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Realtime PCR PDF
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IBT-UNAM
Mtodos fsico-qumicos en
Biotecnologa (2006-II)
Presentado a:
Dr. Roberto P. Stock Silberman
INDICE
CAPITULO 1 INTRODUCCIN..................................................................................3
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.........................................................................53
CAPITULO 1
INTRODUCCIN
CAPITULO 2
RESEA HISTRICA
A principios de los aos noventa Higuchi y sus colaboradores del Roche Molecular
Systems y de Chiron (1992; 1993) desarrollaron una tcnica de PCR en la cual incluyeron
el bromuro de etidio (EtBr) en el medio de reaccin, la cual se llev a cabo bajo la luz
ultravioleta. Desde el ao 1966, Le Pecq y Paoletti reportaron que este agente intercalante
del ADN de doble cadena fluoresce bajo la luz UV. Esta propiedad fue aprovechada para
grabar la acumulacin de ADN utilizando una videocmara. Esta sencilla reaccin
combinada con la videografa permiti el nacimiento del PCR en tiempo real, el cual
combina la enorme sensibilidad de la tcnica de PCR con la precisin que asegura el
monitoreo in situ de los productos generados por esta reaccin a travs del tiempo.
La primera compaa que desarroll la instrumentacin necesaria para llevar a cabo el
RT-PCR fue Applied Biosystems en el ao 1996, y desde entonces otras compaas como
BioGene, Bioneer, Bio-Rad, entre otras han desarrollado nuevos equipos. Una parte
importante de estas mquinas se utilizan en investigacin acadmica, y de acuerdo a un
estudio realizado en el ao 2003, de 406 investigadores entrevistados, el 48% piensa
realizar RT-PCR en su futuro trabajo (Arlington, 2003). La figura 2.1 muestra el numero
de publicaciones en la base de datos Medline que contienen la palabra real time y
PCR en el ttulo o en el resumen. Como vemos, ocurri un incremento del 43% entre el
2003 y 2004, donde aparecieron 3522 publicaciones (Valasek et al., 2005). Estos datos
demuestran que la tcnica de RT-PCR se perfila como uno de los mtodos de vanguardia
en las ciencias biomdicas, fundamentalmente en el diagnstico molecular y la fisiologa.
CAPTULO 3
3.1 Definicin
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, tambin conocida como Real
Time PCR (RT-PCR) muestra la capacidad de monitorear el progreso de la reaccin de
PCR a medida que esta ocurre. Los datos son colectados a lo largo del proceso de PCR y
no al final como se realizaba antes. Este mtodo revolucion la forma en que se usaba la
tcnica de PCR para cuantificacin de ADN y ARN. El RT-PCR usa molculas de un
reportero fluorescente para monitorear la amplificacin de productos durante cada ciclo de
reaccin. Esta tcnica combina los pasos de amplificacin de ADN y la deteccin en un
nico ensayo y evita tener que preparar geles de electroforesis para detectar los productos
amplificados. Un anlisis apropiado de los datos y/o de la qumica tambin permite
eliminar la necesidad de realizar pruebas de Southern Blot o secuenciacin de ADN para
identificacin de los amplicones. Su simplicidad, especificidad y sensibilidad junto con su
potencial como tcnica en aplicaciones futuras y la evolucin hacia nuevos conocimientos
de la qumica, adems de la confiabilidad en la instrumentacin y protocolos mejorados,
han hecho del RT-PCT una tecnologa altamente competitiva para la deteccin de ADN y
ARN.
3.2 El ensayo
La tecnologa del RT-PCR est basada en la deteccin de una seal fluorescente
producida proporcionalmente durante la amplificacin del ADN blanco (Fig. 3.1). Antes
que revisar la cantidad de ADN blanco producido despus de un nmero fijo de ciclos, las
pruebas de RT-PCR determinan el punto en el tiempo durante el proceso de ciclado
cuando se detecta por primera vez la amplificacin de un producto de PCR. Este se
Desnaturalizacin Sonda
Primer
Fluorescena
Extensin
Este nmero del ciclo est referido como el ciclo umbral o threshold cycle (Ct). El Ct se
determina en la fase exponencial de la reaccin de PCR y es inversamente proporcional al
nmero de copias del blanco. Por lo tanto cuanto ms alto es el nmero de copias iniciales
de los cidos nucleicos a amplificar, ms pronto se observa un aumento significativo en
la fluorescencia, y son ms bajos los valores de Ct. Los ensayos de RT-PCR son
altamente reproductivos (Fig. 3.2(A)) y pueden discriminar fcilmente entre valores
diferentes de cantidad de templado (Fig. 3.2 (B)).
3.3 Principio qumico del ensayo
El RT-PCR puede utilizar fluorforos generales de unin no especfica a ADN como el
Bromuro de Etidio o el SYBR Green I, sondas de hidrlisis (Sondas 5 nucleasa), sondas
de hibridizacin, molecular beacon o sondas de secuencias especficas (Ej. Scorpions).
Fluorescencia
Ciclos
Fluorescencia
Ciclos
Fig. 3.2 Reproducibilidad y precisin del RT-PCR. Anlisis de una placa de 96 pozos que contiene rplicas
del mismo templado. El ensayo fue llevado a cabo en un instrumento Stratagene MX 4000 usando el mtodo
Taqman. El promedio de Ct para las 96 reacciones es 230.3. (B) Dos reacciones mezcladas, ajustadas por
triplicado. Una contiene 1x103 copias de templado de ADN y marca un Ct de 23.10.15. La otra tiene 2x103
copias de templado de ADN y marca un Ct de 24.10.1. Esto corresponde exactamente al valor esperado de
DCt de 1. (Bustin, S. 2005)
Figura 3.3. Representacin de la interaccin de SYBR green I con el ADN de doble cadena.
Sonda
beacon
Fig. 3.6 Sondas marcadas con fluorforos. a) El
diseo original usa un p r i m e r con una
estructura tallo-asa que tiene en su extremo 5
un fluorforo y un represor al final de la
estructura. b) Durante el primer ciclo de PCR
Gen blanco los primers se extienden y se vuelven
templados durante los siguientes ciclos de
Emisin de fluorescencia PCR. Esto lineariza la estructura tallo-asa,
separa el donador y aceptor y resulta en
emisin de fluorescencia desde el fluorforo
(Mocelln et al., 2003)
Gen blanco
TABLA 3.1 Principales molculas fluorescentes empleadas como marcadores en la PCR a tiempo real
(Costa J, 2004)
b) Molecular beacons: Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una molcula
donadora en el extremo 5 y una aceptora en el extremo 3 pero, adems, presentan una
estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unin especfica
con el ADN diana.
Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no est hibridada, lo que conlleva a
que donador y aceptor estn muy cerca uno de otro. En esta conformacin la fluorescencia
emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo.
Sin embargo, al hibridar con el ADN blanco la sonda se abre, alejndose donador y
aceptor, pudindose detectar la fluorescencia emitida por el primero (Fig. 3.9).
Research. La nica mquina que utiliza lser para la excitacin hasta el momento es el
ABI Prism 7900HT (Valasek et al., 2005).
Para colectar los datos, la energa de emisin de los fluorforos tambin debe ser
detectada en longitudes de onda especficas. Los detectores estn representados por
cmaras acopladas a dispositivos de carga, tubos fotomultiplicadores u otro tipo de
fotodetectores. Generalmente se emplean filtros o canales para detectar pequeos rangos
de longitudes de onda. Usualmente se pueden detectar varias longitudes de onda discretas
simultneamente, lo que permite correr mltiples ensayos en un solo tubo de reaccin.
Otra porcin importante de la instrumentacin consiste en un termociclador efectivo para
llevar a cabo las reacciones de PCR. Es muy importante que estos mantengan una
temperatura consistente a lo largo de todos los tubos de ensayo dado que pequeas
desviaciones de la temperatura resultan en errores graves de cuantificacin (Wilhelm et
al., 2000; Zuna et al., 2002). Un bloque de calentamiento (Peltier o por resistencia) o el
calentamiento por aire, o una combinacin de ambos, son los ms utilizados. Los bloques
calentadores cambian la temperatura ms lentamente que los calentadores de aire, lo que
resulta en ciclos ms largos.
La instrumentacin del PCR en tiempo real no estara completa sin un hardware de
computacin y un software de anlisis de datos apropiado. Los softwares simplifican el
anlisis de los datos arrojando los resultados en forma de grficos que muestran la
amplificacin y disociacin de los productos. Las curvas de amplificacin permiten el
anlisis cintico y la cuantificacin del ADN de partida, mientras que las curvas de
disociacin revelan las caractersticas, entre ellas la pureza, del producto final de la
reaccin.
El primer termociclador de PCR en tiempo real fue
producido por Appied Biosystems de forma comercial en
1997, el ABI 7700 (Fig. 3.13). El sistema de deteccin de
este equipo consiste en un termociclador conectado a un
lser y a un sistema ptico CCD (dispositivo de carga
acoplada, el cual genera una respuesta elctrica
proporcional a la luz que capt). Este equipo detecta un
Fig. 3.13 ABI 7700
rango de fluorescencia desde 500 a 660nm. La
fluorescencia se induce emitiendo luz lser simultneamente a todas las muestras a travs
El Rotor-Gene utiliza varios LEDs de diferentes longitudes de onda que estn. acoplados
a un filtro de banda estrecha. Este equipo adems tiene un paso ptico pequeo y menos
complejo que el de los sistemas que utilizan fibra ptica, los cuales tienden a ser lentos,
frgiles y caros. De acuerdo a las necesidades del operador, el sistema de deteccin cuenta
con filtros band pass (que permiten el paso de rangos discretos de longitudes de onda y
por ende se prefieren para los ensayos de multiplexing) y filtros high pass (a travs de
los cuales pasan todas las longitudes de onda por encima de un valor de corte
determinado, lo que incrementa la sensibilidad de la deteccin).
2-Rpida recoleccin de los datos: Todos los tubos pasan por el detector cada 150
milisegundos.
3- Al igual que en el Light Cycler, la rotacin garantiza la uniformidad de la temperatura
del aire del sistema. Adems no hay diferencia entre los tiempos de equilibracin trmica
entre pozos durante los cambios de temperatura. Los fabricantes garantizan que entre
muestra y muestra la variacin de temperatura es menor a 0.01 grados Kelvin. El rotor
opera a velocidad normal cuando est calentando (Aproximadamente 500 rpm), y al
enfriar incrementa la velocidad, por lo que la fuerza centrifuga que se ejerce sobre cada
muestra asegura que no haya condensacin y las burbujas de aire son eliminadas
automticamente.
Donde la referencia pasiva debe ser un cido nucleico idntico a la muestra que estamos
analizando pero sin el fragmento de secuencia correspondiente al templado, de esta forma
tenemos un control negativo perfecto.
Las curvas de amplificacin constan de tres partes diferentes:
1) La fase inicial donde no se puede medir a acumulacin del producto de PCR pues
hay pocos cambios en la seal de fluorescencia, lo que define la lnea basal
2) La fase exponencial, donde la fluorescencia cambia a medida que se forman ms
productos
3) La fase de meseta, donde no se distinguen cambios en la fluorescencia a pesar de
que se siguen acumulando productos
Para cada muestra, el nmero de ciclos necesarios para interceptar el valor umbral se
llama ciclo umbral o threshold cycle (Ct). El Ct es inversamente proporcional al
nmero de copias iniciales del ADN muestra. Por tanto, si graficamos el logaritmo de la
cantidad inicial de ADN de estndares de concentracin conocida versus el Ct, el
resultado es una lnea recta. En cada corrida de PCR en tiempo real debemos analizar
muestras estndar de concentracin inicial conocida, de esta forma estamos determinando
el rango dinmico de deteccin de nuestro mtodo, requisito indispensable para publicar
resultados de calidad. Se pueden analizar diferentes diluciones decimales del mismo
estndar, preferentemente en cuadruplicados. Para presumir la reproducibilidad de
nuestros resultados, debemos tener desviaciones estndar menores a 0.2 unidades de Ct.
Por cada unidad de Ct que cambia en el resultado de una amplificacin, se incrementa al
doble la concentracin inicial de muestra calculada.
Para lograr una mayor exactitud en la cuantificacin es necesario calcular al eficiencia de
la amplificacin.
Durante la fase exponencial, la seal S puede ser representada por la ecuacin 1 (Wilhelm
y Pingoud, 2003):
S= pNoc (1)
c= mlogNo + b (3)
No = 10(Ct-b)/m (4)
= 10-1/m (5)
No = (b-Ct) (6)
El mximo valor de es 2.0 (si se duplica la cantidad de producto en cada ciclo), pero los
valores experimentales de fluctan entre 1.5 y 1.9. Si la eficiencia es baja disminuye la
sensibilidad del ensayo pero permite cuantificaciones con mayor precisin (mayor
reproducibilidad entre repeticiones).
El error en los valores de Ct resultan del ruido de fondo y del mtodo de clculo de Ct. En
ensayos altamente optimizados, podemos obtener errores estndares menores de 0.2
ciclos, asumiendo una eficiencia de amplificacin del 100%, lo que implica que el error
relativo mnimo para la cuantificacin est entre el 10 y el 20%.
El rango dinmico de esta tcnica es extraordinariamente alto, con ms de seis rdenes de
magnitud .
Para calcular la concentracin inicial de nuestro templado se grafica el logaritmo decimal
de las concentraciones de los estndares versus el Ct. El resultado es una recta cuya
pendiente deber ser tericamente igual a 3.32 si tenemos una eficiencia de
amplificacin del 100% (Ecuacin 5). En la prctica, un ensayo es aceptable hasta con un
92% de eficiencia.
El clculo del rango dinmico se puede realizar en amplificaciones monoplex (un solo
blanco biolgico) o en modelos multiplex (para dos o ms blancos biolgicos
amplificados simultneamente).
Curvas de desnaturalizacin
Estas curvas representan la relacin que existe entre la fluorescencia y la temperatura
(Fig.3.18.a). Se realizan para corroborar la identidad del amplicn luego del ensayo de
PCR, puesto que debe tener una temperatura de desnaturalizacin (Tm) especfica. La
deteccin se puede realizar con intercalantes del ADN como el SYBR Green o con sondas
especficas como los Molecular Beacons. Otras como los Scorpions no pueden utilizarse
pues forman parte del producto de PCR, como tampoco se utilizan las sondas TaqMan,
dado que su seal depende de la hidrlosis de la sonda. Para la caracterizacin de los
productos de la reaccin de PCR se utilizan ms los agentes intercalantes del ADN,
mientras que las sondas especficas se usan para otros estudios como los de
genotipificacin. En estas curvas la seal decrece gradualmente como resultado de la
disminucin de la fluorescencia dependiente de la temperatura y posteriormente
disminuye de forma abrupta debido a la separacin de las dos hebras de ADN. La
temperatura de desnaturalizacin o Tm se identifica como el punto ms alto de la derivada
negativa de la curva de desnaturalizacin (Fig. 3.18.b). En esta representacin adems, el
rea bajo el pico es proporcional a la cantidad de producto, por lo que las curvas de
desnaturalizacin tambin permiten cuantificar la cantidad de producto que tenemos si
contamos con estndares de concentracin conocida (Wilhelm et al, 2003).
3.4.1 Ensayos de cuantificacin absoluta
El objetivo es determinar el nmero exacto de molculas de ADN o ARN presentes en
una muestra. El resultado estar expresado en las mismas unidades que los estndares de
la curva de calibracin (nmero de copias, ng/mL,). Este tipo de cuantificaciones se
emplean para la deteccin y cuantificacin de cargas virales, agentes patgenos o en la
terapia gnica.
3.4.2 Ensayos de cuantificacin relativa
Este tipo de cuantificaciones permite determinar cuantas veces (ms o menos) cido
nucleico se tiene de un templado o una muestra biolgica determinada con respecto a un
tejido o muestra de referencia. Los resultados son expresados de manera relativa por lo
que no se necesita una curva de calibracin con un estndar de concentracin conocida.
Para ejemplificar este modelo, mostramos la evaluacin de la expresin del gen c-myc en
cuatro tejidos diferentes: hgado, rin, pulmn y cerebro. Se emplea como control
endgeno o normalizador, la expresin de la enzima gliceraldehdo 3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) en estos tejidos. La normalizacin de los tejidos se lleva a cabo
calculando:
Ct pulmn = Ct (c-myc)pulmn- Ct (GAPDH)pulmn
Ct hgado = Ct (c-myc) hgado Ct (GAPDH) hgado
y as sucesivamente con los otros dos tejidos.
Luego calculamos Ct y la expresin relativa de c-myc en pulmn, hgado y rin
tomando como referencia el valor de Ct en cerebro:
Ct pulmn = Ct pulmn - Ct cerebro
Ct hgado = Ct hgado - Ct cerebro
Ct rin = Ct rin - Ct cerebro
y graficamos la expresin relativa de c- myc tomando como referencia los niveles en
cerebro como se muestra a continuacin:
sin embargo generar resultados cualitativos, pero debemos ser muy cuidadosos si
queremos realizar un anlisis cuantitativo. Afortunadamente, con la tcnica de captura por
microdiseccin utilizando lser se puede cuantificar la cantidad de ARN mensajero
proveniente de un corte de tejido como nmero de copias del templado por rea de
diseccin (Fink et al., 1998).
A) Tamao de la muestra
La primera forma de minimizar el error experimental es partiendo de masas o volmenes
de tejido similares a partir del cual aislaremos nuestro cido nucleico templado.
Desgraciadamente grupos de muestras del mismo tamao no siempre son representativos
entre s. Cuando trabajamos con cultivos celulares en monocapa, muchas veces se
dificulta la estimacin de la densidad celular, no slo por la prdida debido a la
mortalidad sino por cambios morfolgicos y fisiolgicos que pueden ocurrir en las
clulas. Se hace evidente entonces que asegurar muestras de igual tamao, densidad o
peso, minimiza los errores pero no es suficiente.
B) Cuantificacin de ARN
Una cuantificacin precisa y de calidad del ARN que queremos reverso transcribir es
esencial para lograr muestras de partida homogneas. Existen muchos mtodos para
cuantificar ARN, y entre los ms precisos est el uso del reactivo ribogreen, el cual se
intercala de manera precisa en los cidos nucleicos de doble cadena y es mucho ms
sensible que el bromuro de etidio. De esta forma, si tenemos una preparacin
relativamente pura de ARN celular y medimos la cantidad de ARN ribosomal (el cual
consta de muchas estructuras secundarias) por unin al ribogreen, podemos inferir que el
resto de nuestro ARN, sea mensajero o de transferencia, tambin conserva una buena
integridad. Se utiliza el ARN ribosomal como referencia pues representa
aproximadamente del 85 % al 95% de todo el ARN celular, mientras que el ARN
mensajero se encuentra entre el 2 y el 5%, por tanto se asume que la relacin
ARNr:ARNm no cambia entre grupos de anlisis, lo cual no siempre es vlido. Los
niveles de ARNr varan menos en condiciones que afectan a los de ARNm (Schmittgen y
Zakrajsek, 2000), por lo que su utilizacin como normalizadores se ha vuelto ms
confiable que muchos genes de referencia. Un reporte reciente donde se comparan los
niveles de expresin de ARN entre clulas nucleadas de la sangre en resposo o activadas,
revel que el ARNr 18S es el blanco de referencia ms estable.
En este tipo de anlisis podemos realizar una electroforesis, donde debemos observar dos
bandas bien definidas que corresponden al ARNr 28S y 18S, siendo la de 28S mucho ms
intensa debido a que, en condiciones normales, este ARNr se encuentra al doble de la
concentracin del ARNr 18S (Fig.3.20.a). Tambin podemos utilizar un bioanalizador
(Agilent Bioanalyser) donde, de manera similar a una cromatografa, separamos los ARNr
y se visualiza el cromatograma por tincin con ribogreen. Los tiempos de retencin de los
ARNr 28S y 18S ya son conocidos (Fig.3.20.b). No obstante, la normalizacin de una
muestra respecto al ARN total tiene la desventaja de no controlar las variaciones
inherentes a la reverso transcripcin o a las reacciones de PCR.
C) ADN genmico
La cuantificacin de ADN genmico para la normalizacin pudiera parecer una buena
estrategia, por cuanto no se necesita hacer un paso previo de reverso-transcripcin, pero la
realidad es que existen inconvenientes. Por ejemplo, cuando las clulas estn proliferando,
tenemos mucho ms ADN, lo que puede representar el doble de la informacin gentica
para clulas eucariotas. En el caso de las bacterias o las clulas tumorales, podemos tener
8 copias o ms de la informacin gentica de un cierto loci comparado con clulas que no
se replican. De esta forma aunque partamos de una cantidad de clulas similar, existe
mucha variabilidad en la cantidad de ADN genmico extrado. Otro problema es la
carencia de protocolos altamente estandarizados para una purificacin de ADN genmico
de calidad.
ARNr 28S
ARNr 18S
Fig. 3.20. Ejemplo de una cuantificacin de ARNr de buena calidad mediante (a) Gel de
agarosa y (b) Agilent Bioanalyser.
D) Genes de referencia
Se utilizan en los ensayos de cuantificacin relativa que describimos previamente. Una de
las ventajas de esta tcnica es que tanto el gen a cuantificar como el normalizador, son
detectados utilizando el RT-PCR en tiempo real. Existen numerosas publicaciones que
subrayan el hecho de que no existe ni un solo gen de referencia universal, pues todos se
regulan de alguna forma y ninguno se expresa constitutivamente en todos los tipos
celulares y bajo cualquier condicin experimental. Muchos de los genes de referencia
clsicos ampliamente utilizados como normalizadores en los RT-PCR en tiempo real
son genes regulados, hecho que se conoce desde mucho antes de que surgiera la tcnica de
PCR en tiempo real. Tal es el caso del ARNr 18S, el cual se sobreexpresa frente a una
infeccin con citomegalovirus, o del gen que codifica para la GAPDH, el cual se
transcribe de manera similar en diferentes tejidos de rata, pero esto no correlaciona con las
cantidades de ARN mensajero encontradas en dichos tejidos. A pesar de estas evidencias,
estos genes de referencia se siguen utilizando como normalizadores sin un proceso previo
de validacin. Reportes recientes han demostrado que muchos de estos genes no pueden
utilizarse como normalizadores. Una de las peores situaciones que se pueden presentar es
que el gen de referencia se vea afectado por las condiciones que queremos evaluar.
La validacin de los genes de referencia est sujeta tambin a los problemas de la
normalizacin. El grado de variabilidad aceptable para un gen de referencia depende de la
E) Molculas artificiales
Estas molculas de ARN artificiales pueden ser obtenidas a partir de otro organismo en
el cual sus genes hayan sido clonados o pueden generarse de forma sinttica. Dado que
conocemos su cantidad exacta, pueden ser adicionadas a la muestra en las etapas de
extraccin de ARNm y as estarn sujetas a todos los errores experimentales que afectan
al ARN de inters. Adems no se vern afectadas por las fluctuaciones propias de los
sistemas biolgicos que muchas veces afectan a los genes de referencia. Sin embargo, la
generacin de estas molculas alien no es asequible a muchos laboratorios, sobre todo
los que realizan pocos ensayos de RT-PCR en tiempo real. La adquisicin comercial de
este tipo de estndares para la normalizacin permanece todava como una idea terica
que no ha sido validada.
En trminos generales, una adecuada normalizacin es crtica para obtener resultados
biolgicos relevantes. Dado que no existe una sola estrategia que sea aplicable a todas las
condiciones experimentales, la clave para una buena normalizacin en los ensayos de
PCR en tiempo real es la demostracin de que el gen utilizado como referencia ha sido
correctamente validado (Bustin et al., 2005).
CAPITULO 4
4.1 Virologa
El PCR en tiempo real ha sido extremadamente til para el estudio de agentes virales
asociados a enfermedades infecciosas y ha ayudado a clarificar en alguna medida los
procesos infectivos de dichas enfermedades. La mayor parte de los ensayos que se
encuentran en la literatura muestran un aumento en la frecuencia de deteccin de virus
comparndolos con las tcnicas tradicionales, lo cual ha hecho ms atractivo el uso del RT
PCR en muchas reas de la virologa.
El RT PCR se ha hecho valioso en estudios generales de virologa, desde la simple
confirmacin de la presencia o ausencia de virus de diferentes enfermedades, o del
monitoreo de la actividad de genes especficos como resultado del crecimiento bajo
condiciones manipuladas. Tambin se puede seguir la entrada alterada o replicacin de un
virus causada por la modificacin tejido-especfica y permite comparar entre replicacin
viral y expresin de genes celulares. (Mackay et al., 2002).
EL RT PCR ha mejorado la velocidad y el alcance de la medicin de cepas virales y las
diferencias entre ttulos de pacientes que muestran diferentes sndromes debidos a
Rodrguez M & Rodrguez W 36
Aplicaciones
variaciones del mismo virus. (Furuta et al., 2001). Tambin, los estudios epidemiolgicos
han avanzado ya que con la tcnica de RT PCR se puede medir con precisin la cantidad
de dos cidos nucleicos blanco en una sola reaccin. El uso de nuevas estrategias
qumicas ha permitido una mejor discriminacin de mltiples genotipos virales en un solo
recipiente y ha provisto una alternativa a los mtodos de deteccin de virus basados en
ensayos de morbilidad y mortalidad.
El uso del RT PCR ha suministrado datos ms profundos sobre el papel de algunos
compuestos que tienen inhibicin en la reaccin de PCR como tambin ha dado luz sobre
la eficiencia de diferentes mtodos de extraccin de cidos nucleicos de un diverso tipo de
muestras. Esta capacidad de utilizar templados de diversos tipos de muestras, llena un
requerimiento importantsimo para un sistema ideal de deteccin, que es capaz de aplicar
una tecnologa sencilla en muchos campos. Esta flexibilidad se destaca por la deteccin de
cidos nucleicos virales, derivados en diferentes formas de plantas, animales, lodos
urbanos, fluido cerebroespinal, cultivo de tejidos, clulas sanguneas mononucleares,
plasma, suero, saliva y orina.
Tambin, condiciones crticas como sarcoma, carcinoma, neoplastia cervical intraepitelial
y desrdenes linfoproliferativos pueden ser fcilmente estudiados para investigar
relaciones directas o indirectas con infecciones virales. Tambin, el seguimiento de la
carga viral por tcnicas de RT PCR ha sido beneficioso para realizar seguimiento de
pacientes a quienes se les han trasplantado rganos.
Esta tecnologa se est convirtiendo en una herramienta esencial en el aseguramiento de
vectores de terapia gnica viral antes de su uso en pruebas clnicas. Adicionalmente, el
estudio de virus emergentes ha sido complementado con la tcnica de RT PCR como
herramienta para demostrar relaciones existentes entre secuencias virales nicas, seales
clnicas y sntomas de cada paciente.
La velocidad y flexibilidad del RT PCR tambin ha sido de utilidad para los intereses
comerciales y ha sido usada para la deteccin de contaminacin microbiana en
preparaciones de reactivos producidos a gran escala en sistemas de expresin eucariticos.
CAPITULO 5
Existen muchos componentes dentro de la sangre y los tejidos que inhiben los ensayos de
RT-PCR. La sangre de los mamferos en cantidades tan pequeas como al 1% v/v inhibe a
la Taq polimerasa (Panaccio y Lew, 1991). El cido hmico, polmero componente de las
muestras extradas de suelo, inhibe las reacciones de PCR (Zhou et al., 1996), as como el
calcio proveniente de los alimentos (Rossen et al., 1992). Las drogas terminadoras de
cadena como el Aciclovir son tambin inhibidores de la Taq polimerasa, lo que lleva a
obtener resultados que son falsos negativos en determinados pacientes (Yedidag et al.,
1996). Algunos componentes de los medios de cultivo y de los agentes de extraccin de
cidos nucleicos, e incluso los palillos de madera utilizados para picar colonias
bacterianas, son algunos de los inhibidores ms comunes de las reacciones de PCR (Lee et
al., 1995). Otros inhibidores son altamente especficos, como los provenientes del
msculo esqueltico, los cuales frenan a la Taq polimerasa pero no a la polimerasa aislada
de Thermus thermophilus (Belec et al., 1998).
ejemplo, para determinar si existe alguna interaccin entre los primers mediante el
anlisis de curvas de disociacin o para explorar de forma preliminar la tcnica de
deteccin de mltiples amplicones antes de utilizar un ensayo basado en sondas
fluorescentes especficas.
Entre las desventajas de la deteccin no especfica se encuentra la unin indiscriminada
hacia cualquier estructura de doble cadena, lo que produce fluorescencia en el control sin
templado debido a su unin a los dmeros de primers. Un segundo problema es que las
curvas de disociacin para analizar la calidad del producto obtenido son absolutamente
necesarias, lo cual incrementa la complejidad de los anlisis. Un tercer problema es que
muchas de estas molculas son capaces de unirse a una sola molcula de amplicn, por lo
que la intensidad de la seal fluorescente luego de la radiacin depender del tamao del
ADN de doble cadena. Si asumimos similares eficiencias de amplificacin, el PCR en
tiempo real de un templado ms largo generar una mayor seal fluorescente.
Fig. 5.1.
cual se traduce en valores de Ct similares para ambos fluorforos. Una analoga til es la
comparacin entre la altura que alcanzan dos personas al saltar: slo podemos compararlo
si ambas saltan desde el mismo nivel.
Fig. 5.2
Fig. 5.3. A. Curva de amplificacin donde el nivel umbral seleccionado de 0.12 no detecta resultados
claramente positivos. B. La reduccin manual de la lnea umbral permite tomar en cuenta los resultados
positivos de Ct para todas las muestras, donde tambin se incluye ahora el NTC (morado).
CONCLUSIONES
Como hemos visto a travs de todo este trabajo, la tcnica de PCR en tiempo real es
altamente poderosa y puede generar resultados reproducibles con significado biolgico.
Sin embargo, est ms que demostrado que hay que tomar muchas precauciones durante
la planeacin, la ejecucin del ensayo y el anlisis e interpretacin de los resultados. En el
futuro ser necesario introducir nuevos estndares y reportar todo el procedimiento para
establecer guas confiables que puedan validar los resultados experimentales y que sean
utilizadas por los editores para la revisin rigurosa de las publicaciones. En resumen, el
PCR en tiempo real es una tcnica que debe ser tratada con respeto.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Applied Biosystems: Data analysis on the ABI PRISM 7700 sequence detection system: setting
baselines and thresholds.
(http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/data_analysis_7700.pdf).
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Belec, L., Authier, J., Eliezer-Vanerot, MC., Piedouillet, C., Mohamed, AS., Gherardi, RK..
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