BIOQUIMICA CLINICA

SEMINARIO-3

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

Prof. Lidn Badenes

Dept. Ciencias Biomdicas.
lidon.badenes@uch.ceu.es
ELECTROFORESIS DE
PROTEINAS
FUNDAMENTO TEORICO
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
PATRONES ELECTROFORETICOS
FUNDAMENTO TERICO

La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas por la

carga elctrica.

Se basa en el movimiento de las molculas cargadas en un campo
elctrico.

La electroforesis se aplica en el campo de la Bioqumica a la
separacin de compuestos que poseen grupos ionizables
(aminocidos, pptidos, protenas, cidos nucleicos) teniendo en
cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del
medio en que se encuentren.

Si la molcula tiene carga positiva migrar hacia el ctodo (polo
negativo) y si tiene carga negativa, hacia el nodo (polo positivo)

La fuerza inica de la solucin tampn tiene una importancia
fundamental en la electroforesis, puesto que cuando es baja,
permite velocidades de migracin de los solutos ms rpidas y con
menor desprendimiento de calor.

En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se

coloca en un campo elctrico se mover hacia uno u otro electrodo
dependiendo de:

1) su carga elctrica,

2) su tamao,

3) la intensidad del campo elctrico

4) la temperatura del medio.

Las protenas estn compuestas de aminocidos que poseen
grupos ionizables (COO- y -NH3+) y por ello pueden encontrarse
cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer
elctricamente neutras segn la proporcin de los diversos grupos
ionizados a un determinado pH.

El punto isoelctrico es el pH al que una sustancia anftera tiene

carga neta cero.

A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula.

Por debajo del punto isoelctrico las protenas estarn cargadas

positivamente y por encima del punto isoelctrico negativamente.

Las protenas de suero se pueden separar mediante esta tcnica.

Sus puntos isoelctricos estn entre 4,9 (Albmina) y 7,4 (Gamma-
globulinas).

Al realizar la electroforesis con un tampn de pH = 8,6, todas las
protenas del suero tendrn carga negativa.

La albmina, al tener el punto isoelctrico ms alejado del pH, tiene
ms carga negativa y avanza ms rpido, quedando ms cerca del
polo positivo que las gamma-globulinas, que migran muy poco por
ser el pH prximo a su punto isoelctrico.

Las restantes protenas sricas quedan situadas entre estas dos.

A mayor carga y menor tamao, ms velocidad de migracin.
MATERIAL Y REACTIVOS

Soporte: papel, acetato de celulosa, gel de agarosa, poliacrilamida y
electroforesis capilar

Cubeta de electroforesis

Aplicador

Fuente de electroforesis

Tampn: Tris -hipurato, pH=8,6 (buffer)

Solucin de tincin: negro amido, rojo ponceau
negro amido: (0.5 gr+ 45ml metanol+ 45 ml agua + 10ml cido
actico )

Solucin de lavado: metanol 99 %

Solucin transparentadora:
(10 ml cido actico 80 % + 50 ml metanol)
(8 ml cido actico glacial + 42 ml metanol)
ELECTROFORESIS EN ACETATO DE
CELULOSA

El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con
propiedades de adsorcin mnimas, por lo que se evita la formacin
de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien
definidas.

Otras ventajas son:

1) La separacin es muy rpida

2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeas

3) Las tiras pueden hacerse transparentes

4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes
separados

5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos
radiactivos
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1)Electroforesis:

- Humedecer en tampn las tiras de acetato de celulosa 10 minutos
antes de su uso, para su equilibrado.

- Eliminar el exceso de tampn poniendo las tiras entre dos hojas de
papel de filtro, con cuidado de que no lleguen a secarse por
completo.

- Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la
superficie penetrable quede hacia la parte superior. El lado
penetrable es el que se ve cuando la tira se coloca en vertical
delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha

- Depositar con ayuda del aplicador las muestras de suero en cada
tira, en el extremo prximo al ctodo.

- Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial y un
tiempo determinado.
2.- Revelado:

- Finalizada la separacin, depositar las tiras en una cubeta con
solucin de tincin, de modo que queden cubiertas por el lquido,
durante 10 minutos.

- Lavar las tiras en solucin de transparentado hasta que se
observen bien las bandas de protena sobre un fondo blanco.

3.- Clculo del porcentaje de las protenas:

- Colocar las tiras bien pegadas y estiradas sobre un cristal. Se
pasa un rodillo para eliminar las burbujas.

Se espera a que estn bien secas y se ponen en un
fotodensitmetro para su posterior escaneo y lectura de las bandas
obtenidas

-El resultado de la lectura son los datos proporcionales en % de
cada una de las fracciones proteicas obtenidas.
VALORES DE NORMALIDAD
Los valores de normalidad tienen una ligera variacin dependiendo de la
tcnica pero en lneas generales podran ser:

Porcentajes
Albmina: 54.7 - 68.7%
Alfa1- globulina: 3.7 - 7.8%
Alfa2- globulina: 5.2 - 10.7%
Beta globulina: 8.6 - 13.7%
Gammaglobulina 10.7 - 19.3%

Valores absolutos

Protena total: 6.4 - 8.3 g/dl

Albmina: 4.18 - 5.25 g/dl
Alfa-1 globulina: 0.28 - 0.59 g/dl
Alfa-2 globulina: 0.39 - 0.81 g/dl
Beta globulina: 0.65 - 1.04 g/dl
Gammaglobulina: 0.81 - 1.47 g/dl
 FRACCIONES

Albmina srica

Banda mayoritaria del total del proteinograma representando ms
del 50% del mismo en condiciones normales.
Est integrada por la protena ms abundante del plasma.
Su inters se centra en las hepatopatas (cirrosis) y nefropatas
(sndrome nefrtico), donde est disminuida.

Pre-albmina (retinol binding protein)

Es una banda difusa, por delante de la albmina, poco visible y que
est constituida por dos protenas con un gran inters para la
valoracin nutricional como son la prealbmina y la protena fijadora
del retinol.

Por sus bajas concentraciones, se requieren tcnicas
inmunolgicas para valorar su cuanta.
Fraccin 1 globulinas

Aumenta durante los procesos inflamatorios agudos,
neoplasias,infartos y necrosis

1 glicoprotena cida

1 antitripsina

1 antiquimiotripsina

1 fetoprotena

La disminucin de las protenas alfa-1 globulinas pueden

indicar:
- Deficiencia de alfa-1 antitripsina
Fraccin 2 globulinas

Aumenta en el sndrome nefrtico, ictericia obstructiva,

tuberculosis,inflamacin crnica

2 macroglobulina ( Sndrome nefrtico)

Ceruloplasmina ( transporte Cu2+).( Enfermedad de Wilson)
Haptoglobina ( transporte Hb)
Aumenta en inflamacin, neoplasias
Disminuye en la hemlisis intravascular, anemia perniciosa
Protena C reactiva (<6 mg/100 ml). Inflamaciones e infecciones

La disminucin de las protenas alfa-2 globulinas puede

indicar:
Hemlisis
Fraccin globulinas

Aumento moderado en sndrome nefrtico, ictericia obstructiva,

cirrosis, tuberculosis, inflamacin crnica

Fibronectina
Aumenta en sndrome nefrtico, colestasis, neoplasias.
Disminuye en politraumatismos, quemaduras extensas, sepsis
Transferrina (200-400 mg/100ml) Se encarga del transporte de Fe .
Aumenta en anemias
Disminuye en el sndrome nefrtico y hepatopatias
Transcobalamina. Se encarga del transporte de B12.
 Complemento C3 C4
Aumentan en procesos inflamatorios agudos.
Disminuyen en reacciones autoinmunes

La disminucin de las protenas beta globulinas puede indicar:

 Trastorno de coagulacin congnito, Coagulacin intravascular
diseminada
Fraccin globulinas

 La fraccin de las gammaglobulinas supone entre 10.7 y

19.3% del total de protenas del suero.
 Se pueden detectar :
 IgM (40 230) mg/dl
 IgA (70 400 mg/dl)
 IgG (700 1600 mg/dl)
 IgE (hasta 100 U/l)

IgM aparece aumentada tras procesos agudos virales

IgA aumenta en enfermedades intestinales autoinmunes (Crohn)

IgG aumenta en enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso,

hepatitis crnica activa, infecciones bacterianas crnicas)

IgE est aumentada en enfermedades con un componente alrgico

(eczema, asma, infeccin parasitaria)
PATRONES ELECTROFORETICOS

Los patrones electroforticos surgieron de la asociacin que se

observ entre las diversas enfermedades y determinadas
alteraciones en el proteinograma.

Actualmente, como tenemos la posibilidad de cuantificar las

protenas individualmente, el inters por el conocimiento de los
patrones electroforticos ha disminuido; no obstante, no hay que
olvidar que una observacin detallada del proteinograma aporta una
informacin semicuantitativa sobre las protenas mayoritarias de
cada banda.
Patrn normal
Patrn inflamatorio
Cirrosis heptica
Sndrome nefrtico
Mieloma mltiple/gammapatia
monoclonal