografa en gel y determinaron que el peso molecular de la banda oscilaba entre los
5,000 a 5,400 Da, aunque no repitieron el experimento debido a limitaciones con las
muestras de dializados.
Como se mencion anteriormente, en el presente trabajo se describi la presencia

de bandas individuales de un peso aproximado de 6,000 a 6,500 Da nicamente en los
dializados de sangre perifrica de vaca. Desde luego, esto no condiciona que las bandas
encontradas sean el factor de transferencia bovino, ya que para este se ha reportado un
peso molecular de 1,100 a 3,000 Da obtenido por cromatografa (Wilson y col. 1982). Por
ello se propone que tal vez se trate de uno o varios componentes mayoritarios de los
dializados, encontrados nicamente en la sangre bovina y que no requieren de
sofisticados sistemas de aislamiento. De hecho, se corri un experimento alterno en
donde se elaboraron dializados de sangre de otras dos vacas distintas a las utilizadas en el
proyecto, y se observ la presencia de bandas similares en sus dializados.
Esto nos lleva a pensar que la banda observada podra contener pptidos ricos en
residuos aromticos y bsicos (acorde a los resultados de la tincin con Coomassie),
ubicuos en la sangre del ganado vacuno y aparentemente susceptibles de ser dializados.

58
ENCB-IPN 2010
Los ensayos de DTH y de induccin de TNF- sugieren que los DLEs de sangre
bovina poseen la capacidad de transferir respuesta celular y tambin son capaces de
estimular la produccin de la citocina proinflamatoria. Pero la mejor manera de confirmar
esto, sera por medio del aislamiento y la purificacin de los pptidos observados en
dichas bandas, para estudiar su accin biolgica de manera ms concreta y especfica.
En cuanto a la ausencia de bandas en el dializado humano, sta podra explicarse

por el hecho de que no se parti de un material puro y aislado, como ha ocurrido en otros
reportes (Kirkpatrick y Rozzo 1992, Burger y col. 1976, Klesius y col. 1978).
En estos casos, los investigadores emplearon tcnicas de cromatografa en fase

reversa, cromatografa de exclusin molecular y fraccionamiento por HPLC, para purificar
y concentrar los factores de transferencia contenidos en los dializados de sangre perifrica
humana. Despus de esto, prosiguieron con ensayos biolgicos y de digestin enzimtica
con el objeto de estudiar la composicin y estructura de estos factores de transferencia.
Esto es importante de sealar porque en el presente estudio, no se utilizaron ninguna de
las tcnicas de purificacin mencionadas anteriormente. De hecho, a pesar de que se
aument diez veces la concentracin de pptidos de dializado humano en los geles, estos
no pudieron ser detectados por las tinciones, o separados por electroforesis debido a
causas parecidas a lo ocurrido en el calostro (efecto de dilucin, mtodo de cuantificacin
protica, pptidos que han sido cortados en porciones muy pequeas y muy bajo peso
molecular).
A pesar de todo esto, se ha mencionado que una molcula puede estudiarse o

identificarse por medio de su accin biolgica, y en el caso del dializado de sangre humana
es evidente su efecto sobre los sistemas vivos, tal como se demostr en los cultivos
celulares que produjeron TNF-. sto sin contar los numerosos estudios clnicos y
testimonios mdicos en donde su aplicacin ha sido exitosa (ver tabla de usos y
aplicaciones en la clnica) (Berrn y col. 2007).

59
ENCB-IPN 2010
Una vez terminada la parte del anlisis de peso molecular por electroforesis, se
procedi a determinar la huella espectral de cada uno de los dializados. Para ello se hizo
un barrido de lecturas que abarc dos intervalos, uno de 220 a 350 nm, y otro de 220 a
750 nm. En este punto, los datos de espectroscopia UV mostrados, concuerdan
parcialmente con lo sugerido por otros autores (Kirkpatrick y col. 1995, Burger y col.
1976), ya que ellos reportan un perfil de absorcin UV que va desde los 254 a los 280 nm,
y es en este intervalo donde se encontr una intensa capacidad de absorcin en los
dializados obtenidos en este trabajo.
Por otra parte, dichos investigadores sealan un pico mximo de absorcin a

240 nm, mientras que los dializados obtenidos de extracto de calostro y calostro, se
detect que el mximo de absorcin ocurre entre los 250-255 nm, y en el caso de aquellos
obtenidos de sangre perifrica, sean de humano o vaca, se registra hasta antes de los 230
nm.
As mismo, se sabe que los cidos nucleicos absorben radiacin UV dentro del
rango de 260-265 nm. Esta absorcin es debida a los centros cromforos que se forman
gracias a la presencia de bases nitrogenadas pricas y pirimdicas. Existen reportes que
postulan que el factor de transferencia contenido en los DLE es una molcula oligorribo-
nucleopeptdica (Fudenberg y Pizza 1993, Burger y col. 1979). Sin embargo, esta
aseveracin podra no ser vlida porque como se demostr en la espectroscopia, tenemos
una intensa absorcin UV en el rea de 250 nm, zona en donde se encuentra el mayor
perfil de absorbancia. De esta forma, demostramos que los componentes de los DLE no
son de naturaleza oligorribonucleotdica. No obstante, hubiera sido interesante el
efectuar la prueba de orcinol, para determinar la presencia de ribosa y as corroborar la
idea de que los factores de transferencia pueden acoplarse a porciones ribonucleotdicas.
Otra informacin que se deriva de los ensayos de espectroscopia, es que la

composicin de los extractos de calostro parece ser pobre en residuos aromticos, ya que
no se encontraron picos o tendencia a incrementar el perfil de absorcin en la zona del UV

60
ENCB-IPN 2010
cercano. Recordemos que en esta parte del espectro, la absorcin UV se debe a

aminocidos como la tirosina, triptfano y en pequea proporcin de la cantidad de
fenilalanina, la cual exhibe mltiples bandas de 250-260 nm. Por otro lado, la tirosina
exhibe bandas a 275 nm, mientras que el triptfano las presenta en 280 nm. Adems
estos dos ltimos aminocidos presentan bandeo de menor energa en la zona del UV
lejano (www.unizar.es/departamentos/). En conjunto, estos datos coinciden con lo
encontrado por la tincin de Coomassie, ya que como se mencion anteriormente este
colorante reacciona con los aminocidos bsicos y aromticos (Syrovy y Hodny 1991), y
aunque en la electroforesis no se pudieron visualizar los pptidos, si sabamos que
estaban presentes puesto que la determinacin de BCA, as lo indic.
En el ao 2000, Kirckpatrick report la existencia de una secuencia muy conservada

de aminocidos entre diferentes tipos de DLE (murino y bovino). La secuencia, LLYAQDL /
VEDN es una regin que hipotticamente se considera el sitio de unin al receptor del
factor de transferencia (Kirkpatrick 2000). Pero observando detalladamente, podemos
notar que carece de aminocidos aromticos e incluso solo exhibe una tirosina. De
acuerdo a los resultados de espectroscopia mostrados en el presente trabajo, se podra
sugerir que esta secuencia pudiera tener una aparente relacin con lo encontrado en las
muestras analizadas, ya que tanto la secuencia como los pptidos presentes en los
dializados de calostro, son pobres en residuos aromticos y en cambio podran tener otros
grupos qumicos.
En trminos generales, con base en los resultados derivados de la espectroscopia,

se podra decir que los extractos provenientes del calostro y los de sangre perifrica, sean
de humano o bovino, son entidades muy diferentes y si bien es posible establecer
semejanzas entre un Dcal y un DEcal, esto no ocurre si se comparan estos con el producto
de calostro. Mucho menos es factible establecer similitud alguna entre este producto y el
DLEsp humano.

61
ENCB-IPN 2010
Una vez analizado el espectro de absorcin de los dializados, se prosigui con el

estudio de su accin inmunomoduladora. Para esto, la literatura menciona el efecto de los
DLE en cultivos celulares en donde se evalan citocinas como IFN-, IL-6, IL-8, IL-10 y
TNF-. sta ltima, juega un papel crucial en la inflamacin y por ello numerosos
investigadores (Robledo 2008, Prez 2007, Ojeda y col. 2005) se han avocado a estudiar
los efectos de los DLE en la induccin y regulacin de esta molcula.
En nuestro estudio, se encontr que la secrecin de TNF- por clulas mono-

nucleares de sangre perifrica humana es estadsticamente significativa (p<0.001) cuando
las clulas se estimulan exclusivamente con dializados bovinos (sean de calostro o sangre
perifrica), con respecto del control. Sin embargo, tambin se encontr significancia
estadstica al comparar los dializados de bovino con el dializado humano, a excepcin del
DEcal 2.
Este ltimo hecho, es debido a que la muestra result positiva para la prueba de
endotoxina por Limulus polyphemus. Anteriormente se mencion en la metodologa que
el calostro bovino se obtiene en condiciones aspticas pero no de esterilidad, por lo que
se cree que este calostro en particular tena una carga microbiana mucho mayor que las
otras muestras, y a pesar de que la prueba de esterilidad arroj un resultado negativo,
existe la posibilidad de que numerosos fragmentos de pared bacteriana (resultado de la
lisis) hayan quedado como remanente. Esto explica por qu el ensayo de endotoxina
result positivo las tres veces que se elabor el extracto dializado a partir del calostro de
esta vaca. Incluso se puede observar en las grficas que la induccin de TNF- es mayor
con este dializado. Sin embargo, se decidi correr el experimento con todo el juego de
muestras completo, pero considerando que el resultado de esta muestra carece de
validez.
Adems, cuando la induccin de TNF- se estudia contra las clulas que no

recibieron estmulo, se observa que dicha produccin es dependiente del tipo de dializado

62
ENCB-IPN 2010
y vara de un donador a otro encontrndose diferencias en la produccin de la citocina. De

hecho un dializado puede tener un efecto mayor en un donador que en otro, por ejemplo
los DLEsp bovinos parecen estimular mejor a las clulas del donador tres que el dializado
de extracto de calostro. Esto podra deberse a las diferencias polimrficas de algunos
genes relacionados con la respuesta inmune, entre las clulas de los receptores, los cuales
pueden tener una reactividad distinta ante los componentes presentes en los dializados.
Este ltimo hecho correlaciona con los resultados obtenidos por Garca Hernndez en
donde reporta que la induccin del TNF- vara de un individuo a otro (Garca 2007,
Alvarez-Thull y Kirkpatrick 1996, Rozzo y col. 1988).
En el ao 2004, Franco-Molina di a conocer un estudio en el que menciona el

papel modulador de los dializados de extracto bovino obtenidos a partir de bazo de
bovino en un modelo de choque endotxico en ratn. Segn sus hallazgos, los dializados
bovinos inducen la expresin de RNAm para TNF-, durante las fases iniciales de su
administracin alcanzando un pico mximo de produccin a las 4 h, luego se mantiene
estable hasta las 48 h.
Este resultado tuvo diferencia significativa con el control (p<0.05), adems de que
seala que el incremento en el nivel de expresin de mensajero, no condicion a los
animales a presentar la sintomatologa asociada a la endotoxemia (Franco-Molina y col.
2004). La perspectiva cambia cuando los animales reciben un pretratamiento con LPS y a
las 8 h se les administran dializados bovinos. Entonces descubre que la produccin de
TNF- se encuentra disminuida respecto del grupo que no recibi DLE. Todo esto con
diferencia estadstica (p<0.01) con respecto del control sin tratamiento.
Con dicha informacin, Franco-Molina propone que los dializados bovinos ejercen
una actividad reguladora del TNF- (Franco-Molina y col. 2004).

63
ENCB-IPN 2010
Entonces, basndonos en nuestros resultados y en los de Franco-Molina, sera

interesante sugerir que aunque los dializados se obtengan de bazo, sangre o calostro
bovino, todos pueden inducir TNF-, como se demostr en nuestras grficas, aunque la
produccin es distinta segn la capacidad de respuesta del donador (Franco-Molina y col.
2004, Garca 2007). Sin embargo, el dializado humano indujo una mayor cantidad de la
citocina y estadsticamente fue diferente de los de sangre de bovino y de dos extractos
dializados de calostro.
Por otra parte, la literatura reporta que uno de los efectos biolgicos ms
importantes de los DLE, es su capacidad de estimular la activacin y proliferacin de
linfocitos T (Fudenberg y Pizza 1993). De hecho existe un estudio en donde se utilizan
clulas mononucleares de sangre perifrica humana, las cuales fueron estimuladas con
DLE humano y se observ un aumento en la proliferacin de linfocitos T CD4+ (De la
Fuente Granada 2006), por lo que sera importante evaluar si los dializados obtenidos en
el presente trabajo inducen linfoproliferacin.
Una vez que se concluy con este objetivo, se prosigui con el estudio de la
actividad biolgica in vivo encontrndose que los dializados de extracto de calostro y el
calostro dializado, no transfieren inmunidad celular. Por otra parte, slo uno de los tres
dializados de sangre perifrica bovina, indujo una respuesta de DTH.
A pesar de estos resultados, es importante sealar que se observ una tendencia

por parte de stos ltimos dializados por mantener la induracin en el cojinete plantar
hasta por 72 h, lo cual en algunos casos podra interpretarse como una reaccin positiva
de DTH, aunque no existe evidencia estadstica que sustente este hecho.
Respecto de los dializados de extracto de calostro, parece que stos no siguen el

comportamiento de una reaccin tpica de hipersensibilidad tarda, la cual implica que la

64
ENCB-IPN 2010
induracin permanezca o incluso aumente ligeramente hasta las 72 h, cosa que si ocurre
con el control positivo, y el control de transferencia (DLE mur).
En la literatura se menciona que el calostro tiene la capacidad de inducir

pasivamente respuestas de hipersensibilidad tarda en cras de bovino (Radosevich y col.
1985, Klesius y col. 1978), de hecho la administracin de calostro a los recin nacidos es
una prctica comn que contribuye de manera importante al desarrollo fsico e
inmunolgico del animal (Stewalgen y col. 2009). No obstante, estos estudios de
transferencia se desarrollan empleando nicamente bovinos, y si bien el factor de
transferencia contenido en los dializados es capaz de funcionar de manera interespecie
(Fudenberg y Pizza 1993), cabra la posibilidad de que este fenmeno carezca de la
amplificacin de respuesta tarda suficiente, de tal forma que no se observara igual en un
ratn que en una vaca. Recordemos que los dializados de extractos leucocitarios
contienen molculas que amplifican la respuesta inmune y cabra la posibilidad de que
tales molculas se encontraban en mucha menor cantidad que en el calostro crudo, o
simplemente no puedan cruzar las barreras entre especies.
Por ello, para verificar si la respuesta de DTH de un animal se favorece con la

administracin de dializados provenientes de su misma especie, se desarroll un
experimento en donde se probaron los dializados murino y humano para averiguar la
cantidad ptima de dializado capaz de transferir inmunidad. Entonces, se encontr que el
dializado murino present una mayor capacidad de induccin de DTH.
Por otra parte, son diversos los autores que argumentan que los donadores con
una prominente respuesta de DTH, son los mejores candidatos para elaborar factores de
transferencia aptos para receptores con un fenotipo de respuesta alto o bajo para el
antgeno (Kirkpatrick y col. 1985, Rozzo y col. 1988).

65
ENCB-IPN 2010
Otra posible explicacin de la falta de transferencia de inmunidad por parte de los

dializados de calostro y del extracto de calostro, podra estar en su fuente de obtencin: el
calostro. Como ya se ha reportado, el calostro es una secrecin vasta y compleja cuyos
componentes no han sido estudiados del todo (Kelly 2003). Entonces, cabra la posibilidad
de que sta mezcla sea rica en molculas como el factor supresor, el cual se ha reportado
en la porcin de 3,500 a 6,000 Da de peso molecular (Lawrence y Borkowsky 1983), y
aunque este factor no se estudi en el presente trabajo ni se ha visualizado por
electroforesis en otros reportes, se sabe que tiene la propiedad de abatir la respuesta de
DTH y de suprimir a las clulas Th1 efectoras, las cuales se estudiaron en un modelo in
vitro (Lawrence y Borkowsky 1983).
Adems, en el calostro de varias especies animales se encuentran hexapptidos

relacionados con la calostrinina (Zimechi 2008). Estas molculas tienen la caracterstica
de ser lineales o cclicas y consisten principalmente en residuos polares, aromticos e
hidrofbicos. Se distinguen por tener una potente accin inmunosupresora y son de bajo
peso molecular (Bolewska y col. 1993). De hecho, la configuracin de los pptidos tipo
calostrinina (FYVPGA) hallada en los calostros bovino y ovino (Bolewska y col. 1993), es
distinta a la secuencia consenso (LLYAQDLEDN) encontrada por Kirkpatrick en los factores
de transferencia bovino y murino (Kirkpatrick 2000). Adicionalmente, esta ltima
secuencia no presenta actividad moduladora y se cree que acompaa a los factores de
transferencia para unirse con su receptor.
Finalmente, otro candidato a considerar sera una sustancia descrita en el calostro

bovino y humano, conocida como Colostrum Inhibitory Factor (CIF) el cual inhibe la
produccin de IL-2 en lneas celulares de linfocitos T. Se propone que es una molcula con
caractersticas semejantes al TGF-, pero si se utilizan antisueros anti-TGF-, slo se
disminuye el 10% de su actividad (Mandalapu y col. 1995).

66
ENCB-IPN 2010
En cuanto al estudio de la respuesta de transferencia de inmunidad, se han

desarrollado diversos modelos in vivo utilizando ratas, cobayos, bovinos y perros
(Petersen y col. 1980). En el presente trabajo, se emple un modelo de DTH murino el cual
ha sido probado por su eficacia y simplicidad por diversos investigadores en el mundo
(Rozzo y col. 1988, Kirkpatrick y col. 1985) y en nuestro grupo de trabajo (Fabr y col.
2004, Valderrbano 2009). La ventaja principal de este modelo, radica en el uso de
animales singnicos, con los cuales se descarta la variabilidad de respuesta inmune debida
a polimorfismos genticos (Rozzo y col. 1988). Adems de que es posible emplear
volmenes menores de los dializados, en comparacin con otras especies animales y su
administracin es rpida (Franco-Molina y col. 2003). Si bien este modelo presenta
numerosas ventajas al momento de estudiar la transferencia inmune celular, cabe la
posibilidad de que este necesite ser complementado con el anlisis microscpico. Ya que
tal vez si se present una reaccin positiva, pero esta fue tan dbil y poco notoria que slo
con la ayuda del anlisis histolgico, se podran apreciar cambios.
En contraste con todo lo anterior, y como se mencion previamente, slo uno de

los tres dializados de sangre perifrica de bovino manifest capacidad de transferir
respuesta celular antgeno especfica. En este aspecto, se retoma la idea de que la fuente
de obtencin (el tejido) juega un papel importante al momento de elaborar los extractos,
ya que la composicin del microambiente en el calostro difiere enormemente de la
composicin del torrente sanguneo. Entonces, adems de la fuente de obtencin, debe
considerarse la capacidad de respuesta inmune del donador, ya que los donadores con
una fuerte respuesta de hipersensibilidad tarda, resultan ser una mejor fuente para
elaborar factores de transferencia (Lawrence y Borkowsky 1983). Esto tal vez se deba a
que los FT especficos de antgeno, podran encontrarse en mayor concentracin, o incluso
stos podran tener mayor afinidad por su receptor. De esta forma, nuestros resultados
coinciden con los de otros investigadores que reportan una transferencia parcial de
hipersensibilidad, en receptores vrgenes que recibieron dializados de sangre de bovino

67
ENCB-IPN 2010
con especificidad a la hemocianina de molusco (KLH) (Burger y col. 1979), o en ratones con
melanoma B16 que recibieron DLEsp de bovino (Candanosa de ME y col. 1997). Adems,
existe la posibilidad de que la vaca a partir de la cual se obtuvo el DLEsp que transfiri una
respuesta de DTH, haya generado una mayor respuesta hacia el antgeno, ya sea por
infeccin subclnica o por estrecho y continuo contacto con el mismo. Tambin es posible
que su gentica haya contribudo a generar una RI ms intensa que las otras vacas.
Sin embargo, existen reportes que apoyan la idea de que el fenmeno de

transferencia no ocurre en la totalidad de los receptores, y de hecho un porcentaje de
stos puede no responder favorablemente a los dializados (Spitler LE 1980).
Finalmente, aunque se han sugerido diversas propuestas para tratar de explicar

tales resultados, (muchas de las cuales se han mencionado a lo largo de la discusin),
ninguna ha sido lo suficientemente concluyente hasta el momento y todava falta mucho
para comprender la naturaleza y el comportamiento del FT sobre el sistema inmunolgico.

68
ENCB-IPN 2010
CONCLUSIONES
Es factible obtener una gran cantidad de clulas mononucleares a partir

del calostro bovino.
No se pudo detectar la presencia de pptidos de bajo peso molecular en los

extractos obtenidos de calostro. Sin embargo fue notable la visualizacin de
este tipo de pptidos en el extracto de leucocitos de sangre perifrica de vaca.
Las variaciones en la huella espectral de los dializados de extracto de calostro

en comparacin de los de sangre perifrica, denotan diferencias en
composicin qumica.
Es posible estimular la produccin de TNF- con los dializados bovinos, sin

embargo la induccin es dependiente del tipo de dializado.
Los dializados de extracto de calostro no inducen la transferencia de

hipersensibilidad tarda y slo uno de tres dializados se sangre de bovino si lo
hace de manera estadsticamente significativa (p<0.001).

69
ENCB-IPN 2010
PERSPECTIVAS DE TRABAJO
Analizar la actividad antimicrobiana o antitumoral de los dializados

obtenidos en este trabajo.
Purificar los pptidos encontrados por electroforesis en los

dializados de extracto de sangre bovina, para estudiar su efecto
biolgico.
Efectuar la prueba de orcinol, para conocer si existe ribosa en las

muestras y correlacionarlo con la teora del oligorribonucleopptido.
Analizar por medio de tcnicas bioinformticas y modelado

molecular, si la calostrinina est relacionada con el factor de
transferencia bovino o en su defecto, determinar si la calostrinina
es en realidad el factor de transferencia.
Aumentar el nmero de vacas y enfocarse en la obtencin y estudio

del dializado de sangre perifrica, empleando la prueba de DTH.

70
ENCB-IPN 2010
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77
ENCB-IPN 2010
ANEXOS
APENDICE I
REACTIVOS EMPLEADOS EN LA ELECTROFORESIS
A) Geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE) (cantidades para 10ml).
1) GEL DE RESOLUCION 15%

H2O 2.3 ml
30% Acrilamida mix 5.0 ml
1.5 M Tris (8.8) 2.5 ml
10% SDS 0.1 ml
10% APS 0.2 ml
TEMED 0.008 ml
2) GEL CONCENTRADOR 13%

H2O 6.8 ml
30% Acrilamida mix 1.7 ml
1.5 M Tris (8.8) 1.25 ml
10% SDS 0.1 ml
10% APS 0.1 ml
TEMED 0.01 ml
B) Regulador de corrimiento (cantidades para 1L).
H2O destilada 890 ml

Regulador de corrimiento 10X 100 ml
10% SDS 10 ml
C) Regulador de corrimiento 10X.
H2O destilada Aforar a 500 ml

Tris 15 g
Glicina 72 g

78
ENCB-IPN 2010
D) Preparacin de regulador de muestra en condiciones reductoras

(cantidades para 250l).
Regulador de muestra reductor

Regulador de muestra 200 l
SDS 10% 45 l
DTT 5 l
E) Preparacin de regulador de muestra base (cantidades para 50 ml).

Tris (200mM) 10 ml
Sucrosa (0.5 M) 8.55 g
EDTA (5mM) 0.5 ml
Azul de bromofenol 0.03% 1.5 ml
F) Preparacin de azul Coomassie al 0.20% (cantidades para 1L).

Azul de Coomassie R-250 2g
Acido actico glacial 100 ml
Metanol 200 ml
G) Preparacin de solucin fijadora/desteidora (cantidades para 1L).

Metanol 300 ml
Acido actico glacial 70 ml
H) Preparacin de la solucin de ditiotrietol 1 M (DTT).
Pesar 0.154g de DTT y disolver en 1 ml de agua destilada, conservar a -20C.

79
ENCB-IPN 2010
APENDICE II
ESTADSTICA GENERAL Y VALORES SIGNIFICATIVOS PARA EL ENSAYO DE

CUANTIFICACIN DE TNF-
TABLA 8. Valores significativos de la produccin de TNF- haciendo una comparacin entre los diferentes
dializados, con las clulas del donador 1.
Correspondiente a la pgina 48. *** p<0.001, ** p<0.01 , * p<0.05 (prueba ANOVA/Tukey).
DEcal 1
DEcal 2
DEcal 3
DLEsp 1
DLEsp 2
DLEsp 3
1
3
DONADOR
DLEsp
hum
1
Dcal
Dcal
Dcal
LPS
SE
Dcal 1 X NS *** NS *** *** NS *** NS *** *** ***
DEcal 1 - X *** *** *** *** *** *** * *** *** ***
DLEsp 1 - - X NS *** NS NS NS ** *** *** ***
Dcal 2 - - - X *** NS NS NS NS *** *** ***
DEcal 2 - - - - X *** *** *** *** NS *** ***
DLEsp 2 - - - - - X NS NS ** *** *** ***
Dcal 3 - - - - - - X NS NS *** *** ***
DEcal 3 - - - - - - - X *** *** *** ***
DLEsp 3 - - - - - - - - X *** *** ***
DLEsphum - - - - - - - - - X *** ***
LPS - - - - - - - - - - X ***

80
ENCB-IPN 2010
TABLA 9. Valores significativos de la produccin de TNF- haciendo una comparacin entre los diferentes
dializados, con las clulas del donador 2 y 3.
Correspondiente a la pgina 48. *** p<0.001, ** p<0.01 , * p<0.05 (prueba ANOVA/Tukey).
DEcal 1
DEcal 2
DEcal 3
DLEsp 1
DLEsp 2
DLEsp 3
1
3
DONADOR
DLEsp
hum
2
Dcal
Dcal
Dcal
LPS
SE
Dcal 1 X NS * NS *** NS NS NS NS *** *** ***
DEcal 1 - X NS NS *** NS NS NS NS *** *** ***
DLEsp 1 - - X NS *** NS NS NS NS *** *** ***
Dcal 2 - - - X *** NS NS NS NS *** *** ***
DEcal 2 - - - - X *** *** *** *** *** *** ***
DLEsp 2 - - - - - X NS NS NS *** *** ***
Dcal 3 - - - - - - X NS NS *** *** ***
DEcal 3 - - - - - - - X NS *** *** ***
DLEsp 3 - - - - - - - - X *** *** ***
DLEsphum - - - - - - - - - X *** ***
LPS - - - - - - - - - - X ***
DEcal 1
DEcal 2
DEcal 3
DLEsp 1
DLEsp 2
DLEsp 3
1
DONADOR
DLEsp
hum
3
Dcal
Dcal
Dcal
LPS
SE
Dcal 1 X * *** *** *** *** NS *** *** *** *** ***
DEcal 1 - X *** *** *** *** NS *** *** *** *** ***
DLEsp 1 - - X *** *** *** *** *** *** *** *** ***
Dcal 2 - - - X *** NS *** NS *** *** *** ***
DEcal 2 - - - - X *** *** *** NS *** *** ***
DLEsp 2 - - - - - X *** NS *** *** *** ***
Dcal 3 - - - - - - X *** *** *** *** ***
DEcal 3 - - - - - - - X *** *** *** ***
DLEsp 3 - - - - - - - - X *** *** ***
DLEsphum - - - - - - - - - X *** ***
LPS - - - - - - - - - - X ***

81
ENCB-IPN 2010
APENDICE III
CERTIFICADOS DE CONTROL DE CALIDAD DE LOS DIALIZADOS OBTENIDOS

82

Obtención y Caracterización de Extractos Leucocitarios de Origen Bovino

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

Obtencin y caracterizacin de dializados de

Tesis que para obtener el grado de Maestra en

QFB Hctor Avalos Flores

DIRECTORES: Dra. Jeanet Serafn Lpez

Mxico, D.F. 2010

As mismo, se cont con el apoyo del proyecto

El sustentante fue becario PIFI y becario CONACYT

A la Dra. Jeanet. Muchas gracias por haber contribuido de manera substancial en mi

A mis sinodales. Gracias por sus comentarios y crticas, siempre objetivas y

A Violeta Dejanira, ya que contigo la palabra AMISTAD, tom un valor altamente

A mis padres, Hctor y Lilia.

es no dejarse abatir ni por los

hombres ni por los acontecimientos"

Figura 1: Diagrama de obtencin de los diferentes dializados. 22

Figura 2: Esquema de inmunizacin para la DTH. 29

Figura 3: Leucocitos en el calostro bovino 40X. 32

Figura 4: Corrimiento electrofortico de muestras de calostro teidas 33

Figura 5: Corrimiento electrofortico de muestras de dializados de 34

Figura 6: Corrimiento electrofortico de muestras de dializados de 35

Figura 7: Corrimiento electrofortico de muestras de dializados de 36

Figura 8: Barrido UV de los dializados obtenidos de las diferentes 39

Figura 9: Barrido UV de los distintos dializados segn el tipo de 40

Figura 10: Rangos de longitud de onda del espectro UV-VIS. 41

Figura 11: Barrido UV-VIS de 220-750 nm de las muestras Dcal de los 43

Figura 13: Barrido UV-VIS de 220-750 nm de las muestras DLEsp de 45

Figura 14: Barrido UV-VIS de 220-750 nm de la muestra de DLEsp 46

Figura 15: Determinacin de TNF- en CMSP humanas estimuladas con 47

Figura 16: Produccin de TNF- por donador. 49

Figura 17: Reconocimiento de antgenos de M. tuberculosis 50

Figura 18: Respuesta de DTH medida a 48 h. 52

Tabla 1: Actividades inmunolgica de los DLE. 7

Tabla 2: Padecimientos en los cuales se han empleado los DLE con 9

Tabla 3: Glosario de trminos. 18

Tabla 4: Nmero de clulas totales en el calostro bovino. 31

Tabla 5: Produccin normalizada de TNF- por donador. 48

Tabla 6: Valores significativos de la respuesta de DTH a las 24 h 52

Tabla 7: Valores significativos de la respuesta de DTH a las 48 y 72 h 53

Tabla 8: Valores significativos de la produccin de TNF- haciendo 80

Tabla 9: Valores significativos de la produccin de TNF- haciendo 81

Los dializados de extractos leucocitarios (DLE), contienen molculas por debajo de

El objetivo de este trabajo fue demostrar la presencia de molculas de bajo peso

Los resultados indican la presencia de pptidos de bajo peso molecular en los

Dializable Leukocyte Extracts (DLE) are immunomodulators that contents low

En 1942, Landstainer y Chase transfirieron respuesta inmune celular (RIC) de un donador

Obtencin y caracterizacin de dializados de extractos leucocitarios de origen bovino

En 1979, Petersen y col. desarrollaron un modelo murino en el cual estudiaron la respuesta

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CARACTERISTICAS GENERALES Y COMPOSICIN DE LOS DLE

La fraccin antgeno especfica o antgeno dependiente que corresponde a molculas de

La fraccin antgeno inespecfica o antgeno independiente, comprendida por molculas por

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POSIBLES MECANISMOS DE ACCIN DE LOS DLE

Inicialmente se propuso que los DLE, (especficamente el FT) funcionaban simplemente

No obstante lo anterior y con el conocimiento que se tiene actualmente sobre el sistema

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En 1996, Alvarez-Thull y Kirkpatrick propusieron que el principal mecanismo inmunolgico del

Tratando de averiguar un poco ms sobre el efecto biolgico de los dializados, el grupo de

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Posteriormente, siguiendo esta lnea de investigacin sobre el efecto de los componentes

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TABLA 1. Actividades inmunolgicas de los DLE.