INTRODUCCION

El anlisis de laboratorio clnico, es una variante de la qumica analtica

cuantitativa, que busca establecer la cantidad de un analto especfico en una
muestra biolgica, para lo cual puede usar:

Mtodos clsicos, como la gravimetra y la volumetra

Mtodos instrumentales, que dependen de la propiedad del analito, o de la
muestra que lo contiene que vaya a ser analizada, siendo los mtodos
fotomtricos los ms utilizados, en estos estn incluidos:
Colorimetra,
Espectrofotometra UV- visible,
Espectrometra de emisin,
Reflectancia,
Nefelometra
Turbidimetria;
as, como los mtodos polarometricos, los mtodos electroqumicos,
conductimtricos, los mtodos cromatogrficos (de particin y HPLC) y
electroforticos, entre otros.

Mtodos semicuantitativos, los cuales no establecen cantidades absolutas

sino relativas, generalmente comparadas contra un standard tomado como
unidad de referencia. Generalmente son reacciones a la gota.

FOTOMETRIA

1. CONCEPTOS BSICOS DE FOTOMETRA

INTERACCIN DE LA ENERGA RADIANTE CON LA MATERIA

La energa radiante puede manifestarse como movimiento ondulatorio

(radiacin electromagntica) o como si estuviese integrada por un flujo de
partculas discretas o paquetes ondulatorios energticos denominados
fotones, es decir, presentando propiedades electromagnticas y energticas.
Estos dos modelos de comportamiento de la energa radiante no son
excluyentes, sino que son complementarios.

PARAMETROS ONDULATORIOS

AMPLITUD (A): Longitud del vector elctrico/magntico en el mximo de la

onda, y est relacionada con la intensidad de la radiacin.
LONGITUD DE ONDA (): Es la distancia entre dos puntos de un ciclo
completo del movimiento ondulatorio. Se suele expresarse en nanmetros
para las radiaciones visible y ultravioleta en angstrom.
PERODO (T): Es el tiempo en segundos que tarda una partcula en realizar
una vibracin completa.
FRECUENCIA (f): Es el nmero de oscilaciones completas que una
partcula realiza en una unidad de tiempo.
 VELOCIDAD DE PROPAGACIN (): Es el resultado del producto de la
frecuencia y la longitud de onda. Se mide en metros por ciclo (m/ciclo).Es
un parmetro que depende del medio de propagacin de la radiacin.
NMERO DE ONDA: Es el parmetro descriptivo cuyo valor es la inversa
de la longitud de onda. Se mide en cm-1.
POTENCIA (P): Es la energa de haz de radiacin que llega hasta un rea
determinada en la unidad de tiempo (un segundo).

Parmetros ondulatorios

Existe una relacin entre la energa radiante y la longitud de onda de la

radiacin que se expresa en la ecuacin:

Se denomina espectro electromagntico al conjunto de radiaciones

electromagnticas y se ha dividido en varias regiones, de acuerdo con la
longitud de onda.

Rayos X (1 100nm).
Ultravioleta (100 390 nm).
Visible (390 700 nm).
Infrarrojo (700 100 000 nm).
Microondas (100 000 1 000 000 nm).

En la regin visible, la luz se descompone en colores, la luz blanca contiene

todo el espectro de longitud de onda. Si interacciona con una molcula puede
ser absorbida.
2. LEYES DE ABSORCIN

Las leyes de absorcin se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad

del absorbente y el grado con el que es absorbida la energa radiante. En
trminos generales, puede decirse que hay 2 variables capaces de afectar al
grado de absorcin. La concentracin del absorbente y la longitud del trayecto
que el rayo luminoso recorre a travs de la solucin.

Existen 2 trminos que se usan ampliamente en la espectrometra por

absorcin

A. TRANSMITANCIA (T)

Es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector, una

vez que ha atravesado la muestra, y la cantidad de luz que incidi sobre ella. El
valor de la trasmitancia de un objeto se puede determinar segn la siguiente
expresin:

I = Es la cantidad de luz transmitida por la muestra.

I0 =Es la cantidad total de luz incidente.

Muchas veces encontramos la transmitancia expresada en porcentaje, segn la

frmula:

Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente.

Para evitar este error se hace una primera medida con una solucin de
referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que
intervienen en la lectura menos el que vamos a medir.

Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta
medida inicial y se harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del
blanco.

B. ABSORBANCIA (A )

La absorbancia es un concepto ms relacionado con la muestra, es la cantidad

de intensidad de luz que se hace incidir en la muestra. Est definida como:
Donde
I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y
I0 es la intensidad de la luz incidente.

La medida de la absorbancia de una solucin es usada con mucha frecuencia

en laboratorio clnico, para determinar la concentracin de analitos tales como
colesterol, glucosa, creatinina y triglicridos en sangre. Cada uno de estos
analitos se hace reaccionar qumicamente con determinados compuestos, a fin
de obtener una solucin coloreada. A mayor intensidad de color, mayor ser la
absorbancia de la solucin en una determinada longitud de onda.

La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentracin del

analito.

Para medir esta absorbancia, se hace incidir un haz de luz con determinada
intensidad y longitud de onda, sobre la solucin, y se mide la luz transmitida al
otro lado de la cubeta que contiene dicha solucin. Estas tcnicas estn
comprendidas en el rea de la espectrofotometra.

LEY DE LAMBERT

Expresa la proporcionalidad que existe entre la absorbancia de una solucin

coloreada y la distancia que recorre la luz monocromtica en ella (sin variacin
de la concentracin).

LEY DE BEER

Expresa la proporcionalidad que existe entre la absorbancia de una solucin

coloreada y la concentracin de esta en un haz de luz monocromtica (sin
variacin de la longitud que recorre el haz).
Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert y Beer:

Io e I = Intensidad de la luz incidente e Intensidad de la luz transmitida,

despus de haber atravesado la cubeta de la muestra, respectivamente.

A = Absorbancia. Medida de la absorcin de la luz. Tambin se conoce como

densidad ptica o extincin.
Es una magnitud adimensional. Generalmente los espectrofotmetros
expresan la absorbancia hasta las milsimas. Suelen ser magnitudes que
oscilan entre 0 y 1, aunque en determinados anlisis en lo que se mide la
variacin de absorbancia con el tiempo se pueden obtener valores
superiores.
 b = Trayecto ptico. Su valor esta estandarizado en 1 cm. Es la longitud de la
muestra que atraviesa la radiacin cuando esta se encuentra depositada en
una cubeta. Es una medida estandarizada para todos los
espectrofotmetros.
c = Concentracin de la sustancia (analito) en la muestra suele expresarse en
moles/L (con la absortividad molar) o g/L (si se emplea la absortividad)
= Coeficiente de extincin molar (si c = moles/L), y se designa como
Coeficiente de extincin (si c =g/l).
La constante Epsilon (), se define como la absorcin de una solucin de
concentracin 1 mol/l a una determinada longitud de onda y un espesor de
cubeta de 1 cm.

LIMITACIONES A LA LEY DE LAMBERT- BEER

La relacin directamente proporcional entre la absorcin de la radiacin por

parte del analito y su concentracin en la muestra no es lineal en cualquier
situacin. Existen una serie de condiciones limitantes o desviaciones de esta
ley que dependen de determinadas caractersticas del analito o que tienen un
origen instrumental o qumico, en las que la relacin no presenta linealidad.
Estas desviaciones son:

I. DEPENDIENTES DE LAS CARACTERISTICAS DEL ANALITO

Cuando la concentracin del analito (tomos, molculas e/o iones) es

relativamente pequea y adems, existen en la muestra concentraciones
elevadas de electrolitos que son capaces de alterar, mediante
interacciones electrostticas, la absortividad molar del analito.Este
hecho ocasiona una alteracin en la absorcin de la radiacin que la
desva la linealidad.
Cuando la concentracin del analito es elevada.Se considera que, si
supera el valor 0,01 M, la distancia media entre las especies
responsables de la absorcin disminuye tanto como para alterar la
distribucin de la carga elctrica y, por tanto su capacidad de absorcin
de la radiacin.
Cuando existen impurezas (sustancias o situaciones distintas al analito)
en la muestra que presentan absorcin o emisin de la radiacin a la
longitud de onda del anlisis.

II. LIMITACIONES QUIMICAS

Cuando por las caractersticas de la tcnica o del analito, se produce una

interaccin qumica (asociacin, disociacin o reaccin) de este con otras
sustancias de la muestra o de los reactivos, resultando un compuesto que
presenta un espectro de absorcin distinto al del analito.

III. LIMITACIONES INSTRUMENTALES

Cuando por las caractersticas del aparato ptico de medida, se detecta

una cantidad de radiacin diferente a la absorbida por el analito.
El cumplimiento de la ley de Lambert Beer nicamente es estricto cuando la
radiacin incidente es monocromtica, hecho que es muy difcil de conseguir
dado que los dispositivos que discriminan las longitudes de onda no son tan
selectivos. Esta desviacin de la ley no es perceptible cuando el rango de
longitudes de onda discriminadas es relativamente estrecho.
 3. ESPECTROFOTOMETRIA

La espectrofotomtrica se refiere a los mtodos cuantitativos, de anlisis

qumico que utilizan la luz para medir la concentracin de las sustancias
qumicas .Se conocen como mtodos espectrofotomtricos y segn sea la
radiacin utilizada como espectrofotometra de absorcin visible (colorimetra),
ultravioleta, infrarroja.

Se distinguen dos tipos de aparatos:

COLORIMETRO O FOTOMETROS: Se designa un instrumento para medir la

absorcin, el ojo humano funciona como el detector con ayuda de uno o ms
patrones de comparacin de color. Un fotmetro consta de una fuente un filtro y
un transductor fotoelctrico as como un procesador de seales y una pantalla
donde se leen los resultados. Los fotmetros de filtro se encuentran en el
comercio para efectuar mediciones de absorcin en las regiones ultravioletas,
visible e infrarroja, as como emisiones y fluorescencia en las primeras dos
regiones de longitud de onda.

ESPECTROFOTOMETRO: Es un espectrmetro equipado con una o ms

rendijas de salida y transductores fotoelctricos que facilitan la determinacin
de la relacin entre la potencia radiante de dos haces en funcin a la longitud
de onda como en la espectroscopia de absorcin.

Esquema de espectrofotmetro.

COMPONENTES DEL ESPECTROFOTOMETRO

I. FUENTE DE RADIACION VISIBLE:

Existen dos tipos de fuente de radiacin comnmente empleadas para la

obtencin de radiacin visible, muy ligadas entre si. La primera a tener en
cuenta es la lmpara de Wolframio, la cual se fabrica cuidadosamente con un
 filamento de wolframio encerrado en una ampolla de vidrio en cuyo interior se
ha hecho el vaco.
Las lmparas de este tipo se regulan bien con estabilizadores de potencia de
corriente alterna.La intensidad de la lmpara es funcin de la temperatura del
filamento de wolframio, la cual a su vez es funcin de la corriente que pasa a
travs del filamento .El flujo de corriente se controla de tal forma para que la
intensidad de la lmpara sea constante con el tiempo.La intensidad de la
lmpara, aun a temperatura de filamento constante, es funcin de la longitud de
onda

Lmpara de Wolframio

Hace unos pocos aos se introdujeron las lmparas de halgenos y de cuarzo

como fuente de radiacin .Estas lmparas de halgeno son lmparas de
filamento wolframio en las cuales la ampolla es de cuarzo.
Estas lmparas as mismo tienen iodo a baja presin y operan a temperatura
mas altas que las lmparas ordinarias de wolframio. La cubierta de cuarzo es
necesaria para resistir a altas temperaturas .El iodo se incluye en la lmpara
para proteger el filamento de wolframio y mantenerlo en buen estado.
Una fuente de radiacin visible menos comn es el diodo emisor de luz
(LED).Estas fuentes se fabrican con materiales semiconductores tales como
arseniuro de galio, fsforo de galio o fofoarseniuro de galio.
La energa radiante emitida por una lmpara de diodo emisor de luz (LED)
generalmente abarca un amplio intervalo de longitudes de onda.

II. SELECTORES DE LONGITUD DE ONDA O ANALIZADORES

La longitud de onda requerida para las medidas puede aislarse por medio de
un filtro o de un monocromador. Los sistemas de seleccin de longitud de onda
se catalogan por su amplitud de banda o paso de banda, que es la anchura en
nanmetros de la curva de transmitancia en el punto medio del pico.

Amplitud de la banda.
Existen dos tipos de analizadores:

a. FILTROS

Los filtros pticos se pueden utilizar cuando se necesita trabajar con un corto
intervalo de longitudes de onda. Cuando se utiliza un filtro para seleccionar las
radiaciones, los instrumentos que llevan tales filtros se llaman fotmetros de
filtros.
Los instrumentos empleados para tales aplicaciones se denomina
espectrofotmetros o espectrmetros. Dichos instrumentos tienen un
dispositivo llamado monocromador que selecciona luz monocromtica de la luz
policromatica incidente.
Un monocromador permite trabajar a cualquier longitud de onda simplemente
cambiando a voluntad de posicin el selector de la radiacin. Los
monocromadores son dispositivos un tanto caros, de ah el que muchos
aparatos utilicen filtros.
Cuando el analista que emplea esta absorciometra sabe que deber llevar a
cabo el anlisis de muchas muestras de un mismo tipo, entonces se
aconsejara usar un fotmetro de filtros. En este caso el fotmetro con el filtro
adecuado, se dedicara a un nico tipo de anlisis. Los fotmetros de filtros son
relativamente baratos por lo que la justificacin de su uso es fcil.
Existen dos tipos de filtros de uso ms comn. Los primeros a considerar son
los llamados filtros de vidrio, los cuales se fabrican con dos tipos de vidrio
especial. Consta de 2 piezas de vidrio, la primera de ellas por ejemplo no dejan
pasar radiaciones por debajo de 450nm y sin embargo transmite el 100%de
intensidad de las radiaciones de longitud de onda superior a 550 nm.
El segundo vidrio acoplado al anterior transmite el 100% de la intensidad de las
radiaciones de longitud de onda inferiores a 450 nm y no se transmite ninguna
radiacin de longitud de onda superior a 550nm.La combinacin de ambos
vidrios da lugar a un filtro que transmite radiaciones en un intervalo de
longitudes de onda 450 nm a 550 nm.Los filtros de interferenciales se utilizan
cuando la monocromaticidad obtenida mediante el uso de filtros de vidrio no es
la suficiente para el anlisis a realizar. Los filtros interferenciales se fabrican
con fluoruro de magnesio (MgF2) plata (Ag).

b. MONOCROMADORES

Un monocromador es un dispositivo ptico que permite, por medio de un

mecanismo, seleccionar y transmitir una estrecha banda de longitudes de onda
ya sean electromagnticas o no a partir de una fuente emisora que produzca
una amplia gama de longitudes de onda. El nombre monocromador se deriva
de las races griegas mono- que significa uno, y chroma, color; el sufijo -ador
derivado del latn denota la realizacin de una accin Un monocromador puede
utilizar cualquiera de los fenmenos de refraccin, por ejemplo utilizando un
prisma; o de difraccin, utilizando una red de difraccin; para separar
espacialmente los diferentes colores de la luz.
Usualmente el monocromador cuenta con un mecanismo que permite dirigir el
color seleccionado hacia una ranura de salida, por donde el rayo de luz
monocromtico puede abandonar el dispositivo. Por lo comn la red o el prisma
son utilizados en modo reflectivo.
 Las REDES DE DIFRACCION se fabrican haciendo una serie de incisiones o
surcos longitudinales con una punta de diamante sobre una placa de vidrio o
aluminio.Estos surcos se hacen con un dispositivo de manera muy cuidadosa
de tal forma que los espaciados entre los surcos y cortes deben tener un perfil
especfico.

III. CUBETAS

Hay dos tipos de cubetas comunes, las cilndricas y las cuadrangulares.

Las cubetas cilndricas son semejantes a tubos de ensayo, pero han de
construirse de una manera aproximadamente cuidadosa a fin de evitar
imperfecciones, o variaciones tanto en el espesor como en el dimetro de las
mismas. Los tubos de ensayo regulares ,sin embargo ,nunca debern sustituir
a las cubetas cilndricas .
Las cubetas cuadradas tienen la ventaja de que el valor del espesor de cubeta
es perfectamente conocido y tambin puede ser medido, emplendose dicho
valor para los clculos .En cualquier caso el material empleado deber ser
siempre transparente a la radiacin deseada.
Los vidrios borosilicatados constituyen un buen material empleado en la
construccin de cubetas para la regin visible del espectro electromagnetico.
Transmiten bien las radiaciones comprendidas entre 350 nm y 2.000 nm. El
cuarzo es tambin un material muy adecuado pues transmite las relaciones
comprendidas entre 200 nm y 3.300 nm. Sin embargo, es algo caro por lo solo
debe emplearse cuando sea necesario .Algunos plsticos transmiten bien en la
regin visible, por lo que tambin se emplean en la citada regin.
Las cubetas deben mantenerse limpias y evitar que se araen en la medida de
los posible. Asimismo se debe evitar coger las cubetas por las caras
pticamente transparentes, dejando as las huellas dactilares. Es aconsejable
no utilizar papel filtro, pauelos o felpa para secar la cubetas, ya que estos
contribuyen a rayarlas y deteriorarlas, siendo fuente de error en las medidas
analticas.

IV. DETECTORES DE LA INTENSIDAD DE RADIACION

Existen varios tipos de detectores:

 A) CELULAS FOTOVOLTAICAS

La fotoclula tambin se denomina clula fotovoltaica o clula de capa de

barrera. Est constituida por una lmina fina de un semiconductor, el selenio,
colocada entre dos lminas de hierro y plata.
La lamina de hierro es lo bastante gruesa como para dotar al dispositivo de la
suficiente fortaleza mecnica, lmina de plata es semitransparente y
proporciona el contacto elctrico con la de selenio; la lmina constituye el otro
contacto elctrico.
El conjunto formado por las tres lminas tiene dos conexiones entre
conductores de distintas caractersticas, la unin del hierro y la del selenio y la
plata. Las uniones que se producen entre conductores de distinta naturaleza
siempre generan una energa elctrica potencial; por tanto la clula
fotovoltaica es una clula que genera su propio voltaje. No se requiere aportar
energa; la suma de estos dos potenciales de unin proporciona todo el voltaje
requerido.
En resumen, las clulas fotovoltaicas son econmicas y dan proporcionalidad
lineal entre la intensidad de radiacin y la respuesta del detector.

B) FOTOTUBOS
El segundo detector de radiaciones visibles que consideraremos a continuacin
es el fotodiodo de vaco ms frecuentemente denominado fototubo. El fototubo
se basa en el efecto fotoelctrico capaz de transformar energa radiante en
energa elctrica. Un fototubo consta de un terminal que acta como nodo y
una cavidad cncava que es el fotoctodo. El fotoctodo se construye con un
electrodo cncavo de nquel plateado .La lamina de plata se oxida entonces
para producir algo de xido e plata. Luego el electrodo se cubre con una capa
de cesio y se trata trmicamente resultado es un fotoctodo con una superficie
capaz de absorber los fotones convenientemente.
El fototubo es un buen detector de radiaciones visibles .Presenta una respuesta
lineal al incrementarse la intensidad de radiacin. Desgraciadamente el
fototubo no responde a todas las longitudes de onda por igual.

C) TUBOS FOTOMULTIPLICADORES
Los fotomultiplicadores son detectores rapidos. Los cambios de intensidad de
la radiacin generan cambios de intensidad en la fotocorriente casi de forma
instantanea. Los comercializados cubren un intervalo de longitudes de onda de
180 nm a 1.200 nm. Sin embargo, al igual que en el caso de los fototubos, un
nico fotomultiplicador no cubre un intervalo completo.

V. PROCESADORES DE SEALES Y SISTEMAS DE LECTURA

Por lo general, el procesador de seal es un dispositivo electrnico que

amplifica la seal elctrica proveniente del transductor .Adems, puede
cambiar la seal .Cambiar la fase de la seal y filtrarla para eliminar
componentes indeseables. Adems, el procesador de seales ejecuta
operaciones matemticas con la seal, como derivacin, integracin o
conversin a un logaritmo.
Se puede encontrar diferentes tipos de dispositivos que despliegan la
informacin en los instrumentos modernos. Entre ellos se incluyen el medidor
 de DArsonval, medidores digitales, registradores, tubos de rayos catdicos,
paneles de pantallas de cristal lquido y pantallas de computadora.

INTERFERENCIA EN LAS DETERMINACIONES

ESPECTROFOTOMETRICAS

Las interferencias en las medidas espectrometricas son de dos tipos:las

estticas y las cinticas. Las interferencias estticas se producen por
sustancias presentes en el espcimen que no experimentan variacin durante
la reaccin analitica.Los ejemplos mas tpicos de este tipo de interferencias en
los laboratorios clnicos son la ictericia, la lipemia y la hemlisis.La correccin
se realiza utilizando un blanco con el espcimen al que no se aade alguna de
las sustancias necesarias para la reaccin.

La interferencia cintica se origina a causa de sustancias presentes en el

espcimen que reaccionan con algn componente de la mezcla de reaccin,
de forma que la importancia relativa de su contribucin depende del tiempo, as
como de su concentracin.

VI. REGISTRO Y PRESENTACION DE DATOS

La seal elctrica producida, es amplificada por el procesador de seal, que la

transforma en dgitos numricos que nos pueden indicar la absorbancia o la
transmitancia del analito en la muestra o su concentracin, dependiendo de
cmo se programe el espectrofotmetro en cada caso ya que debe contar con
la capacidad de realizar operaciones matemticas.
CONCEPTO DE CALIBRACION

Se entiende por calibracin al conjunto de operaciones que establece, bajo

condiciones especficas, la relacin entre las seales producidas por un
instrumento analtico y los correspondientes valores de concentracin o masa
del juego de patrones de calibrado.

CALIDAD DE UNA CALIBRACION

La calidad de la determinacin de una concentracin no puede ser mejor que la

calidad intrnseca de la calibracin. Los factores que determinan la calidad de
una calibracin son:

LA PRECISION DE LAS MEDIDAS: Estimada a travs de la repetitividad y la

reproducibilidad de las medidas. La repetitividad se evala a travs del
clculo de la desviacin estndar relativa de la medida de los patrones
calibrado. En la prctica puede ocurrir que la repetitividad para los patrones
sea ms pequea que para las muestras, por lo que ser necesario fabricar
patrones similares a las muestras o agregar el analto a las mismas.

EXACTITUD DE LOS PATRONES: El valor de concentracin o masa asignado

a cada patrn trae aparejado un error pequeo si es preparado a partir de
reactivos puros. Este error en general se desprecia, frente al error en las
medias de las seales producidas por el instrumento.

VALIDEZ DE LA CALIBRACION: Generalmente es el factor mas importante.

Cuando se calibra un instrumento se debe tener una razonable certeza de que
este responder de igual manera a los patrones as como a las muestras,
aunque estas tengan una matriz relativamente diferente. Si estas diferencias
son muy grandes, pueden llegar a invalidar el proceso de calibracin. Es
necesario estar completamente seguro de que el calibrado es valido antes de
utilizarlo para obtener el valor de concentracin de muestras incgnitas.

ESPECTRO DE ABSORCIN DE UNA SUSTANCIA.

El color es el resultado de la incidencia de la luz blanca sobre un objeto o

sustancia, la misma absorbe algunas longitudes de onda y refleja otras, el
resultado es que las longitudes de onda reflejadas son percibidas por nuestros
ojos y nuestro cerebro lo traduce en una tonalidad dentro de un rango de color
determinado.

Por ejemplo en el caso de la clorofila, esta tiene tres variantes Clorofila a, b y

c; estas absorben luz en los extremos de la escala de luz visible, violeta, azul y
rojo; pero muy poco en verde por ello es que vemos las hojas verdes, la
tonalidad del color observado depende de las longitudes de onda que en
definitiva emite cada tipo de hoja; y su intensidad de la cantidad de fotones
reflejados.
Entonces cuando analizamos un objeto debemos establecer que longitudes de
onda absorbe y emite, para ello debemos contruir la curva de absorcin del
mismo, para ello tomamos una solucin coloreada y medimos la absorbancia a
diferentes longitudes de onda determinando el pico de mxima absorcin, que
se convierte en caracterstico de la misma y en casos de haber interferencia se
busca el siguiente de mayor absorcin para tomarlo como caracterstico.

Por ejemplo,

En el caso de la clorofila a el pico caracterstico es alrededor de 425 nm, la

clorofila b y c tambin absorben algo a esa longitud de onda pero en menor
intensidad.
En el caso de la clorofila b el pico caracterstico es alrededor de 470 nm, la
clorofila c tambin absorbe una cantidad importante a dicha longitud de onda,
por ello preferimos tomar como caracterstico el pico de alrededor de 645 nm.

Para evitar las interferencias realizaremos una evaluacin comparando como

absorbe una muestra pura de concentracin conocida contra las muestras
desconocidas.
 CURVA DE CALIBRACIN

El mtodo consiste en emplear soluciones de concentracin conocida y

crecientes denominadas estndares o patrones a las ciales se les determinar
su absorbancia, se grafican en un sistema de coordenadas donde en el eje X
se grafican las concentraciones y en el eje Y la absorbancia.

Los puntos resultantes de la interseccin de ambos ejes, se unen trazando una

curva entre ellos, la lnea obtenida se denomina curva de calibracin o curva
estndar y sirve para estimar la concentracin de una muestra cualquiera de la
misma sustancia que los patrones conociendo la absorbancia.

Ejemplo
Considrese los siguientes datos
Solucin Concentracin del analito Absorbancia

Estndar 1 1 mg / 100 ml 0.17

Estndar 2 3 mg / 100 ml 0.51

Estndar 3 6 mg / 100 ml 1.03

Blanco 0 0.00
Muestra 1 ? 0.89

Cul es la concentracin del analito en la muestra 1?

Solucin:

Paso 1
usando papel milimetrado establecer la escala:
eje x = concentracin ( en este caso tenemos como valor mximo 6
mg/100 ml podemos tomar concentraciones crecientes hasta 7 mg/100
ml)

eje y =Absorbancia (en este caso tenemos como valor mximo 1.03
unidades de absorbancia podemos tomar hasta 1,2 unidades)

1.2 Nota: observe que los intervalos

entre unidades son de la misma
proporcin tanto en el eje x como en
Absorbancia 1 el eje y..

0.8 La escala se escoge en funcin del

rango de variacin de los datos y de
la exactitud que queramos asignar a
0.6 nuestra grafica

0.4
0.2
0
CONCENTRACION: mg/100 ml
1 2 3 4 5 6 7
 Absorbancia 1.2
1
La unidad mayor
de divisin del eje
y es 0.2 unidades
0.8
de Absorbancia

0.6

La unidad menor de 0.4 La unidad mayor

divisin del eje y es de divisin del eje
0.04 unidades de x es 1 mg/ 100 ml
absorbancia 0.2
0
1 2 3 4 5 6 7
La unidad menor de
divisin del eje x es mg/100 ml
0.5 mg/ 100 ml

Paso 2:
Ubicamos los puntos segn los datos
Absorbancia

1.2
1 X: 6mg/100 ml

Y: 1.03
0.8
0.6
X: 3mg/100 ml

0.4 Y: 0.51

0.2 X: 1mg/100 ml

Y: 0.17
0
1 2 3 4 5 6 7
mg/100 ml
 Paso 3

Trazamos la recta entre los puntos, buscando que esta incluya lo mejor posible
a todos

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1 2 3 4 5 6 7

En este momento hemos construido la curva estndar

Paso 4

Buscamos la concentracin de la muestra problema (muestra del paciente)

Para nuestra caso la muestra del paciente tiene una absorbancia de 0.89
entonces y trazamos la recta hasta cortar la curva patrn, luego trazamos la
perpendicular hasta cortar el eje x, en ese momento encontramos la
concentracin de la muestra

1.2
1
0.89 0.8
0.6
0.4
0.2
0
1 2 3 4 5 6 7
5.25 mg/100 ml
La respuesta grafica es que la concentracin de la muestra 1 es 5.25 mg/100
ml

FACTOR DE CALIBRACIN

El factor de calibracin es un trmino que relaciona la concentracin de un

estndar o patrn de una sustancia con su absorbancia.
Nos sirve para calcular la concentracin de una muestra desconocida al
multiplicar la absorbancia de la misma con este factor de calibracin

Sabemos que:
A
A = C b => = b
C

Entonces podemos aplicar esta relacin para el estndar y para la muestra

problema
Astandard Amuestra
= b = b
Cstandard Cmuestra

Astandard Amuestra
=
Cstandard Cmuestra

Cstandard Cmuestra
=
Astandard Amuestra

Como los datos del standard son conocidos los tomamos como referencia y lo
denominamos Factor de Calibracin (Fc)

Cmuestra
Fc =
Amuestra

Por tanto

Fc Amuestra = Cmuestra
 PARTES DEL ESPECTROFOTMETRO

Selector de modo de operacin:

Trasmitancia
Absorbancia
Factor de calibracin
Pantalla digital Ajuste del factor
Concentracin
Incremento / disminucin

Porta muestra
(se usa tubo
spectronic)

Selector de
longitud de onda

Swicht de encendido /
ajuste a 100% transmitancia
ajuste a 0% transmitancia
 PARAMETROS ANALITICOS MS EMPLEADOS

SENSIBILIDAD

La sensibilidad de un equipo instrumental, tcnica o mtodo analtico se define

como la capacidad de poder diferenciar dos seales muy parecidas del mismo
analito.
Si se presenta en forma grfica la variacin de la seal que se registre con
respecto a la concentracin de un analito en diferentes soluciones patrn, el
mtodo, tcnica o equipo instrumental mas sensible es el que de lugar a una
recta de calibrado de mayor pendiente.

Rectas de adicin de soluciones patrn del analito. Clculo de la sensibilidad

LIMITE DE DETECCION (LD)

El lmite de deteccin de una tcnica, mtodo y/o instrumental se define como

la mnima cantidad o concentracin del analito que es capaz de detectar para
un nivel de confianza dado.

Esta magnitud depende de las fluctuaciones de la seal del blanco.

Para su clculo, se realiza una recta de adicin, (y=a +bx), con soluciones
patrn del analito en una matriz similar a la muestra biolgica (por ejemplo, si
se van a analizar sueros, preparar las soluciones en suero fisiolgico) y se
registran al menos 20 medidas del blanco.La menor concentracin de patrn
que se distingue del blanco al menos en tres veces el valor de su desviacin
estndar, se considera como el lmite de deteccin.
La frmula para hallar el lmite de deteccin es:

LIMITE DE CUANTIFICACION

Su valor es el de la menor concentracin de patrn que se distingue del blanco

al menos en diez veces el valor de su desviacin estndar .El concepto es
similar al lmite de deteccin.

La frmula para hallar el lmite de cuantificacin es:

LINEALIDAD

La capacidad de un mtodo de anlisis, dentro de un determinado intervalo, de

dar una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la
calidad del analito que se habr que determinar en la muestra de laboratorio.
Los lmites de linealidad son los limites experimentales de concentraciones
entre los que pueden aplicarse un modelo de calibracin lineal con un nivel de
confianza conocido.
 Zona de respuesta del equipo que
cambia linealmente con la
concentracin, por lo tanto es el
rango vlido de trabajo

Linealidad

SELECTIVIDAD

La selectividad indica el grado de ausencia de interferencias, debidas a otras

especies contenidas en al matriz de la muestra.
Cuando mayor es la selectividad de un mtodo y/o tcnica analtica, menos se
ve afectado por las interferencias que daran lugar a una lectura errnea del
parmetro que se este analizando.

Esta magnitud suele expresarse en trminos relativos, como coeficientes de

selectividad (CS) de las especies interferentes con respecto al analito (A) y su
valor es el que indica la ecuacin.

CSI.A = Coeficiente de selectividad de la especie interferente I con respecto al

analito A.

b1 b2 Valores de las respectivas pendientes de las rectas de adicin

obtenidas empleando concentraciones crecientes de la especie interferente que
se pretende evaluar y del analito.
PRECISIN

Es el grado de concordancia entre un grupo de resultados obtenidos al aplicar

repetitiva e independientemente el mismo mtodo analtico a alcuotas de la
misma muestra.
La precisin se expresa en trminos de coeficiente de variacin cuyo valor
porcentual es el de:

La precisin es mayor cuanto menor es el valor del coeficiente de variacin.

Un resultado elevado del coeficiente de variacin suele indicar la presencia de
errores aleatorios. La precisin de un conjunto de resultados se caracteriza por
la desviacin estndar.

La precisin se divide en 2 categoras:

A) REPETIBILIDAD: La ms pequea precisin esperada, da una idea del

tipo de variabilidad que se puede esperar cuando el mtodo es desarrollado en
el mismo laboratorio, por el mismo analista, usando el mismo equipamiento en
un intervalo de corto tiempo.

B) REPRODUCIBILIDAD: La precisin ms grande esperada. Una muestra

analizada por varios laboratorios, distintos analistas, diferentes equipamientos,
mayor periodo de tiempo.

La repetibilidad y la reproducibilidad dependen de la concentracin del analito.

EXACTITUD

Es el grado de concordancia entre el valor medido y el valor aceptado o

verdadero.
El valor real de la concentracin del analito es conocido en el material de
referencia.
Un resultado inexacto al analizar el material de referencia suele indicar la
presencia de errores sistemticos en la medida.
Los errores sistemticos se clasifican en:

Errores Instrumentales: Circuito electrnico, fugas y/o perdidas, alteracin

del fluido, voltaje, prdida del calibrado.
Errores Personales: Fallo en la destreza y forma de trabajo del operador.
Errores del mtodo: Prdida del analito, alteraciones del analito, reacciones
qumicas incompleta o alteradas, inestabilidad de los reactivos.
La exactitud se expresa en trminos de error, error que puede ser absoluto
(Ea) o relativo (Er) se expresa como la diferencia entre el valor obtenido en la
analitica, x y el considerado como real, xr.El error relativo (Er) se expresa como
porcentaje del absoluto con respecto al valor real.
 PARTE EXPERIMENTAL

Indicaciones generales

La prctica se llevara a cabo en dos sesiones, en la primera se realizar la

actividad I y II

En la segunda sesin se realizar la actividad III y IV

Equipos:

Espectrofotometro
Balanza

Materiales (por mesa de trabajo y por cada sesin)

Beaker 50 ml 02
Fiolas de 100 01
Pipetas de 5 ml 02
Propipeta 01

Reactivos (en cada sesin)

Permanganato de potasio
Agua destilada

I. Identificacin del espectrofotmetro

Observa la explicacin del profesor de las partes del espectrofotmetro,
su uso y cuidados.
Anote.

II. Determinacin de la longitud de onda de mxima absorcin.

1. Preparar una solucin de permanganato de potasio de 5 ppm
(solucin coloreada)
2. Leer la solucin en el espectrofotmetro a 420, 440, 460, 480, 500,
520, 540, 560 580, 600, 620 640 640 y 660 nm. Anote la absorbancia
en cada caso
3. Grafique la curva de absorcin o curva espectral en un papel
milimetrado colocando en el eje X la longitud de onda y en el eje Y la
absorbancia
4. Determinar la longitud de onda de mxima absorcin, eligiendo el
punto donde se obtiene la mayor lectura de absorbancia.

III. Elaboracin de la curva y factor de calibracin

Recibir del profesor una solucin stock de permanganato de potasio y
proceder de la siguiente manera
 1. Prepare una batera de tubos de acuerdo al siguiente esquema:
Tubo 1 2 3 4
KMnO4 (aq) 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml
Agua 4 ml 3 ml 2 ml 1 ml
destilada
Calcule la concentracin de cada tubo

2. Realice la lectura del de absorbancia de cada tubo usando la longitud

de onda de trabajo encontrado en el experimento anterior
3. Realice la curva de calibracin en papel milimetrado colocando en el
eje X concentracin, en el eje Y absorbancia
4. Trace la curva caracterstica
5. Encuentre el factor de calibracin para la curva

IV. Determinacin de la concentracin de una muestra problema.

1. Recibir por parte del profesor una muestra de permanganato de
potasio de concentracin desconocida,
2. Mida la absorbancia de la muestra.
3. Encuentre la concentracin usando la curva de calibracin y el factor
de calibracin.
 ANEXO 1

EL PROBLEMA DE LOS COLORES EN LAS REACCIONES CON

DISOLUCIONES DE PERMANGANATO

Las disoluciones de permanganato potsico que tan frecuentemente se

utiliza para analizar los procesos redox, dado que sus cambios de color
son espectaculares, tienen dos grandes inconvenientes. La variacin de
color con el pH, en las reacciones redox en funcin de la zona de
dominio de cada especie y el enmascaramiento de los colores reales por
mezcla de las propias disoluciones.

El color caracterstico del permanganato potsico; el prpura, cambia a

verde al formar manganato potsico que rpidamente se desestabiliza tomando
diferentes formas1. Si pasa a dixido de manganeso, Mn(IV), el color puede ser desde
marrn muy oscuro hasta rojizo segn que est precipitado o en suspensin. Si se
transforma en Mn(III), el color es rosa-rojizo, si en Mn(II), prcticamente incoloro o
rosa muy plido en disoluciones concentradas. El color rojo que aparece primero y en la
frontera, cuando se reduce el permanganato potsico en medio cido, se debe a la
formacin de complejos acuosos de Mn3+, pero esta especie no es especialmente estable,
predominando el paso a Mn2+. Hay que tener en cuenta que mientras que el paso de
Mn7+/Mn3+ tiene un potencial normal de reduccin de 1,5V, tal como el del Mn3+/Mn2+,
el del Mn7+/Mn2+ es de 1,51V.La diferencia es muy pequea, de forma que la
interrelacin entre ambos procesos se va a dar siempre. Pero si el medio es muy bsico
podra formarse Mn(V)2 de color azul, o los hidrxidos de Mn(II) crema claro, o
Mn(III) crema mas oscuro. Por qu esa variacin de colores, que tanto llam la
atencin a los qumicos a lo largo de los ltimos tres siglos?

El ion permanganato, correspondiente a un Mn(VII), con estructura electrnica d0 ,

debera ser incoloro, tal como lo son los iones semejantes perclorato ClO4 - y sulfato
SO4 2- , sin embargo esto no es as debido a la transferencia de electrones p, desde los
orbitales del oxgeno a los d del Mn. Esta transicin electrnica, origina un enlace pi
que dar lugar a unas bandas electrnicas del estado slido, capaces de absorber en el
espectro visible (verde) (primera banda a 18.000 cm-1,responsable del color
caracterstico, debida a la transferencia de 2electrones desde los OM antienlazantes del
oxgeno) con lo cual emiten en el prpura. El desdoble energtico se mantiene en
disolucin acuosa. Todos los iones del manganeso con estructura tetradrica, esto es

1Fue Scheele el que en 1774 llam camalen mineral al manganato potsico verde, aunque
Pott, el qumico vidriero y ceramista alemn, fuera el que lo prepar en 1740, y antes Glauber
en 1659. Sin embargo la primera referencia al compuesto aparece en la Pyrotecnia de
Vanoccio Biringuccio, de 1540, en la que al referirse al trabajo de los vidrieros sajones deca..
Hay un mineral que se encuentra en las proximidades de Cara, en la alta Toscana, de color
marrn oscuro, que si se aade a sustancias vitrificables les da un bello color violeta. Los
maestros vidrieros obtienen con l vidrios de un violeta maravilloso. Los maestros alfareros lo
emplean tambin para decoraciones violetas.... Realmente estaba describiendo la oxidacin
del dixido de manganeso (pirolusita, braunstein de Basilio Valentino o magnesia migra de
Plinio) a permanganato.

2 El ion Mn(V), fue descubierto por Lux, en 1946

agrupaciones [MnO4] n-, producen colores intensos, por eso las disoluciones de
permanganato, manganato e hipomanganato, son tan llamativas. Sin embargo el
complejo que forma este ltimo no solo es poco estable a pH altsimo, sino que debe
estar por debajo de los 3C, por eso conviene cuando se hace reaccionar el
permanganato en esta situacin , tener las disoluciones en la nevera. En este caso el ion
Mn5+, est en d2, y la diferencia de energa para la transicin electrnica es de 11000
cm-1.

Los complejos de Mn2+ y Mn3+ son octadricos, y sus colores son mucho ms
plidos. Mn3+, tiene una configuracin en d4, lo cual implica la posibilidad de
formacin de complejos de alto spin con un ligando de campo dbil como es el
agua. La energa de desdoblamiento implica una absorcin sobre 20.000cm-1
(azul verdoso) con emisin en el rojo.

Dado que los potenciales

de reduccin varan con el
pH, segn ste, dominar
ms una forma u otra, lo
cual proporcionar unas
mezclas de colores
siempre difciles de
interpretar.

Obsrvense en los
diagramas de Pourbaix, la
variacin de los
potenciales de reduccin
de las especies que se
pueden formar en la
reduccin del
permanganato potsico, y
las zonas de pH donde
domina ms una especie
u otra

Adems, debido a la
capacidad de los iones manganeso, para formar complejos con el agua debido
a la capacidad aceptora de los orbitales d, sus colores en disolucin son por lo
general diferentes de los que tienen una vez aislados.

Todo un mundo de colores distintos a los esperados, hacen difcil la

interpretacin de las reacciones porque los colores naturales de dichos
productos podran confundirse con los producidos por las mezclas de colores
de otros productos como se aprecia en la simulacin presentada abajo. As el
rojo del Mn(III) podra interpretarse como producido por el dixido de
manganeso en suspensin. El azul del hipomanganato (Mn V) o tetraoxo-
manganato(V) de potasio, como el producido por la mezcla de prpura y verde.