Obtencin de embrioides de Agave tequilana

Weber a partir de explantes de raz

LIBERATO PORTILLO(*) Y FERNANDO SANTACRUZ-RUVALCABA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS BIOLGICAS Y AGROPECUARIAS, UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA, MXICO
(*) Email: portillo@cencar.udg.mx

RESUMEN
Los tallos de las plantas de Agave tequilana Weber cultivar azul se utilizan para producir la
bebida alcohlica denominada tequila, el rea de cultivo de esta planta abarca todo el estado
de Jalisco y parte de otros cuatro estados de Mxico, donde en la dcada pasada ms del
20% de 200 millones de plantas se reportaron enfermas; el sistema de propagacin por hi-
juelos de rizoma del cultivar se consider factor de proliferacin de las enfermedades. Como
alternativa en la obtencin de plantas sanas se tienen las herramientas de la biotecnologa
vegetal; en este sentido se presenta un protocolo de embriognesis somtica indirecta para la
especie en cuestin, con base en explantes de hoja y raz en combinacin con diversas dosis
de reguladores de crecimiento. Los resultados muestran que es posible obtener embrioides
a partir de explantes de raz similar que de explantes de hoja, adems se observaron varias
ventajas cualitativas con el uso de explantes de raz sobre protocolos que usan explantes de
hoja; entre ellos se resaltan la poca presencia de fenoles oxidados y la ausencia de hiperhi-
dricidad en los callos de raz, caractersticas deseables no solo para los cultivos in vitro en
medio slido, sino en especial para el uso relativamente nuevo de biorreactores con sistemas
de inmersin temporal.
Palabras Clave: Embriognesis somtica, genotipo, fenoles, reguladores de crecimiento

ABSTRACT
The stems of Agave tequilana Weber cultivar azul plants are used to elaborate the alcoholic bev-
erage named Tequila, the cultivating area of this plant includes all the state of Jalisco and part
of another four Mexican states, where in last decade more than 20% out of 200 million plants
were reported attacked by disease, the system of propagation by rhizomatous shoots was considered
factor of proliferation of diseases. As alternative in the obtaining of healthy plants are the plant
biotechnology tools; in this way a protocol of indirect somatic embryogenesis for the species is pre-
sented, in base to explants from leaf and root and diverse doses of growth regulators. The results
show that it is possible to obtain embryoids from explants of root, similar to those from leaf ex-
plants, besides several qualitative advantages with root explants were found against protocols that
use leaf explants. There were found less presence of oxidized phenols and the absence of hyperhid-
ricity in root calli, desirable characteristics not only for the in vitro cultures on solidied media,
but in especially for the relatively new use of bioreactors with temporary immersion systems.
Key Words: Genotype, phenols, growth regulators, somatic embryogenesis

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Agave tequilana Weber cultivar azul es una planta mexicana cuyo tallo se usa para la elabora-
cin de la bebida alcohlica denominada tequila (Figura 1a), el rea de cultivo de esta planta,
conocida como maguey tequilero, abarca todo el estado de Jalisco y algunos municipios de
otros cuatro estados de Mxico, que se incluyen dentro de la Denominacin de Origen para
la produccin de tequila (Consejo Regulador del Tequila, 2006). Su propagacin comercial
es mediante hijuelos de rizoma (Figura 1b), la cual se ha sealado como factor en la prolife-
racin de enfermedades en el cultivar (Fucikovsky, 2004), fenmeno que en la dcada pasa-
da afect a ms del 20% de 200 millones de plantas establecidas (Fucikovsky, 2002), motivo
por el que se consideran como alternativas de obtencin de plantas sanas a las herramientas
de la biotecnologa vegetal (Portillo & Santacruz-Ruvalcaba, 2006). Existen reportes sobre
diversos procesos morfognicos en varias especies de Agave (Binh et al., 1990; Nikam, 1997;
Hazra et al., 2002; Martnez-Palacios et al., 2003; Nikam et al., 2003), en particular para A.
tequilana se tienen desarrollados sistemas de proliferacin de yemas (Castro-Concha et al.,
1990; Robert et al., 1992) y embriognesis somtica (Rodrguez-Garay et al., 2003; Porti-
llo & Santacruz-Ruvalcaba, 2006), realizados a partir de explantes provenientes de tejidos
areos, pero ninguno a partir de tejido radicular. Adems, debido a que diferentes fuentes
de explantes de un mismo vegetal responden distintamente a un proceso morfognico dado
(George, 1993), se consider oportuno desarrollar un protocolo de obtencin indirecta de
embrioides (embriones somticos) a partir de explantes de raz, para comparar su factibili-
dad de uso frente a los explantes de hoja que se usan de forma comn. Asimismo, probar
diversos genotipos, ya que la embriognesis somtica se considera dependiente del tipo de
genotipo (Portillo, 1997) y tambin debido a que la posibilidad de seleccionar un genotipo
altamente embriognico se incrementa al evaluar varios genotipos (Compton, 1994). Por lo
tanto, el objetivo planteado para el presente estudio, consisti en comparar la obtencin de
embrioides en cuatro genotipos de Agave tequilana Weber cultivar azul a partir de explantes
de hoja y raz, as como la inuencia de los tipos de raz.

MATERIALES Y MTODOS
Para el establecimiento del material vegetal, los explantes utilizados provinieron de hijuelos
de rizoma y semillas de Agave tequilana Weber cultivar azul, para el caso de los rizomas, las
hojas externas e internas se eliminaron hasta llegar al tallo central y quedar un cubo de 3
cm por cada lado que contena el domo del meristemo. Todo el material vegetal (rizomas y
semillas) se estableci en condiciones aspticas, para lo cual se llev a cabo un lavado con
jabn y agua destilada, para posteriormente pasarlo a una inmersin con agitacin en alco-
hol de 96 por 10 seg, seguido de una inmersin con agitacin en hipoclorito de sodio al
3% adicionado de dos gotas de detergente lquido durante 10 min, luego de los cuales se
lavaron tres veces con abundante agua estril. Las partes afectadas de los hijuelos de rizomas
por el proceso de desinfeccin se eliminaron con ayuda de bistur y nalmente el material se
estableci en medio MS (Murashige & Skoog, 1962) para su brotacin y/o germinacin.
Los explantes establecidos se multiplicaron en medio MS adicionado de 10 mg/l de 6-ben-
cilaminopurina (BA) durante 6 meses, cuyos brotes se individualizaron para permitir su

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enraizamiento en medio de cultivo MS carente de reguladores de crecimiento. Con estos

materiales se realizaron dos experimentos para conocer la factibilidad embriognica de los
explantes de raz, el primero consisti en comparar la obtencin de embrioides entre ex-
plantes de raz y hoja provenientes de un genotipo de semilla detectado como altamente
embriognico (ES4), con base en siete dosis de reguladores de crecimiento para la induc-
cin embriognica. Cada uno de los catorce tratamientos que se conformaron (siete con
explantes de hoja y siete con explantes de raz), contaron con seis repeticiones para dar un
total de 84 unidades experimentales, que se repartieron en 42 cajas de petri desechables de
10 cm de diam de doble cavidad. Los medios de induccin se elaboraron con las sales nu-
tritivas MS, vitaminas L2 (Phillips & Collins, 1979), suplementados con las siete dosis de
reguladores de crecimiento del cuadro 1 y solidicados con 6 g/l de Phytagel. El segundo
experimento contempl analizar la obtencin de embrioides en tres tipos de races (termi-
nales, intermedias y basales) procedentes de cuatro diferentes genotipos, dos de hijuelos de
rizoma y dos de semillas, respectivamente (A11H2, C4, ES4 y G1), estructurados en doce
tratamientos que se repitieron cinco veces, lo que arroj un total de 60 unidades experi-
mentales colocadas en cajas de petri desechables de 10 cm de diam. El medio de induccin
se elabor de manera similar al primer experimento pero suplementado de 2 mg/l de cido
2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y 0.3 mg/l de BA (Rodrguez-Garay et al., 2003). Para
ambos experimentos cada repeticin cont con 25 ml de medio de cultivo, aquellas con
explantes de hoja se conformaron con cuatro trozos de hoja recin emergida de 1 cm2 cada
uno, en tanto que las repeticiones con explantes de raz estuvieron conformadas por cuatro
trozos de raz terminal de 1 cm de longitud cada uno. El periodo de induccin tom 30 d,
luego del cual el callo embriognico generado se transri a medio de expresin elaborado
como los de induccin pero sin reguladores de crecimiento y suplementado con 250 mg/l
de glutamina y 500 mg/l de hidrolizado de casena. Todos los medios de cultivo se ajustaron
a pH 5.8 y se incubaron a una temperatura de 27 2C con un fotoperodo de 16 h de luz
uorescente (25 m/seg/m2). La variable de respuesta estuvo constituida por el nmero de
embrioides obtenidos por repeticin, se evalu con base en Anlisis de Varianza (ANVA) de
doble interaccin y comparaciones mltiples de medias con la prueba de Diferencia Mni-
ma Signicativa (Montgomery, 1991). Para los anlisis estadsticos se emple el paquete de
cmputo Statgraphics Plus 4.0 (Statistical Graphics Corp.).

RESULTADOS Y DISCUSIN
La generacin de callo se form primero en los explantes provenientes de hoja que aquellos
de raz, pero luego de 20 d ambos tipos de explantes mostraron callo, aunque en menor
cantidad en los explantes de raz. Adems, el aspecto de los callos generados en ambos tipos
de explantes fue muy diferente, el callo obtenido de hoja fue ms variable que aquel de raz,
ya que present callo conformado desde clulas muy friables hasta muy compactas, adems
en la coloracin del callo friable se observaron sectores traslcidos con tonos de verde a
amarillo, en tanto que los callos compactos por lo regular fueron amarillo-cremoso, pero
cuando se mostraban hiperhdricos stos eran verdes (Figura 2a). En cambio el tipo de callo

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generado de raz, aunque tambin friable o compacto, su aspecto era ms lustroso, nunca
hiperhdrico, ni se observaron sectores verdes, siempre fue amarillo-cremoso (Figura 2b). El
hecho que el aspecto de los callos de hoja sea tan variable, est relacionado con los diferentes
tipos celulares que conforman los tejidos de la hoja, donde estn activos los cloroplastos,
es por ello que el color verde no se observ en los callos de raz, ya que sus clulas no estn
activas hacia la fotosntesis. Por otra parte, la expresin de embrioides surgi de manera
simultnea en ambos tipos de explantes (guras 2c y d), con la tpica asincrona comn en
los procesos de embriognesis somtica, por lo que fue posible ubicar desde las primeras
divisiones asimtricas hasta la germinacin de embrioides maduros en un mismo callo.
Los resultados estadsticos del primer experimento indicaron que la obtencin de embrioi-
des entre los explantes de raz y hoja, no dirieron estadsticamente (P = 0,9374), en tanto
que las dosis de induccin resultaron con alta signicancia (P = 0,0000), donde aquella
conformada por 3 mg/l de 2,4-D ms 0,3 mg/l de BA result con la mayor generacin de
embrioides (Cuadro 1). Entre la interaccin de las dosis de induccin y el tipo de explante
no se encontraron diferencias signicativas (P = 0,9999). Estos resultados en conjunto con
las observaciones cualitativas hechas durante el desarrollo experimental son destacables por
cinco importantes observaciones; primero, los explantes de raz se consideraban con poca
viabilidad para generar embrioides maduros, a pesar de que su callo presentaba polaridad en
sus primeras divisiones asimtricas (Portillo, 1997), proceso bsico de la embriognesis so-
mtica (Dodeman et al., 1997; Gutirrez-Mora et al., 2004). La segunda observacin fue el
hecho que los explantes de raz no mostraron la tpica oxidacin de fenoles que caracteriza a
los cultivos de explantes de hoja (Figuras 2c y d), comparacin ms evidente al deshidratarse
los medios de cultivos, donde los fenoles oxidados se mostraron en color marrn (Figura
2 e). La poca presencia de fenoles en los explantes de raz, resulta ventajoso al prolongar el
tiempo de uso del medio de expresin, lo que favorece un trasplante de embrioides ms ma-
duros que los provenientes de hoja. Una tercera observacin fue que los callos de explantes
de raz no mostraron hiperhidricidad, como ocurre en los callos de explantes de hoja, lo que
promete ser parte de la solucin a la alta incidencia de hiperhidricidad en los embrioides
(50 a 80%), cuando se lleva a cabo el proceso de embriognesis somtica en sistemas de in-
mersin temporal (Portillo & Santacruz-Ruvalcaba, 2006). La cuarta observacin es sobre
la generacin de embrioides en los explantes de raz, respecto de los explantes de hoja, que
no se afect signicativamente, aun cuando el contenido endgeno de los reguladores de
crecimiento se considera diferente en los diversos tipos de explantes (George, 1993). Final-
mente, la quinta observacin se reere a la importancia del cido 2,4-D en la obtencin de
embrioides en A. tequilana, ya que de las dosis evaluadas, aquellas suplementadas con este
regulador de crecimiento tuvieron un desempeo ms destacable hacia la embriognesis
somtica (Cuadro 1).
El segundo experimento solamente indic alta signicancia estadstica entre los genotipos
evaluados (P = 0,0000) que de acuerdo con la prueba de Diferencia Mnima Signicativa se
formaron dos grupos, uno constituido por el genotipo ES4 que produjo la mayor cantidad
de embrioides y otro grupo con el resto de los genotipos que se comportaron poco embrio-

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gnicos (Cuadro 2). El comportamiento diferencial de los genotipos hacia diversos procesos
morfognicos, ha sido reportado en varias especies monocotiledneas (Tokuhara & Masahi-
ro, 2003; Ma et al., 2004; Sato et al., 2004) incluido Agave (Portillo, 1997), lo que supone
ajustar los protocolos para cada genotipo en particular.
El hecho de que el tipo de raz haya resultado no signicativo (P = 0,6942), favorece el uso
de prcticamente cualquier edad de raz como explante para generar embrioides, ya que
las races terminales al estar en los extremos de la radcula, son de reciente emergencia, en
tanto las intermedias y basales, ubicadas en las secciones primarias del sistema radicular, les
corresponde una edad ms avanzada.

CONCLUSIONES
La contribucin ms importante del presente escrito, radica en demostrar la factibilidad de
obtener embrioides a partir de explantes de raz, cuyas plntulas presentan la misma morfo-
loga y desarrollo que aquellos provenientes de explantes de hoja (Figuras 3a y b), con lo que
se ampla la gama de uso de explantes para embriognesis somtica en A. tequilana.
Tambin es importante resaltar las observaciones de que los explantes de raz mostraron
poca presencia de fenoles oxidados y prcticamente ausencia de callo hiperhdrico, com-
portamientos que resultan atractivos para el escalamiento de la embriognesis somtica en
biorreactores de inmersin temporal.

AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa de Mxico por el soporte otorgado a Liberato
Portillo, becario con nmero de registro 70575, estudiante del Doctorado en Ciencias en
Procesos Biotecnolgicos del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenieras de la
Universidad de Guadalajara, Mxico.

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Cuadro 1
Nmero de embrioides de Agave tequilana Weber cultivar azul obtenidos de las siete dosis de reguladores
de crecimiento utilizados en el primer experimento.

Dosis de reguladores de crecimiento Nmero de embrioides por repeticin

3 mg/l de cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) 7,25 b*

3 mg/l de 2,4-D + 0,3 mg/l de 6-benciladenina 80,40 a
3 mg/l de cido naftalenactico (ANA) + 1 mg/l de 2,4-D 5,83 b
3 mg/l de ANA + 1 mg/lde cido indolbutrico 0,42 b
3 mg/l de ANA + 1 mg/l de cido indol-3-actico 0,00 b
3 mg/l de ANA + 1 mg/l de cido 4-amino3,5,6-tricloropicolnico 4,75 b
3 mg/l de ANA + 1 mg/l de cido 2,4,5-triclorofenoxiactico (2,4,5-T) 1,50 b

*Letras iguales no son estadsticamente diferentes con la prueba de Diferencia Mnima Signicativa ( = 0,05)

Cuadro 2
Nmero de embrioides de Agave tequilana Weber cultivar azul obtenidos de los cuatro genotipos utilizados
en el segundo experimento.

Genotipo Nmero de embrioides por repeticin

A11H2 3,78 b*
C4 1,67 b
ES4 101,73 a
G1 0,13 b

*Letras iguales no son estadsticamente diferentes con la prueba de Diferencia Mnima Signicativa ( = 0,05)

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1a 1b

Figura 1
Proceso de cosecha y plantacin de Agave tequilana Weber cultivar azul.
a) Jimado del maguey tequilero para cosechar el tallo que se utiliza en la elaboracin del tequila.
b) Establecimiento en suelo de hijuelos de rizoma de maguey tequilero.

2a 2b 2c

2d
2e

Figura 2
Diferentes aspectos del proceso de embriognesis somtica de Agave tequilana Weber cultivar azul en dos
tipos diferentes de explantes. a) callo embriognico proveniente de explante de hoja, b) callo embriognico
proveniente de explante de raz, c) embrioides provenientes de explante de hoja, d) embrioides provenientes
de explante de raz, e) cajas de petri que muestran del lado izquierdo el medio de cultivo con la coloracin
tpica causada por la presencia de fenoles oxidados donde se cultivaron explantes de hojas. El lado derecho
muestra donde se cultivaron explantes de raz. Barras = 1 cm.

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3a 3b

Figura 3
Plntulas de Agave tequilana Weber cultivar azul provenientes de embrioides que muestran ambas un de-
sarrollo normal de hojas y raz luego de cinco meses de su germinacin en medio de expresin.
a) Plntula de embrioide obtenido de explante de hoja.
b) Plntula de embrioide obtenido de explante de raz. Barras = 1 cm.

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