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INTRODUCCIN
MECANISMOS DE REACCIN
+ AH f XH + A (1)
Por lo tanto , muchos cientficos creen que son ms relevantes para las reacciones en
antioxidantes normalmente actan . Reactividad relativa en mtodos de sombrero est
determinada por el BDE del grupo H- donar en el potencial antioxidante , dominando
para los compuestos con BDE de ~ - 10 kcal / mol y el potencial de ionizacin ( IP )
de < -36 kcal / mol ( 7 ) . Mediciones de reactividad o capacidad antioxidante se basan
en la cintica de competencia. Reacciones HAT son solventes y pH independiente y
suelen ser bastante rpido , por lo general termin en segundos a minutos. La
presencia de agentes reductores , incluyendo metales , es una complicacin en los
ensayos de HAT y puede conducir a error alta reactividad aparente. Mtodos basados
en SET detectan la capacidad de un antioxidante potencial para transferir un electrn
para reducir cualquier compuesto, incluyendo metales, carbonilos, y los radicales ( 7 ) :
+ AH f X- + AH+ (1)
AH
+798 H2O
A + H3O+ (2)
N2 + 2ROO (14)
ROO
ROO
+ AH f ROOH + A
ROO
+ A98 fast
ROOA
S + hV + O2 f [S * O2] f S + + O2 -
El mecanismo completo de reaccin no es conocida (52). Hay dos tipos bsicos de los
radicales presentes en el sistema de medicin PCL: O2 - y los radicales luminales;
As, en el sentido ms estricto, la capacidad antioxidante representa una capacidad
antirradical (52). Los radicales libres se detectan con un reactivo de CL, luminol, que
acta como un fotosensibilizador, as como un reactivo de deteccin de radicales de
oxgeno. Los kits ACW y ACL proporcionados por el fabricante se utilizan para medir
AOC hidrfilos y lipfilos, respectivamente, de las muestras biolgicas. El AOC
hidrfilo se ensay por medio de la fase de latencia (L) en el segundo
donde L0 y L1 son los parmetros respectivos de la pieza y de la muestra. El AOC
lipfilo se ensay por el grado de inhibicin PCL (I), de acuerdo con el clculo
donde S0 es la integral bajo la curva en blanco y S es la integral bajo la curva de la
muestra. El cido ascrbico y Trolox se utilizan normalmente como reactivos de
calibracin para AOC hidrfilos y lipfilos, respectivamente, en rangos de medicin de
0-2 nmol. En contraste con otros ensayos AOC comnmente utilizados, el mtodo
PHOTOCHEM no se limita a un valor de pH especfico o intervalo de temperatura.
Ventajas / desventajas del Sistema PHOTOCHEM. Este sistema se comercializa como
un sistema de tiempo y rentable para la determinacin de la capacidad antioxidante
integral hacia superxido. Los reactivos para los ensayos lipoflicas e hidroflicas slo
estn disponibles por parte del fabricante. Debido a que slo una muestra se puede
medir en un momento, no es, en su configuracin actual, adaptable a un sistema de
ensayo de alto rendimiento. El ensayo se ha utilizado para medir la capacidad
antioxidante en las bayas (53) y otros alimentos. Los datos de Dr. Luke Howard
(Figura 2; comunicacin personal) sealan claramente que hay poca relacin entre
ORAC y los datos Photochem a travs de una variedad de alimentos. Esto no es
inesperado en la que se estn evaluando dos fuentes radicales completamente
diferentes. Ser necesario trabajo adicional con el fin de tener una mejor comprensin
de la importancia potencial de tener datos utilizando el radical superxido y cmo
podra ayudar en la relacin con los efectos potenciales en vivo. Croton o -Caroteno
El blanqueo por LOO : general Chemistry. Los carotenoides blanqueador a travs de
autooxidacin, la oxidacin inducida por la luz o el calor (54), o la oxidacin inducida
por radicales peroxilo (por ejemplo, AAPH o lpidos oxidantes) (55, 56), y esta
decoloracin puede ser disminuido o impedido por los antioxidantes clsicos que
donan tomos de hidrgeno para eliminar los radicales. Aunque -caroteno se utiliza a
menudo como el objetivo (54), su decoloracin en 470 nm puede ocurrir por mltiples
vas, por lo que la interpretacin de los resultados puede ser complicado. En contraste,
crocina, defendido por primera Bors y colegas (57), tiene reacciones sencillas y
blanqueadores slo por la va de oxidacin de radicales, por lo que se ha convertido
en el reactivo de eleccin sobre -caroteno.
La prdida de color es seguido pticamente a 443 nm (443) 89000 M-1 cm-1 en
tampn de fosfato, pH 7,4) (58), por lo que la reaccin no requiere instrumentacin
especial. Ventajas / desventajas de Croton blanqueo. Blanqueo de carotenoides es
fcilmente adaptable a la metodologa de alto rendimiento tales como microplacas. Sin
embargo, el control de la temperatura es crtica, y una mayor variabilidad en los pozos
externos se ha sealado (59). Debido a la necesidad de calcular la IC50, mltiples
diluciones de la misma muestra se deben ejecutar para que slo tres muestras se
pueden ejecutar por duplicado por placa. Limitaciones adicionales son que crocin no
est disponible comercialmente y as debe ser extrado, y no hay formatos estndar
para expresar estudio resultssevery tiene un mtodo diferente para calcular la cintica
de inhibicin. Lipoprotenas de baja densidad (LDL) Oxidacin: general Chemistry. Ex
vivo oxidacin de LDL fue desarrollado principalmente como una medida del estado
antioxidante, pero las aplicaciones de la oxidacin de LDL tambin se han adaptado
para evaluar la capacidad antioxidante en un sistema ms fisiolgicamente relevante.
LDL es aislado de muestras de sangre fresca, la oxidacin se inicia por Cu (II) o
AAPH, y la peroxidacin de los componentes lipdicos es seguida a 234 nm para
dienos conjugados o por los valores de perxido de hidroperxidos de lpidos (60, 61).
Ventajas / desventajas del ensayo FRAP. Tanto los ensayos de FRAP y TEAC
evolucionan a partir de ensayos que se basan en la hiptesis de que las reacciones
redox proceder tan rpidamente que todas las reacciones son completa dentro de 4 y
6 min, respectivamente, pero de hecho esto no es siempre cierto. FRAP resultados
pueden variar enormemente dependiendo de la escala de tiempo de anlisis. Fenoles
de reaccin rpida que se unen al hierro o descomponen a compuestos con menor
reactividad o diferente se pueden analizar mejor con tiempos de reaccin cortos, por
ejemplo, 4 min. Sin embargo, algunos polifenoles reaccionan ms lentamente y
requieren tiempos de reaccin ms largos para la deteccin, por ejemplo, 30 min. El
orden de reactividad de una serie de antioxidantes puede variar enormemente, e
incluso invertir, dependiendo del tiempo de anlisis (69). Pulido y compaeros de
trabajo (69) examinaron recientemente el ensayo FRAP de polifenoles dietticos en
agua y metanol. La absorcin (A593) aument lentamente para polifenoles tales como
el cido cafeico, cido tnico, cido ferlico, cido ascrbico, y quercetina, incluso
despus de varias horas de tiempo de reaccin. Por lo tanto, un punto final de la
absorcin de un solo punto no puede representar una reaccin completados. El
ensayo FRAP no mide antioxidantes tiol, tales como el glutatin. FRAP en realidad
mide slo la capacidad reductora basado en el ion frrico, que no es relevante para la
actividad antioxidante mecnicamente y camente fisiolgica. Sin embargo, en
contraste con otras pruebas de poder antioxidante total, el ensayo FRAP es simple,
rpido, barato y robusto y no requiere equipo especializado. El ensayo FRAP se puede
realizar utilizando mtodos semiautomticos o manuales automatizadas.
Segn Cano et al. (82), ABTS + puede ser generado por cualquiera de reaccin
qumica [por ejemplo, dixido de manganeso (83), ABAP (81), persulfato de potasio
(80)] o enzima reacciones [por ejemplo, metmioglobina (78), la hemoglobina, o
peroxidasa de rbano picante (82, 84)]. En general, la generacin de producto qumico
requiere un largo tiempo (por ejemplo, hasta 16 h para la generacin de persulfato de
potasio) o altas temperaturas (por ejemplo, 60 C para la generacin de ABAP),
mientras que la generacin de la enzima es ms rpido y las condiciones de reaccin
son ms leves. Cano et al. (85) peroxidasa de rbano picante utilizados para generar
ABTS + y han demostrado que la reaccin puede ser estudiada en un amplio
intervalo de valores de pH. Sin embargo, el mecanismo de reaccin puede cambiar
con el pH; por ejemplo, la transferencia de electrones se facilita a pH cido (8). Esta
variacin se ha adaptado tambin para medir antioxidantes selectivamente hidrfilos y
lipfilos mediante la ejecucin del ensayo en medios tamponados y disolventes
orgnicos, respectivamente (82, 86, 87), o mediante la particin de antioxidantes en
mezclas entre hexano y disolventes acuosos (18). Sin embargo, las reacciones
solubles en agua parecen ser favorecidos (88). Los mximos de absorcin (max) de
ABTS + mostraron ser en longitudes de onda de 415, 645, 734 y 815 nm. Entre ellos,
415 y 734 nm fueron adoptados por la mayora de los investigadores para supervisar
espectrofotomtricamente la reaccin entre los antioxidantes y ABTS + (87). En
trminos de mtodos de cuantificacin, la mayora de los mtodos revisados recientes
miden la disminucin de absorbancia de ABTS + en presencia de muestra de prueba
o Trolox en un punto de tiempo fijo (4-6 min) y, a continuacin capacidad antioxidante
se calcul como equivalentes de Trolox. Ventajas / desventajas de TEAC. Debido a
que el ensayo TEAC es operacionalmente simple, se ha utilizado en muchos
laboratorios de investigacin para el estudio de AOC. Se han reportado valores TEAC
de muchos compuestos y muestras de alimentos (66-68, 89-91). ABTS + reacciona
rpidamente con los antioxidantes, tpicamente dentro de 30 min. Se puede utilizar
sobre un amplio rango de pH y se puede utilizar para estudiar los efectos del pH sobre
los mecanismos antioxidantes (8). Tambin, ABTS + es soluble tanto en disolventes
acuosos y orgnicos y no se ve afectado por la fuerza inica, por lo que se puede
utilizar en mltiples medios para determinar tanto las capacidades antioxidantes
hidrfilos y lipfilos de extractos y fluidos corporales (92). TEAC reacciones pueden
ser automatizados y adaptados a las microplacas (55, 73, 93), fluya de inyeccin (10,
94), y para flujo detenido (95). El radical ABTS utilizado en ensayos de TEAC no se
encuentra en la biologa de los mamferos y por lo tanto representa una fuente de
radicales "no fisiolgico". Termodinmicamente, un compuesto puede reducir ABTS +
si tiene un potencial redox inferior a la de ABTS (0,68 V). Muchos compuestos
fenlicos tienen bajos potenciales redox y por lo tanto pueden reaccionar con ABTS
+. Adems, la reaccin TEAC puede no ser la misma para reacciones lentas, y puede
tomar mucho tiempo para llegar a un punto final. Por lo tanto, mediante el uso de un
punto final de corta duracin (4 o 6 min), uno puede ser la lectura antes de que se
termin la reaccin y el resultado en valores TEAC bajados. Van den Berg et al. (81)
concluy que "la evaluacin cuantitativa de la capacidad antioxidante utilizando el
TEAC puede ser problemtico o incluso imposi- ble, pero puede ser utilizado para
proporcionar un orden de clasificacin de los antioxidantes". 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH) Ensayo general Chemistry. El DPPH (Figura 6) radical es uno de los pocos
radicales orgnicos de nitrgeno estables, que lleva un color prpura intenso. Est
disponible comercialmente y no tiene que ser generada antes del ensayo como ABTS
+. Este ensayo se basa en la medicin de la capacidad reductora de antioxidantes
hacia DPPH . La capacidad se puede evaluar por resonancia de spin electrnico
(EPR) o mediante la medicin de la disminucin de su absorbancia. El ensayo de
decoloracin ampliamente utilizado fue reportado por primera vez por los compaeros
de trabajo (96) Brand-Williams y. Ensayos de antioxidantes se basan en la medicin
de la prdida de color DPPH a 515 nm despus de la reaccin con compuestos de
ensayo (97), y la reaccin se controla por un espectrmetro eter. El porcentaje de
DPPH restante se calcula como :
El ensayo de DPPH se
considera que est basado principalmente en una reaccin ET, y la abstraccin de
hidrgeno-tomo es una ruta de reaccin marginal (2). Ventajas / desventajas del
ensayo DPPH. La prueba es simple y rpida y slo necesita un espectrofotmetro UV-
vis de realizar, lo que probablemente explica su uso generalizado en el cribado
antioxidante. Sin embargo, la interpretacin es complicada cuando los compuestos de
ensayo tienen espectros que se superponen DPPH a 515 nm. Los carotenoides, en
particular, interfieren (98). El uso de DPPH para medir AOC est plagada de muchos
inconvenientes. El ensayo es
% DPPH
AE) 1 / EC50TEC50
4296
y peroxinitrito, porque estos son activos en las clulas y tejidos de plantas y animales
por igual, y es evidente que no todos los antioxidantes se comportan de la misma
hacia diferentes fuentes de radicales. No solo ensayo puede ser considerado un
"ensayo total capacidad antioxidante" a pesar de que se puede realizar tanto en una
solucin acuosa y en un entorno lipfilo. Sin embargo, para dilucidar plenamente un
perfil completo de la capacidad antioxidante contra varios ROS / RNS, como O2 -,
HO y NO , puede ser necesario el desarrollo de diferentes mtodos especficos para
cada ROS / RNS. Entre otros factores que son importantes e influyen en la seleccin
de un buen mtodo son relevancia biolgica y el punto final, as como mtodo de
cuantificacin. ORAC, TRAP, y la oxidacin de LDL son considerados como los
ensayos ms biolgicamente relevantes (Tabla 1). La capacidad antioxidante de estos
mtodos in vitro puede reflejar ms estrechamente en la accin vivo. Por esta razn
tienen ventajas sobre los mtodos que adoptan los radicales libres menos relevantes o
irrelevantes en un sistema biolgico. La eleccin de los mtodos de punto final y de
cuantificacin estn relacionados a si un determinado mtodo puede evaluar con
precisin las diferentes muestras o no. Un buen mtodo debe ser adecuado para
evaluar diferentes antioxidantes o mezcla de antioxidantes y dar un valor exacto.
Adems, un buen mtodo debe ser capaz de distinguir el antioxidante (s) con
diferentes cinticas de reaccin. Numerosos estudios han demostrado que la diferente
antioxidante (s), especialmente para muestras de alimentos con una composicin
antioxidante complicado, tener diferentes curvas de reaccin. Por ejemplo, en ensayos
de decoloracin, hay tres curvas tpicas que podran ser observadas en siguiendo la
disminucin de radicales libres o de la sonda (Figura 8) ya sea por espectrometra UV-
vis, fluorescencia, luminiscencia o. Para los mtodos que utilizan un tiempo o
inhibicin grado fija como punto final, la seleccin de tiempo o el grado de inhibicin es
crtica para el ensayo. De la Figura 8 , est claro que los diferentes puntos de tiempo
T1 , T2, y T3 o diferentes grados de inhibicin ( 50 o 20 % , respectivamente) darn
bastante diferentes valores de AOC y pueden incluso cambiar el ranking. Cualquier
actividad de la reaccin despus de que el punto fijo es totalmente ignorado en el valor
AOC computarizada . Sin embargo , los mtodos que utilizan las AUC como ORAC ,
que tiene un punto de partida claro (lnea de base ) y un punto final claro ( de nuevo a
la lnea de base ) . El clculo de las AUC utiliza tanto tiempo de inhibicin y el grado ,
lo que refleja los diferentes cintica de la reaccin . Desde este punto de vista ,
creemos que los ensayos utilizando AUC proporcionan mejores datos que los mtodos
que utilizan un punto de tiempo fijo o el grado de inhibicin .
Figura 8. Comparacin Ejemplo de utilizacin de criterios de valoracin de tiempo fijo o
inhibicin fija por ciento en los datos de AOC .
Con estos factores en mente, se propone que tres de los mtodos discutidos en esta
revisin (ORAC, fenlicos ensayo FC y TEAC) deben ser normalizados para su uso en
el control de calidad de rutina y la medicin de AOC de suplementos dietticos y otros
productos botnicos. Sin embargo, en lo que sugiere mltiples mtodos, no est claro
si realmente hemos ayudado a la industria de los nutracuticos. No va a haber ningn
tipo de relacin "normal" entre los mtodos, y por lo tanto uno debe decidir sobre un
solo mtodo o utilizar varios ensayos para comparar los alimentos o suplementos
dietticos. Puede ser necesaria estandarizacin de los mtodos adicionales en el
futuro a medida que se desarrollaron mtodos que utilizan otras fuentes de radicales.
Esta eleccin de los mtodos se basa en dos mtodos con diferentes mecanismos de
reaccin, con uno que utiliza el radical peroxilo debido a su predominancia en los
sistemas biolgicos y el otro el mecanismo SET utilizando el ABTS + radical. El
ensayo de compuestos fenlicos FC ofrece una tercera opcin para un ensayo simple,
rpido, barato y robusto que no requiere equipo especializado, pero se puede
automatizar para el ensayo de rendimiento alto. El ensayo ORACFL representa un
mecanismo biolgicamente relevante, que puede medir tanto AOC lipfilo e hidrfilo y
est adaptado para ensayo de alto rendimiento.
RECONOCIMIENTO
para este trabajo de los Dres. L. Howard, D. Huang, CY Lee, B. Ou, y J. Vinson es
apreciado.