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Mtodos estandarizados para la determinacin de la capacidad antioxidante y

compuestos fenlicos presentes en los alimentos y suplementos dietticos

Los mtodos disponibles para la medicin de la capacidad antioxidante se revisan,


presentando la qumica general que subyace a los ensayos, los tipos de molculas
detectadas, y las ventajas y desventajas de cada mtodo ms importantes. Esta
descripcin general proporciona una base y fundamento para el desarrollo de mtodos
de capacidad antioxidante estandarizados para la comida, nutracuticos, y las
industrias de suplementos dietticos. A partir de la evaluacin de los datos
presentados en el Primer Congreso Internacional sobre Mtodos antioxidantes en
2004 y en la literatura, as como la consideracin de los posibles usos finales de los
antioxidantes, se propone que los procedimientos y aplicaciones para tres ensayos se
considerarn para la normalizacin: la absorcin de radicales de oxgeno capacidad
(ORAC) de ensayo, el mtodo de Folin-Ciocalteu, y, posiblemente, la capacidad
antioxidante (TEAC) de ensayo equivalente Trolox. ORAC representar un mecanismo
de reaccin de transferencia de tomo de hidrgeno (HAT), que es ms relevante para
la biologa humana. El mtodo Folin-Ciocalteu es una transferencia de electrones (ET)
ensayo basado y da reduccin de la capacidad, que normalmente se ha expresado
como contenidos fenlicos. El ensayo TEAC representa un segundo mtodo basado
en ET. Pueden necesitar ser considerados en el futuro a medida que se aprende ms
acerca de algunas de las otras fuentes de radicales y su importancia para la biologa
humana Otros ensayos.

INTRODUCCIN

El Primer Congreso Internacional sobre Mtodos antioxidantes se celebr en Orlando,


FL, en junio de 2004 con el expreso propsito de hacer frente a los problemas
analticos relativos a la evaluacin de la capacidad antioxidante (AOC) en alimentos,
productos botnicos, nutracuticos, y otros suplementos dietticos y proponer uno o
ms mtodos analticos que podran ser estandarizados para la evaluacin rutinaria de
AOC. Aspectos ms destacados de este congreso, que se ocupan de la qumica de los
mtodos analticos antioxidantes se resumirn. La investigacin sobre antioxidantes ha
aumentado considerablemente durante los ltimos 10 aos. Sobre la base de la
informacin en la base de datos Medline solo, manuscritos mencionar "antioxidante"
aumento de 340%, mientras que el nmero de manuscritos en la planta, animal, y el
rea humana aument slo 39% .El nmero de mtodos y variaciones en los mtodos
para medir los antioxidantes en botnicos que se han propuesto tambin ha
aumentado considerablemente. Los comentarios de algunos de los mtodos se han
publicado recientemente (1-5). En este trabajo consideramos varios de los mtodos
ms comnmente utilizados para la medicin de AOC, perfilando los mecanismos de
reaccin y de las principales ventajas y desventajas de cada uno. Un factor que
proporciona un desafo distinto en el ensayo de la capacidad antioxidante es que
dentro de los sistemas biolgicos, hay al menos cuatro fuentes generales de
antioxidantes: (1) enzimas, por ejemplo, superxido dismutasa, glutatin peroxidasa,
catalasa y; (2) grandes molculas (albmina, ceruloplasmina, ferritina, otras protenas);
(3) pequeas molculas [cido ascrbico, glutatin, cido rico, tocoferol,
carotenoides, fenoles (poli)]; y (4) algunas hormonas (estrgeno, la angiotensina, la
melatonina, etc.). Por otro lado, hay mltiples fuentes de radicales libres y oxidantes
[por ejemplo, O2 -, 1O2, HO , NO , ONOO, HOCl, RO (O) , LO (O) ], y ambos
oxidantes y antioxidantes tienen diferentes caractersticas qumicas y fsicas.
Antioxidantes individuales pueden, en algunos casos, actuar por mecanismos mltiples
en un solo sistema (6) o por un mecanismo nico diferente dependiendo del sistema
de reaccin. Adems, los antioxidantes pueden responder de manera diferente a
diferentes fuentes de radicales o oxidantes. Por ejemplo, los carotenoides no son
particularmente buenos inactivadores de radicales peroxilo relativos a compuestos
fenlicos y otros antioxidantes pero son excepcionales en el bloqueo del oxgeno
singlete, en el que la mayora de otros compuestos fenlicos y antioxidantes son
relativamente ineficaces. Sin embargo, el oxgeno singlete no es un radical y no
reacciona a travs de mecanismos de radicales pero reacciona principalmente por la
adicin de dobles enlaces, formando perxidos endo- que pueden ser reducidos a los
radicales alcoxilo que inician reacciones en cadena de radicales. Debido a mltiples
caractersticas y mecanismos de reaccin, as como diferentes localizaciones de fase
estn a menudo involucrados, no solo ensayo reflejar con precisin todas las fuentes
de radicales o todos los antioxidantes en un sistema mixto o complejo. Claramente,
igualando fuente de radicales y el sistema caracterizado.

cas a los mecanismos de reaccin antioxidantes es fundamental en la seleccin de


mtodos apropiados de ensayo AOC, como es la consideracin de la utilizacin final
de los resultados. Se debe apreciarse en primer lugar que no hay ningn mtodo
universal simple por el cual AOC puede medirse con precisin y cuantitativamente.
Por qu necesitamos un mtodo estandarizado AOC? Aunque pueda parecer
intuitivo, uno podra preguntarse por qu necesitamos mtodos analticos
estandarizados de AOC. Acuerdo sobre los mtodos de prueba estandarizados
permite (1) orientacin para la aplicacin adecuada de los ensayos, (2) comparaciones
significativas de los alimentos o productos comerciales, (3) un medio para controlar la
variacin dentro o entre productos, y (4) la prestacin de la calidad normas para las
cuestiones reglamentarias y de propiedades saludables. Demasiados mtodos
analticos producen resultados inconsistentes, aplicacin inadecuada e interpretacin
de los ensayos y de especificacin incorrecta de AOC. Sin algn tipo de acuerdo sobre
normas para las cantidades y unidades, la comercializacin de productos botnicos y
el comercio asociado se vuelve irregular, la ciencia se convierte en "no cientfica", y el
desarrollo tecnolgico de nutracuticos es minusvlido. Factores que debern
considerarse en la seleccin Mtodo y Desarrollo. En la seleccin de cualquier mtodo
para la normalizacin, la primera consideracin es que el mtodo se ha utilizado
durante un perodo de tiempo suficiente y en una serie de diferentes laboratorios tales
que las fortalezas y debilidades de la prueba se han hecho evidentes y algn tiempo
tiene ha gastado en el tratamiento de estos temas. Esto no quiere decir que los
mtodos ms nuevos no pueden potencialmente ser tan bueno o mejor, pero el uso a
travs del tiempo generalmente sealar esto. Un mtodo estandarizado para AOC
debe cumplir con los siguientes requisitos "ideales": (1) medidas Chemistry realidad
que ocurre en aplicacin potencial (s); (2) utiliza una fuente de radicales
biolgicamente relevante; (3) la simple; (4) utiliza un mtodo con un punto final
definido y mecanismo qumico; (5) la instrumentacin es fcilmente disponible; (6) bien
dentro de plazo y entre das reproducibilidad; (7) adaptable para el ensayo de ambos
antioxidantes y uso de diferentes fuentes de radicales hidrfilos y lipfilos; (8)
adaptable al anlisis de "alto rendimiento" para el control de calidad de rutina analiza.
Las caractersticas de rendimiento que deben ser considerados en la estandarizacin
de un ensayo incluyen (a) rango analtico, (b) la recuperacin, (c) la repetibilidad, (d) la
reproducibilidad, y (e) el reconocimiento de sustancias interferentes.

MECANISMOS DE REACCIN

Diferenciacin entre la transferencia de tomos de hidrgeno (HAT) y Single


transferencia de electrones (SET). Los antioxidantes pueden desac- tivar radicales por
dos mecanismos principales, HAT y SET. El resultado final es el mismo,
independientemente del mecanismo, pero la cintica y potencial de reacciones
laterales difieren. Reacciones de transferencia de electrones y el sombrero de
protones acoplados pueden ocurrir en paralelo, y el mecanismo dominante en un
sistema dado se determina por la estructura antioxidante y propiedades, la solubilidad
y coeficiente de reparto, y solvente sistema. Energa de disociacin Bond (BDE) y el
potencial de ionizacin (PI) son dos factores importantes que determinan el
mecanismo y la eficacia de los antioxidantes (7). A menudo hay confusin en la
literatura y la atribucin errnea de los mecanismos de reaccin. As, junto con los
procedimientos especficos, debe haber reconocimiento definitivo de los mecanismos y
la identificacin de las aplicaciones apropiadas. De hecho, se necesita un protocolo
que implica la medicin de ms de una propiedad porque los polifenoles tienen
mltiples actividades, y la actividad dominante depende del medio y el sustrato de
prueba. Mtodos basados en HAT miden la capacidad clsica de un antioxidante para
apagar los radicales libres por la donacin de hidrgeno (AH) cualquier donante H)

+ AH f XH + A (1)

Por lo tanto , muchos cientficos creen que son ms relevantes para las reacciones en
antioxidantes normalmente actan . Reactividad relativa en mtodos de sombrero est
determinada por el BDE del grupo H- donar en el potencial antioxidante , dominando
para los compuestos con BDE de ~ - 10 kcal / mol y el potencial de ionizacin ( IP )
de < -36 kcal / mol ( 7 ) . Mediciones de reactividad o capacidad antioxidante se basan
en la cintica de competencia. Reacciones HAT son solventes y pH independiente y
suelen ser bastante rpido , por lo general termin en segundos a minutos. La
presencia de agentes reductores , incluyendo metales , es una complicacin en los
ensayos de HAT y puede conducir a error alta reactividad aparente. Mtodos basados
en SET detectan la capacidad de un antioxidante potencial para transferir un electrn
para reducir cualquier compuesto, incluyendo metales, carbonilos, y los radicales ( 7 ) :

+ AH f X- + AH+ (1)

AH

+798 H2O

A + H3O+ (2)

- + H3O+ f XH + H2O (3) M(III) + AH f AH+ + M(II) (4)


SET y mecanismos HAT casi siempre ocurren al mismo tiempo en todas las muestras,
con el saldo determinado por la estructura antioxidante y pH. Reactividad relativa en
los mtodos SET se basa principalmente en la desprotonacin (8) e IP (7) del grupo
funcional reactivo, las reacciones de modo SET son dependientes del pH. En general,
los valores de IP disminuyen al aumentar el pH, reflejando el aumento de la donacin
de electrones con capacidad desprotonacin. El mecanismo antioxidante es SET
predominantemente de compuestos con una IP de> -45 kcal / mol. Una correlacin
entre los mtodos posibles y SET redox ha sugerido (2), pero no consistentemente
demostraron. SET reacciones suelen ser lentos y pueden requerir tiempos largos para
llegar a la finalizacin, por lo que los clculos de capacidad antioxidante se basan en
por ciento de disminucin en el producto en lugar de la cintica. Cuando AH + tiene
una vida til suficiente, las reacciones secundarias convertido en una interferencia
significativa en los ensayos e incluso pueden llevar a la toxicidad o mutagenicidad in
vivo (9). Mtodos establecidos son muy sensibles al cido ascrbico y cido rico, que
son importantes en el mantenimiento del tono redox de plasma, y reducir tambin se
detectan los polifenoles. Es importante destacar que trazan componentes y
contaminantes (especialmente metales) interfieren con mtodos establecidos y pueden
dar cuenta de una alta variabilidad y la mala reproducibilidad y consistencia de los
resultado
CARACTERSTICAS DE LOS MTODOS AOC CANDIDATO

Mtodos AOC utilizando los mecanismos de reaccin sombrero. Un nmero de


ensayos se han desarrollado para la deteccin tanto de la accin antioxidante general
y especfica. De stos , el oxgeno capacidad radical absorbancia ( ORAC) , y el total
de radicales atrapando parmetro anti- oxidante (TRAP ) (y algunas de sus variantes )
cumplir los requisitos para la mayora de los ensayos de cribado descritos
anteriormente y puede merecer la normalizacin. Los otros mtodos se indican a
continuacin son ms apropiados para aplicaciones individuales. ORAC : Qumica
General. El ensayo ORAC se basa en los primeros trabajos de Ghiselli et al. ( 10 ) y
Glazer ( 11 ) , tal como se desarrollan por Cao et al. ( 12 ) . Medidas ORAC dantes
inhibicin dant de peroxilo oxidaciones radicales inducidos y por lo tanto refleja la
cadena radical clsica romper actividad antioxidante por transferencia de tomo de H (
13 ) . En el ensayo bsico, los radicales peroxilo reacciona con una sonda fluorescente
para formar un producto fluorescente

Figura 1. ORAC actividad antioxidante de la muestra ensayada expresa como el


rea neta bajo la curva ( AUC) . De Brunswick Laboratories ( 2003 ) , que se
utiliza con permiso. Figura 1. ORAC actividad antioxidante de la muestra
ensayada expresa como el rea neta bajo la curva ( AUC) . De Brunswick
Laboratories ( 2003 ) , que se utiliza con permiso.
RsNdN-R 98 O2

N2 + 2ROO (14)

ROO

+ probe (fluorescent) f ROOH + oxidized probe (loss of fluorescence)

ROO

+ AH f ROOH + A

ROO

+ A98 fast

ROOA

B-ficoeritrina (B-PE), una protena aislada de Porphyridium cruentum, se utiliz como


sonda fluorescente en los primeros estudios (12). Sin embargo, el uso de B-PE en
ensayos de antioxidantes tiene Ings shortcom- en que (1) B-PE tiene la variabilidad de
lote a lote en la reactividad de los radicales peroxilo, dando lugar a la inconsistencia en
los resultados del ensayo (15); (2) B-PE se convierte photobleached despus de la
exposicin a la luz de excitacin; y (3) los polifenoles, en particular las
proantocianidinas, se unen a B-PE a travs de la protena unin no especfica. Estos
dos ltimos factores causan falsos valores bajos de ORAC. Las sondas fluorescentes
que estn actualmente preferredsfluorescein (FL; 3 ', 6'-dihidroxi espiro
[isobenzofuran-1 [3H], 9' [9H] -xanthen] -3-ona) (13) o dicloruro de rofluorescein
(H2DCF- dA; 2 ', 7'-diacetato de dichlorodihydrofluorescein) Sar ms estable y menos
reactiva (6). Los productos oxidados de FL inducidos por los radicales peroxilo han
sido identificados por LC-MS, y el mecanismo de reaccin ha sido verificado como un
mecanismo de sombrero clsico (13). Reaccin de la sonda con los radicales peroxilo
es seguido por prdida de fluorescencia con el tiempo. Antioxidante tradicional analiza
extensin seguirse slo la fase de latencia, pero los efectos antioxidantes menudo se
extienden mucho ms all de las primeras etapas de la oxidacin (2, 3). Para evitar la
subestimacin de la actividad antioxidante y para tener en cuenta los efectos
potenciales de los productos antioxidantes secundarios, el ensayo ORAC sigue la
reaccin durante perodos prolongados, por ejemplo, g30 min. Clculo de los efectos
protectores de un antioxidante (AOX) es de las reas netas integrado bajo las curvas
de decaimiento de fluorescencia (AUC) [AUCAOX - AUCno AOX], como se muestra en
la Figura 1, y representa el tiempo de retraso, tasa inicial, y el alcance total de
inhibicin en un solo valor. Valores ORAC generalmente se reportan como
equivalentes de Trolox. Una curva estndar se genera utilizando las AUC durante
cinco concentraciones estndar de Trolox, y los equivalentes Trolox de la muestra se
calcula utilizando las siguientes relaciones lineales o cuadrticas (Y) a + bX, lineal; o
Y) a + bX + CX2, cuadrtica) entre la concentracin de Trolox (Y) (M) y el rea bajo la
curva neta FL decaimiento (X) (AUCsample - AUCblank). Una regresin lineal se
utiliz en el intervalo de 6,25 a 50 mM Trolox, aunque el uso de una regresin
cuadrtica se extiende ligeramente el rango dinmico del ensayo (Wu et al., Datos no
publicados). Los datos se expresan como micromoles de equivalentes de Trolox (TE)
por litro o por gramo de muestra (mol de TE / g o mol de TE / L) (13, 16). Como
configurado originalmente, el ensayo ORACFL se limita a la medicin de la cadena
hidrfila romper capacidad antioxidante contra los radicales peroxilo nica. Esto ignora
antioxidantes lipoflicos que son particularmente importantes frente a la oxidacin
lipdica en todos los sistemas, as como otros radicales (HO , HOO , ONOO, O 2 -,
etc.) que son fisiolgicamente muy reactivo. Para ser ms ampliamente aplicable, el
ensayo ORAC ha sido adaptado para medir lipfilo, as como antioxidantes hidrfilos
utilizando una solucin de 50% de acetona / 50% de agua (v / v) que contiene 7%
metilada aleatoriamente -ciclodextrina (RMCD) para solubilizar los antioxidantes (17,
18). Los componentes lipfilos e hidrfilos se extraen selectivamente antes del ensayo
(16). El ensayo ORAC ha sido utilizado para estudiar el AOC de muchos compuestos y
muestras de alimentos (16, 18-25). Industria ha aceptado el mtodo hasta el punto de
que algunos fabricantes nutracuticos estn empezando a incluir valores ORAC en las
etiquetas de productos (26, 27).

Ventajas / desventajas de ORAC. El ensayo ORAC proporciona una fuente


controlable de radicales peroxilo que las reacciones de modelo de antioxidantes con
lpidos tanto en alimentos y sistemas fisiolgicos, y puede ser adaptado para detectar
ambos antioxidantes hidrfilos e hidrfobos mediante la alteracin de la fuente de
radicales y disolvente (2, 16, 28, 29). Frankel y Meyer (5) han criticado ORAC (y lo
mismo para TRAP) en que se supone que el mecanismo antioxidante y proteccin de
los B-PE por los antioxidantes imita sustratos biolgicos crticos. Aunque los estudios
mecanicista detallados no se completaron utilizando B-PE, que se han hecho con
fluorescena (13), y la reaccin se ha determinado que es un mecanismo de HAT. Los
principios del mtodo ORAC se pueden adaptar a utilizar otras fuentes de radicales
(28). El mtodo ORAC se automatiza fcilmente. El mtodo fue automatizado primero
en el COBAS FARA II (30) y ms recientemente ha experimentado mejoras
adicionales en la instrumentacin y la sonda fluorescente (13, 16). Excelentes
resultados se han obtenido usando un sistema de manejo de lquidos multicanal junto
con un lector de microplacas de fluorescencia, ya sea en un formato de 96 o 48
pocillos (13, 29), aunque el ensayo coeficiente de variacin es ligeramente inferior en
el formato de 48 pocillos (4 -5%, en comparacin con 4-10% con un formato de 96
pocillos) (16). Debido a que la reaccin de ORAC es temperatura sensible, cercano
control de la temperatura en toda la placa es esencial. La incubacin del tampn de
reaccin a 37 C antes de la AAPH se disolvi disminuy la variabilidad intra-ensayo
(16). Las pequeas diferencias de temperatura en los pocillos externos de la
microplaca pueden disminuir la reproducibilidad del ensayo (31). Esto no es nico para
el ensayo ORAC, pero ser cierto para cualquier ensayo que es altamente sensible a
la temperatura que utiliza microplacas y microplacas lectores en el ensayo.
Marcadores fluorescentes, aunque sensibles, requieren la deteccin por fluormetros,
que pueden no estar disponibles rutinariamente en los laboratorios de anlisis, aunque
este instrumento se utiliza rutinariamente en muchos laboratorios de cultivo celular. El
tiempo de anlisis de largo (~ 1 h) tambin ha sido una de las principales crticas, pero
esta limitacin ha sido parcialmente superada por el desarrollo de ensayos de alto
rendimiento (29). TRAMPA: Qumica General. Este mtodo monitoriza la capacidad de
los compuestos antioxidantes para interferir con la reaccin entre los radicales peroxilo
generados por AAPH o ABAP [2,2'-azobis (2- amidinopropano)] y una sonda para la
diana (10, 14, 32). Captacin Diferentes variaciones del mtodo han utilizado de
oxgeno (32), la fluorescencia de R-ficoeritrina (10, 33), o la absorbancia de 2,2'-
azinobis (cido 3-etilbenzotiazolina-6-suslfonic (ABTS) (34) como el sonda de
reaccin. Las reacciones bsicas del ensayo son similares a los de ORAC. Requisitos
para el ensayo son que la sonda debe ser reactivo con ROO a bajas
concentraciones, tiene que haber un cambio espectroscpico dramtica entre la sonda
nativo y oxidado (para maximizar sensibilidad), y no hay reaccin en cadena de radical
ms all de la oxidacin de la sonda debe ocurrir. Tpicamente, la oxidacin de la
sonda se sigue pticamente (34) o por fluorescencia (10). La actividad antioxidante se
ha determinado como el tiempo para consumir todo el antioxidante, por extensin de el
tiempo de retardo para el aspecto de la sonda oxidado cuando antioxidantes estn
presentes, y por el porcentaje de reduccin de una reaccin. TRAP valores se expresa
generalmente como un tiempo de retardo o tiempo de reaccin de la muestra en
comparacin con los tiempos correspondientes para Trolox. ventajas / desventajas de
la TRAP Ensayo. El ensayo TRAP fue diseado y es la ms utilizada para las
mediciones de AOC en vivo en suero o plasma, ya que mide los antioxidantes no
enzimticos, tales como el glutatin, cido ascrbico, R-tocoferol, y -caroteno (35).
Mayor problema del mtodo es quizs su mayor fortaleza; demasiados puntos finales
diferentes se han utilizado, por lo que las comparaciones entre laboratorios son
difciles. Sin embargo, punto final y mtodo de deteccin se pueden adaptar a los
sistemas y procesos fisiolgicos de inters particular e instrumentacin fcilmente
disponible, respectivamente. El uso de la fase de latencia se basa en la suposicin de
que todos los antioxidantes muestran una fase de latencia y que la duracin de la fase
de latencia es proporcional a AOC. Sin embargo, no todos los antioxidantes posee una
fase obvia lag. Por otra parte, el valor obtenido de la fase de latencia solo a menudo
subestima AOC considerablemente, debido a que el valor antioxidante contribuy
despus de la fase de latencia es totalmente ignorado.

El ensayo TRAP implica el inicio de la peroxidacin lipdica mediante la generacin de


radicales peroxilo solubles en agua y es sensible a todos los conocidos cadena de
romper antioxidantes, pero es relativamente compleja y requiere mucho tiempo para
llevar a cabo, lo que requiere un alto grado de especializacin y experiencia. Sin
embargo, el ensayo TRAP ha sido criticada por el empleo de un estrs oxidativo no
fisiolgica (radicales peroxilo solubles en agua) (36), pero el mtodo puede ser
adaptado para usar iniciadores solubles en lpidos. Capacidad total de barrido oxidante
(TOSC): general Chemistry. Desarrollado por Winston et al. (37), este mtodo permite
la cuantificacin de la capacidad de absorbancia de antioxidantes especfica- mente
hacia tres oxidantes potentes, es decir, radicales hidroxilo, radicales peroxilo, y
peroxinitrito (38). Este mtodo resuelve un problema importante en trminos de ser
capaz de evaluar diferentes antioxidantes con diferentes fuentes de radicales
biolgicamente relevantes. El sustrato que se oxida en este ensayo es R-ceto-cido -
methiolbutyric (KMBA), que forma etileno. El curso temporal de la formacin de etileno
se sigui por anlisis de espacio de cabeza de la celda de reaccin por cromatografa
de gases, y la capacidad antioxidante se cuantifica por la capacidad del antioxidante
para inhibir la formacin de etileno en relacin con una reaccin de control. El mtodo
utiliza un rea bajo la curva que mejor define los puntos experimentales durante el
tiempo de reaccin, que puede ser de hasta 300 min. Curvas de dosis-respuesta lineal
para los antioxidantes pueden ser generados a partir de la cintica de la reaccin.
Ventajas / desventajas de la Valoracin TOSC. El mtodo tiene la ventaja de que
permite la cuantificacin de la capacidad antioxidante hacia tres oxidantes, es decir,
radicales hidroxilo, radicales peroxilo y peroxinitrito. Sin embargo, el mtodo no es
fcilmente adaptable para los anlisis de alto rendimiento requerido para el control de
calidad en que requiere mltiples inyecciones a partir de una sola muestra en un
cromatgrafo de gas para medir la produccin de etileno. La cintica del ensayo TOSC
son tales que no hay una relacin lineal entre el porcentaje de inhibicin de TOSC por
la fuente de antioxidante y la concentracin de antioxidante o de dilucin (39). Por lo
tanto, calculado factores de dilucin para 20, 50, y 80% TOSC se determinan, y un
DT50 se calcula, que es la primera derivada de la curva de dosis-respuesta en un
TOSC de 50%. La comparacin entre los alimentos se hace difcil debido a estos
mltiples parmetros de punto final. Quimioluminiscencia (CL): Qumica General. Una
modificacin de alta sensibilidad de TRAP sigue reacciones de radicales con CL. La
qumica fundamental de ensayos de CL se basa en la reaccin de los oxidantes
radicales con compuestos marcadores para producir especies estado excitado que
emiten quimioluminiscencia (luz inducida qumicamente). Cualquier compuestos que
reaccionan con los radicales que inician inhiben la produccin de luz. Fuentes de
oxidantes de los radicales peroxilo incluyen la peroxidasa de rbano picante enzima
(40) y H2O2-hemina (41). Al cambiar el iniciador, la reaccin se puede adaptar para
diferenciar temple de oxidantes especficos, por ejemplo, O2 -, HO , HOCl, LO (O) ,
OONO (42), y 1O2 (43). El compuesto marcador ms utilizado para atrapar a los
oxidantes y convertir las emisiones dbiles en las emisiones de luz intensa,
prolongada y estable es el luminol (40), aunque las protenas lucigenina y
bioluminiscentes como Pholasin son cada vez ms populares (44-48). Salida de luz
continua depende de la produccin constante de intermediarios de radicales libres
derivados de p-yodofenol, luminol, y oxgeno, y esta emisin de luz es sensible a las
interferencias por los antioxidantes barrido de radicales, pero se restaurar cuando
todos los antioxidantes aadidos se han consumido en el reaccin. La capacidad
antioxidante se mide como el tiempo de la emisin de luz deprimido (t), que se mide
arbitrariamente en 10% de recuperacin de salida de luz.

La quimioluminiscencia se caracteriza por la intensidad de emisiones muy bajo,


decenas a unos pocos miles de cuentas por segundo en contraste con millones de
cuentas para fluorescencia. Por lo tanto, la deteccin CL requiere equipo especial que
ambos lugares muestras cercanas al detector y detecta la luz en los niveles de fotones
individuales y, adems, proporciona un control de la temperatura (49). Sin embargo,
CL puede ser muy sensible en la deteccin de reacciones de bajo nivel, ya que
proporciona una respuesta detectable por debajo del lmite de deteccin de la mayora
de los ensayos qumicos. Ventajas / desventajas de CL. Las quimioluminiscencia
reaccin son adaptables a la automatizacin y se pueden ejecutar en placas de
microtitulacin. La eleccin del emisor es una consideracin crtica. Lucige- nin sufre
redox ciclismo y realmente produce el anin superxido, y as no se prefiere para
algunas aplicaciones antioxidantes. Luminol se ha utilizado ampliamente para estudiar
las reacciones de radicales y es aceptable cuando se estn midiendo los oxidantes
individuales. Sin embargo, debido a que la intensidad de las emisiones vara
considerablemente con el oxidante, el uso de luminol en sistemas con oxidantes
mixtos no es sencillo. Adems, el producto activado de luminol en s es redox activo.
Fotoquimioluminescencia (PCL) Ensayo: Qumica General. Este ensayo fue descrito
por Popov y Lewin (50-52), fue comercializado por Analytik Jena AG (Jena, Alemania),
y se vende como un sistema completo bajo el nombre PHOTOCHEM. El ensayo
implica la generacin fotoqumica de xido de super- O2 - radicales libres
combinadas con deteccin CL. El ensayo se inicia por excitacin ptica de un
fotosensibilizador (S), lo que resulta en la generacin del anin radical superxido (51).

S + hV + O2 f [S * O2] f S + + O2 -

Figura 2. Relacin entre ORACFL y la capacidad PCL antioxidante en diferentes


alimentos ( Luke Howard , datos no publicados , comunicacin personal).

El mecanismo completo de reaccin no es conocida (52). Hay dos tipos bsicos de los
radicales presentes en el sistema de medicin PCL: O2 - y los radicales luminales;
As, en el sentido ms estricto, la capacidad antioxidante representa una capacidad
antirradical (52). Los radicales libres se detectan con un reactivo de CL, luminol, que
acta como un fotosensibilizador, as como un reactivo de deteccin de radicales de
oxgeno. Los kits ACW y ACL proporcionados por el fabricante se utilizan para medir
AOC hidrfilos y lipfilos, respectivamente, de las muestras biolgicas. El AOC
hidrfilo se ensay por medio de la fase de latencia (L) en el segundo
donde L0 y L1 son los parmetros respectivos de la pieza y de la muestra. El AOC
lipfilo se ensay por el grado de inhibicin PCL (I), de acuerdo con el clculo
donde S0 es la integral bajo la curva en blanco y S es la integral bajo la curva de la
muestra. El cido ascrbico y Trolox se utilizan normalmente como reactivos de
calibracin para AOC hidrfilos y lipfilos, respectivamente, en rangos de medicin de
0-2 nmol. En contraste con otros ensayos AOC comnmente utilizados, el mtodo
PHOTOCHEM no se limita a un valor de pH especfico o intervalo de temperatura.
Ventajas / desventajas del Sistema PHOTOCHEM. Este sistema se comercializa como
un sistema de tiempo y rentable para la determinacin de la capacidad antioxidante
integral hacia superxido. Los reactivos para los ensayos lipoflicas e hidroflicas slo
estn disponibles por parte del fabricante. Debido a que slo una muestra se puede
medir en un momento, no es, en su configuracin actual, adaptable a un sistema de
ensayo de alto rendimiento. El ensayo se ha utilizado para medir la capacidad
antioxidante en las bayas (53) y otros alimentos. Los datos de Dr. Luke Howard
(Figura 2; comunicacin personal) sealan claramente que hay poca relacin entre
ORAC y los datos Photochem a travs de una variedad de alimentos. Esto no es
inesperado en la que se estn evaluando dos fuentes radicales completamente
diferentes. Ser necesario trabajo adicional con el fin de tener una mejor comprensin
de la importancia potencial de tener datos utilizando el radical superxido y cmo
podra ayudar en la relacin con los efectos potenciales en vivo. Croton o -Caroteno
El blanqueo por LOO : general Chemistry. Los carotenoides blanqueador a travs de
autooxidacin, la oxidacin inducida por la luz o el calor (54), o la oxidacin inducida
por radicales peroxilo (por ejemplo, AAPH o lpidos oxidantes) (55, 56), y esta
decoloracin puede ser disminuido o impedido por los antioxidantes clsicos que
donan tomos de hidrgeno para eliminar los radicales. Aunque -caroteno se utiliza a
menudo como el objetivo (54), su decoloracin en 470 nm puede ocurrir por mltiples
vas, por lo que la interpretacin de los resultados puede ser complicado. En contraste,
crocina, defendido por primera Bors y colegas (57), tiene reacciones sencillas y
blanqueadores slo por la va de oxidacin de radicales, por lo que se ha convertido
en el reactivo de eleccin sobre -caroteno.
La prdida de color es seguido pticamente a 443 nm (443) 89000 M-1 cm-1 en
tampn de fosfato, pH 7,4) (58), por lo que la reaccin no requiere instrumentacin
especial. Ventajas / desventajas de Croton blanqueo. Blanqueo de carotenoides es
fcilmente adaptable a la metodologa de alto rendimiento tales como microplacas. Sin
embargo, el control de la temperatura es crtica, y una mayor variabilidad en los pozos
externos se ha sealado (59). Debido a la necesidad de calcular la IC50, mltiples
diluciones de la misma muestra se deben ejecutar para que slo tres muestras se
pueden ejecutar por duplicado por placa. Limitaciones adicionales son que crocin no
est disponible comercialmente y as debe ser extrado, y no hay formatos estndar
para expresar estudio resultssevery tiene un mtodo diferente para calcular la cintica
de inhibicin. Lipoprotenas de baja densidad (LDL) Oxidacin: general Chemistry. Ex
vivo oxidacin de LDL fue desarrollado principalmente como una medida del estado
antioxidante, pero las aplicaciones de la oxidacin de LDL tambin se han adaptado
para evaluar la capacidad antioxidante en un sistema ms fisiolgicamente relevante.
LDL es aislado de muestras de sangre fresca, la oxidacin se inicia por Cu (II) o
AAPH, y la peroxidacin de los componentes lipdicos es seguida a 234 nm para
dienos conjugados o por los valores de perxido de hidroperxidos de lpidos (60, 61).

Ventajas / desventajas de la oxidacin LDL Ensayo. La oxidacin de LDL utilizando


AAPH como la fuente de radical claramente tiene relevancia para las reacciones
oxidativas que pueden ocurrir in vivo. En un grupo limitado de muestras, se observ
una buena relacin entre la oxidacin de LDL usando AAPH y el valor ORAC (60); sin
embargo, la relacin no estaba presente cuando se us Cu (II) como oxidante. El
mtodo tiene un inconveniente importante en que la LDL debe ser aislado sobre una
base regular, y debido a la necesidad de obtener muestras de sangre de individuos
diferentes, no es posible obtener preparaciones consistentes. Por lo tanto, este
mtodo no es propicio para el desarrollo de un ensayo de alta consistente,
reproducible AOC rendimiento. Mtodos AOC utilizando SET Mecanismos de reaccin.
Frrico Reducir Antioxidante Potencia (FRAP): Qumica General. El ensayo FRAP fue
desarrollado originalmente por Benzie y Strain (62, 63) para medir la reduccin de
energa en el plasma, pero el ensayo posteriormente tambin se ha adaptado y
utilizado para el ensayo de los antioxidantes en productos botnicos (64-68). La
reduccin de las medidas de reaccin frrico 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) en un
producto coloreado (Figura 3) (62, 63). La reaccin detecta compuestos con
potenciales redox de <0,7 V (el potencial redox de Fe3 + -TPTZ), por lo FRAP es una
pantalla razonable para la capacidad de mantener el estado redox en las clulas o
tejidos. La reduccin de potencia parece estar relacionado con el grado de
hidroxilacin y grado de conjugacin en polifenoles (69). Sin embargo, FRAP no puede
detectar compuestos que actan por enfriamiento (transferencia H) radical, en
particular los tioles y protenas (65). Esto provoca una subestimacin grave en el
suero.

Debido a que el potencial redox de Fe (III) -TPTZ es comparable con la de ABTS +


(0,68 V), compuestos similares reaccionan tanto en el TEAC (vase ms adelante) y
los ensayos de FRAP. Las condiciones de reaccin difieren, sin embargo: TEAC se
lleva a cabo a pH neutro, y el ensayo FRAP se lleva a cabo a pH cido 3,6 para
mantener la solubilidad del hierro. Reaccin a bajo pH disminuye el potencial de
ionizacin que impulsa la transferencia de electrones y aumenta el potencial redox,
causando un cambio en el mecanismo de reaccin dominante (70, 71). Por lo tanto,
TEAC y TRAP pueden dar valores relativos comparables, pero los valores de TRAP
son generalmente ms bajos que los valores TEAC para una serie dada de
compuestos antioxidantes (69, 72, 73). A menudo, los valores FRAP tienen una mala
relacin con otras medidas de antioxidantes. Se ha argumentado que la capacidad de
reducir el hierro tiene poca relacin con los procesos de extincin radicales (de
transferencia H) mediadas por la mayora de los antioxidantes. Sin embargo, la
oxidacin o la reduccin de los radicales a los iones an paradas de cadenas de
radicales, y reduciendo la potencia refleja la capacidad de los compuestos para
modular el tono redox en el plasma y los tejidos. El mecanismo de FRAP es totalmente
transferencia de electrones en lugar de SET mixta y HAT, por lo que en combinacin
con otros mtodos puede ser muy til para distinguir los mecanismos dominantes con
diferentes antioxidantes. Adems, debido a metales reducidos son propagadores
activos de las cadenas de radicales a travs de la reduccin de hidroperxido de RO ,
sera interesante evaluar si los valores de alta FRAP se correlacionan con la tendencia
de los polifenoles para convertirse en pro-oxidantes bajo algunas condiciones. Esto se
ha demostrado para algunos flavonas y flavanonas (74), que tambin tienen altos
valores de FRAP.

Ventajas / desventajas del ensayo FRAP. Tanto los ensayos de FRAP y TEAC
evolucionan a partir de ensayos que se basan en la hiptesis de que las reacciones
redox proceder tan rpidamente que todas las reacciones son completa dentro de 4 y
6 min, respectivamente, pero de hecho esto no es siempre cierto. FRAP resultados
pueden variar enormemente dependiendo de la escala de tiempo de anlisis. Fenoles
de reaccin rpida que se unen al hierro o descomponen a compuestos con menor
reactividad o diferente se pueden analizar mejor con tiempos de reaccin cortos, por
ejemplo, 4 min. Sin embargo, algunos polifenoles reaccionan ms lentamente y
requieren tiempos de reaccin ms largos para la deteccin, por ejemplo, 30 min. El
orden de reactividad de una serie de antioxidantes puede variar enormemente, e
incluso invertir, dependiendo del tiempo de anlisis (69). Pulido y compaeros de
trabajo (69) examinaron recientemente el ensayo FRAP de polifenoles dietticos en
agua y metanol. La absorcin (A593) aument lentamente para polifenoles tales como
el cido cafeico, cido tnico, cido ferlico, cido ascrbico, y quercetina, incluso
despus de varias horas de tiempo de reaccin. Por lo tanto, un punto final de la
absorcin de un solo punto no puede representar una reaccin completados. El
ensayo FRAP no mide antioxidantes tiol, tales como el glutatin. FRAP en realidad
mide slo la capacidad reductora basado en el ion frrico, que no es relevante para la
actividad antioxidante mecnicamente y camente fisiolgica. Sin embargo, en
contraste con otras pruebas de poder antioxidante total, el ensayo FRAP es simple,
rpido, barato y robusto y no requiere equipo especializado. El ensayo FRAP se puede
realizar utilizando mtodos semiautomticos o manuales automatizadas.

Ensayo de reduccin de cobre (CUPRAC, AOP-90): Qumica General. Las variantes


del ensayo FRAP usando Cu en lugar de Fe se han introducido recientemente como
Bioxytech AOP-490 (75) y CUPRAC (76). Estos ensayos se basan en la reduccin de
Cu (II) a Cu (I) por la accin combinada de todos los antioxidantes (agentes
reductores) en una muestra. En el ensayo Bioxytech AOP-490, bathocuproine (2,9-
dimetil-4,7-difenil-1,10-fenantrolina) (Figura 4) forma un complejo 2: 1 con Cu (I),
produciendo un cromforo con mximo de absorbancia a 490 nm. Tarifas y la reaccin
y la concentracin de los productos son seguidos por bathcuproine formacin de
complejos de Cu (I) producido. El ensayo CUPRAC utiliza un compuesto relacionado,
neocuprona (throline 2,9-dimetil-1,10-phenan-) (Figura 4), el complejo Cu (I) de que
absorbe a 450 nm. Una curva de dilucin generada por las normas de cido rico se
utiliza para convertir absorbancia de la muestra a equivalentes de cido rico.
Complejos fenantrolina han solubilidad en agua muy limitada y por lo tanto deben ser
disueltos en disolventes orgnicos tales como etanol 95% y se diluye. Sin embargo, -
caroteno no reaccionar con el reactivo CUPRAC en etanol acuoso y requiere
dicloroetano, lo que limita la miscibilidad (76). CUPRAC valores son comparables a los
valores TEAC de polifenoles, mientras que los valores FRAP son por lo general
considerablemente inferior (76). El cobre, libre y en complejos fenantrolina, tiene un
potencial redox bajo que el hierro, por lo que sus reacciones son ms selectivos;
azcares y cido ctrico, interferencias comunes con FRAP, no se oxidan en CUPRAC.
Al mismo tiempo, el potencial redox bajo mejora el ciclo redox, por lo que la reduccin
de cobre puede ser un indicador an ms sensibles de potencial actividad pro-oxidante
de antioxidantes. Ventajas / desventajas de los ensayos de reduccin de cobre. El
cobre tiene ventajas sobre el hierro para los ensayos de antioxidantes en que todas las
clases de antioxidantes, incluyendo tioles, se detectan con poca interferencia de los
radicales reactivos y la cintica de reaccin de cobre son ms rpidos que el hierro. El
ensayo AOP-490 requiere slo 3 min; el ensayo CUPRAC es completa en minutos
para el cido ascrbico, cido rico, cido glico, y la quercetina, pero requiere 30-60
min para las molculas ms complejas. Por lo tanto, los ensayos de reduccin de
cobre tienen problemas similares con una mezcla compleja de antioxidantes en
trminos de la seleccin de un tiempo de reaccin adecuado. Mtodos AOC Utilizando
tanto del sombrero y de mecanismos. Aunque el TEAC y ensayos DPPH se clasifican
generalmente como reacciones SET, estos dos radicales indicadoras de hecho
pueden ser neutralizados, ya sea por reduccin directa a travs de transferencias
electrnicas o por extincin de radicales mediante transferencia atmica H (77).
Patrones y mecanismos de reactividad son, pues, difcil de interpretar sin informacin
detallada sobre la composicin y estructura de los antioxidantes que se ensaya. La
interpretacin es particularmente difcil cuando los pequeos agentes de molcula
reductor tal como el cido ascrbico estn presentes en los extractos de fenoles.
TEAC o ABTS Otros ensayos: Qumica General. El ensayo TEAC se inform por
primera vez por Miller y Rice-Evans (78), que se basa en la capacidad de eliminacin
de antioxidantes a la largo de la vida anin radical ABTS + (Figura 5). En este
ensayo, se oxida ABTS por los radicales peroxilo o otros oxidantes a su catin radical,
ABTS +, que es intensamente coloreado, y AOC es

Figura 3. Reaccin para el ensayo FRAP. Figura 4. Estructuras de bathocuproine y


neocuprona utilizan en ensayos de reduccin de cobre.

Mtodos estandarizados para la determinacin de la capacidad antioxidante

J. Agric. Food Chem.,

Vol. 53, N 10, 2005 4295

medido como la capacidad de los compuestos de ensayo para disminuir el color


reaccionar directamente con el ABTS + radical. Los resultados de los compuestos de
ensayo se expresan en relacin a Trolox. Originalmente, este ensayo utiliza
metmioglobina y H2O2 para generar ferrilmioglobina, que despus se hace reaccionar
con ABTS para formar ABTS + (78). La muestra a ensayar se aadi en el medio de
reaccin antes de la formacin del radical. Esta orden de adicin de los reactivos en el
ensayo TEAC entonces fue criticado como un gran peligro, porque los antioxidantes
pueden reaccionar con agentes oxidantes s mismos y, por tanto, dar lugar a una
sobreestimacin de la capacidad dantes dante (79). Por lo tanto, los protocolos de
"post-adicin" se propuso mejorar este ensayo (80, 81). En estas versiones revisadas,
la muestra a ensayar se aadi despus de la generacin y cuantificacin de ABTS
+, que se esperaba para minimizar la interferencia de compuestos con oxidantes
durante la formacin radical y prevenir la posible sobreestimacin. Aparte de esta
modificacin, otras modificaciones en trminos del mtodo utilizado para generar
ABTS +, longitudes de onda que se utilizan para controlar la reaccin, y mtodos de
cuantificacin fueron tambin hechas por diferentes investigadores, que han conducido
a una serie de diversos mtodos. Algunos mtodos modificados no han utilizado el
nombre "TEAC", pero que en realidad comparten el mismo mecanismo de reaccin y
utilizar el mismo catin radical, ABTS +

Segn Cano et al. (82), ABTS + puede ser generado por cualquiera de reaccin
qumica [por ejemplo, dixido de manganeso (83), ABAP (81), persulfato de potasio
(80)] o enzima reacciones [por ejemplo, metmioglobina (78), la hemoglobina, o
peroxidasa de rbano picante (82, 84)]. En general, la generacin de producto qumico
requiere un largo tiempo (por ejemplo, hasta 16 h para la generacin de persulfato de
potasio) o altas temperaturas (por ejemplo, 60 C para la generacin de ABAP),
mientras que la generacin de la enzima es ms rpido y las condiciones de reaccin
son ms leves. Cano et al. (85) peroxidasa de rbano picante utilizados para generar
ABTS + y han demostrado que la reaccin puede ser estudiada en un amplio
intervalo de valores de pH. Sin embargo, el mecanismo de reaccin puede cambiar
con el pH; por ejemplo, la transferencia de electrones se facilita a pH cido (8). Esta
variacin se ha adaptado tambin para medir antioxidantes selectivamente hidrfilos y
lipfilos mediante la ejecucin del ensayo en medios tamponados y disolventes
orgnicos, respectivamente (82, 86, 87), o mediante la particin de antioxidantes en
mezclas entre hexano y disolventes acuosos (18). Sin embargo, las reacciones
solubles en agua parecen ser favorecidos (88). Los mximos de absorcin (max) de
ABTS + mostraron ser en longitudes de onda de 415, 645, 734 y 815 nm. Entre ellos,
415 y 734 nm fueron adoptados por la mayora de los investigadores para supervisar
espectrofotomtricamente la reaccin entre los antioxidantes y ABTS + (87). En
trminos de mtodos de cuantificacin, la mayora de los mtodos revisados recientes
miden la disminucin de absorbancia de ABTS + en presencia de muestra de prueba
o Trolox en un punto de tiempo fijo (4-6 min) y, a continuacin capacidad antioxidante
se calcul como equivalentes de Trolox. Ventajas / desventajas de TEAC. Debido a
que el ensayo TEAC es operacionalmente simple, se ha utilizado en muchos
laboratorios de investigacin para el estudio de AOC. Se han reportado valores TEAC
de muchos compuestos y muestras de alimentos (66-68, 89-91). ABTS + reacciona
rpidamente con los antioxidantes, tpicamente dentro de 30 min. Se puede utilizar
sobre un amplio rango de pH y se puede utilizar para estudiar los efectos del pH sobre
los mecanismos antioxidantes (8). Tambin, ABTS + es soluble tanto en disolventes
acuosos y orgnicos y no se ve afectado por la fuerza inica, por lo que se puede
utilizar en mltiples medios para determinar tanto las capacidades antioxidantes
hidrfilos y lipfilos de extractos y fluidos corporales (92). TEAC reacciones pueden
ser automatizados y adaptados a las microplacas (55, 73, 93), fluya de inyeccin (10,
94), y para flujo detenido (95). El radical ABTS utilizado en ensayos de TEAC no se
encuentra en la biologa de los mamferos y por lo tanto representa una fuente de
radicales "no fisiolgico". Termodinmicamente, un compuesto puede reducir ABTS +
si tiene un potencial redox inferior a la de ABTS (0,68 V). Muchos compuestos
fenlicos tienen bajos potenciales redox y por lo tanto pueden reaccionar con ABTS
+. Adems, la reaccin TEAC puede no ser la misma para reacciones lentas, y puede
tomar mucho tiempo para llegar a un punto final. Por lo tanto, mediante el uso de un
punto final de corta duracin (4 o 6 min), uno puede ser la lectura antes de que se
termin la reaccin y el resultado en valores TEAC bajados. Van den Berg et al. (81)
concluy que "la evaluacin cuantitativa de la capacidad antioxidante utilizando el
TEAC puede ser problemtico o incluso imposi- ble, pero puede ser utilizado para
proporcionar un orden de clasificacin de los antioxidantes". 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
(DPPH) Ensayo general Chemistry. El DPPH (Figura 6) radical es uno de los pocos
radicales orgnicos de nitrgeno estables, que lleva un color prpura intenso. Est
disponible comercialmente y no tiene que ser generada antes del ensayo como ABTS
+. Este ensayo se basa en la medicin de la capacidad reductora de antioxidantes
hacia DPPH . La capacidad se puede evaluar por resonancia de spin electrnico
(EPR) o mediante la medicin de la disminucin de su absorbancia. El ensayo de
decoloracin ampliamente utilizado fue reportado por primera vez por los compaeros
de trabajo (96) Brand-Williams y. Ensayos de antioxidantes se basan en la medicin
de la prdida de color DPPH a 515 nm despus de la reaccin con compuestos de
ensayo (97), y la reaccin se controla por un espectrmetro eter. El porcentaje de
DPPH restante se calcula como :

El porcentaje restante de DPPH ( DPPH REM) es proporcional a la concentracin


de antioxidante, y la concentracin que provoca una disminucin en la concentracin
inicial de DPPH por 50 % se define como EC50 . El tiempo necesario para alcanzar
el estado estacionario con EC50 se define como TEC50 . Compaeros de trabajo ( 99
) Sa'nchez -Moreno y se introdujeron adicionalmente otro parmetro para expresar la
capacidad antioxidante , llamado "eficiencia antirradical (AE ) " . Se define como

El ensayo de DPPH se
considera que est basado principalmente en una reaccin ET, y la abstraccin de
hidrgeno-tomo es una ruta de reaccin marginal (2). Ventajas / desventajas del
ensayo DPPH. La prueba es simple y rpida y slo necesita un espectrofotmetro UV-
vis de realizar, lo que probablemente explica su uso generalizado en el cribado
antioxidante. Sin embargo, la interpretacin es complicada cuando los compuestos de
ensayo tienen espectros que se superponen DPPH a 515 nm. Los carotenoides, en
particular, interfieren (98). El uso de DPPH para medir AOC est plagada de muchos
inconvenientes. El ensayo es

Figura 5. Estructura de 2,2'-azinobis (3-6-etilbenzotiazolina-sulfnico) (ABTS +).

Figura 6. Estructura de 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH ).

% DPPH

REM) 100 [DPPH ] REM / [DPPH ] T) 0

AE) 1 / EC50TEC50

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J. Agric. Food Chem.,

Vol. 53, No. 10, 2005 Prior et al.

no una reaccin competitiva porque DPPH es a la vez la sonda radical y oxidante.


Color de DPPH se puede perder a travs de cualquiera de reaccin radical (HAT) o
reduccin (SET), as como las reacciones no relacionados, y la accesibilidad estrica
es un determinante importante de la reaccin. Por lo tanto, las pequeas molculas
que tienen un mejor acceso al sitio radical tienen mayor aparente AOC con esta
prueba. DPPH tiene una gama relativamente pequea reaccin lineal de solamente
3.2 veces. DPPH es un radical nitrgeno estable que no guarda ninguna similitud con
los radicales peroxilo altamente reactivas y transitorias que participan en la
peroxidacin lipdica. Muchos antioxidantes que reaccionan rpidamente con los
radicales peroxilo puede reaccionar lentamente o incluso pueden ser inerte para DPPH
debido a la inaccesibilidad estrico. DPPH tambin se decolora por agentes
reductores, as como la transferencia de H, lo que tambin contribuye a
interpretaciones inexactas de AOC. Por lo tanto, AOC no est bastante calificado por
la capacidad de los antioxidantes para reaccionar con DPPH. Folin-Ciocalteu (FC)
AOC o fenoles totales Ensayo. Siempre existe la controversia sobre lo que est siendo
detectado en fenoles totales de capacidad antioxidante assayssonly, o fenoles ms
agentes reductores, ms posiblemente, quelantes de metales. El ensayo FC durante
muchos aos ha utilizado como una medida de fenoles totales en productos naturales,
pero el mecanismo bsico es una reaccin de oxidacin / reduccin y, como tal, se
puede considerar otro mtodo AOX.

Qumica General del Mtodo F-C. El mtodo FC original desarrollado en 1927 se


origin a partir de reactivos qumicos utilizados para el anlisis de tirosina (100) en el
que la oxidacin de fenoles por un reactivo molybdotungstate produce un producto
coloreado con max a 745-750 nm:

El mtodo es simple, sensible y preciso. Sin embargo, la reaccin es lenta a pH cido,


y carece de especificidad. Singleton y Rossi (101) mejoraron el mtodo con un reactivo
heteropolianin fosfrico molybdotungsto y que la reduccin de fenoles ms
especficamente; la max para el producto es 765 nm. Tambin impusieron medidas y
condiciones para la obtencin de datos fiables y predecibles obligatorios: (1) la
relacin de volumen adecuado de reactivo alcalino y FC; (2) el tiempo de reaccin y la
temperatura ptima para el desarrollo del color; (3) el seguimiento de la densidad
ptica a 765 nm; y (4) el uso de cido glico como el estndar de fenol referencia-. El
mtodo mejorado descrito por Singleton y Rossi (SR; 100; 101) especifica las
condiciones para minimizar la variabilidad y eliminar resultados errticos. Las
condiciones explcitas del mtodo de SR son como sigue: mezcla 1 ml de muestra
(adecuadamente diluido) con al menos 60 ml de agua y 5 ml de reactivo de FC;
despus de 30 s y antes de 8 minutos, aadir 15 ml de Na2CO3; mezclar y llevar a
100 ml de volumen total con agua; incubar durante 2 horas a 75 F y medir la
absorbancia. Singleton y Rossi (101) concluyeron que "en comparacin con mtodos
de oxidacin o de absorbancia ultravioleta de permanganato, el mtodo SR produce
resultados predecibles en una amplia gama de compuestos fenlicos". Sin embargo,
muy pocos trabajos publicados en 2003 siguieron los pasos exactos del mtodo
mejorado FC. Diferentes concentraciones de reactivos y el calendario de las adiciones
y la incubacin se utilizan con frecuencia. Adems, un nmero de trabajos han
sustituido equivalentes
el estndar recomendado glico referencia cido con equivalentes de catequina (102,
103), equivalentes de cido tnico (104), cloro gnicas de cido (105), equivalentes de
cido cafeico (106), equivalentes de cido protocatquico (107), equivalentes de cido
vanllico (108 ), y equivalentes de cido ferrulic (109). La falta de estandarizacin de
los mtodos puede llevar a varios rdenes de magnitud de diferencia en fenoles
detectados. Fenoles totales en los arndanos, por ejemplo, oscilaron desde 22 hasta
4180 mg / 100 g de peso fresco, dependiendo principalmente de las condiciones de
ensayo (110). Por lo tanto, continu los esfuerzos para estandarizar el ensayo estn
claramente justificadas. Se estn llevando a cabo en la industria del vino de
estandarizar este mtodo para la medicin de compuestos fenlicos del vino. Ventajas
/ desventajas de la prueba F-C. El mtodo FC es simple y puede ser til en la
caracterizacin y estandarizacin de muestras botnicas siempre que algunas de las
limitaciones y variaciones antes mencionadas estn adecuadamente controlados. El
mtodo FC adolece de una serie de interferencias sustancias ing [en particular
azcares, aminas aromticas, dixido de azufre, cido ascrbico y otros enediols y
reductonas, cidos orgnicos, y Fe (II)], y se debe hacer correccin para las
sustancias que interfieren. Sustancias orgnicas no fenlico adicionales que
reaccionan con el reactivo includd FC adenina, adenosina, alanina, anilina, cido
aminobenzoico, cido ascrbico, benzaldehdo, creatinina, cistena, citidina, citosina,
dimethyaniline, lamine dipheny-, EDTA, fructosa, guanina, guanosina , glicina,
histamina, histidina, indol, metilamina, cido nitriloactico, cido oleico, feniltiourea,
protenas, piridoxina, sacarosa, cido sulfanlico, tiourea, timina, timidina, trimetilamina,
triptfano, uracilo, cido rico, y xantina. Adems, algunas sustancias inorgnicas
tales como hidrazina, cloruro de hidroxiamonio, sulfato de hierro y amonio, sulfato de
hierro, sulfato de manganeso, nitrito de potasio, cianuro de sodio, metabisulfito de
sodio, fosfato de sodio, sulfito de sodio, y cloruro de estao tambin pueden
reaccionar con el reactivo de FC para dar elevado concentraciones de fenlicos
aparentes (111, 112). El tipo de compuestos fenlicos que se incluyen en el mtodo
FC debe ser considerado, los pasos de anlisis deben ser seguidos de acuerdo con el
mtodo modificado SR original, correcciones adecuadas en el anlisis de FC deben
hacerse segn proceda, y cido glico deben utilizarse como un estndar de
referencia. Si se siguen estos factores, un mtodo uniformemente aceptable de
anlisis total de compuestos fenlicos se puede establecer, por lo que los resultados
se pueden comparar racionalmente.

La relacin entre el mtodo FC y AOC medi- medicio- por ORACFL generalmente es


bueno; Sin embargo, las diferencias en la forma en que los componentes antioxidantes
en diferentes alimentos reaccionan de este mtodo difieren (ver Figura 7; comparar
caup a arndanos y moras) de la del mecanismo SOMBRERO de ORACFL.

RECOMENDACIONES PARA NORMALIZADO AOC MEDICIN

Las ventajas y desventajas de algunos de los diferentes mtodos de AOC relativos a la


simplicidad, instrumentacin requerida, la relevancia biolgica, mecanismos, punto
final, mtodo de cuantificacin, y el potencial tanto para AOC lipfilo e hidrfilo
medicin de se resumen en la Tabla 1. Un factor principal a considerar en la seleccin
de un mtodo se refiere al mecanismo de la reaccin y su relacin con lo que podra
ocurrir en la aplicacin de destino. Para que la accin antioxidante clsica, se prefiere
un ensayo basado en un mecanismo de sombrero sobre un mecanismo de reaccin
SET porque el radical peroxilo es el predominante radical encontrado en la oxidacin
de lpidos en los alimentos y los sistemas biolgicos libre. Sin embargo, tambin puede
ser importante para desarrollar ensayos que utilizan otras fuentes de radicales tales
como el hidroxilo, superxido.
Figura 7. Relacin entre ORACFL y la medicin de la capacidad antioxidante por el
mtodo F- C en diferentes alimentos (Lucas Howard , datos no publicados ,
comunicacin personal).

y peroxinitrito, porque estos son activos en las clulas y tejidos de plantas y animales
por igual, y es evidente que no todos los antioxidantes se comportan de la misma
hacia diferentes fuentes de radicales. No solo ensayo puede ser considerado un
"ensayo total capacidad antioxidante" a pesar de que se puede realizar tanto en una
solucin acuosa y en un entorno lipfilo. Sin embargo, para dilucidar plenamente un
perfil completo de la capacidad antioxidante contra varios ROS / RNS, como O2 -,
HO y NO , puede ser necesario el desarrollo de diferentes mtodos especficos para
cada ROS / RNS. Entre otros factores que son importantes e influyen en la seleccin
de un buen mtodo son relevancia biolgica y el punto final, as como mtodo de
cuantificacin. ORAC, TRAP, y la oxidacin de LDL son considerados como los
ensayos ms biolgicamente relevantes (Tabla 1). La capacidad antioxidante de estos
mtodos in vitro puede reflejar ms estrechamente en la accin vivo. Por esta razn
tienen ventajas sobre los mtodos que adoptan los radicales libres menos relevantes o
irrelevantes en un sistema biolgico. La eleccin de los mtodos de punto final y de
cuantificacin estn relacionados a si un determinado mtodo puede evaluar con
precisin las diferentes muestras o no. Un buen mtodo debe ser adecuado para
evaluar diferentes antioxidantes o mezcla de antioxidantes y dar un valor exacto.
Adems, un buen mtodo debe ser capaz de distinguir el antioxidante (s) con
diferentes cinticas de reaccin. Numerosos estudios han demostrado que la diferente
antioxidante (s), especialmente para muestras de alimentos con una composicin
antioxidante complicado, tener diferentes curvas de reaccin. Por ejemplo, en ensayos
de decoloracin, hay tres curvas tpicas que podran ser observadas en siguiendo la
disminucin de radicales libres o de la sonda (Figura 8) ya sea por espectrometra UV-
vis, fluorescencia, luminiscencia o. Para los mtodos que utilizan un tiempo o
inhibicin grado fija como punto final, la seleccin de tiempo o el grado de inhibicin es
crtica para el ensayo. De la Figura 8 , est claro que los diferentes puntos de tiempo
T1 , T2, y T3 o diferentes grados de inhibicin ( 50 o 20 % , respectivamente) darn
bastante diferentes valores de AOC y pueden incluso cambiar el ranking. Cualquier
actividad de la reaccin despus de que el punto fijo es totalmente ignorado en el valor
AOC computarizada . Sin embargo , los mtodos que utilizan las AUC como ORAC ,
que tiene un punto de partida claro (lnea de base ) y un punto final claro ( de nuevo a
la lnea de base ) . El clculo de las AUC utiliza tanto tiempo de inhibicin y el grado ,
lo que refleja los diferentes cintica de la reaccin . Desde este punto de vista ,
creemos que los ensayos utilizando AUC proporcionan mejores datos que los mtodos
que utilizan un punto de tiempo fijo o el grado de inhibicin .
Figura 8. Comparacin Ejemplo de utilizacin de criterios de valoracin de tiempo fijo o
inhibicin fija por ciento en los datos de AOC .

Comparacin Futuro de los resultados de diferentes mtodos de AOC no es probable


que produzcan mayor cantidad de informacin nueva, porque no es posible observar
buena concordancia entre los mtodos a travs de un grupo diverso de productos
botnicos, particularmente si el meca- nismo de reaccin difieren. Altas correlaciones
se han observado entre el FRAP y ORACFL en algunos alimentos, pero poca o
ninguna relacin en otros alimentos (65). En el ensayo de AOC de extractos a partir de
materiales naturales, es importante reconocer que los antioxidantes pasan abarcar una
amplia gama de polifenoles, agentes reductores, y nuclefilos que varan en (a) la
solubilidad y la fase de la localizacin, (b) el potencial redox, y ( c) especificidad y
mecanismo de accin. Adems, cuando se consideran los efectos fisiolgicos de los
antioxidantes, es importante tener en cuenta tambin la reduccin de la actividad que
puede estar involucrado en el mantenimiento de tono redox, en la transduccin de la
seal, y en el ciclismo de metal y los posibles efectos pro-oxidantes. En la actualidad,
no solo ensayo disponible proporciona toda la informacin deseada, por lo que la
evaluacin de la capacidad antioxidante total puede requerir mltiples ensayos para
generar un "perfil antioxidante" abarca reactividad hacia ambos radicales acuosas y de
lpidos / orgnicos directamente a travs de inactivacin de radicales y radical
reduccin de mecanismos e indirectamente a travs de complejos metal. Problemas
de validacin. Las principales razones del fracaso de muchos estudios de validacin
de mtodos analticos a menudo son el resultado de (1) la falta de optimizar la
robustez de la prueba, (2) la falta de describir claramente el mtodo, (3) muchos
analitos, (4) tambin ms amplia gama de concentraciones de analitos en el material
de prueba, (5) la falta de formacin analista, (6) las calificaciones del laboratorio, y (7)
la falta de reconocimiento o controlar la presencia de sustancias interferentes. Los
problemas a menudo se pasa por alto en los estudios colaborativas han incluido la
homogeneidad de la muestra, el fracaso para maximizar la eficiencia de la extraccin,
falta de identificacin de los puntos crticos de control, y el incumplimiento de los
procedimientos de control de calidad buenos. Incluido en los protocolos de
normalizacin deben ser los procedimientos de extraccin y toma de muestras, manejo
crtico consideraciones opera- incluyendo la identificacin de las interferencias y los
procedimientos para su eliminacin, los procedimientos de almacenamiento,
procedimientos detallados para el anlisis, y el anlisis estadstico. Mtodos de
extraccin consistentes sern crticos. Debido a la diversidad de fitoqumicos
antioxidantes en productos botnicos, ningn sistema de disolvente nico es probable
que sea ptima para todos. Por lo tanto, puede ser necesario realizar algunos
compromisos. Estas cuestiones especficas que no se han tratado en detalle en este
resumen, pero ser importante que se inici la validacin real de mtodos
estandarizados. Recomendaciones para Mtodos AOC Normalizacin. A partir de esta
evaluacin, es claro que ningn ensayo de una AOC ser verdaderamente reflejar la
"capacidad antioxidante total" de una muestra particular. La capacidad antioxidante
total debe reflejar tanto la capacidad lipfila e hidrfila, y al menos para la actividad
fisiolgica que necesita para reflejar y diferenciar tanto por transferencia de tomos de
hidrgeno (inactivacin de radicales) y la transferencia de electrones (reduccin
radical). Adems, para dilucidar plenamente un perfil completo de la capacidad
antioxidante, las pruebas que evalan la eficacia contra diversas especies de oxgeno
reactivo especies reactivas de nitrgeno / como O2 -, HO y ONOO- se necesita, y
esto puede requerir el desarrollo futuro de mtodos adicionales especfico para cada
fuente de radicales.

Con estos factores en mente, se propone que tres de los mtodos discutidos en esta
revisin (ORAC, fenlicos ensayo FC y TEAC) deben ser normalizados para su uso en
el control de calidad de rutina y la medicin de AOC de suplementos dietticos y otros
productos botnicos. Sin embargo, en lo que sugiere mltiples mtodos, no est claro
si realmente hemos ayudado a la industria de los nutracuticos. No va a haber ningn
tipo de relacin "normal" entre los mtodos, y por lo tanto uno debe decidir sobre un
solo mtodo o utilizar varios ensayos para comparar los alimentos o suplementos
dietticos. Puede ser necesaria estandarizacin de los mtodos adicionales en el
futuro a medida que se desarrollaron mtodos que utilizan otras fuentes de radicales.
Esta eleccin de los mtodos se basa en dos mtodos con diferentes mecanismos de
reaccin, con uno que utiliza el radical peroxilo debido a su predominancia en los
sistemas biolgicos y el otro el mecanismo SET utilizando el ABTS + radical. El
ensayo de compuestos fenlicos FC ofrece una tercera opcin para un ensayo simple,
rpido, barato y robusto que no requiere equipo especializado, pero se puede
automatizar para el ensayo de rendimiento alto. El ensayo ORACFL representa un
mecanismo biolgicamente relevante, que puede medir tanto AOC lipfilo e hidrfilo y
est adaptado para ensayo de alto rendimiento.

RECONOCIMIENTO

Especial agradecimiento se extiende a todos los participantes y presentadores para la


entrada y animadas discusiones en el Primer Congreso Internacional sobre Mtodos
antioxidantes. Entrada especfica

para este trabajo de los Dres. L. Howard, D. Huang, CY Lee, B. Ou, y J. Vinson es
apreciado.