U.N.P.S.J.B.

Facultad de Ciencias Naturales Dpto. de Biologa General

Ctedra Fisiologa General TP N1: Membranas Celulares

Trabajo Prctico N 1
Membranas Celulares

Introduccin:

Si la clula no opusiera ninguna barrera a la entrada y salida de materiales, quedara muy

expuesta a los cambios del medio, por ms pequeos que stos sean. Sin embargo, limitando el
protoplasma se encuentra una estructura fina, flexible, llamada membrana plasmtica o
plasmalema, que regula el flujo de sustancias disueltas dentro y fuera de la clula y por smosis el
flujo de agua.
La estructura bsica de la membrana es similar en clulas eucariticas y procariticas y es
explicada a travs del llamado modelo de mosaico fluido. Segn este modelo se considera a la
membrana como constituida por una doble capa lipdica con la porcin hidroflica hacia el exterior y
la porcin hidrofbica hacia el interior.

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Las molculas de protenas flotan en la doble capa lipdica, con uno o ambos extremos
hidroflicos penetrando una o ambas superficies de la membrana. Las dos superficies de la
membrana son diferentes entre s y existe una gran variedad en este aspecto en cuanto a la
calidad y cantidad de lpidos y protenas entre distintas membranas como la plasmalema,
tonoplasto, retculo endoplsmico y membranas de dictiosomas, cloroplastos, ncleo,
mitocondrias, etc.

La composicin de las membranas tambin depende de la especie de que se trate y del

medio en que ellas viven, por ejemplo, en membranas de cloroplastos hay mayor cantidad de
glucolpidos, siendo menos abundante los fosfolpidos.

Las molculas de protenas son bsicamente de tres tipos segn su funcin: protenas
catalticas (enzimas), protenas que constituyen canales y otras que facilitaran el pasaje de
solutos a travs de la membrana (transportadores o carriers). Segn su disposicin, las
protenas pueden ser integrales o intrnsecas cuando estn estrechamente ligadas a todos los
componentes de la membrana y su remocin es difcil; y perifricas o extrnsecas, cuando estn

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dbilmente unidas a una u otra superficie de la membrana. Algunas de stas se encuentran

ligadas a molculas cortas y ramificadas de polisacridos unidos a la superficie externa de la
membrana. Una funcin importante de estos polisacridos sera la de reconocimiento de
molculas externas, como protenas y otros polisacridos secretados eventualmente, por
ejemplo, por patgenos. La composicin y el comportamiento de la membrana plasmtica, entre
otros factores, es determinante respecto a la sensibilidad de algunos organismos a las bajas
temperaturas y a las heladas, ya que los cidos grasos insaturados de los fosfolpidos de las
membranas son ms fluidos a bajas temperaturas que los cidos grasos saturados,
permitiendo, por ejemplo, a las plantas que tienen una mayor proporcin de los primeros, ms
resistencia a heladas, mientras que las especies susceptibles poseen cidos grasos saturados
en mayor proporcin.

Algunos organismos del tipo de los protistas y la mayora de las clulas de hongos y
plantas superiores presentan una pared celular. Excepciones en cuanto a la presencia de
pared son las clulas de grano de polen y las del endosperma. Algunas clulas vegetales
poseen solamente pared primaria (clulas jvenes en activo crecimiento, fotosintetizadoras,

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parenquimticas, etc.). Los componentes proteicos de la pared primaria juegan un importante

rol en el crecimiento de la pared (extensina) y en el reconocimiento de molculas externas
(lectinas), cuya presencia demuestra su actividad metablica.
En algunas clulas vegetales los protoplastos secretan una pared secundaria entre la
primaria y la membrana plasmtica luego de que la clula ha detenido su crecimiento. (Por ej.,
clulas del tejido xilemtico que conducen fluidos bajo tensin).
El dimetro de los poros de la pared celular es lo suficientemente grande como para
permitir que el agua y los solutos disueltos en ella puedan moverse libremente por las paredes
en el espacio denominado apoplasto. La pared celular es atravesada por plasmodesmos, que
son canales de citoplasma que conectan protoplastos de clulas vecinas. Esta va, denominada
simplasto, facilita la circulacin tanto de solventes como de solutos entre clulas de un mismo
tejido.

Las vacuolas cumplen un rol fundamental en vegetales superiores: son responsables de

mantener la forma y rigidez en tejidos constituidos por clulas que slo poseen pared primaria
(ej. Hojas y tallos jvenes) gracias a la presin que ejercen en ellas el agua y los solutos
disueltos. A expensas de ello el volumen celular aumenta significativamente lo que hace
posible el aumento del rea de absorcin del agua en races o de la luz en hojas constituyendo
este aumento de volumen y superficie la segunda funcin vacuolar. Entre los procesos
metablicos que ocurren en vacuolas se puede citar el ltimo paso en la sntesis de etileno que
tiene lugar en el tonoplasto. La concentracin de materiales disueltos en vacuolas es alta, tanto
como la concentracin de sales en el agua de mar (0,4 a 0,6 M). Existen cientos de materiales
disueltos: sales, molculas orgnicas pequeas, protenas, pigmentos, productos secundarios
del metabolismo como alcaloides y cristales.
La vacuola actuara tambin como reservorio de productos que no seran
metabolizados inmediatamente por la clula y que impediran su desperdicio. Su rol en la
homeostasis (mantenimiento de parmetros fisiolgicos en un nivel medianamente constante)
constituye tambin una caracterstica de la actividad vacuolar. Por ejemplo, la vacuola juega un
importante papel en el mantenimiento del pH constante puesto que elevada concentracin de
iones hidrgeno en el citosol puede ser bombeado dentro de la vacuola. Esto ocurre en ctricos
donde el pH vacuolar desciende hasta valores de 3,0 mientras el pH del citosol circundante es
de 7,0 a 7,5. Los solutos totales en la vacuola determinan sus propiedades osmticas y las del
citosol que se hallan en equilibrio.

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Hasta el momento hemos analizado la composicin y organizacin de las membranas

citoplasmticas. Una segunda propiedad de las mismas referente al aspecto funcional es lo
referido a las caractersticas del movimiento de diferentes sustancias a travs de ellas y los
factores que las regulan. De acuerdo a la permeabilidad se pueden clasificar las membranas
segn el esquema que sigue:

a) Impermeables

b) Permeables Totalmente permeables

Semipermeables Puras: permiten pasaje de solvente pero no de soluto
Selectivas: permiten pasaje del solvente y solutos

Las membranas celulares pertenecen al tipo de las semipermeables selectivas, lo que se

refleja en el rpido movimiento del agua a travs de ellas, con velocidades variables y menores
para los solutos. stas ejercen una regulacin precisa del movimiento de molculas y iones dentro
y fuera de la clula, es decir, regulan el transporte de sustancias (movimiento de molculas y iones
entre diferentes compartimientos de un sistema biolgico). La membrana determina entonces el
tipo de molculas que se mueven dentro y fuera de la clula y la direccin y velocidad de
transporte. Dentro del transporte se puede diferenciar el pasivo del activo. El primero ocurre cuando
las molculas de soluto se mueven a travs de la membrana sin que la clula realice trabajo alguno
mientras que el segundo requiere suministro de energa de reacciones metablicas ocurridas en el
citoplasma o incluso en la propia membrana, producto generalmente de la hidrlisis del ATP. En
relacin al transporte de solventes y solutos en una membrana biolgica podemos enunciar:
1) En las clulas que estn biolgicamente inactivas (muertas o sin actividad metablica por
bajas o altas temperaturas, inhibidores, etc.) sus membranas se vuelven mucho ms
permeables a los solutos, tornndose menos selectivas. De este modo los solutos dentro y
fuera de la clula difunden a favor del gradiente de concentracin.
2) Las molculas de agua y gases disueltos como el N2, O2 y CO2 difunden pasivamente a
travs de todas las membranas rpidamente.
3) Los solutos hdrofbicos penetran a una tasa directamente proporcional a su solubilidad en
lpidos: los solutos ms hidrofbicos o menos hidroflicos, se mueven a travs de la
membrana ms rpidamente que aquellos con propiedades opuestas debido a su solubilidad
en la doble capa lipdica, cuya naturaleza es fundamentalmente hidrofbica.
4) Las molculas hidroflicas y los iones con similar solubilidad en lpidos, penetran a tasas
inversamente proporcionales a su tamao.

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5) Los iones y cationes con mayor densidad de cargas penetran ms lentamente que aquellas
con menor densidad (el caso de K+ vs. Ca++ o Fe++ vs. Fe+++) o compuestos ms o menos
ionizados (esto depende de su constante de ionizacin= Ki: es baja en cidos y bases
dbiles y alta en cidos y bases fuertes)
6) El grado de hidratacin de los iones influencia la penetracin de la membrana: a mayor
grado de hidratacin, existe menor velocidad de penetracin.

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Los factores ambientales (sequa, salinidad, fro, temperaturas congelantes, temperaturas

elevadas, anoxia, alta intensidad luminosa y desbalance de nutrientes) ejercen una influencia
directa sobre casi todos los aspectos del funcionamiento de las plantas durante su ciclo de vida. En
respuesta a condiciones cambiantes, y a menudo desfavorables, la percepcin del estrs por las
plantas inicia cadenas de transduccin de seales que conducen a la expresin de genes
especficamente relacionados con el estrs, as como la generacin de metabolitos que protegen
contra este. La membrana plasmtica de las clulas en general, y de las clulas vegetales en
particular, acta como una barrera que las separa y protege del medio ambiente.
Las modificaciones en la membrana plasmtica causadas por factores de estrs
incrementan la permeabilidad y la liberacin de iones, lo cual puede medirse como el flujo de
electrolitos.
Estimar el dao de la membrana celular en funcin de la liberacin de iones en solucin es
un mtodo fcil y es ampliamente utilizado para evaluar la resistencia ante factores de estrs. El
mtodo inicialmente fue descripto por Sullivan (University of Nebraska) en la dcada del 60 para
evaluar resistencia a altas temperatura en sorgo y maz y luego se han hecho modificaciones para
evaluar resistencia al frio y sequa en diversas especies vegetales.

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Objetivo:

Evidenciar la naturaleza lipoproteica de la membrana plasmtica a travs de tratamientos que

afecten a sus componentes, modificando su permeabilidad.
Estimar dao en membranas celulares

Materiales:
60 tubos de ensayo Sacabocados
12 tubos de centrfuga Agua destilada
Pipetas de 5 - 10 ml Solucin salina isotnica (0.9%)
4 cpsulas de petri Solucin detergente
3 vasos de precipitados de 200 ml Solucin salina hipertnica (2%)

Gradillas 20 ml de soluciones 1M de:

Mecheros HONa
Guantes de ltex HOK
Centrfuga HONH4
Heladera HCl
Pinza, bistur Acido actico
Microscopio Remolachas
Balanza Hojas de distintas plantas (xerfitas y
mesfitas)
Agitador
Conductivmetro

Los materiales subrayados deben ser provistos por los alumnos.

Procedimiento:

I) Hemlisis
Para realizar esta experiencia utilizar guantes de latex y, una vez finalizadas las
actividades, disponer el material utilizado en un balde con lavandina.
1. Tomar 10 ml de la sangre provista por la ctedra y colocar unas gotas de anticoagulante
para poder manipularla .
2. Colocar en un tubo de ensayo 1 o 2 ml de sangre y cuatro partes de agua destilada.
3. Efectuar el mismo procedimiento con solucin salina hiperosmtica.
4. Lo que resta de sangre diluirlo en 1:4 pares de solucin salina isosmtica.
5. A 2 ml de la solucin anterior, agregar 2 o 3 ml de solucin detergente (agua saturada con
benceno) .

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6. Tomar 3 tubos de ensayo y colocarle a cada uno 4 ml de la solucin 4. Llevar a bao mara,
uno a 40C, otro a 70C (durante 10 minutos) y el tercero a freezer durante 1 hora.
7. Tomar 5 tubos de ensayo y colocar en cada uno 4 o 5 ml de la solucin 4. A uno agregarle
unas gotas de una solucin 1M de HONa; al 2do, HOK; al 3ero HONH4, al 4to HCl y al 5to cido
actico. Guardar el resto como testigo (sn. isosmtica)
8. Obsevar y registrar los cambios ocurridos en forma macroscpica. En el caso de las
soluciones hipo, iso e hiperosmticas, observar al microscopio y graficar.
9. Llevar cada muestra a un tubo de centrfuga y centrifugar durante 2 minutos a 3000 rpm. Si
la sustancia sobrenadante est coloreada de rojo, ha existido hemlisis. Graficar en funcin
de la intensidad de coloracin a partir de una escala arbitraria.

II) Tejido Vegetal:

1. Cortar trozos de raz de remolacha de 4 x 1 cm lo ms uniformemente posible y lavarlos con

agua corriente durante 5 minutos, para eliminar el pigmento de las clulas seleccionadas.
2. Marcar 4 tubos de ensayo con las siguientes temperaturas: 0 C, T ambiente, 40 C y 70 C
3. El trozo que corresponde a 0 C debe colocarse en refrigerador durante 1 hora. Transcurrido
ese tiempo, colocar en agua corriente 30 minutos y retirar el trozo de remolacha
4. El trozo que corresponde a T ambiente se coloca en agua y se deja durante 30 minutos. El
resto se lleva a bao mara a las temperaturas indicadas unos 10 minutos, se deja
descansar 30 minutos y se retiran los trocitos de remolacha.
5. Colocar otro trozo de remolacha en un tubo de ensayo con solucin detergente (agua
saturada con benceno). Dejar reposar 1 hora a temperatura ambientey retirar la remolacha.
6. Rotular 5 tubos de ensayo para: HONa, HOK, HONH4, HCl y cido Actico. Colocar un trozo
de remolacha en cada reactivo y esperar 30 minutos. Retirar los trozos de remolacha.
7. En todos los casos, observar y registrar los cambios ocurridos. Graficar en funcin de la
intensidad de coloracin a partir de una escala arbitraria.

III) Medicin de dao de membranas celulares

Las membranas celulares pueden sufrir daos en su estructura y composicin por diferentes
agentes de estrs entre ellos las bajas temperaturas.

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1. Pesar 0,2gr de hojas de diferentes plantas (mesfitas, xerfitas) y colocarlas en el interior de

tubos de ensayo para luego ser sometidas a diferentes temperaturas (temperatura ambiente,
heladera y freezer) durante 1 hora.
2. Retirar de los tratamientos y agregar 10ml de agua destilada a cada tubo de ensayo.
3. Agitar con un agitador (Vortex) durante 1hora.
4. Determinar la conductividad elctrica de la solucin con un conductivmetro, que indica el grado
de integridad de las membranas celulares. Para determinar el porcentaje de dao cada muestra
ser sometida a altas temperaturas (colocadas en bao mara) para obtener la conductividad
elctrica mxima.
5. Calcular el porcentaje de dao mediante la siguiente frmula:

Dao(%) = (Conductividad elctrica de la muestra / Conductividad elctrica mxima) * 100

Conductividad elctrica de la muestra

6. Graficar temperatura en funcin del porcentaje de dao y determinar el LT50 que representa la
temperatura a la cual se obtiene el 50% de conductividad elctrica en solucin lo cual
representa dao celular irreversible.

Resultados:
Expresar los resultados obtenidos en forma de tablas, grficos y/o dibujos.

Conclusiones:
- Una vez representados y/o graficados los resultados obtenidos, elaborar las conclusiones
acerca de las experiencias realizadas.
- Enumerar los factores que influyen sobre el funcionamiento de la membrana celular.
- Explicar cmo afectan a la membrana los factores mencionados y sobre qu porcin actan
especficamente.
- Es semejante la influencia de los diversos procedimientos en clulas animales y
vegetales? Por qu?

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Bibliografa:

Alberts, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts,, K.; & Watson, J.- 1987- Biologa Molecular
de la clula- Ediciones Omega S.A.- Barcelona- 1232 pp.
Curtis & Barnes, S. 1994- Biologa- Ed. Interamericana
Eckert, R.; Randall, D.; Burggren, W. & French, K.- 1999 Fisiologa Animal- Mecanismos y
adaptacionesEd. Interamericana- Mc Graw Hill- 4ta Edicin- 795 pp-
Gua de Trabajos Prcticos de Fisiologa Vegetal. U.N.P.S.J.B. Comodoro Rivadavia.
Gua de Trabajos Prcticos de Fisiologa General. Univ. Crdoba.
Gua de Trabajos Prcticos de Fisiologa Vegetal y Fitogeografa. 1997. U.N.L.P.
Salisbury, F. B. & Ross, C. W. 1994. Fisiologa vegetal-Ed. Interamericana-759 pp.

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