Regulacin Gnica

Herramientas moleculares de la
Biotecnologa moderna

Ingeniera Gentica de Plantas - 2017

MSc. Giovanni Garro M

Regulacin en
procariotas

Regulacin
en eucariotas
Modificaciones post-transcripcionales
Regulacin Gnica
Regulacin Gnica
Dominios de Unin al ADN
Dedos de zinc en el ADN
 Herramientas
moleculares de la
introduccin de genes
forneos
en plantas
 Tecnologa del ADN recombinante

Una molcula de ADN hbrida formada por la unin de dos

secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos.

ADN de inters

ADN
Vector de clonacin
recombinante

Molcula de ADN recombinante. Tomado de

http://www.slideshare.net/mrtangextrahelp/18a-cloning 15
 Creacin ADN recombinante

Aislamiento de la secuencia de ADN de inters (ADN genmico,

ADNc o ADN copia o bien un ADN obtenido mediante PCR).

Unin de la secuencia de ADN de inters a un vector de

clonacin.

Introduccin de la molcula de ADN recombinante en una

clula husped que puede ser procariota (bacterias) o
eucariota (levaduras).
 Creacin ADN recombinante

Identificacin y purificacin de los clones que

poseen la molcula de ADN recombinante de
inters.

Crecimiento y amplificacin de las clulas husped

que incorporaron el ADN recombinante de inters.
 Creacin ADN recombinante

Pasos bsicos en la creacin de una molcula de ADN recombinante. Tomado de

http://www.zo.utexas.edu/faculty/sjasper/images/20.1.gif
 Enzimas de restriccin
Clonacin depende de las endonuclesas de
restriccin.

Enzimas que cortan la molcula de ADN en sitios

especficos denominados: sitios de restriccin
(secuencias de 4 8 pares de bases).

Mecanismo de defensa de las bacterias contra la

infeccin por fagos.
Bacterias metilan su propio ADN.
 Enzimas de restriccin

Reconocen secuencias de ADN palindrmicas.

Producen cortes en las dos cadenas.

Enzimas de restriccin:

Extremos cohesivos o pegajosos (EcoRI)

Extremos romos (Hind II)

 Enzimas de restriccin
Enzima de
restriccin

Secuencia
Enzima de
especfica
restriccin

Extremos cohesivos

Modo de accin de las enzimas de restriccin. Tomado de

https://biologiamolecularinteractiva.wordpress.com/about/enzimas-de-restriccion/
Enzimas de restriccin
 Enzimas de restriccin
A Sitio B Sitio
reconocimiento reconocimiento
EcoRI SmaI

corte corte

Extremos Extremos
Mecanismo de accin de las enzimascohesivos
de restriccin: (a) extremos cohesivos yromos
(b) extremos romos. Tomado y
modificado de http://synbio101.org/genetic-engineering/2-3-the-restriction-enzymes-as-molecular-scissors/
 Vector de clonacin
Molcula de ADN que vehiculizar al fragmento de
inters y permitir su multiplicacin.
Componentes:
Un origen de replicacin.
Un gen marcador.
Sitio de clonacin mltiple o sitio de restriccin
mltiple: segmento corto de ADN con muchos
sitios de restriccin distintos.
 Vectores de clonacin
Son molculas pequeas y bien caracterizadas

Tipo tamao de distintos vectores de clonacin

Plsmidos < 10 Kb
Bacterifagos 9-20 Kb
Csmidos 33-47 Kb
BACs 75-125 Kb
YACs 100 1000 Kb
 Vector clonacin

Sitio mltiple
de clonacin

Gen marcador
( por ejemplo seleccin a antibiticos)

Origen de replicacin

Diagrama bsico de un vector de clonacin bacteriano (plsmido). Tomado y

modificado de http://oregonstate.edu/instruct/bb331/lecture04/FigF6.html
 Plsmidos
Mleculas de ADN circular, doble banda, extracromosmicos.
Ventajas como vector de clonacin:
Tamao pequeo.
Circulares.
Replicacin independiente del ADN cromosmico.
Presencia mltiples copias en la clulas bacteriana.
Presencia de genes de resistencia a antibiticos.
Transferencia a la clula hospedera por transformacin utilizando choque de
calor o electroporacin.
 Vector de expresin
Estos vectores se caracterizan por poseer las secuencias
regulatorias (promotor, terminador, secuencias de unin al ARNr)
que permitan la adecuada expresin del gen de inters.

Asimismo, poseen un sitio de replicacin, un sitio de clonacin

mltiple (MCS) y un gen marcador que permita la seleccin de las
clulas que incorporaron el vector.
 Vector expresin
promotor
Gen de MCS
seleccin
terminador

Origen de
replicacin

Diagrama bsico de un vector de expresin. Tomado y modificado de

http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/constitutive_gene_expression_lactococcu
s.html
Paso 1: restriccin y ligacin del ADN
Vector de
clonacin
ADN de inters

Corte con
EcoRI
Sitios de Corte con
corte EcoRI

ADN ligasa

Plasmido recombinante
Paso 2: Introduccin del ADN en una clula hospedera

ADN de inters
Vector de
clonacin

Ligacin del vector

de clonacin Ligacin del ADN
de inters

Transformacin
Transformacin Transformacin

Crecimiento en el medio con No hay crecimiento en el

el antibitico medio con el antibitico
Paso 3: Seleccin de las clulas transformadas
 Vectores de expresin
Plsmidos
Son molculas de ADN circular.
Pueden ser introducidos en clulas por transformacin
bacteriana
Son considerados mini-cromosomas que se replican
autnomamente
Tamao promedio entre 1-200 Kpb
Poseen genes que pueden conferir resistencia antibitica a la
clula hospedera y ser seleccionados fcilmente.
Pueden replicarse en gran nmero dentro de la clula
hospedera
Mapa gnico
Plsmido de Agrobacterium rhizogenes

Plsmido desarmado con genes de seleccin

y de inters
 Construcciones gnicas

Son arreglos de un cassette de genes dentro de un vector

Contienen secuencias codificantes y no codificantes

Pueden expresarse de forma constitutiva, o sea siempre se

est expresando en la planta (ej: protena de estructura).

Pueden ser construcciones con expresin selectiva o dirigida

Requieren estudios previos de los mecanismos de expresin

y regulacin de la actividad de los genes utilizados.
Construcciones gnicas
 Nomenclatura de los vectores

La nomenclatura utilizada para las diferentes construcciones que

utilizan plsmidos posee varios trminos con un significado
especfico.

Por ejemplo el plsmido pMON200, quiere decir :

p= plsmido
MON = Monsanto o nombre de la empresa duea de la patente de su
diseo
200= identificacin especfica del plsmido
Mapa de pSH-s gus:

RB: right border- borde derecho

LB: left border- borde izquierdo
3g7: secuencia 3 no traducida del gen g7
gusA-int: secuencia codificante del gen gusA con un intrn de un gen vegetal.
p35S: promotor CaMV 35S
pNOS: promotor del gen nos (nopalina sintasa)
nptII: gen de resistencia a kanamicina
3ocs: secuencia 3 no traducida del gen ocs (octipina sintasa)
Sm: gen de resistencia a estreptomicina y espectinomicina
PVS1: ORI para Agrobacterium (amplio rango).
 Secuencias codificantes (genes)

Genes de seleccin
Son secuencias gnicas que codifican para algn gen con resistencia a
un producto, usualmente un antibitico u hierbicida.
Son necesarios para permitir el crecimiento exclusivo de las clulas
transformadas.

Gene Antibitico Herbicida

NptII Kanamicina
bar Basta
hpt Higromicina
 Secuencias codificantes (genes)
Genes reporteros
Son genes que codifican para una protena con alguna actividad
enzimtica que al estar en contacto con un sustrato qumico, presenta
una coloracin sensible a la luz visible o a luz ultravioleta o infrarroja.
La mayor parte requieren de ensayos destructivos del tejido en el cual
se realizan

Diaz et al, 2004

Secuencias codificantes (genes)

GUS reporter gene

Secuencias codificantes (genes)
GFP, RFP, YFP
green fluorecent protein
 Secuencias codificantes (genes)

Gen: LUC
Luciferasa.
 Secuencias codificantes (genes)

Genes de escisin

Modelo para la escisin de genes de seleccin basado en una

protena recombinasa (Ow et al., 2007; Ow, 2002).

Los sistemas de recombinasa tiene utilidad en la escisin de

copias redundantes o copias mltiples de genes ya que si estas
quedan colocadas como repeticiones indirectas frecuentemente
provocan silenciamiento del gen de inters
 Secuencias codificantes (genes)

Genes de inters
Son genes aislados y bien caracterizados, los cuales codifican para
protenas que actan en:

Mecanismos de resistencia a patgenos

virus, bacterias, hongos, insectos

Estrs ambiental
metales, agua, temperatura

Modifican caractersticas morfolgicas o de contenido en cultivos

 Secuencias no codificantes

Promotores
El control de la expresin gnica se puede llevar a cabo en tres
niveles:
a. El control de la transcripcin de un determinado gen
b. El procesamiento de los ARNm
c. El control de la traduccin:
c.1. A nivel de la estabilidad del ARNm
c.2. A nivel de la estabilidad de la protena formada

Promotores mas utilizados:

35S CaMV: Cauliflower mosaic virus
el promotor de la ubiquitina
el promotor de la actina.

Estas secuencias funcionan sobre todo a nivel de control transcripcional.

Secuencias no codificantes - Promotores
Diaz et al, 2004
Promotores
Promotores
Promotores y genes
Maz
 Secuencias no codificantes
Terminadores
Son secuencias no codificantes ubicadas en el extremo 3 y funcionan
sobre todo aumentando la expresin de los genes introducidos.
Dentro de los ms usados se encuentran:
CAT: cloranfenicol acetyl trasferasa
PI-II: potato proteinaza Innhibidor II
NOS: Nopaline sintasa (Agrobacterium sp.)

Aumentadores (Enhancers). Intrones

Son secuencias no codificantes que aumentan el poder del promotor y
la estabilidad del ARN, disminuyendo la degradacin del ARNm.