Universidad Central de Venezuela

Facultad de Ciencias
Escuela de Biologa
Departamento de Biologa Celular
Unidad Docente de Gentica
Electiva 1451
Fundamentos de Gentica Molecular

Manual de Laboratorio

Autores:
Dra. Palmira Guevara
Lic. Riward Campelo Morillo
Lic. Richard Clark
Lic. Vernica Guariglia
Lic. Flix Moronta
Lic. Kamran Rizzolo
1
INDICE

1er BLOQUE Tcnicas bsicas en Gentica Molecular 5

INTRODUCCION 5
Prctica 1 Transformacin bacteriana 8
Anexo 1 Genes reporteros in vivo:
La protena de fluorescencia verde y vectores de
clonamiento 15
Prctica 2 Aislamiento de ADN plasmdico
Minipreparacin de ADN plasmdico 16
Prctica 3 Anlisis del ADN en geles horizontales
de agarosa 20
Prctica 4 Cuantificacin de ADN por espectrofotometra 26
Prctica 5 Caracterizacin de plsmidos recombinantes por
anlisis de restriccin 29
Anexo 2 Patrones de restriccin esperados para pEGFP y pEYFP 32
2do BLOQUE Aplicacin de tcnicas de la gentica
molecular al diagnstico de enfermedades hereditarias
humanas 33
INTRODUCCION 33
Prctica 6 Anlisis de perfiles genticos humanos
mediante PCR-RFLP:
deteccin de una mutacin puntal o single nucleotide
polymorphism (SNP) en el gen de la -globina 34
Parte I Preparacin y tratamiento de muestras 37
1.1 Aislamiento de ADN a partir de epitelio bucal 39

Anexo 3 Consentimiento informado 42

Parte II Ensayos de amplificacin mediante la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) 44
Parte III Digestin del amplicn con la enzima Bsu36 I y
anlisis del patrn de restriccin. 51
Anexo 4 Resultados esperados del diagnstico por PCR-RFLP en
el gen de la -globina humana 54
Anexo 5 Lectura: Gentica y Sociedad 55
BIBLIOGRAFIA 60

2
 <!> GLOSARIO DE BIOSEGURIDAD

DE MATERIALES PELIGROSOS<!>

cido actico (concentrado) manipular con gran cuidado. Puede

causar dao por inhalacin, ingestin, o absorcin cutnea. Utilizar
guantes y lentes apropiados. Utilizar dentro de una campana.

Ampicilina puede causar dao por inhalacin, ingestin, o absorcin

cutnea. Utilizar guantes y lentes. Manipular en campana.

Bromuro de Etidio mutagnico poderoso y txico. Evitar inhalacin

del polvo. Utilizar guantes al trabajar con soluciones de BrEt.
Consultar para su descarte.

Cloroformo irritante a la piel, ojos, membranas mucosas, y tracto

respiratorio. Es un carcingeno votil y puede causar dao al hgado
y riones. Evitar inhalacin de vapores. Utilizar guantes y lentes.
Manipular en campana.

Dodecil sulfato de sodio (SDS) es txico, irritante, y posee un

alto riesgo de dao a los ojos. Puede causar dao al ser inhalado,
ingerido, o absorbido por la piel. Utilizar guantes y lentes. Manipular
en campana. No inhalar el polvo.

Etanol puede causar dao si es inhalado, ingerido, o absorbido por

la piel. Utilizar guantes y lentes apropiados.

Hidrxido de sodio y las soluciones que contengan hidrxido de

sodio son altamente txicas y custicas, deben ser manipuladas con
mucho cuidado. Utilizar guantes apropiados y mascarilla. Todas las
bases concentradas deben ser manipuladas de igual manera.

Isopropanol es irritante puede causar dao al ser inhalado,

inherido, o absorbido por la piel. Utilizar guates apropiados y lentes
de seguridad. El vapor no debe ser respirado. Mantener alejado del
calor, chispas, y la llama.

Luz UV y/o radiacin UV es peligrosa y puede causar daos a la

retina de los ojos. Jams se debe ver directamente la luz UV
desprotegida. La luz UV es tambin mutagnica y carcinognica.
Para minimizar el riesgo de exposicin, la fuente de luz UV debe ser
resguardada adecuadamente. Utilizar guantes protectores adecuados
al sostener materiales bajo una fuente de luz UV.

3
Fenol es extremadamente txico, altamente corrosivo, y puede
causar quemaduras graves. Puede causar dao por inhalacin,
ingestin, o absorcin cutnea. Utilizar guantes, lentes, y bata.
Utilizar dentro de una campana. Enjuagar con mucha agua y lavar
con agua y jabn cualquier rea de la piel que tenga contacto con el
phenol. !No utilizar etanol!

Tris puede causar dao si es inhalado, ingerido, o absorbido por la

piel. Utilizar guantes y lentes apropiados.

4
1ER BLOQUE Tcnicas bsicas en
Gentica Molecular

INTRODUCCIN

La contribucin de la gentica y en particular de la gentica

molecular, disciplina que nace con la publicacin del modelo de la
doble hlice para la molcula de ADN propuesto por Watson y Crick
en 1953, ha transformado la visin y la dimensin de las ciencias
biolgicas. Esta transformacin, que conlleva el entender el
funcionamiento integrado de la clula desde la molcula responsable
de la herencia y los procesos que resultan de su mantenimiento y la
expresin de esta informacin en el fenotipo, han tenido un impacto
en todas las reas relacionadas a la biologa. Este alcance tiene
dimensiones cotidianas si consideramos que la transferencia
horizontal de conocimientos y tecnologas estn presentes en la
agroindustria y en los nuevos medicamentos a nivel mundial. Gran
parte de esta rpida transferencia tecnolgica es producto de un
conjunto de metodologas de rutina del trabajo en el laboratorio
conocidas como ingeniera gentica. Es posible aislar e identificar
secuencias especficas de genes o fragmentos del genoma de una
especie, insertarlos en vehculos o vectores de clonamiento y
transferirlos y expresarlos en otra especie, fundamentalmente con
objetivos asociados a la investigacin bsica. Sin embargo la
inmediata aplicabilidad derivada de la relativa accesibilidad de las
metodologas, incentivadas por su gran potencial de desarrollo
biotecnolgico, ha empujado los lmites de la biologa molecular y
sus aplicaciones fuera del mbito netamente acadmico, teniendo
hoy da una marcada presencia en la medicina, el desarrollo
agropecuario, el estudio de poblaciones, e inclusive la identificacin
de individuos a travs del perfil de su genoma y el desarrollo de
armas biolgicas. Las herramientas de la biologa molecular y el

5
conocimiento generado permiten derivar aplicaciones tiles y con
valor comercial que alcanzan a todos los sistemas biolgicos.
El conocimiento bioqumico de los procesos asociados al
funcionamiento y mantenimiento del ADN, fundamentalmente la
replicacin, la transcripcin, la recombinacin, la reparacin, su
empaquetamiento en los cromosomas y la segregacin durante la
divisin celular, han sido la base de las metodologas utilizadas en la
manipulacin de los genomas desde las primeras experiencias de
clonamiento de genes en los aos 70, la secuenciacin de genomas
completos durante los 90 y continan siendo punto de partida para
el diseo de nuevas tcnicas de anlisis en investigacin en el siglo
XXI. El dominio tecnolgico hoy permite la masificacin del anlisis
con el surgimiento de nuevas disciplinas como la genmica y la
protemica que investigan en masa los eventos celulares a nivel
molecular.
Con el objetivo de iniciar al estudiante de biologa en el
proceso de construccin y adquisicin del conocimiento en la
disciplina de la gentica molecular hemos diseado un manual de
prcticas que complementan los conceptos discutidos en la teora. En
esta primera parte, se describen las herramientas bsicas utilizadas
para el anlisis gentico molecular en el quehacer diario de un
laboratorio de investigacin. Estas herramientas aprovechan enzimas
y reacciones qumicas que ocurren naturalmente en las clulas desde
las formas de vida ms simples, tales como las clulas bacterianas y
los virus, hasta clulas eucariotas. El conjunto de estas herramientas
y reacciones dirigidas a la manipulacin del material gentico se
conocen como tecnologa del ADN recombinante. Las enzimas ms
importantes en este conjunto de herramientas son aquellas que
actan sobre la misma molcula de ADN: las enzimas de restriccin
que cortan el ADN en sitios especficos, las ligasas que permiten unir
dos molculas de ADN o ARN, las polimerasas que sintetizan nuevas

6
hebras de ADN, y las transcriptasas reversas que sintetizan ADN
complementario a partir de ARN.
La reaccin bioqumica no-catalizada ms importante para los
anlisis en la gentica molecular es la hibridacin mediante la cual
ocurre el enlace de dos hebras de ADN con secuencias nucleotdicas
complementarias. La hibridacin resulta de la tendencia natural de
molculas de ADN o ARN cadena-sencilla complementarias para
formar una doble-cadena estable.
El primer bloque comprende los ejercicios de transformacin
bacteriana, aislamiento de ADN plasmdico, minipreparacin de ADN
plasmdico, anlisis del ADN en geles horizontales de agarosa,
registro y anlisis de resultados, cuantificacin de ADN por
espectrofotometra y la caracterizacin de recombinantes por anlisis
de restriccin. Todas estas experiencias ponen en prctica los
fundamentos y conceptos bsicos presentados en la teora e
ilustrados en las referencias escogidas para su discusin.
El trabajo est dirigido para que al finalizar el curso el
estudiante domine los conocimientos fundamentales de la
metodologa del ADN recombinante y su aporte a los progresos en la
biologa molecular. Igualmente, deber estar en capacidad de
interpretar una publicacin sobre esta materia, tanto en la
escogencia de una metodologa adecuada para alcanzar un objetivo,
como en la correcta interpretacin de los resultados.

7
 PRCTICA 1
TRANSFORMACIN BACTERIANA

Objetivos
Familiarizar al estudiante con el fenmeno de transformacin
bacteriana y la transferencia horizontal de genes.
Conocer los mtodos de transformacin bacteriana en el
laboratorio.
Hacer competente una cepa de E. coli con tratamiento qumico
y transformarla con un plsmido.
Analizar transformantes a travs de medios selectivos.
Reconocer los usos prcticos de los genes reporteros y
marcadores selectivos.

Introduccin
La transformacin es un proceso por el cual las clulas
procariotas captan ADN libre presente en el medio. Es un fenmeno
que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero con
variaciones en su eficacia entre especies. Para que ocurra la
transformacin, la bacteria tiene que encontrarse en un estado de
competencia, en el cual la clula presenta modificaciones en su
pared y membrana, que permiten la entrada del material gentico
desde el exterior celular.
En el laboratorio se han normalizado tcnicas que inducen el
estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma
natural, como es el caso de Escherichia coli. Estas tcnicas se basan
en diversos tratamientos qumicos o fsicos que producen poros en la
pared celular. El tratamiento qumicos con cloruro de calcio (CaCl2) y
la electroporacin, que consiste en inducir la competencia mediante
la aplicacin de un pulso elctrico muy breve e intenso, son dos
mtodos utilizados con frecuencia en el laboratorio de investigacin.

8
Sin embargo tras estos tratamientos no todas las clulas del cultivo
se hacen competentes y se afecta la viabilidad de la clula.
La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de
enorme utilidad, que nos permite introducir plsmidos
recombinantes en casi cualquier tipo de bacteria. El mtodo que se
describe a continuacin es, por su simplicidad, uno de los ms
utilizados para transformar E. coli. Para seleccionar las clulas
transformantes, el ADN introducido llevar un marcador selectivo de
resistencia a antibiticos que proporciona una ventaja selectiva bajo
las condiciones de crecimiento, con respecto a las clulas no
transformadas y un gen reportero, que confiere un fenotipo de
emisin de fluorescencia fcilmente detectable. Ambos marcadores
genticos permitirn identificar las clulas transformantes.

9
Materiales, reactivos y equipos
Cultivo de Escherichia coli DH10B. Genotipo:
F- mcrA (mrr-hsdRMS-mrcBC) 80dlacZM15 lacX74
deoR recA1 endA1 araD139 (ara, leu) 7697 galU galK
- rpsL nupG
ADN del plsmido pEGFP o pEYFP
2 mL de medio LB lquido
10 mL de medio LB lquido+ estreptomicina 40 g.mL-1
3 Placas de agar LB +estreptomicina 40 g.mL-1
2 Placas de agar LB +ampicilina 100 g.mL-1
+estreptomicina 40 g.mL-1
20 mL 0,85% Solucin Salina
15 mL CaCl2 50 mM
Rastrillo de vidrio
Cava y hielo para incubaciones a 4C
Microcentrfuga.
3 Tubos de microcentrfuga estriles 1,5 mL
4 Tubos estriles 15 mL
6 Tubos de dilucin estriles
Baos de incubacin.
Micropipetas
Puntas para micropipetas 20-200 L y 1 mL
Pipetas estritles de 10 mL, 5 mL y 1 mL

10
Protocolo
Nota: Durante todo el proceso trabaje en condiciones de esterilidad.

Preparacin de clulas competentes

1. Previo al da de la prctica, partiendo de una colonia aislada,
inocular las bacterias en 2 mL de medio LB+ estreptomicina
(40 g.mL-1) en un tubo estril.
2. Incubar a 37C con agitacin toda la noche.
3. Agregar 8 mL de medio LB+estreptomicina (40 g.mL-1) al
cultivo en fase estacionaria de la noche anterior.
4. Incubar a 37C con agitacin por 1 hora.
5. Transferir el cultivo a un tubo estril de 15 mL.
6. A partir de este paso trabajar a 4 C. Centrifugar durante 10
minutos a 5000 r.p.m.
7. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 2 mL
de solucin salina (0,85% SS) agitando el tubo. Luego
completar el volumen a 10 mL.
8. Centrifugar estrilmente a 4 C a 5000 r.p.m por 10 minutos.
9. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 10 mL
de CaCl2 50 mM recientemente preparado y fro.
10. Incubar 1 hora en hielo.
11. Centrifugar estrilmente y a 4 C a 5000 r.p.m por 10
minutos.
12. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de
bacterias en 1 mL de CaCl2 50 mM y guardar a 4C.

11
Transformacin

1. Pre-incubar dos tubos de 1,5 mL estriles en hielo. Marcarlos

como A y B. Colocar en cada uno 200 L de las clulas
competentes del paso 11 del protocolo de preparacin de las
clulas competentes.
2. Al tubo A, aadirle aproximadamente 0.1 g del ADN
plasmdico en un volumen no mayor a 10 L. Al tubo B no
colocarle el plsmido.
3. Incubar 1 hora en hielo cada tubo.
4. Someter las clulas a un choque trmico a 45C por 90
segundos exactos.
5. Agregar 1 mL de medio LB e incubar a 37C por 60 min.
6. Sembrar por rastrilleo 100 L de cada tubo en una placa de
LB+ampicilina (100 g.mL-1)+ estreptomicina (40 g.mL-1).
7. Para el clculo de la eficiencia de transformacin y control de
viabilidad realizar una titulacin del cultivo transformado (tubo
A) hasta un factor de dilucin de 10-7 y 10-8. Sembrar por
rastrilleo 100 L de las diluciones 10-7 y 10-8 en placas de
agar LB.
8. Incubar las placas a 37C por 24 horas.
9. A las 24 horas registre el nmero de colonias en cada tipo de
placa y calcule el ttulo de clulas receptoras y de clulas
transformantes.
10. Evalu la expresin de los genes reporteros GFP o YFG segn
sea el caso, en las colonias transformadas exponiendo la placa
a la luz UV.
Nota: utilice lentes para protegerse la vista.
11. Sembrar por agotamiento al menos cuatro colonias
transformantes en placas de LB+ampicilina (100 g.mL-1)+
estreptomicina (40 g.mL-1) que utilizar en la prctica 2 para
el aislamiento del ADN plasmdico.

12
Preguntas de la prctica
1. Calcular la eficiencia de transformacin en base a la
concentracin de ADN plasmdico y en base al ttulo de las
clulas receptoras con las frmula:
n de colonias transformantes / g ADN aadidos)x10
n de colonias transformantes / ttulo de clulas receptoras)
2. Describa qu se observa en la placa de LB+ampicilina
sembrada con 100 l del tubo B. Sabras explicar por qu?
Para qu se realiza este control?
3. Discuta el genotipo de la cepa utilizada E. coli DH10B. Por
qu se utiliza estreptomicina en el medio?

4. Desde el punto de vista gentico Qu caractersticas

especiales deben tener las cepas bacterianas a ser usadas en
experimentos de transformacin?

5. Discuta las caractersticas de los vectores pEGFP y pEYFP y su

relevancia para el clonamiento de genes. Qu importancia
tienen los sitios mltiples de clonamiento ubicados en las
regiones 5 y 3 de los genes GFP y YFP? Por qu es posible
observar el fenotipo de fluorescencia en las clulas E. coli
DH10B transformadas con los plsmidos pEGFP y pEYFP?
6. Describa otros tipos de tipos de vectores de y estrategias de
clonamiento.
7. Explique qu otros mtodos son utilizados para hacer
competente a una cepa bacteriana.
8. Desde el punto de vista evolutivo Cul es la importancia de
los fenmenos de transformacin bacteriana en la naturaleza?

13
Figura 1. Mapa de los plsmidos pEGFP y pEYFP. Se muestran: el
tamao del plsmido en kb, los sitios nicos de restriccin, los sitios
mltiples de clonamiento (MCS), los genes de resistencia a
ampicilina (Ampr), los genes reporteros EGFP/EYFP, el promotor del
operon Lactosa (PLac) y el origen de replicacin de pUC (pUCori). Los
nmeros en parntesis indican la ubicacin en pb desde el sitio 1.
(http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3078-5.pdf y
http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3175-5.pdf).

14
ANEXO 1. Genes reporteros in vivo:

La protena de fluorescencia verde y vectores de

clonamiento

La Protena de Fluorescencia Verde (GFP por sus siglas en

ingls Green Fluorescent Protein), aislada originalmente de la
medusa Aequorea victoria, se utiliza como una molcula reportera
para analizar el funcionamiento in vivo de regiones reguladoras, as
como para determinar la localizacin subcelular de protenas. La GFP
emite una fluorescencia de color verde brillante al ser expuesta a luz
UV, lo que la hace fcilmente detectable. La Protena de
Fluorescencia Amarilla (YFP por sus siglas en ingls Yellow
Fluorescent Protein) se deriva de una mutacin puntual en el gen de
la GFP por lo que absorbe a una longitud de onda diferente y emite
una fluorescencia ms tenue. Ambas protenas son fcilmente
detectables y de amplio uso en el anlisis funcional de genes.

Los vectores de clonamiento pEGFP y pEYFP tienen su origen

en el plsmido pUC19 al cual se le ha insertado un fragmento de
ADN conteniendo a los genes GFP y YFP respectivamente (Figura1).
La estructura base del pUC19 proporciona el gen de resistencia al
antibitico ampicilina y un origen de replicacin relajado que
permite su propagacin en E. coli y genera mltiples copias del
plsmido en la clula. Los genes GFP y YFP estn insertados en fase
al codn de iniciacin del gen lacZ por lo que la protena de fusin
del marcador fluorescente se expresa a partir del promotor de lac.

De esta forma, el fenotipo de resistencia al antibitico

ampicilina y la presencia de fluorescencia servirn como indicativo
de la presencia del plsmido en una clula bacteriana hospedera. En
este caso, nos servir para determinar si el ensayo de
transformacin tuvo xito. Sin embargo las aplicaciones y usos de
este tipo de plsmidos son muy amplias. Podras sugerir en qu
tipo de experimentos seran tiles los plsmidos pEGFP y pEYFP?

15
 PRCTICA 2
AISLAMIENTO DE ADN PLASMDICO
Minipreparacin de ADN plasmdico

Objetivo

Manejar fundamentos tericos y prcticos del aislamiento de

ADN plasmdico y genmico en bacterias.

Estudiar el efecto de detergentes aninicos, como el Dodecil

Sulfato de Sodio (SDS por sus siglas en ingls Sodium
Dodecyl Sulfate), sobre la clula bacteriana.

Extraer y aislar de la clula bacteriana E. coli DH10B el

plsmido transformado en la prctica 1.

Introduccin

La lisis alcalina, en combinacin con el detergente Dodecil

Sulfato de Sodio, SDS, ha sido usada por ms de 20 aos para aislar
ADN plasmdico de E. coli. La exposicin de suspensiones
bacterianas a detergentes aninicos fuertes en valores de pH altos
desestabiliza la envoltura celular, desnaturaliza el ADN cromosomal
y las protenas, y libera el ADN plasmdico al sobrenadante. Aunque
la solucin alcalina separa completamente las bases apareadas del
ADN, las hebras de un plsmido circular no se separan
completamente unas de otras debido a que estn topolgicamente
entrelazadas. Mientras la intensidad y la duracin de la exposicin al
OH- no sea demasiado larga, ambas hebras del ADN plasmdico se
renaturalizarn cuando los niveles de pH retornen a sus valores
neutros reconstituyendo una molcula de ADN doble cadena circular.

Durante la lisis, las protenas bacterianas, la pared celular

rota y el ADN cromosomal desnaturalizado constituyen grandes
complejos que se agregan y son cubiertos con SDS. Estos complejos

16
son precipitados eficientemente de la solucin acuosa cuando los
iones sodio son reemplazados por potasio. Despus que este
material ha sido removido por centrifugacin, el ADN plasmdico
puede ser recuperado del sobrenadante.

La lisis alcalina en presencia de SDS es una tcnica flexible

que trabaja muy bien con todas las cepas de E. coli y con cultivos
bacterianos en fase logartmica en un rango de 1 mL a >500 mL. El
ADN plasmdico circular cerrado recuperado del lisado puede ser
purificado de distintas maneras y en diferentes grados, dependiendo
de las necesidades del experimento.

Materiales y reactivos

Medio LB lquido+estreptomicina 40 g.mL-1+ampicilina 100

g.mL-1

Solucin Salina (NaCl 0,85 %)

Solucin I (glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris pH 8.0 25 mM)

Solucin II (NaOH 0.2 M, SDS 1%)

Solucin III (Acet. de potasio 3 M, cido actico glacial 5 M,

pH 4.5)

Solucin cloroformo:fenol (1:1)

Isopropanol grado Biologa Molecular

Etanol 70% v/v

Tampn TE (Tris-HCl pH 8.0 10 mM, EDTA 1 mM)

Microcentrfuga

3 tubos plsticos de microcentrfuga estriles de 1.5 mL

Micropipetas

Puntas para micropipetas 20-200 L

Hielo/cava

17
Protocolo

1. Previo al da de la prctica, partiendo de una colonia aislada,

crecer toda la noche un cultivo de 4 mL de medio
LB+ampicilina (100 g.mL-1) + estreptomicina (100 g.mL-1)
de la cepa bacteriana transformada con el plsmido pEGFP o
pEYFP obtenida en la prctica 1.

2. Transferir el cultivo a un tubo estril de 15 mL.

3. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m.
4. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 2 mL
de solucin salina (0,85% SS) agitando el tubo. Luego
completar el volumen a 10 mL.
5. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m.
6. Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular
en 100 L de solucin I con agitacin.

7. Transferir este sobrenadante a un tubo de 1,5 mL.

8. Aadir 200 L de solucin II. Tapar el tubo y mezclar las dos

soluciones invirtiendo dos o tres veces el tubo muy
suavemente. Incubar en hielo por 5 min.

9. Aadir 150 L de solucin III fra. Mezclar por inversin del

tubo e incubar en hielo de 5 a 8 min.

10. Centrifugar a 14000 r.p.m. por 15 min.

11. Tomar el sobrenadante CON MUCHO CUIDADO, evitando

tomar del sedimento, pues ste es la principal fuente de
contaminacin por ADN cromosomal. De ser necesario,
centrifugue este sobrenadante una vez ms para asegurarse
que no contiene ninguna contaminacin.

12. Calcular el volumen de sobrenadante y extraer con un

volumen igual de mezcla cloroformo-fenol (1:1). Mezclar bien.
Nota: el fenol es muy corrosivo, evite su contacto con la piel.

18
 13. Centrifugar esta mezcla por 3 min. a 14000 r.p.m. Deben
separarse dos fases.

14. Tomar la fase acuosa superior, con cuidado de no tocar la

interfase ni la fase fenlica, y transferirla a un nuevo tubo de
1,5 mL.

15. Agregarle un volumen de isopropanol igual al volumen del

sobrenadante. Mezclar por inversin e incubar por 10 min. en
hielo.

16. Centrifugar a 14000 r.p.m. por 15 min.

17. Eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento con etanol 70%

y centrifugar por 5 min. a 14000 r.p.m.

18. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y dejar el tubo en

posicin invertida sobre un toalln a fin de que drene todo el
etanol. Dejar secar completamente a temperatura ambiente.

19. Resuspender el sedimento con los cidos nucleicos en un

volumen no mayor a 50 L de tampn TE y guardar en la
nevera. Esta muestra que contiene al ADN del plsmido ser
examinada en un gel de agarosa en la prxima prctica.

Preguntas de la prctica

1. Explique cmo y por qu se logra separar el ADN plasmdico

del ADN cromosmico durante la lisis alcalina.

2. Explique qu se logra al aadir consecutivamente las

soluciones I, II y III?

3. En qu paso del protocolo se elimina al ARN? Con qu

tratamiento adicional podra eliminar al ARN?

4. Cmo se desnaturalizan las protenas?

5. Cmo se eliminan los lpidos de la preparacin?

6. Por qu se realiza un lavado con etanol 70%?

19
 PRCTICA 3
ANLISIS DEL ADN EN GELES
HORIZONTALES DE AGAROSA

Objetivo

Manejar los fundamentos tericos de la electroforesis en geles

de agarosa.

Conocer y evaluar las ventajas de la tcnica de electroforesis

en geles horizontales de agarosa para el anlisis y
caracterizacin de cidos nucleicos.

Separar cidos nucleicos segn su tamao y configuracin.

Comprobar si la minipreparacin de plsmidos realizada en la

prctica 2 fue exitosa.

Reconocer las diferentes conformaciones del ADN circular.

Introduccin

La electroforesis en geles de agarosa es una de las tcnicas

analticas utilizadas en la caracterizacin de cidos nucleicos en base
a la forma y tamao de las molculas. La carga neta negativa,
producto de los grupos fosfatos en el ADN y el ARN, resulta en una
migracin de las molculas hacia el nodo cuando se aplica un
campo elctrico; sin embargo la matriz, formada por la agarosa (un
polisacrido ramificado de unidades de D-galactosa y 3,6-anhidro-
galactosa altamente hidrofbico) en la sales del tampn, ofrece una
resistencia al movimiento (Figura 2). Las molculas lineales de
mayor tamao tendrn dificultad para pasar por los poros de la
matriz, quedndose en la regin superior del gel, mientras que los
fragmentos de menor tamao se movilizarn con facilidad,
alcanzando la parte inferior del gel.

20
 BOLSILLOS

Figura 2. Esquema representativo de una corrida electrofortica

Dependiendo de la concentracin de agarosa en el gel, la

matriz formada permitir la separacin efectiva de diferentes
tamaos de ADN durante la electroforesis (Tabla 1), en
consecuencia, la masa molecular relativa puede ser calculada
utilizando un marcador de ADN de peso molecular conocido, como
referencia. Sin embargo existen otros factores que influyen en el
grado de resolucin de los geles de agarosa. La conformacin de las
molculas afecta la migracin. El ADN plsmidos migra en orden de
velocidad desde el ms rpido al ms lento, de acuerdo a si est en
forma superenrollada, lineal o circular abierta.

Tabla 1. Rango de separacin de molculas lineales de ADN doble

cadena por electroforesis en geles horizontales de acuerdo al
porcentaje de agarosa.

% de
Agarosa en ADN (kb)
el gel
0,6 20-1,0
0,7 10-0,8
0,8 7-0,5
1,3 4-0,2

El voltaje es otro factor que influye en la velocidad de

migracin del ADN, a mayor voltaje una migracin ms rpida; sin

21
embargo el calor generado produce que el gel se derrita adems de
desmejorar la resolucin de la separacin de las molculas.
Generalmente los geles de agarosa en corrida horizontal son
utilizados para separar fragmentos entre 100 pb hasta 20 kb. Para la
separacin de molculas de menor tamao se utilizan geles de
poliacrilamida y para molculas mayores a 0,1 Mb hasta 2 Mb se han
diseado los sistemas de electroforesis de campo pulsado (Pulse
Field Gel Electrophoresis o PFE) y electroforesis de campos
invertidos (Field Inverted Gel Electrophoresis, FIGE), ambos
realizados en geles de agarosa de alta concentracin (agarosa 1,5%
a 2 %).
Previa a la colocacin de la muestra en los bolsillos del gel, se
mezcla con el tampn de carga, compuesto por un reactivo que
incremente la densidad, como el glicerol o la sacarosa, y uno o dos
colorantes que permitan hacer el seguimiento de la corrida en
tiempo real. Generalmente se utiliza el azul de bromofenol y el cileno
cianol, los cuales estn cargados negativamente y migran a un peso
molecular equivalente a 5 kb y 300 pb de ADN doble cadena
respectivamente.
El mtodo ms conveniente y comnmente usado para la
visualizacin del ADN separado en estos geles de agarosa es la
tincin con el colorante fluorescente bromuro de etidio (BrEt), el cual
contiene grupos planares tricclicos que se intercalan entre las bases
del ADN, sin especificidad de secuencia. Bajo estas condiciones, el
colorante aumenta su fluorescencia, de modo que emite luz visible
(color naranja) cuando es excitado por radiacin ultravioleta.
Para el registro del resultado de la electroforesis que se
visualiza mediante la exposicin a la luz UV del gel teido con BrE,
desde hace algunos aos se utiliza un aparato de fotodocumentacin
que digitaliza la imagen, el cual hace uso de programas
especialmente diseados para este fin.

22
Materiales y reactivos.

Agarosa 0,8% en tampn TAE 1X

Tampn TAE 1X (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM).

Tampn de carga III 6X. (azul de bromofenol 0,25% p/v;

cileno cianol 0,25% p/v; Glicerol 30% v/v)

Bromuro de etidio 0.5 g.mL-1

Agua destilada

Cmara de electroforesis horizontal/Fuente de poder

Peines, moldes y bandeja para la preparacin de geles

Balanza

Horno microondas

Fiola de 125 mL

Bandeja para tincin

Cilindros graduados de 100 y 500 mL

Papel Parafilm

Micropipetas

Puntas para micropipetas 20-200 L

Agujas de inyectadotas

Transiluminador UV/sistema de fotodocumentacin

Guantes desechables

23
Protocolo

1. Preparar 100 mL de la solucin de agarosa 0,8% en tampn

TAE 1X. Para ello, pesar 0,8 g de agarosa requeridos en una
fiola y agregar 100 mL del tampn TAE 1X.

2. Disolver la agarosa calentando hasta hervir en el microondas

por 2-5 minutos evitando la evaporacin. Dejar enfriar.
Cuando la temperatura se acerque a los 50C (temperatura
tal que se pueda visualizar a la solucin an como lquido),
verter la agarosa en el molde con los peines. Evite la
formacin de burbujas, en caso de que se formen, removerlas
con una aguja. Dejar solidificar el gel a temperatura
ambiente.

3. Una vez solidificada la agarosa, remover los peines y colocar

el gel en la cmara de corrida con tampn TAE 1X.

4. En un trozo de papel Parafilm fijado al mesn, mezclar 5 L

de la solucin de ADN con 2 L del tampn de carga 6X y
colocar cada muestra en el bolsillo correspondiente. Recuerde
colocar un marcador de peso molecular mezclado con tamn
de carga y tomar nota de la ubicacin de sus muestras.

5. Aplicar un voltaje no superior a 5 V.cm-1 y dejar correr hasta

que el primer colorante alcance partes del gel.

6. Al finalizar la corrida, y utilizando guantes, teir el gel en una

solucin de Bromuro de etidio a 0,5 g.mL-1 durante 1
minutos. Transferir el gel a una bandeja con agua destilada.
Registre la imagen mediante la exposicin sobre un
transiluminador de luz UV (312 nm) y utilizando el aparato de
fotodocumentacin.

7. NOTA: El BrEt es un poderoso agente mutgeno. Use siempre

guantes. No permita su contacto con la piel.

No exponga ninguna parte de su cuerpo a la luz UV.

24
Preguntas de la prctica

1. Explique por qu la matriz del gel de agarosa ofrece

resistencia al paso de las molculas de ADN?

2. Por qu un fragmento de ADN de 10 kb no migra ms rpido

que un fragmento de 0,5 kb, cuando se someten a un campo
elctrico en la electroforesis en geles de agarosa, si el
primero posee mayor nmero de grupos fosfato y por tanto
ms cargas negativas?

3. Cules son las funciones de los tampones de electroforesis

como el TAE 1X? Qu otros tampones de electroforesis son
frecuentemente usados en laboratorio?

4. Con qu propsito se mezcla la solucin de ADN con el

tampn de carga? Cules son las funciones de cada uno de
de los componentes, el glicerol, el azul de bromofenol y el
cileno cianol?

5. Qu otros mtodos existen para la visualizacin del ADN en

geles de agarosa?

6. La electroforesis en geles de agarosa a diferentes

concentraciones resuelve fragmentos desde 100 pb hasta 20
kb. Con qu otra metodologa se logra resolver fragmentos
menores a 100 pb? Explique.

7. En la prctica se utiliz un marcador de ADN de molculas

lineales. Sirve este marcador para calcular el peso molecular
de molculas circulares? Explique.

25
 PRCTICA 4

CUANTIFICACIN DE ADN POR

ESPECTROFOTOMETRA

Objetivos

Conocer y manejar el fundamento de la tcnica de

espectrofotometra para la cuantificacin de la concentracin
de una muestra de ADN.

Estimar la concentracin de ADN plasmdico aislado de las

clulas transformantes de E. coli DH10B en la prctica 2.

Introduccin
Existen diversos mtodos para estimar la concentracin de
cidos nucleicos en una preparacin. Si la muestra es pura (no
contiene cantidades significativas de contaminantes como protenas,
fenol, agarosa o incluso otros cidos nucleicos), su medicin
mediante espectrofotometra de la luz UV absorbida por las bases
nitrogenadas es la ms adecuada. Por el contrario, si la cantidad de
ADN o ARN es muy pequea, o si la muestra contiene grandes
cantidades de impurezas, la estimacin de los cidos nucleicos se
puede llevar a cabo por la intensidad de fluorescencia emitida por
compuestos como el bromuro de etidio.

En esta prctica se cuantificar la cantidad de ADN mediante

espectrofotometra, donde se tomarn lecturas de la Densidad
ptica (D.O.) a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura
a 260 nm permite calcular la concentracin del ADN en la muestra.
Una D.O.260 de 1.0, corresponde aproximadamente a 50 g.mL-1 de
ADN doble cadena, a 33 g.mL-1 de ADN cadena sencilla, a 20-30
g.mL-1 de oligonucletidos entre 20 a 40 bases y a 40 g.mL-1 de
RNA. La relacin entre las medidas a 260 y 280 (D.O.260:D.O.280)

26
proporciona un estimado de la pureza de la muestra. Las
preparaciones puras de ADN deben tener un valor D.O.260:D.O.280 de
1,8 a 2. Valores por debajo de este rango son un indicativo de
contaminacin con protenas o fenol.

Debido a su rapidez, simplicidad y ausencia de dao, la

cuantificacin de ADN por espectrofotometra ha sido ampliamente
utilizada. Sin embargo, esta tcnica es poco sensible, y para la
mayora de los espectrofotmetros se requiere una concentracin de
ADN de al menos 1 g.mL-1 en la muestra para poder realizar
estimaciones vlidas. En esta prctica utilizaremos la tcnica de
cuantificacin de cidos nucleicos mediante espectrofotometra, para
evaluar la muestra de ADN plasmdico aislado de las clulas
transformantes de E. coli en la prctica 2.

Materiales y Reactivos

Tampn TE (Tris-HCl pH 8.0 10 mM, EDTA 0.1 mM)

Tubos de microcentrfuga de 1,5 mL

Micropipetas P20, P200 y P1000

Puntas para micropipetas 20-200 L

Cubetas de cuarzo de 1 mL

Espectrofotmetro con lmpara de luz UV

Protocolo

1. Realizar una dilucin 1:200 (5 L en 1 mL) de la muestra de

ADN plasmdico aislado en la prctica 2 utilizando tampn TE,
en un volumen final de 1 mL.

2. Calibrar a cero el espectrofotmetro con tampn TE. Colocar

el volumen total de la dilucin de la muestra en una cubeta de
cuarzo de 1 mL. Mida y registre el valor de la D.O. a 260 y
280 nm.

27
 3. Estime la concentracin de ADN en la muestra utilizando la
siguiente relacin:

[ADN] = 50 g.mL-1 x D.O.260nm x factor de dilucin

Como alternativa a la estimacin directa de la concentracin

de ADN utilizando el espectrofotmetro, es posible correr la
muestra problema simultneamente con una serie de diluciones de
ADN plasmdico de concentracin conocida. Una vez realizada la
corrida electrofortica, teido el gel en una solucin de BrEt y
registrada la imagen, siguiendo las indicaciones del paso 6 del
protocolo de la prctica 3, estime la concentracin de la muestra
por comparacin con los ADNs de las diluciones.

Preguntas de la prctica

1. Por qu considera usted que es necesario realizar la

estimacin de la concentracin del ADN aislado?

2. Por qu se debe realizar una dilucin de la muestra antes de

medir la D.O. en el espectrofotmetro?

3. Por qu slo se toma en cuenta la D.O. a 260 nm en la

estimacin de la concentracin del ADN? Qu informacin
nos provee la D.O. a 280 nm? Por qu utiliz el valor de 50
g.mL-1 en la frmula para calcular la concentracin de su
muestra?

4. Calcule el grado de pureza de la muestra aislada en la

prctica 2 y compare con el valor terico. Discuta sus
resultados.

5. Compare sus resultados (Concentracin de ADN y relacin de

pureza D.O.260:D.O.280) con los del resto del curso. Discuta.

28
 PRCTICA 5

CARACTERIZACIN DE PLSMIDOS
RECOMBINANTES POR ANLISIS DE
RESTRICCIN

Objetivos

Manejar los principios metodolgicos bsicos del uso de las

enzimas de restriccin para la caracterizacin de molculas de
ADN.

Evaluar mediante la tcnica de electroforesis en geles de

agarosa, los tamaos de los fragmentos generados por la
digestin con enzimas de restriccin de los plsmidos aislados
en la prctica 2 y comparar el patrn obtenido con el
reportado en los mapas fsicos.

Introduccin

Las enzimas o endonucleasas de restriccin, ER, son protenas

que reconocen secuencias definidas del ADN entre 4, 6 o ms
nucletidos, cortando en sitios especficos dentro de esta secuencia o
en sitios vecinos a ella. Desde su descubrimiento en los aos 70 se
han aislado ms de 300 enzimas de restriccin dndoles
denominaciones de acuerdo a las diferentes especies de bacterias
donde se originan; por ejemplo EcoR I fue aislada de E. coli, Hind III
de Haemophilus influenzae y Hpa I de Haemophilus parainfluenzae.
Las secuencias reconocidas por las enzimas de restriccin son
generalmente palndromos y cada enzima reconoce una secuencia
diferente. En su conjunto las ER constituyen una herramienta para
obtener fragmentos discretos de ADN con extremos cuya secuencia
es conocida. Los fragmentos de ADN resultantes de una digestin
con enzimas de restriccin pueden ser separados por electroforesis

29
en geles de agarosa en un rango de 200 pb a 20 kb. A la
combinacin de digestin con enzimas de restriccin y al anlisis
mediante electroforesis en geles se le llama anlisis de restriccin.
La representacin de una molcula de ADN, ya sea circular o lineal,
donde se indiquen a escala con el tamao en pb, la ubicacin de los
sitios de restriccin que poseen, se denomina mapa de restriccin.
En este ejercicio prctico se realizar la verificacin del mapa de
restriccin de los plsmidos pEGFP y pEYFP aislados en la prctica 2
(Figura 1).

Materiales y reactivos

ADN plasmdico aislado en la prctica 2

Enzimas Hae II, Xba I y EcoR I

Tampn 10X especfico de cada enzima

Agua bidestilada, autoclavada

Estufa a 37C

Tubos plsticos de microcentrfuga estriles de 1,5 mL

Micropipetas P20 y P200

Puntas para micropipetas 20-200 L

Protocolo

Nota: Cada equipo va a realizar tres digestiones por separado para

la muestra de ADN plasmdico, con cada una de las enzimas Hae II,
Xba I y EcoR I. Previo a montar las digestiones, registre los
reactivos, sus concentraciones y el volumen a utilizar en un cuadro
similar al descrito en la Tabla 2.

1. Siguiendo el orden de la Tabla 2, colocar la solucin de ADN

(pEGFP o pEYFP proveniente de la miniprep de la prctica 2),
en un tubo de 1,5 mL estril. Estime el volumen de la solucin

30
 de ADN de acuerdo a la evaluacin del rendimiento del
aislamiento en el gel de agarosa y a la concentracin estimada
en el espectrofotmetro o a travs de comparacin en geles.

2. Aadir 1,5 L del tampn de la enzima (10x).

3. Agregar 0,5 L la enzima (Hae II, Xba I o EcoR I) .

4. Completar hasta 15 L con H2O bidestilada y autoclavada.

5. Incubar a 37C por 2 horas.

6. Analizar la digestin en una electroforesis en gel de agarosa al

0,8% en tampn TAE 1X. Mezclar 4 L de tampn de carga
con cada tubo de digestin previo a colocarla en el gel. Incluir
un marcador de peso molecular.

7. Utilizando guantes para manipular el gel, teirlo en una

solucin de BrEt 0.5 g.mL-1 por 1 minuto. Transferirlo luego a
una bandeja con agua destilada.

8. Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador

UV y utilizando un aparato de fotodocumentacin.

Tabla 2 Registro de los reactivos, concentraciones y volmes a

utilizar en las digestiones con las enzimas Hae II, Xba I y EcoR I de
los plsmidos pEGFP y pEYFP.

Concentracin Digestin Digestin Digestin

Reactivo del stock HaeII (L) XbaI (L) EcoRI (L)

DNA

Tampn 10X

enzima 8-10 u.L-1

H2O bd

Volumen
final 15 15 15

31
 ANEXO 2. Patrones de restriccin esperados para pEGFP y pEYFP.

M)Marcador PM escalera de 1kb

M 1 2 3 4 5 6 M
1) pEYFP sin digerir

2) pEYFP colonia 1 dig. HaeII +

RNasa

3) pEYFP colonia 2 dig. HaeII +

RNasa

4) pEGFP sin digerir

5) pEGFP colonia 1dig. XbaI +

RNasa

6) pEGFP colonia 2 dig. XbaI +

Rnasa

Figura 3. Resultado esperado del aislamiento de los plsmidos

pYGFP y pEGFP y de su caracterizacin con las enzimas Hae II y
Xba I. Corrida electrofortica de las digestiones especificadas para
cada carril en un gel de agarosa 1% p/v en tampn 1x TAE.

Preguntas de la prctica

1. Investigar la nomenclatura de las enzimas de restriccin. Por

qu las enzimas utilizadas en la prctica se denominan Hae II,
Xba I y EcoR I?

2. Indar sobre el origen de las enzimas de restriccin y la

importancia de su uso en la biologa molecular.

3. Cules son los componentes del tampn de cada ER y cules

son sus funciones?

4. Estimar el tamao de los fragmentos generados en cada

digestin y comprelo con el mapa de restriccin en cada
caso. Visite el sitio www.bdbiosciences.com. Por qu en el
carril 6 de la figura 3 se observan cuatro bandas?

32
2DO BLOQUE
Aplicacin de tcnicas de la gentica
molecular al diagnstico de enfermedades
hereditarias humanas

INTRODUCCION
En la gentica clsica o Mendeliana el estudio del genotipo
implica la realizacin de cruces y el anlisis de las proles en las
diferentes generaciones que revelen la expresin de los genes y las
interacciones allicas a travs del fenotipo. Para el estudio de
enfermedades hereditarias en humanos se analizan los pedigres
familiares, no siempre disponibles, en la bsqueda de patrones
hereditarios asociados al fenotipo de la enfermedad.
Afortunadamente, hoy en da existe la posibilidad de analizar
directamente al genotipo de un individuo. Las herramientas
disponibles, producto de la biologa molecular, permiten establecer
de manera exacta la secuencia de nucletidos en el ADN de un gen
determinando la presencia de mutaciones asociadas a un fenotipo
en particular. El potencial de las nuevas tecnologas radica en su
resolucin y sensibilidad. La combinacin de metodologas que
permiten aislar fragmentos especficos de ADN utilizando la reaccin
de amplificacin en cadena de la polimerasa o PCR, por su siglas en
ingls Polymerase Chain Reaction, y mtodos anlogos de
amplificacin de cidos nucleicos, as como estrategias que detectan
variaciones en la secuencia de nucletidos, como lo son la
hibridacin molecular, secuenciacin directa del ADN o la ganancia o
prdida de sitios de reconocimiento y corte de enzimas de
restriccin detectados mediante tcnicas de electroforesis,
proporcionan las herramientas necesarias para identificar la
presencia de mutaciones asociadas a enfermedades hereditarias y la
certera posibilidad de hacer diagnstico gentico. Con las

33
metodologas existentes y disponibles es posible detectar y analizar
la nica copia de cada uno de los genes presentes en una clula.

Histricamente fue Linus Pauling en 1941 quien acu el

trmino enfermedad molecular al directamente relacionar la causa
de la inmunoglobulinopata o anemia drepanoctica sickle cell con
la molcula de la hemoglobina. Por primera vez fue demostrado que
una protena anormal poda causar una enfermedad y que los genes
determinaban la estructura de las protenas. Utilizando el anlisis
electrofortico, Pauling y sus colaboradores observaron que la
hemoglobina Hb-SS mostraba un cambio en la movilidad
electrofortica respecto a la hemoglobina normal Hb-AA; este
cambio era producto de una mutacin en el gen de la -globina que
daba lugar a un cambio en un aminocido en la protena madura. La
hemogloblina Hb-SS se origina de la sustitucin A -> T en el sexto
codn del gen de la cadena de -globina. Este cambio en un
nucletido cambia al sexto aminocido en la cadena peptdica de
cido glutmico a valina, cambio que a su vez afecta la forma y
funcin de la molcula de hemoglobina adulta. Los eritrocitos que
portan estas molculas pueden tener formas anormales que
obstruyen los capilares o son degradados en los riones. El individuo
que hereda un alelo mutado de -globina de uno de sus padres y un
alelo normal, se dice que porta el carcter y tendr una
hemoglobina adulta del tipo Hb-AS. Si tiene ambos alelos normales
para la -globina, este individuo tendr una hemoglobina adulta del
tipo Hb-AA. En caso de heredar ambos alelos mutantes el individuo
tendr una hemoglobina adulta Hb-SS.

La anemia drepanoctica es una enfermedad hereditaria

autosmica recesiva introducida en el continente Americano con el
trfico de esclavos desde frica y que afecta 1 de cada 600 afro-
descendientes norteamericanos. Fue el primer desorden hereditario
en ser diagnosticado utilizando mtodos moleculares dirigidos al
genotipo. A finales de los aos 70, se realiz el diagnstico

34
molecular combinando tcnicas de hibridacin Southern utilizando
una sonda del gen de la -globina, marcada radiactivamente, para
detectar polimorfismos en el tamao de los fragmentos generados
por la digestin con una enzima de restriccin (diagnstico RFLP por
sus siglas en ingls Restriction Fragment Length Polymorphism).
Esta primera prueba era indirecta y detectaba el ligamiento gentico
de la mutacin en el gen de la -globina a la presencia/ausencia de
un sitio polimrfico Hpa I vecino al gen. En 1982 se identific la
mutacin puntual en el gen de la -globina que da origen a la Hb-SS
y posteriormente se determin que la mutacin destruye un sitio de
corte para la enzima Mst II y sus isoesquizmero Bsu36 I, asociando
directamente un RFLP al diagnstico gentico.

La metodologa del RFLP requiere del aislamiento de clulas

fetales mediante amniosistesis para la obtencin de suficientes
cantidades de ADN genmico a analizar en las hibridaciones
Southern. Este requerimiento del ensayo constitua una limitante que
ha sido solventada acoplando la amplificacin de la regin del gen de
-globina mediante PCR a la digestin del amplicn con la enzima
MstII o la Bsu36I. Luego del anlisis electrofortico de los patrones
de fragmentos generados en la digestin, es posible identificar el
genotipo.

Las pruebas de diagnstico molecular estn disponibles en la

actualidad para un gran nmero de desrdenes genticos y
permiten evaluar familias completas, as como el realizar el
diagnstico prenatal del feto con profundas implicaciones sociales
que deben ser consideradas mucho antes de su implementacin. Es
necesario que se establezcan criterios y marcos referenciales,
conjuntamente con los programas de diagnstico, en los que se
contemplen aspectos como la certeza y efectividad de la prueba, su
verdadera utilidad, particularmente para enfermedades genticas
sin cura, y el asesoramiento o consejo gentico que debe
acompaar al programa de diagnstico. En el caso de la anemia

35
drepanoctica, para la cual no existe un tratamiento curativo, se
considera que la nica medida a nivel mundial para prevenir la
enfermedad es el diagnstico prenatal. El procedimiento del
diagnstico molecular ha sido simplificado y estas pruebas pueden
ser realizadas de forma segura en muchos pases, lo
suficientemente temprano como para permitir una eleccin segura
de terminacin del embarazo.

En este segundo bloque del laboratorio realizaremos la

aplicacin de mtodos de biologa molecular para el anlisis directo
del genotipo con la finalidad de identificar la presencia de los alelos
salvajes y mutantes del gen de -globina asociados al fenotipo de la
anemia drepanoctica. Utilizaremos una metodologa sencilla para el
aislamiento del ADN del epitelio bucal, a partir del cual ser
amplificada una regin del gen de -globina que contiene la regin
N-terminal de la protena donde se ubica la mutacin. Mediante el
patrn de RFLP de este amplicn con la enzima Bsu36 I, ser posible
identificar el genotipo de la muestra con respecto al gen de la -
globina. Consideraremos en este bloque dos aspectos asociados y
consecuencia de la aplicacin de tcnicas moleculares al anlisis del
genoma para el diagnstico de enfermedades hereditarias y la
identificacin de individuos: la incorporacin del consentimiento
informado para los individuos participantes en las pruebas y una
lectura que ilustra la pertinencia de estas metodologas para
resolver problemas legales en los tribunales con un verdadero
impacto en la sociedad. De esta manera, el contenido del segundo
bloque del manual de laboratorio cubre los aspectos tcnicos bsicos
del anlisis a nivel del genoma de las enfermedades hereditarias
humanas como las implicaciones ticas de su aplicacin.

36
PRCTICA 6
ANLISIS DE PERFILES GENTICOS
HUMANOS MEDIANTE PCR-RFLP:
DETECCIN DE UNA MUTACION PUNTUAL O
SINGLE NUCLEOTIDE POLIMORPHISM, SNP,
EN EL GEN DE LA -GLOBINA

Objetivos

Aislar ADN genmico de clulas de epitelio bucal humano para

anlisis de RFLP-PCR

Manejar los fundamentos de la tcnica de amplificacin de

ADN por PCR.

Analizar mediante la tcnica de PCR-RFLP, la presencia de

mutaciones puntuales o del Single Nucleotide Polymorphism,
SNP, en el gen de la -globina humana responsable de la
anemia drepanoctica.

PARTE I
PREPARACIN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS

La efectividad en la aplicacin de una reaccin de

amplificacin de ADN o ARN depende principalmente de la calidad
del material de partida para el anlisis. En primer lugar es
imprescindible la seleccin adecuada de la fuente del material
gentico del organismo a identificar.

El origen del material gentico a evaluar puede ser variado.

En el caso de bacterias y parsitos la fuente ideal es el cultivo del
organismo. Sin embargo, no siempre es posible tener un cultivo por
razones tcnicas y/o biolgicas, en consecuencia se debe obtener
una muestra que contenga al microorganismo o su genoma, como

37
muestras de suelos, biopsias, sangre o suero. Para el anlisis de
genotipos humanos en el diagnstico de enfermedades hereditarias,
determinacin de filiacin e investigaciones fornsicas, se asla ADN
a partir de muestras de sangre o de clulas fetales provenientes del
lquido amnitico en el caso del diagnstico prenatal. Sin embargo,
la altsima sensibilidad de las tcnicas de amplificacin de ADN in
vitro permiten ampliar la fuente del ADN a todo tipo de muestras
que contengan clulas del individuo; clulas del epitelio bucal son
utilizadas rutinariamente en el anlisis de perfiles genticos
humanos.

Una vez seleccionada la fuente de ADN, la muestra debe ser

sometida a un proceso de extraccin de cidos nucleicos con el fin
de preservarlos y evitar la accin degradativa de enzimas u otros
compuestos presentes inicialmente en la misma; as como eliminar
sustancias que interfieran o inhiban de alguna manera la reaccin de
amplificacin. El protocolo de procesamiento previo de la muestra
depende exclusivamente del tipo y origen de la misma, as como de
la calidad del material que se desea obtener. En general, los
mtodos de preparacin de muestras buscan degradar protenas y
extraer el ADN. Las protenas son desnaturalizadas o degradadas
enzimticamente y posteriormente separadas de los cidos
nucleicos. Luego de descartar las protenas, el ADN puede extraerse
por separacin del precipitado proteico o con extraccin fenlica.

Es importante saber que, siempre que se trabaje con

muestras de origen humano debe existir un Consentimiento
Informado del sujeto al cual se le extrae la muestra. El
Consentimiento Informado es un proceso mediante el cual un sujeto
confirma voluntariamente su deseo de participar en un estudio en
particular, despus de haber sido informado sobre todos los aspectos
de ste que sean relevantes para que tome la decisin de participar.
El Consentimiento Informado se documenta por medio de un
formulario donde se registra por escrito la informacin del estudio y

38
la manifiesta aceptacin del individuo en participar, confirmando el
conocimiento de su contenido. Este documento es firmado y registra
la fecha de su elaboracin.

1.1 Aislamiento de ADN a partir de epitelio bucal.

El epitelio bucal est en constante regeneracin y sus clulas

son reemplazadas continuamente. Aprovechando esta propiedad,
este protocolo permite extraer ADN genmico de clulas
provenientes la capa ms superficial del epitelio estratificado
mediante el raspado de las paredes internas de las mejillas y de las
encas, utilizando para ello hisopos de algodn.

La proteinasa K rompe enlaces peptdicos, lo que permite

digerir las protenas que se encuentren junto al ADN en el lisado
celular.

Materiales y reactivos

Proteinasa K 10 mg.mL-1

Tampn de lisis 1X (Tris-HCL 0,05 M pH 8; EDTA 0,05 M pH

8; glucosa 0,05 M; SDS 0,5%; NaCl 0,1 M)

Hisopos estriles

Micropipetas P20, P200 y P1000

Puntas para micropipetas 20-200 L, 1 mL

Baos de incubacin

Centrfuga refrigerada alcance a 10000 r.p.m.

Tubos plsticos estriles de 1,5 mL y 15 mL

39
Protocolo

NOTA: Recuerde rotular todo el material que vaya a utilizar.

1. Con un hisopo estril raspar o rayar generosamente la parte

interna de su mejilla derecha y el espacio entre su mejilla y
enca durante un minuto; intente recolectar tanto material
como le sea posible.

2. Colocar el hisopo con las clulas del epitelio bucal en el tubo

que contiene 1 mL de tampn de lisis 1X. Agitar
vigorosamente el hisopo para liberar las clulas en el tampn,
para transferir la mayor cantidad de clulas posibles.

3. Usando un segundo hisopo estril, raspar o rayar la parte

interna de su mejilla izquierda y el espacio entre su mejilla y
enca, as como en la parte ms interna de la boca como lo
hizo en el paso (1). Trate de recolectar la mayor cantidad
posible de material que le sea posible. Coloque el segundo
hisopo en el tubo con tampn de lisis como hizo en el paso
(2).

4. Tapar e invertir gentilmente el tubo 5 veces para mezclar el

contenido.

5. Agregar 1 L de proteinasa K (10 mg.mL-1) al tubo.

6. Tapar nuevamente el tubo e invertir gentilmente varias veces

para mezclar el contenido.

7. Incubar los tubos en un bao de temperatura a 37 C durante

20 minutos.

8. Pasado este tiempo, colocar los tubos en un bao de

temperatura a 50 C durante 10 minutos.

9. Aadir 200 l de NaCl 8 %. Tape el tubo e invierta

suavemente 5 veces.

40
 10. Trasvasar el contenido de este tubo a un tubo de 15 mL.
Aadir lentamente por las paredes del tubo, 2 mL de etanol
100%. Deje reposar durante 5 min.

11. Transcurridos los 5 min., sellar el tubo con parafilm e invertir

5 veces para ayudar a precipitar el ADN.

12. Centrifugar durante 15 min. a 10000 r.p.m. Descartar el

sobrenadante y dejar secar todo el alcohol.

13. Resuspender el ADN en un volumen no mayor a 200 L de

tampn TE o agua MiliQ (calidad PCR, libre de ADNasas y
ARNasas)

14. Correr 5 L del ADN en un gel de agarosa 0.8% para verificar

la cantidad e integridad del ADN aislado.

15. Diluir el ADN 1/100 antes de iniciar el protocolo de PCR.

Observaciones

La recoleccin de un nmero abundante de clulas es crtica

para lograr los objetivos. Asegrese de emplear el tiempo
recomendado para la coleccin y transferencia de las clulas
del epitelio bucal.

Es muy importante incubar la solucin junto con la proteinasa

K a 37 C para purificar el ADN que se encuentra en la
solucin. Asegrese de realizar las digestiones durante el
tiempo recomendado, note que un mayor tiempo de digestin
permitir obtener un ADN mucho ms puro.

Preguntas de la prctica

Compare los pasos y reactivos utilizados en el aislamiento de

ADN plasmdico (Prctica 2) y ADN genmico (Prctica 6,
Parte I). Qu diferencias y similitudes observ?

41
ANEXO 3

CONSENTIMIENTO INFORMADO
En el Laboratorio de Gentica Molecular, como parte de la
Prctica 6, se propone realizar un anlisis de perfiles genticos
humanos mediante RFLP-PCR.

El objetivo del trabajo es evaluar, mediante esta tcnica, la

presencia de una mutacin puntual en el gen de la -globina
humana, responsable de la anemia drepanoctica.
Los datos obtenidos en este estudio contribuirn inicialmente
a la realizacin de la prctica, y posteriormente, con la acumulacin
de datos ao tras ao, podr llevarse a cabo la construccin de un
banco de datos de este polimorfismo, que eventualmente permitir
calcular la frecuencia de esta mutacin en la poblacin venezolana.

Yo, _______________________________C.l.:_________________,
Nacionalidad___________________Estado Civil ___________siendo
mayor de 18 aos, en uso pleno de mis facultades mentales y sin
que medie coaccin ni violencia alguna, en completo conocimiento
naturaleza, forma, duracin, propsito, inconvenientes y riesgos
relacionados con el estudio que mas abajo se ndica, declaro
mediante la presente:
1.- Haber sido informado de manera objetiva, clara y sencilla, de
todos los aspectos relacionados con la prctica nmero 6 del
laboratorio de la materia electiva Gentica Molecular.
2.- Tener conocimiento claro de que el objetivo del trabajo antes
sealado es: es evaluar, mediante la tcnica RFLP-PCR, la presencia
de una mutacin puntual en el gen de la -globina humana,
responsables de la anemia falciforme.
3.- Conocer bien el protocolo experimental expuesto por el
investigador; en el cual se establece que mi participacin en el
trabajo consiste en donar al laboratorio de la materia electiva
Gentica Molecular de la Escuela de Biologa, Facultad de Ciencias,

42
Universidad Central de Venezuela, una muestra de clulas del
epitelio bucal.
4.- Que la muestra de clulas del epitelio bucal que acepto donar as
como la informacin que suministre al equipo de profesores del
laboratorio de la materia electiva Gentica Molecular coordinados por
la Dra. Palmira Guevara, ser utilizada nica y exclusivamente para
determinar la presencia de mutaciones puntuales en el gen de la -
globina humana.
5.- Que el equipo de profesores coordinados por la Dra. Palmira
Guevara, me ha garantizado confidencialidad, relacionada tanto a mi
identidad como de cualquier informacin a la que tengan acceso, por
concepto de mi participacin en el proyecto antes mencionado.
6.- Que bajo ningn concepto podr restringir el uso, para fines
acadmicos, de los resultados obtenidos en el presente estudio.
8.-.Que mi participacin en dicho estudio no implica riesgo ni
inconveniente alguno para mi salud, as como que dicho estudio no
forma parte de una terapia paliativa o curativa.
7.- Que cualquier pregunta que yo tenga en relacin con este
estudio, me ser respondida oportunamente por parte del equipo de
profesores antes mencionados con quienes me puedo comunicar por
el telfono 0212-605 1044 de la direccin de la Escuela de Biologa
con la Dra. Palmira Guevara.
8.- Que bajo ningn concepto se me ha ofrecido ni pretendo recibir
ningn beneficio de tipo econmico producto de los hallazgos que
puedan producirse en el referido proyecto de investigacin.
9.- Que los resultados de las pruebas realizadas me sern
entregados oportunamente.
Caracas a los ____das del mes de ___________ del 20___
Firma:
Nombre y apellido:

43
PARTE II
ENSAYOS DE AMPLIFICACIN MEDIANTE LA REACCIN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR) DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE -
GLOBINA HUMANA

El desarrollo de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa o PCR

(del ingls Polimerase Chain Reaction) es uno de los avances
tecnolgicos de mayor impacto en las tcnicas de Biologa Molecular
y debido a sus mltiples aplicaciones constituye un importante
progreso en el rea de diagnstico e identificacin molecular.
Posiblemente, una de sus mayores ventajas corresponde a la
simplicidad de la reaccin y la relativa facilidad en los pasos de
manipulacin de material de trabajo, permitiendo la adopcin de la
tcnica de PCR en diversos mbitos.

En esta tcnica, la amplificacin de un fragmento especfico

de ADN, por ciclos sucesivos, es un proceso de multiplicacin
exponencial, que genera suficiente producto que puede acumularse
y ser visualizado. De esta manera, una sola molcula puede
generar ms de un billn de copias de si misma, luego de 30 ciclos
de replicacin exponencial.

El PCR se utiliza para amplificar un fragmento definido de

ADN a partir de una mezcla compleja de material, usualmente
llamada ADN templado. Para la obtencin del templado se precisa
de un proceso de purificacin a partir de la muestra, tal como se
seala en la Prctica 6, Parte I del presente manual. Adems del
templado, se requiere el conocimiento de las secuencias de ADN que
flanquean al fragmento a ser amplificado, conocido como ADN
blanco. A partir de esta informacin se pueden disear y sintetizar
qumicamente dos oligonucletidos iniciadores. Cada uno de estos
oligonucletidos es complementario al extremo 3 de la hebra de
ADN de la secuencia blanco, un oligonucletido para cada una de las

44
dos hebras del ADN (Figura 4).

La tcnica de PCR es un proceso de sntesis in vitro de ADN,

en el cual se copia una hebra complementaria a partir de un
templando, extendindose en direccin 35 a partir de un
iniciador, cebador o primer. Consiste en tres pasos definidos de
tiempo y temperatura, conocidos como desnaturalizacin,
alineamiento y extensin, y cada conjunto secuencial de pasos o
ciclos es repetido de 30 a 40 veces (Figura 4).

En el primer ciclo el templado de ADN doble cadena es

inicialmente desnaturalizado por calentamiento de la mezcla de
reaccin a una temperatura por encima de 90C. Con esta primera
etapa, la regin de ADN que ser especficamente amplificada
(secuencia blanco o diana) se hace accesible, dentro de la muestra
de ADN total. Posteriormente, la temperatura se baja hasta
alcanzar entre 40 a 60 C para iniciar el segundo paso, el
alineamiento de los oligos o cebadores. En este perodo los
cebadores, presentes en exceso en la mezcla de reaccin, se ubican
mediante hibridacin por complementaridad de bases con la
secuencia blanco. Los oligonucletidos alineados actan como
iniciadores para la sntesis del ADN, dado que proveen del grupo
hidroxilo 3 libre para la ADN polimerasa. La precisin en la
temperatura de esta fase es crtica y est definida por el Tm de cada
cebador, en cada sistema de PCR debe optimizarse tomando en
cuenta este parmetro. Las reacciones que no estn optimizadas
pueden generar productos de ADN adicionales al blanco especfico si
la temperatura esta muy por debajo del Tm o pueden no producir
ningn producto amplificado si son muy elevadas.

El tercer paso, la sntesis del ADN o extensin, es realizada a

72 C por una ADN polimerasa termoestable, mas comnmente
llamada Taq ADN polimerasa, porque es originaria de la bacteria
Thermus aquaticus. Finalmente, el ADN sintetizado posee los sitios
de anclaje para los oligonucletidos, sirviendo como templado para

45
los sucesivos ciclos de PCR.

Cada sistema de PCR sigue el mismo principio bsico, sin

embargo la secuencia de los oligonucletidos, los componentes de la
mezcla de reaccin, as como las temperaturas y los tiempos de
cada paso de un ciclo son especficos. En la presente seccin se
presentan un esquema general de los pasos de la reaccin de PCR
con rangos de temperaturas para diversos sistemas.

Figura 4. Pasos de cada ciclo en la reaccin de PCR

2.1 Diagnstico molecular de la anemia drepanoctica: PCR-RFLP,

amplificacin de un segmento del gen de la -globina mediante la
reaccin de PCR

El diagnstico de la anemia drepanoctica se realiza por

diferentes mtodos, las pruebas moleculares detectan la presencia
de la mutacin a nivel de la protena o directamente en el gen. En el
primer caso se evala el cambio de la movilidad de la hemoglobina
en electroforesis en acetato de celulosa, isoelectroenfoque o

46
cromatografa lquida de alta resolucin, asociado a la presencia de
una valina en lugar de un cido glumico en la posicin seis de la
cadena de -globina (Figura 5). La mutacin puntual que resulta en
el cambio del codn GAG del cido glutmico al codn GTG de la
valina, tambin cambia el sitio de reconocimiento de la enzima de
restriccin MstII y su isoesquismero Bsu36I. En la prueba de PCR-
RFLP de la anemia drepanoctica que incluimos en este manual,
luego de la amplificacin de un fragmento de 536 pb,
correspondiente a la regin N-Terminal del gen de la -globina, se
realizar una digestin de este amplicn con la enzima Bsu36 I y se
evaluar el patrn de los fragmentos generados en la restriccin
(Figura 6) para la identificacin del genotipo del individuo entre
homocigoto normales HbAA, homocigotos que sufren la enfermedad
HbSS y heterocigotos o portadores del caracter con hemoglobina
HbAS.

GAG
Mutacin
en el
Codn 6

GTG

Acido glutmico 6

Reemplazo del aa

Valina 6

Variante de hemoglobina HbAA, HbAS y HbSS

Forma
del
eritrocito
Normal Falciforme

Figura 5. Esquema del origen de los eritrocitos falciformes.

47
Materiales y reactivos

Tubos de PCR (200 L)

Micropipetas P10, P20 y P200

Puntas para micropipetas 10 L, 20-200 L

Termociclador

H2O bi-destilada para PCR

Tampn de PCR 10X

dNTPs 1,25 mM

Cebador A (forward) 20 M

5-GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G-3

Cebador B (reverse) 20 M

5-GCT CAC TCA GTG TGG CAA AG-3

MgCl2 50 mM

Muestra de ADN 50 ng.L-1

Muestras de ADN controles (50 ng.L-1 ) de individuos HbSS,

HbAS y HbAA

ADN Taq polimerasa 5 U.L-1

Agarosa

500 mL Tampn TAE 1X

Transiluminador de luz UV/Sistema de fotodocumentacin

Solucin de Bromuro de Etidio 0,5 g. mL-1

Fiola 125 mL

Observaciones

Se debe tomar en cuenta que la mezcla de reaccin debe

realizarse en un rea libre de ADN (irradiada con luz UV al
menos 15 minutos antes de comenzar a trabajar). Debido a

48
 que se utilizarn varios tubos de reaccin, se recomienda
realizar una mezcla madre y luego distribuirla en los tubos
por cantidades iguales, para finalmente agregarle el ADN.
Todo el material debe estar identificado.

A partir del ADN aislado de clulas del epitelio bucal (parte I

de la prctica 6), y de los ADNs controles se amplificar un
fragmento de 536 pb correspondiente al gen de la -globina
utilizando los cebadores A (forward) y B (reverse).
Dependiendo de la eficiencia del aislamiento se deben realizar
previamente diluciones de la muestra, hasta alcanzar
aproximadamente 100 ng.mL-1 de ADN.

Protocolo

1. Se llevarn a cabo cinco reacciones de amplificacin una con

la muestra problema, tres con cada uno de los ADN controles
y el control de contaminacin sin ADN.

2. La mezcla de reaccin se debe preparar siguiendo el orden

indicado en la Tabla 3. En un tubo de mezcla madre de
reaccin se deben agregar los volmenes calculados de H2O
calidad PCR, tampn de reaccin 10X, MgCl2 50mM, dNTPs
1,25mM, cebador A 20 M, cebador B 20 M, Taq ADN
polimerasa 2U. Mezclar muy bien para garantizar que la
mezcla sea homognea.

3. Enumerar cinco tubos para cada tipo de muestra, muestra

problema y controles. Repartir en cada tubo 48 L de la
mezcla madre de PCR.

4. Agregar finalmente 2 L de cada una de las muestras

comenzando por el control sin ADN al cual se le agregan agua
calidad PCR.

5. Colocar los tubos en el termociclador e iniciar el programa de

amplificacin denominado ANEMIA (Tabla 4).

49
 6. Luego de realizar la amplificacin correr un gel de agarosa al
1% en tampn TAE 1X para verificar la presencia del producto
esperado. Analice 20 L de cada reaccin ms 3 L de tampn
de carga 6X.

7. Utilizando guantes para manipular el gel, teirlo en una

solucin de BrEt 0.5 g.mL-1 por 1 minuto. Transferirlo luego a
una bandeja con agua destilada.

8. Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador

UV y utilizando un aparato de fotodocumentacin.

Tabla 3. Reactivos para la reaccin de amplificacin

Cantidad
por tubo Total (4n) Concentracin
Mezcla de reaccin
( L) (L) final en el tubo
1n
H2O calidad PCR 36,6 146,4 -
Tampn de PCR 10X 5 20 1X
MgCl2 50 mM 2 8 2 mM
dNTPs 1,25 mM 2 8 0,2 mM
Cebador A 20 M (*) 1 4 0,4 M
Cebador B 20 M
(**) 1 4 0,4 M
ADN Taq polimerasa
5 U.L-1 0,4 1,6 0,04 U.L-1
ADN 50 ng L-1 2 - -
Volumen final 50 192,0

50
Tabla 4. Programa ANEMIA

No de

Paso Temperatura Tiempo Ciclo repeticiones

(C) (min.) del ciclo

Denaturalizacin

inicial 94 5 1 1

Denaturalizacin 94 1

Hibridacin 55 1

Extensin 72 1 2 40

Extensin final 72 10 3 1

51
PARTE III
DIGESTIN DEL AMPLICN CON LA ENZIMA Bsu36 I Y ANLISIS
DEL PATRN DE RESTRICCIN.

A partir del producto de amplificacin del gen de la cadena de

la hemoglobina humana se realizar la digestin con la enzima
Bsu36 I, isoesquismero de la enzima Mst II. Los patrones de
restriccin luego sern visualizados en un gel de agarosa y
analizados para determinar el genotipo.

Materiales y reactivos

Producto de amplificacin por el programa PCR ANEMIA

Enzima Bsu36 I

Tampn 10X especfico de la enzima

Agua bidestilada y autoclavada

Solucin de EDTA 0,5 M pH 8,0

Estufa a 37C

Microcentrfuga

Tubos plsticos de microcentrfuga estriles de 1,5 mL

Micropipetas P20 y P200

Puntas para micropipetas 1-10 L, 20-200 L

Guantes desechables

Protocolo

1. En un tubo estril de 1,5 mL realice la mezcla de digestin

siguiendo el orden de la Tabla 5.

2. Incubar a 37C por un perodo de 2 h.

3. Detener la reaccin adicionando EDTA 0,5 M (pH 8.0) a una

concentracin final de 10 mM.

52
 4. Analizar todo el producto de la digestin mezclado con 3 L
de tampn de carga, mediante electroforesis en un gel de
agarosa al 3% en tampn TAE 1X. Incluir un marcador de
peso molecular.

5. Visualice el resultado mediante tincin del gel en una solucin

de BrEt 0,5g.mL-1 por 1 minuto. Transferirlo luego a una
bandeja con agua destilada. Recuerde utilizar guantes.

6. Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador

UV y utilizando un aparato de fotodocumentacin.

Tabla 5. Reactivos de la reaccin de digestin.

Componente Cantidad (L)

Tampn de la enzima 10X 1,5
H2O calidad PCR 7,5
Producto PCR 10
Enzima Bsu36 I 10U.L-1 1
Volumen final 20

Preguntas de la prctica

1. Cules son las caractersticas ms importantes que debe

tener la enzima ADN polimerasa para la reaccin de
amplificacin in vitro?

2. Investigue sobre otras enfermedades que puedan ser

diagnosticadas mediante el uso la tcnica del PCR.

3. Por qu debe agregrsele MgCl2 a la mezcla en la reaccin de

la polimerasa?

4. Por qu el EDTA detiene la reaccin enzimtica?

53
ANEXO 4

Resultados esperados del diagnstico por PCR-RFLP en el gen de -

globina humana

En la figura 6 se muestra un ejemplo de los patrones de

restriccin esperado cuando el producto e PCR de 536 pb del gen -
globina es sometido a digestin con la enzima Bsu36 I.

pb

Figura 6. Patrn de digestin del fragmento de 536 pb del gen -

globina cuando se digiere con Bsu36 I. M: Marcador de peso
molecular X 174 Hae III. 1 en pb; Amplicn de 536 pb PCR sin
digerir. 2: Digestin del ADN de un sujeto homocigoto para
Hemoglobina A (HbAA). 3: Digestin del ADN de un sujeto
heterocigoto (HbAS). 4: Digestin del ADN de un sujeto homocigoto
para Hemoglobina S (HbSS).

54
ANEXO 5

LECTURA
GENTICA Y SOCIEDAD
Tomado y traducido de Hartwell y col., (2000)
Genetics from genes to genome. McGraw Hill.

Pruebas de ADN mitocondrial reemplazan tipificacin HLA como

evidencia de parentesco en cortes argentinas.

Entre los aos 1976 y 1983, la dictadura militar gobernante de

Argentina secuestr, encarcel y asesin a ms de 10.000
estudiantes universitarios, profesores, trabajadores sindicalistas
sociales, y otras personas opuestas al rgimen. Una gran cantidad
de nios lactantes de meses desaparecieron en la crcel junto con
los jvenes adultos, y cerca de 120 bebs nacieron en centros de
detencin. En 1977, las abuelas de algunos de estos nios
comenzaron a organizar vigilias en la principal plaza de Buenos Aires
para servir de testigos e informar a la poblacin sobre la
desaparicin de sus hijos y nietos. Estas mujeres rpidamente
formaron un grupo defensor de los derechos humanos llamado Las
Abuelas de la Plaza de Mayo.
La meta de Las Abuelas fue localizar ms de 200 nietos a
quienes sospechaban an con vida, y reunirlos con sus familias
biolgicas. Para este fin, recolectaron informacin de diferentes
testigos, como parteras y carceleras, y formaron as una red
organizada para monitorear los documentos de inscripcin de nios
en jardines de infancia. Los certificados de nacimiento dudosos
podran revelar a un potencial nieto perdido. Este grupo tambin
publicit su trabajo dentro de Argentina, y contactaron
organizaciones de otras partes del mundo, incluyendo la United

55
Nations Human Rights Comission y la American Association for the
Advancement of Science (AAAS).
Lo que el grupo de Las Abuelas de la Plaza de Mayo pidi a la
AAAS fue su ayuda para realizar los anlisis genticos vlidos en la
corte. Para el momento, la democracia haba remplazado al rgimen
dictatorial militar y Las Abuelas de la Plaza de Mayo pudieron
argumentar casos legales ante tribunales relativamente imparciales;
los nios que haban sido secuestrados entre los 2 o 3 aos, o recin
nacidos, tenan entre 7 y 10 aos de edad. An cuando Las Abuelas
de la Plaza de Mayo haban recogido una gran cantidad de evidencia
circunstancial, los tribunales argentinos no aceptaron esta evidencia
como prueba de identidad de un infante y su relacin biolgica a una
familia en particular. Sin embargo, los tribunales reconocieron que, a
pesar de que el tamao y las caractersticas fsicas de los nios
habran cambiado, sus genes -que los relacionaban inequvocamente
a sus familias biolgicas- no lo habran hecho. Las Abuelas de la
Plaza de Mayo, quienes se haban documentado de manera
autodidacta sobre el potencial de estas pruebas genticas, buscaron
ayudar con los detalles necesarios para obtener y analizar dichas
pruebas. A partir de 1983, los tribunales argentinos acordaron
aceptar los resultados de estas pruebas como evidencia de
parentesco.
En 1983, la mejor manera de confirmar o descartar la relacin
entre dos o ms individuos (por ejemplo, un nio con sus abuelos)
era comparando protenas (codificadas en genes) que constituyen los
antgenos de los linfocitos humanos (HLAs por sus siglas en ingls,
Human Lymphocyte Antigen). Las personas tienen una combinacin
nica de marcadores HLA en sus glbulos blancos, o linfocitos, y
estos marcadores son lo suficientemente diversos como para
conformar una especie de huella molecular. El anlisis de HLA puede
llevarse a cabo incluso si los padres del nio han fallecido, debido a
que por cada marcador HLA, un nio hereda un alelo de los abuelos

56
maternales y un alelo de los abuelos paternales. Los anlisis
estadsticos pueden establecer la probabilidad que un nio comparta
genes con unos abuelos en particular, debido a que son parientes,
en comparacin con la probabilidad que el nio comparta estos
genes por casualidad.
La AAAS puso en contacto a Las Abuelas de la Plaza de Mayo
con Mary Claire King, quien entonces trabajaba en la Universidad de
California. En los aos 80, King ense a un equipo mdico
argentino a analizar los diversos marcadores HLA de los glbulos
blancos. Luego Las Abuelas obtuvieron los tipos de HLAs de la mayor
cantidad posible de personas vivas en una familia con algn nio
perdido, construyendo as un banco de datos de HLA. Cuando
apareca un nio o nia a quien crean perdido, analizaban su patrn
de HLAs y trataban de conseguir una correspondencia dentro del
banco de datos de HLA. Dependiendo del nmero de alelos
diferentes que portaba este individuo y la rareza de sus variaciones,
la probabilidad que un nio en cuestin perteneciera a la familia que
lo reclamaba variaba de 75% a 99%.
Al final de los aos 80, la combinacin de evidencia
circunstancial y gentica, haba ayudado a reunir a 49 nios con sus
respectivas familias biolgicas. En uno de los casos, una abuela que
haba sido secuestrada el 5 de septiembre de 1976, junto con su hija
embarazada, y luego fue dejada en libertad, contact a Las Abuelas
de la Plaza de Mayo buscando ayuda. Diez aos y medio despus, en
abril de 1987, fue reunida con su nieta. Esta nia haba nacido el 5
de noviembre de 1976 y fue registrada a nombre de un oficial de la
polica de un centro carcelario. Su lugar de nacimiento permanece
desconocido. Sin embargo, su abuela en una entrevista de abril de
1987 dijo: Fue muy fcil comprobar que ella era mi nieta gracias a
las pruebas de sangre. Analizaron mi sangre, la de mi esposo y la de
sus otros abuelos y los resultados mostraron ms de un 99%
positivo.

57
 A medida que transcurri el tiempo, y los casos fciles fueron
resueltos, se evidenci las limitaciones de las pruebas de HLA. Para
mediados de los 80, por ejemplo, haba muy pocos parientes vivos
en algunas familias como para poder establecer una relacin
confiable a travs de la tipificacin por HLA. Pero el surgimiento de
nuevas tcnicas como el PCR y la secuenciacin de ADN hizo posible
el anlisis directo del ADN.
La profesora King junto a dos colegas, C. Orrego y A. C.
Wilson, utilizaron las nuevas tcnicas para desarrollar una prueba de
ADN mitocondrial (ADNmt) basada en la amplificacin por la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls polymerase
chain reaction) y la secuenciacin directa de una regin altamente
variable, no codante, del genoma mitocondrial. El ADN mitocondrial
tiene varias caractersticas que lo hacen una herramienta ms
poderosa que la tipificacin de HLA para confirmar o descartar el
parentesco en una determinada familia, como lo son: la herencia
materna, la ausencia de recombinacin, una regin altamente
variable y no codante de 331 pb, y un alto nmero de copias de
ADNmt por clula. La herencia materna y la ausencia de
recombinacin permiten que, mientras exista un pariente materno
vivo con el cual comparar, este enfoque poda resolver los casos de
parentesco ms disputados. La regin no codante extremadamente
polimrfica hace posible la identificacin de nios a travs de la
relacin directa de su ADNmt con slo una persona - su abuela
materna, su ta o su hermano- en lugar de a travs de anlisis de
clculos estadsticos evaluando cuatro personas; la probabilidad que
dos individuos no relacionados sean idnticos en los 331 pb de
ADNmt es prcticamente nula. Finalmente, el gran nmero de copias
ADNmt por clula incrementa la probabilidad de aislar ADN e
identificar los cuerpos de presuntos padres que han sido hallados
luego de muchos aos.

58
 Para validar este enfoque de identificar abuelas con sus
nietos, King y sus colaboradores amplificaron las secuencias de tres
nios y sus tres abuelas maternas sin saber quien estaba
emparentado con quien. La prueba de ADNmt relacion sin
ambigedades a cada nio con su respectiva abuela. De esta forma,
luego de 1989, Las Abuelas incluyeron la informacin del ADNmt en
sus registros.
Hoy en da, los nietos/as-hijos/as de los desaparecidos/as,
han alcanzado la adultez y han obtenido independencia legal. A
pesar que la mayora de sus abuelas han muerto, pueden an
descubrir el paradero de sus familias as como su identidad biolgica
a travs de la data de HLA y ADNmt que Las Abuelas recopilaron.

Preguntas de la lectura

1. Qu significan las siglas HLA?

2. Cules son las limitaciones de la identificacin de relaciones

de parentesco o filiacin utilizando los marcadores de HLA?

3. Por qu el genoma mitocondrial proporciona una herramienta

ms poderosa para estos fines?

59
BIBLIOGRAFA

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