UNIVERSIDAD DEL VALLE

FACULTAD DE INGENIERIAS
ESCUELA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

PLAN DE ESTUDIOS: Tecnologa en Alimentos

ASIGNATURA: Microbiologa de alimentos

GUIA DE LABORATORIO: 3. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS

INTRODUCCIN

La investigacin sobre los productos alimenticios requiere especial atencin para detectar
aquellos microorganismos que los deterioran o que son patgenos para el consumidor. El
examen microbiolgico permite obtener pautas para el establecimiento de normas de
higiene aplicables durante la produccin, as como mtodos eficaces de conservacin.

Microorganismos indicadores: Este trmino se aplica a cualquier grupo taxonmico,

fisiolgico o ecolgico de microorganismos cuya presencia proporcione evidencia indirecta
de que los alimentos estuvieron expuestos a condiciones que pudieron determinar la
llegada de microorganismos peligrosos o permitir la proliferacin de especies patgenas o
toxignicas. Los organismos patgenos son de gran utilidad tanto para determinar la
calidad bacteriolgica de los alimentos como la garanta que ofrecen al consumidor.

Escherichia coli y coliformes: Son organismos que habitan en el tracto digestivo del
hombre y otros animales. Su presencia en un alimento indica contaminacin directa o
indirecta de origen fecal. La presencia de E. coli advierte el riesgo de que pudieran estar
presentes bacterias patgenas entricas, entre ellas algunas de los gneros Salmonella,
Shiguella y Vibrio; as como virus entricos y parsitos diversos.

Los otros coliformes (especies de varios gneros de la familia Enterobacteriaceae), son

buenos indicadores de limpieza y desinfeccin inadecuadas, o de una manipulacin o
tratamiento incorrecto de los alimentos. La presencia de niveles altos de coliformes en un
alimento tratado, no indica necesariamente un contacto inmediato con heces o con
superficies contaminadas con heces. Indica que pudieron existir circunstancias
favorecedoras de la multiplicacin de estos microorganismos introducidos probablemente
por deficiente limpieza o desinfeccin.

Streptococcus salivarus Se ha utilizado como indicador de contaminacin oral, debido a

que est casi siempre presente en la boca humana.

Staphylococcus aureus, Su presencia se interpreta como contaminacin proveniente de la

piel, la boca o las fosas nasales de los manipuladores.

Clostridium botulinum y Clostridium perfringens: La presencia de esporas en alimentos

enlatados no cidos, es seal de que posiblemente el tratamiento trmico fue insuficiente.
OBJETIVOS

Determinar la calidad del producto alimenticio en trminos de contaminacin microbiana.

MATERIALES

Muestra de alimentos
12 Cajas de petri esterilizadas.
4 Pipetas esterilizadas.
1 Frasco con 90 mL de agua peptonada.
120 mL de Agar cuenta grmenes fundido
2 Tubos de ensayo con 9 mL de agua peptonada.
9 Tubos de ensayo con 10 mL de caldo LSMUG.
Mechero.
Gradilla para tubos.
Reactivo de Kovac's.

PROCEDIMIENTO

1. Dilucin de la muestra de alimento.

1. Comenzar el trabajo lo ms pronto posible. Se preparan diluciones del alimento

10-1 a 10-3.
2. La dilucin 10-1 se prepara pesando 10 gramos de la muestra, que se vierte
aspticamente en un frasco con 90 mL de diluyente (agua peptonada).
3.
La dilucin as preparada se vierte luego en una bolsa plstica y se lleva al
stomaker (homogenizador) para obtener fragmentos muy pequeos.
4.
Transferir luego mL de la dilucin 10-1 a un tubo que contenga 9 mL de diluyente
para obtener la dilucin 10-2
5.
Transferir 1 mL de la dilucin 10-2 a un tubo con 9 mL de diluyente para obtener la
dilucin 10-3
6. Cada dilucin sucesiva disminuir 10 veces la concentracin. No olvide marcar
convenientemente los tubos.

2. Recuento de Mesfilos. (Agar cuenta grmenes)

Su presencia puede reflejar deficiencias en el proceso de elaboracin y contaminacin en

la manipulacin durante el empaque.

1. Tomar 1 mL de las diluciones (10-1 a 10-3) transfiralos a cajas de petri vacas

estriles y previamente marcadas por duplicado.
2. Inmediatamente adicione el agar cuenta grmenes fundido.
3. Mezcle el inculo con el medio fundido, moviendo suavemente la caja hacia arriba,
hacia abajo y en forma circular.
4. Deje solidificar el agar.
5. Invierta e incube las cajas de petri a 37 C durante 24 horas.
6. Pasado este tiempo, cuente las colonias que hayan crecido en las cajas.

2.1 Lectura de resultados:

Seleccione las cajas de la misma dilucin que tengan entre 30 y 300 colonias. Cuente el
nmero de colonias de ambas cajas, haga promedio aritmtico y multiplique por el
reciproco de la dilucin leda.
Los resultados se deben expresar con 2 dgitos y el resto en potencia de 10.
Ej: Si el recuento se realiza en una dilucin 10-2 y fue de 148 colonias, el tercer dgito por
ser mayor a 5 se aproxima al siguiente nmero, o sea que el recuento sera 150x102, se
expresa mejor como 15x103.

Si el recuento fue 234, por ser el tercer dgito menor que 5, se anula y se expresa:
230x102, o mejor 23x103. Reporte el recuento de microorganismos mesfilos como
Unidades Formadoras de Colonia (UFC) por gramo o mililitro segn el tipo de muestra
analizada.

Cuando el recuento se utiliza para determinar la aceptacin de un alimento, se compara

con los valores lmites establecidos segn la normatividad del Ministerio de Salud, del
INVIMA o las Normas Icontec.

3. Nmero ms probable de coliformes totales y fecales:

3.1 Prueba para coliformes totales.

Pipetee 1 mL de cada una de las diluciones (10-1 a 10-3) en tubos con Caldo Lauryl sulfato
MUG, utilizando 3 tubos por dilucin.
Incube los tubos a 352C por 24-48 horas.
Pasadas las 24-48 horas, anote como positivos los tubos que muestren turbiedad y
produccin de gas, que se puede observar por el desplazamiento del tubo de Durham.

3.2 Prueba para coliformes fecales

Esta prueba se realiza despus de pasado el tiempo de incubacin. Para su
determinacin se adicionan 2-3 gotas del reactivo de Kovacs a los tubos positivos para
coliformes totales, este reactivo permite revelar la presencia del indol, que se produce a
consecuencia del crecimiento de este grupo de bacterias, anote como positivos aquellos
tubos que formen un anillo rosado salmn en la superficie.

3.3 Interpretacin de los resultados.

Leer la tabla del NMP (Nmero Ms Probable), para saber el resultado de acuerdo con el
nmero de tubos positivos, tanto para los coliformes totales, como para los coliformes
fecales. Ver Tabla 1.

4. Recuento total de mohos y levaduras

1. Tomar 1 mL de las diluciones (10-1 a 10-3) transfiralos a cajas de petri vacas
estriles y previamente marcadas por duplicado.
2. Inmediatamente adicione el agar Base Ogye.
3. Mezcle el inculo con el medio fundido, moviendo suavemente la caja hacia arriba,
hacia abajo y en forma circular.
4. Deje solidificar el agar.
5. Invierta e incube las cajas de petri a 25 C durante 3 a 5 das.
6. Pasado este tiempo, cuente las colonias que hayan crecido en las cajas

4.1 Lectura de resultados

Seleccione las cajas de la misma dilucin que tengan entre 10 y 100 colonias. Cuente el
nmero de colonias de ambas cajas, haga promedio aritmtico y multiplique por el
reciproco de la dilucin leda.
Los resultados se deben expresar con 2 dgitos y el resto en potencia de 10.
Reporte como recuento de mohos y levaduras en Unidades Formadoras de Colonia (UFC)
por gramo o mililitro segn el tipo de muestra analizada

CUESTIONARIO:
Cul es el fundamento de las diferentes pruebas que se han realizado?.
Cules son los componentes de cada uno de los medios de cultivo y porqu se utilizan?
Qu importancia tienen los tipos de microorganismos analizados en la calidad de los
alimentos?

Tabla 1. Nmero Ms Probable (NMP) por g/mL de muestra, usando tres tubos de
0.1, 0.01 y 0.001 g/mL

Numero de Tubos Numero de Tubos Numero de Tubos Numero de Tubos

positivos positivos positivos positivos
0.1 0.01 0.001 NMP 0.1 0.01 0.001 NMP 0.1 0.01 0.001 NMP 0.1 0.01 0.001 NMP
0 0 0 3 1 0 0 3.6 2 0 0 9.1 3 0 0 23
0 0 1 3 1 0 1 7.2 2 0 1 14 3 0 1 39
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95
0 1 0 3 1 1 0 7.3 2 1 0 15 3 1 0 43
0 1 1 6.1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75
0 1 2 9.2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160
0 2 0 6.2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93
0 2 1 9.3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290
0 3 0 9.4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 1100