Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Odontologa
Lic. Julio Turcios
Bioqumica

Reporte del Laboratorio:

Identificacin de Aminocidos y Protenas

Integrantes Carn
Max Alejandro Carrillo 200910847
Mara Fernanda Escobar 200910978
John Stephen Vernon 20092245
Yasmin Susana Orozco 200922263
Mayra Carlota Hernndez 200922300

Nueva Guatemala de la Asuncin, 26 de Abril de 2010

 Introduccin:

Las sustancias qumica estn en todo nuestro entorno, que con el tiempo se ha
aprendido a usarlas a nuestra conveniencia; en el cuerpo se encuentran una infinidad
de molculas y compuestos bioqumicos, que ayudan a realizar muchas funciones que
nos mantienen vivos. Sabes que hay una infinidad de posibles combinaciones entre
cualquieras que fueran sus distintos y elementos y dar inimaginables combinaciones
posibles. Lo que ms nos interesa a nosotros, como futuros profesionales de la salud,
son las molculas biolgicas, y de entre ellas los aminocidos.

Con los avances tecnolgicos del mundo se ha podido comprender mejor que es
lo que sucede en nuestro organismo y cules son las sustancias que intervienen
durante las vas metablicas y el mantenimiento de la homeostasis. En el pasado
laboratorio de bioqumica, se tuvo la oportunidad de poder comprender mejor ciertas
molculas orgnicas que se encuentran en nuestro cuerpo y alimentos, estas
molculas son denominadas aminocidos y protenas. Durante el laboratorio se pudo
identificar protenas y aminocidos, por medio de la cromatografa en papel, as como
con reacciones biuret y de ninhidrina.

A continuacin se presenta un informe donde se explica ms ampliamente lo

sucedido en dicho laboratorio, los resultados obtenidos, la explicacin para dichos
resultados y una gua paso a paso de cmo se realizo la cromatografa en papel, la
reaccin biruet y de ninhidrina ya mencionadas.
 Resumen

Cromatografa en Papel
Instrumentos y materiales: Papel alto en celulosa, Cmara cromatogrfica,
Tijeras, Lpiz, Regla, H20, Tubos capilares, Aminocidos (Cis, Gln), Secadora,
Ninhidrina, Acido Actico (CH3COOH), N-Butanol, Pipetas (10 y 5 ml), Engrapadora,
Beacker.
Procedimiento:
1. Se recubrieron las paredes internas de la cmara cromatogrfica con papel alto
en celulosa y se cort otro pedazo de papel alto en celulosa, con unas medidas
de 16.1x19 cm. A este papel ya cortado le trazamos los siguientes mrgenes:

2. En la estacin de sembrado se pusieron 3 gotas de aminocidos con los tubos

capilares de la siguiente manera, siempre siguiendo las instrucciones del
folleto de laboratorio.

3. Se enroll el mismo de modo que el sembrado qued hacia el exterior.

4. Luego, se coloc la cmara cromatografa en la estacin designada para la fase
mvil. Aqu se le agreg, n-butanol y cido actico, adems se aadi agua, as
se hizo la fase mvil.
5. Se introdujo la parte de la fase estacionaria a la cmara, aqu se debe dejar por
un tiempo mnimo de 30. (Durante este experimento slo se dej por 5
minutos). Luego se procedi a revelar con ninhidrina.
 Identificacin de Aminocidos y Protenas
Instrumentos y materiales:
10 tubos de ensayo, Reactivo Biuret, Ninhidrina, H20, Gelatina, Casena,
Albmina, Solucin de Problema 1 y 2, Hidrxido de Sodio al 10% V/V, Papel Parafilm,
Pipeta de 1ml, Masking Tape, Beacker, Gradilla, Estufa, Sartn, Perlas de Ebullicin,
Tenazas.
-Reaccin Biuret:
1. Al tubo de ensayo No. 1 se le agreg 20 gotas de H20, al No. 2 se le agreg 20
gotas de gelatina, al No. 3 de casena, al No. 4 de albmina, al No. 5 de solucin
de problema 1, y al No. 6 solucin de problema 2.
2. A cada uno de los tubos de ensayo se le agreg 1 ml de hidrxido de sodio al
10% v/v con un gotero, se anotaron los cambios en las distintas soluciones
(ver resultados). Se le agreg el hidrxido de sodio para volver el pH de las
soluciones ms alcalino, ya que el reactivo biuret funciona en pH muy elevados.
3. Se agreg al tubo de ensayo no. 1 con una pipeta 3 gotas de biuret con un
gotero, se cubri el tubo con papel parafilm y se agit vigorosamente de arriba
hacia abajo por 1 minuto. Este procedimiento se hace con todos los tubos. Una
vez terminado con todos los tubos se dejan reposar por 15 en la gradilla.
-Reaccin Ninhidrina:
1. Al tubo de ensayo No. 1 se le agreg 20 gotas de H20, al No. 2 de gelatina, al No.
3 de casena y al No. 4 de albmina.
2. Se agreg al tubo de ensayo no. 1 con una pipeta 5 gotas de ninhidrina con un
gotero, se cubri el tubo con papel parafilm y se agit vigorosamente de arriba
hacia abajo por 1 minuto. Este procedimiento se hace con todos los tubos, una
vez terminado con todos los tubos se colocaron en un beacker.
3. Una vez que todos los tubos estn en el beacker, se colocan bao mara por 10
minutos.

Resultados
Los resultados obtenidos durante la prctica coinciden con lo esperado
tericamente, tanto para la cromatografa en papel como para la identificacin de
protenas. Adems, se da una explicacin coherente sobre por qu suceden o no las
tinciones respectivas durante en anlisis de protenas, as como el porqu del uso de
los distintos materiales en la cromatografa (ver resultados y discusin de resultados).
 Resultados:

Identificacin de Protenas:
Durante la identificacin de protenas con la reaccin de ninhidrina y la
reaccin biuret se anotaron los distintos cambios que se observaron respectivamente
durante el proceso, los cuales se describen a continuacin en los cuadros:

Reaccin Biuret:

Tubos de Ensayos: Soluto: (20 gotas)

Tubo de Ensayo 1 Agua
Tubo de Ensayo 2 Gelatina
Tubo de Ensayo 3 Casena
Tubo de Ensayo 4 Albmina
Tubo de Ensayo 5 Solucin problema 1
Tubo de Ensayo 6 Solucin problema 2
Resultados:
Inicialmente:

Al agregarle Na2OH al 10% (1 ml):

 Con 3 gotas de Biuret (despus de 15 minutos):

Reaccin Ninhidrina:

Tubos de Ensayos: Soluto: (20 gotas)

Tubo de Ensayo 1 Agua
Tubo de Ensayo 2 Gelatina
Tubo de Ensayo 3 Casena
Tubo de Ensayo 4 Albmina
Resultados:
Inicialmente:

Con Ninhidrina (5 gotas):

 10 minutos despus del bao mara:

Cromatografa en Papel:

Proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisis cualitativos que
pese a no ser una tcnica muy potente no requiere de ningn tipo de equipamiento
extraordinario.
Consta de dos fases: fase mvil y fase estacionaria. La fase estacionaria est
constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un
extremo colocando pequeas gotas de la solucin y evaporando el solventen (ver
resumen). Luego el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender
por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del
lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase mvil en el fondo.
Despus de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al
extremo se retira el papel y seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias
tienen color propio se vern las manchas de distinto color separadas. Cuando los
componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado, en
nuestro caso, ninhidrina, sumamente til para revelar aminocidos.
Los resultados obtenidos en el experimento estn expresados por la ecuacin:
= /
Siendo D la distancia recorrida por cada muestra y Df la distancia del frente de
avance del eluente (fase mvil).
Los Rfs son una forma de expresar la cantidad de lo que avanz el aminocido
relativamente con lo que avanz el eluente en el papel (fase estacionaria). Los Rfs
obtenidos empricamente, durante 5 minutos de corrimiento para las siembras de
aminocidos son:

Cis: 1.8/3 = 0.6 cm

Gln: 1.4/2.5= 0.56cm
Cis y Gln: 1.5/2.6= 0.58cm
 Discusin de Resultados:
Identificacin de Protenas:

REACCIN BIURET:

Biuret

Los pptidos y protenas producen una reaccin coloreada muy usada para la
valoracin de los mismos, llamada reaccin del Biuret, que contiene Cu2SO4 como
disolvente. Las protenas por sus uniones peptdicas reaccionan con los iones cpricos
del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta. Se necesitan 2
ms uniones peptdicas para que se forme el complejo coloreado. Esta prueba sirve
para la identificacin de tripptidos en adelante.
Un color violeta resulta cuando los iones cpricos en medio alcalino forman
complejos con los electrones no saturados de los tomos de nitrgeno y oxgeno de los
enlaces de todas las protenas. La cantidad de color producido es proporcional a la
concentracin de protenas. Sin embargo, el mtodo es un poco insensible siendo el
lmite menor de 0.25mg de protenas.
Las sustancias que dan el color violeta tienen dos grupos CONH2 unidos
directamente o por un carbono o nitrgeno. Los compuestos que contienen CH2NH2,
-C(NH)NH2 y CSNH2 en lugar de los grupos CONH2 tambin reaccionan. Las
estructuras peptdicas en protenas y sus derivados que contengan enlaces peptdicos
tambin dan positivo para la prueba de Biuret.
De los aminocidos, la histidina da positivo. Los dipptidos dan pruebas
negativas. Las protenas dan color morado o violeta mientras que las proteosas o
peptonas (enzimas que rompen los enlaces peptdicos de las protenas) dan un color
rosado y los pptidos dan un color rosado claro. Adems, los aminocidos dan un
color amarillento [3].
Agua:
El agua no cambi en ningn momento del procedimiento porque no contiene
ningn tipo de elemento orgnico y mucho menos compuestos proteicos, por esta
razn da negativo a la reaccin de biuret.
Gelatina
La geltaina es una mezcla coloide, incolora, translcida, quebradiza y casi
inspida que se obtiene a partir del colgeno procedente del tejido conectivo de
despojos animales hervidos con agua. El colgeno es un compuesto proteico hecho
sustancialmente de prolina, hidroxiprolina y glicina. El reactivo biuret debera dar
positivo, debido a los componente peptdicos del colgeno presente en la gelatina. El
resultado del laboratorio fue un color morado claro, que concuerda con lo que la
teora requiere, aunque se han hechos estudios donde la gelatina da un color azul [1].
Por ende podemos decir que si se hubiera dejado reaccionar por ms tiempo o si se
hubiera aadido ms gelatina, se hubiera obtenido el color azul.
Casena:
La casena es una fosfoprotena presente en la leche y en algunos de sus
derivados. En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio en un
complejo que se ha denominado caseingeno. El resultado del laboratorio fue el
cambio de coloracin de levemente blanco a un blanco opaco total. El resultado
terico esperado es un cambio de coloracin a un azul lechoso, que en nuestro caso no
fue azul, slo lechoso. Deducimos que fue el hecho de solamente usar 20 gotas de
casena, el que produjo nuestro resultado: es posible que en la solucin de casena no
se alcanz el lmite mnimo (0.25 mg) de casena para que se llevara a cabo la reaccin
biuret [2].
Concordamos, tambin, en que posiblemente el factor tiempo influy en la
manifestacin de la reaccin.
Albmina:
La albmina es una protena que se encuentra en gran proporcin en el plasma
sanguneo, siendo la principal protena de la sangre y a su vez la ms abundante en el
ser humano. Es sintetizada en el hgado. Lo esperado en esta reaccin es obtener un
color violeta translucido. En la prctica del laboratorio, despus de 15 minutos de
reaccin, no se not ningn cambio convincente para afirmar que hay presencia de
protenas. Sin embargo una observacin efectuada 20 minutos despus de la primera
observacin, demostr un cambio de coloracin amarillento. Segn la teora, la
reaccin Biuret, un color amarillento indica presencia de aminocidos.

[1], [2] s.a. (2007). Prelab3: propiedades qumicas de las protenas. 05/05/2007. s.l.. Consultado el: 21/04/2010. Disponible
en: http://www.doschivos.com/trabajos/biologia/88.htm.
[3] s.a. (2004). Experimento 2, identificacin de aminocidos. 06/03/2004. s.l.. Consultado el 23/04/2010. Disponible en:
http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp.
34.
Solucin Problema 1:
sta era una solucin desconocida en la cual se quera probar la presencia o no
de protenas. El resultado fue un cambio de coloracin nulo, lo que nos indica ausencia
de protenas. Esto no quiere decir que no existiera aminocidos en la solucin, ya que
la reaccin biuret no reacciona con aminocidos sino que con enlaces peptdicos.

Solucin Problema 2:
Al igual que en el problema 1, se quera probar la presencia o no de protenas.
El resultado fue un cambio de coloracin a prpura translucido, lo que nos demuestra
presencia de protenas en solucin.

REACCIN CON NINHIDRINA:

Ninhidrina (2,2-Dihidroxindeno-1,3-diona)

La ninhidrina es un poderoso agente reactivo comn para visualizar las bandas

de separacin de aminocidos (y por ende protenas) por cromatografa o
electroforesis. sta reacciona con los aminocidos (pH entre 4 y 8) y en caliente,
produciendo amoniaco, dixido de carbono y un complejo de color prpura azulado.
Todos los aminocidos primarios forman el mismo complejo qumico tras su reaccin
con ninhidrina. Si la coloracin es violeta o amarillo claro se trata de una protena, un
polipptido o un aminocido. Adems, si el color es rojo o amarillo fuerte se trata del
aminocido prolina, o la hidroxiprolina.

Agua:
El agua no cambi en ningn momento del procedimiento, ni al agregar
ninhidrina ni al momento de aplicarle calor, porque no contiene ningn tipo de
elemento orgnico y mucho menos compuestos proteicos, por ende la ninhidrina no
tiene con quin reaccionar.
Gelatina:
Como ya se mencion anteriormente la gelatina es un compuesto proteico, que
en la reaccin de biuret cambi de color por la presencia de colgeno; sin embargo, en
el procedimiento con ninhidrina la muestra de gelatina no cambi de color, aunque la
teora dice que por la presencia de prolina e hidroxiprolina, debera cambiar a una
tonalidad amarillenta o roja. Suponemos que esto sucedi debido a problemas
durante el goteo. Esto lo notamos porque el tubo de ensayo de la gelatina presentaba
un notorio volumen mayor que el de los otros tubos de ensayo. Al ser una gran
cantidad de gelatina y una cantidad relativamente menor de ninhidrina, sta ltima
tuvo una saturacin ms lenta para su reaccin, dejando poco producto visible (lo que
proveera su notorio color positivo).
Casena:
Como ya se sabe la casena es un compuesto proteico presente en la leche y sus
derivados. En la prctica del laboratorio, la casena actu tal y como lo dice la teora;
cambio de color a un azul-morado, debido a la presencia de protenas; y tambin
cambi de estado (debido al aumento de termperatura): se coagul, esto indica
presencia de globulinas [3].
Albmina:
Al hacerse la reaccin con ninhidrina, la albumina cambi de un color
transparente a rojo sangre y adems se coagul. El cambio de color indica la presencia
de prolina e hidroxiprolina. La albmina se coagula por el calor, lo que confirma su
identidad [3].

[3] s.a. (2004). Experimento 2, identificacin de aminocidos. 06/03/2004. s.l.. Consultado el 23/04/2010. Disponible en:
http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENTO%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp.
34.
 Cromatografa
Se recurri al uso de Cromatografa en papel ya que es ms fcil, y rpido en su
aplicacin adems de observacin de las reacciones.
La preferencia en el uso del papel Whatman 1, se debe a su caracterstica de
polaridad, sta impide el rompimiento del papel.
La lnea trazada ms importante fue la inferior que media 2cm (ver resumen),
sta nos daba la pauta de inicio de los aminocidos. Todos los trazos se hicieron a
lpiz porque si se usaba lapiceros, debido a su tinta orgnica, se hubiera reaccionado
con los aminocidos, impidiendo la observacin de ellos.
Las paredes internas de la cmara cromatogrfica se revistieron con papel alto
en celulosa. Esto previene que la presin externa de la cmara interviniera en el
proceso cromatogfico.
La fase estacionaria no toca la cmara cromatogrfica porque est saturada de
agua (para la adhrencia) en sus paredes; si el papel de la fase estacionarioa toca las
paredes, o el papel que las recubre, absorbe fcilmente agua y ya no se puede observar
con claridad el avance de los aminocidos.
Al momento de sembrar la muestra se requiri el uso de capilares para tener
una muestra ms exacta, pero su uso no era necesario ya que podramos utilizar un
gotero.
El orden de las siembras de las muestras no afectaba nuestros resultados, lo
nico importante era colocar la misma cantidad de aminocidos en cada punto, y no
contaminar el papel de la fase estacionaria.
La fase estacionaria se dobl hacia afuera para que las muestras de los
aminocidos no entraran en contacto entre ellos (y as fuera ms fcil la absorcin de
la fase mvil) colocndole grapas en los extremos para unirlos, porque si hubiramos
utilizado masking tape, se hubiera despegado, rompiendo la estructura requerida de
la fase estacionaria.
Al momento de realizar la fase mvil procuramos que la cmara estuviera
tapada para que no se contamine y no reaccionara con otro compuesto.
Al momento de sacar la fase estacionaria de la fase mvil, era necesario
colocarse guantes debido a los componentes qumicos que podran afectar la mano.
Era importante secar la fase estacionaria porque se tena que revelar con ninhidrina,
disminuyendo as la cantidad de los eluentes para evitar la reaccin de los mismos.
Obteniendo as la coloracin de los aminocidos.
La Cistena corri mas debido a su bajo peso molecular, y la Glutena corri
menos debido a su alto peso molecular.
En la combinacin de los aminocidos se puede observar que su recorrido es el
promedio de los recorridos de la Cistena y la Glutena. La Cistena hizo que la mezcla
de ambos aminocidos corriera ms pero al mismo tiempo la Glutena impidi que
siguiera avanzando, esto debido a las diferencias entre pesos moleculares.
 Conclusiones:
Para que se lleve a cabo una reaccin como la de biuret revela nicamente la
presencia de protenas y pptidos pequeos.
La reaccin de ninhidrina es ms genrica que la de biuret. Identifica
aminocidos y protenas no por sus enlaces, sino por su constitucin qumica,
lo cual le otorga un mayor poder de identificacin ante el biuret.
Otros factores como el tiempo, temperatura y cantidad de sustrato afectan la
calidad de la reaccin y resultados para la identificacin de protenas.
Dependiendo de la estructura primaria de cada protena, la manifestacin en
las reacciones puede tener ciertas variaciones especficas.
El tiempo es indispensable en la cromatografa ya que con tiempos de corrida
cortos no se aprecian claramente los cambios relevantes.
El mtodo de identificacin por cromatografa en papel es efectivo ya que los
elementos utilizados como eluentes eran ideales para correr en el papel alto en
celulosa y disolver los aminocidos; adems.
Conforme avanza el tiempo, la corrida del aminocido variar dependiendo de
su peso; a mayor peso, ms lento el corrimiento, a menor peso, ms veloz.
Las interacciones entre el solvente y soluto dieron a mostrar las caractersticas
de cada aminocido.
 Bibliografa:

Mathews, C.K.(1996). Bioqumica. Segunda edicin: Espaa.

Wikipedia. (2010). Peptidasa. (en lnea). s.f.ed.. s.l.. Consultado el:
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Wikipedia. (2010). Casena. (en lnea). s.f.ed.. s.l.. Consultado el: 21/04/2010.
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s.a. (2007). Prelab3: propiedades qumicas de las protenas. 05/05/2007.
s.l.. Consultado el: 21/04/2010. Disponible en:
http://www.doschivos.com/trabajos/biologia/88.htm.
Usuario: denis_qca. (2008). Protenas y sus reacciones. 09/19/2008. s.l..
Consultado el: 21/04/2010. Disponible en:
http://www.scribd.com/doc/2309987/Proteinas-y-sus-reacciones.
s.a. (2009). Precipitacin de protenas. s.f.ed.. Salamanca, Espaa.
Consultado el: 21/04/2010. Disponible en:
http://html.rincondelvago.com/precipitantes-de-proteinas.html.
s.a. (2004). Experimento 2, identificacin de aminocidos. 06/03/2004. s.l..
Consultado el 23/04/2010. Disponible en:
http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERI
MENTO%202%20IDENT%20AA%2006-04.pdf. pp 34.