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Deoxy TTP
(deoxythymidine
Triphosphate)
Las cadenas de nucletidos
que lo forman se enrollan
formando, una en torno a
otra, una estructura
especial que se conoce como
doble hlice ( -hlice ). Son
cadenas complementarias
con direccin opuesta
antiparalela.
Como es la relacion entre las bases?
guanina
citocina
adenina timina
ESQUEMA DE UNA DOBLE HEBRA DE DNA
Las uniones
entre las bases
se dan siempre:
A=T
CG
Son uniones
relativamente
dbiles, de tipo
puente de H
La molecula de ADN esta formada por dos hebras de nucleotidos
antiparalelas que forman una doble helice, que se mantienen
unidas por puentes de hidrogeno.
En cambio, las uniones entre el
grupo fosfato de un
nucletido, y el OH del
nucletido siguiente, son de
tipo COVALENTE, uniones
fuertes, que se pueden romper
nicamente por mtodos
bioqumicos.
Veamos rapidamente el ciclo celular
vSemiconservativa
v Bidireccional
v Discontinua o Asimetrica
La replicacion es Semiconservativa
28
OH
OH
P
3 5
P P + H2O
P
OH
Adicin 35
OH
(hipottica) 29
P
P
La ADN polimerasa solamente puede agregar
nucletidos a un cadena polinucleotidica que ya
esta apareada con una cadena complementaria,
o, mejor an: necesita un extremo 3libre para
poder comenzar a polimerizar.
No puede INICIAR la sintesis de una cadena
de novo.
5 3 5 3
Cmo se logra que ambas se cadenas se copien?
En esa hebra problema, otra ADN polimerasa (la ADN
polimerasa ), se adelanta un poco, y sintetiza un fragmento
pequeo.
A medida que la burbuja crece, este ciclo se repite nuevamente.
Crece la horquilla
de replicacion
Cadena de ADN
recien sintetizada
EL PROCESO CONSTA DE TRES
FASES: INICIACIN,
ELONGACIN Y
TERMINACIN.
viendo toda la pelcula
en cromosoma circular
ORI
TER
ORI
nico
primer 1ro primer RNA
RNA
DNA
3
2do primer RNA
5
...ACGTGATCGGGCTA....ACCGATCACATCGG.....AGGCGATCTTACG...
...TGCACTAGCCCGAT....TGGCTAGTGTAGCC .... TCCGCTAGAATGC...
detalle molecular del mecanismo
Protagonista : DNA Pol III de E. Coli
oligmero con 10 tipos de subunidades (PM = 700 kDa)
sliding clamp sliding clamp
In vitro
DNA Pol III de E coli completa: 10-6/sitio
sin : 10-5/sitio
In vivo
tasa de mutacin en E coli: 10-9/sitio
mutante sin : no viable
Fijalkowska et al (1996)
PNAS 93: 2856-2861
Protenas accesorias, que ayudan a la
Topoisomerasas
DNA Pol III
Clamp loader carga a la en el replisoma
Helicasa separa las hebras molde en la horquilla
ssBP estabiliza ssDNA
Primasa fabrica el primer RNA
DNA Pol I reemplaza al primer RNA al estilo pacman movimiento
del nick. Activ proof-read en el mismo polipptido donde residen sus actividades
polimerasa y 53 exonucleasa a partir de un nick
5
3
Topoisomerasas I y II
o Girasa y Topo II
El replisoma: una maquinaria de replicacin extraordinar
5
3
ADN polimerasa 3
CEBADOR 3
ADN COMPLEMENTARIO 5
ENZIMA FUNCIN
ORI
TER
ORI
3) no todo el tiempo
95 separac y desnaturaliz
de hebras
50-60 apaream de primers
(no dibujados)
37 extension por la Pol
a partir de primers
Nf = Ni #ciclos-1
mostrando los primers (flechas rojas)
temp depende de
estabilidad de DNA Pol
Mirar video de animacin subida a la pgina web materia o en
youtube::
http://video.search.yahoo.com/search/video?fr=tightropetb&p=PCR+animation#id=1&vid=e
847ed0f0d2a9e75146393cde569edc0&action=click
temp depende de % GC
2 duplexe
Termociclador
~ U$ 5.000 .y as sucesivamente
los productos de amplificacin se analizan por electroforesis
en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio fluorescente, se
intercala entre las bases nitrogenadas. Ojo! txico
y si la muestra es RNA?
registro de equipo
nmero de ciclo
qPCR (cuantitativa) o PCR en Tiempo Real
~ U$ 30.000
Aplicaciones de PCR
p ej en evolucin: amplifica
DNA de Neanderthal
Investigacin
Medicina
Agricultura
Anlisis forenses
filiaciones