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Guiade Bioqca Analitica 2011
Guiade Bioqca Analitica 2011
BIOQUMICA ANALTICA
2011
FABRICIO PIERSIMONI
CROMATOGRAFAS
Cromatografa en Papel
Objetivo:
Familiarizarse con la tcnica cromatogrfica , en general y con la de particin en particular.
Comparar la corrida en papel con la desarrollada en TLC.
Resumen:
Se utilizar papeles Whatman N1 para la separacin de soluciones de colorantes
comnmente utilizados en qumica.
Reactivos:
Soluciones de colorantes entregadas por el docente.
Eluyente: n-butanol:etanol:amonaco 2 N (60:20:20).
Materiales e instrumental:
Papel Whatman 1
Cuba cromatogrfica
Tubos capilares
Placas de TLC
Procedimiento:
Cortar una hoja de papel Whatman N1 del tamao adecuado para la cuba cromatogrfica que
se utilizar (para ello previamente hacer un molde con un papel cualquiera). Trazar la lnea de
siembra con un lpiz de trazo fino, aproximadamente a1.5 cm del borde inferior. Marcar los
puntos de siembra sobre dicha lnea, dejando espacios de 1 cm entre ellos y 1 cm de cada
borde del papel.
Realizar la siembra con un capilar previamente cortado. Se sembrar una mezcla de distintos
colorantes.
Introducir el papel en la cuba previamente saturada con el solvente de desarrollo. Una vez que
el solvente haya alcanzado la altura deseada (como mnimo el 80% de la altura total del papel)
sacar el cromatograma de la cuba. Marcar el frente de solvente con un lpiz y dejar secar.
Medir el Rf .
Realizar el mismo procedimiento utilizando una placa de TLC.
Resultados
Consignar los valores de Rf obtenidos para los indicadores utilizados. Comparar los Rf de los
componentes de la mezcla con los Rf de los patrones, a su vez comparar las corridas hechas
en las distintas fases estacionarias.
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Cromatografa en Capa Fina (TLC)
Objetivo:
Familiarizarse con la tcnica de cromatografa en capa delgada para la separacin de distintos
compuestos: aminocidos y pigmentos liposolubles. Aplicacin de la tcnica a productos
naturales.
Resumen:
Se estudiar la influencia del volumen de siembra y la naturaleza del solvente (polaridad) en el
desarrollo del cromatograma. Se aplicar la tcnica para identificar los aminocidos presentes
en jugos de fruta. Lo mismo para la separacin e identificacin de clorofila Ay B.
Reactivos:
Aminocidos
Patrones al 0,25% en isopropanol:agua (10:90) de distintos aminocidos
Solvente: n-butanol:cido actico glacial:agua (3:1:1)
Revelador: ninhidrina 0,2% en acetona, recientemente preparada
Materiales e instrumental:
Cromatofolios recubiertos con slica gel
Cuba cromatogrfica
Tubos capilares
Papel de filtro
Embudo
Erlenmeyer
Varillas de vidrio
Procedimiento:
Ac.
Ac. Asparagi glutamin
glutm histidina treonina serina prolina alanina arginina
asptico na a
ico
Naranja si Si Si si si si si si
Limn si No Si si si si
Pomelo si Si si si si
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Resultados
Comparar los Rf de los componentes del jugo con los valores de los patrones e identificarlos
en las muestras de jugo de fruta. Calcular la polaridad del solvente utilizado.
Pigmentos Vegetales
Introduccin
Muchos de los colores asociados a las plantas superiores se deben a la presencia de
determinados compuestos qumicos o pigmentos. Estos se encuentran estrechamente ligados
a las actividades biolgicas del propio vegetal. Si bien es posible encontrar en el reino vegetal
todos los matices y combinaciones de colores del espectro, existe un predominio general de
los colores primarios: verde, amarillo, rojo y azul. El color particular que presenta determinado
rgano vegetal depende del predominio de uno u otro de dichos pigmentos, o de la
combinacin de varios de ellos. Cuando ciertas partes del vegetal presentan color blanco, es
debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ella no es absorbida
selectivamente como en las partes coloreadas, sino que es trasmitida o reflejada sin sufrir
modificaciones.
Clorofilas
Son los pigmentos verdes implicados en la fotosntesis de la plantas superiores. Este nombre
se extendi posteriormente a todas la clases de pigmentos fotosintticos porfirnicos.
Las molculas de clorofila se encuentran estrechamente unidas a lpidos, protenas y
lipoprotenas. Entre las clorofilas ms abundantes se encuentra la A y la B, siendo la primera la
predominante.
Las feofitinas pertenecen al grupo de las clorofilas. La estructura qumica de la feofitina A
corresponde a una clorofila A sin Mg, y la B a la clorofila B sin Mg.
Objetivo:
Separacin de los pigmentos de hojas verdes.
Resumen:
Las hojas verdes presentan una serie de colorantes, entre ellos la clorofila, responsable del
color, y los carotenos cuya presencia no es tan evidente, ya que habitualmente su color no
alcanza a manifestarse. Se proceder a su extraccin por solventes y a su separacin por
cromatografa en placa delgada.
Reactivos:
Acetona
Etanol
ter de petrleo (fraccin 60-80 C)
Solvente de desarrollo: ter de petrleo (fraccin 60-80 C) y acetona (7:3).
Sulfato de sodio anhidro (secado en estufa a 100 C durante una hora y conservado en
desecador.
ter de petrleo 40-60
ter de petrleo 60-80
Dioxano
Isopropanol
Materiales e Instrumental:
Ampolla de decantacin
Erlenmeyer
Probeta
Varillas de vidrio
Embudo
Algodn
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Bao termostatizado
Ampolla de decantacin
Cristalizador
Cromatofolios de silicagel
Cuba cromatogrfica
Capilares
Procedimiento:
Resultados
Consignarlos Rf de clorofilas y los patrones. Compararlos.
Calcular la polaridad del solvente utilizado
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Cromatografa de Adsorcin En Columna
Objetivo:
Separacin de los pigmentos presentes en las hojas verdes por la tcnica de cromatografa en
columna.
Resumen:
La separacin de los componentes de una mezcla se basa en las distintas fuerzas de atraccin
que stos tienen con el adsorbente (fase fija). El ms fuertemente atrado por el adsorbente
ser el ms difcil de eluir con el solvente (fase mvil) y ser el que menos se desplazar. En
base a esto los distintos pigmentos se separaran de acuerdo a su afinidad por la fase
estacionaria como asi tambin por el eluyente.
Reactivos:
Eluyente ter acetona
Materiales e Instrumental:
Almina activada, a 180 C durante 2 horas.
Pipetas Pasteur
Lana de vidrio
Espectrofotmetro
Procedimiento:
Se prepara una columna de almina bsica. Se utiliza un tubo de vidrio con robinete
(semejante a una bureta) de aproximadamente 12 cm de longitud. Se llena con ter de
petrleo (60-80) y se va cargando con la almina de tal manera que el empaquetado sea
uniforme. No se debe permitir que la columna se seque (en el caso que ocurra esto y el
material aparezca quebrado o con grietas, se deber comenzar el proceso nuevamente).
Sembrar los pigmentos del prctico anterior. Eluir con el solvente ter: acetona. Recoger los
pigmentos a medida que van saliendo de la columna con la precaucin de cambiar de tubo
cuando el eluido cambia de color.
Una vez separados los componentes se reconocern cada uno de los componentes de la
muestra espectro de absorcin de cada uno.
Resultados
Determinar el mximo de absorcin de cada una de las muestras recogidas en los tubos y
compararlas con los valores de tabla para clorofila A y B.
Reactivos:
ter de petrleo 60-80
Acetona
Alcohol absoluto
Materiales e Instrumental:
Almina bsica activada, a 180 C durante 2 horas.
Columna de vidrio (tubo de vidrio con robinete)
Tubos de ensayo graduados
Pipetas Pasteur
Lana de vidrio
Espectrofotmetro
Procedimiento:
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Separacin
El eluyente a utilizar es una mezcla ter de petrleo (60-80)-acetona (9:1). Con ste corren las
xantfilas y se retiene la clorofila (100 ml). Se siembra con pipeta Pasteur (0,5 ml) de la
solucin etrea de pigmentos. Se abre el robinete para que la solucin penetre dentro del
relleno de la columna y se comienza a eluir. Se ver extender la zona verde de la clorofila y
luego comienza a separase y adelantarse una zona de color rojizo que contiene los carotenos.
Si la columna fue bien armada, estas zonas tendrn bordes netos. Cuando se note la
presencia de lquido coloreado a nivel de la lana de vidrio, se debe comenzar a recoger
fracciones de 1 ml. Tener en cuenta que los carotenos se oxidan rpidamente en presencia de
la luz. Cuando se ha eludo en forma completa las xantfilas, se cambia el eluyente por otro
ms polar. En este caso se utiliza la mezcla acetona-alcohol absoluto (1:1) (100 ml). Se eluirn
las clorofilas, recogiendo fracciones de 1 ml.
Caracterizan espectrofomtrica
A las fracciones eludas de la columna se les determina el espectro de absorcin. De esta
manera se determina el pico de absorbancia para cada pigmento.
Beta-Carotenos: 436 nm
Xantfilas: 474 nm
Clorofila A: 665 nm
Clorofila B: 649 nm
Resultados
Graficar absorbancia vs. volumen eluido.
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Cromatografa de Intercambio Inico
Objetivo:
Aplicar la tcnica de intercambio inico a la separacin de los iones presentes en una solucin.
Resumen:
Se utilizar una columna de resina catinica para retener, primero, y eluir, despus, una
solucin de Cu2+.
Reactivos:
Resina Dowex (catinica), previamente equilibrada con agua destilada.
Solucin de HCl 0,2 N
HClO4 (c)
Solucin de CuSO4 conteniendo 5,5 mg Cu2+/ml
Materiales e instrumental:
Columnas cromatogrficas
Pipetas
Tubos de ensayo
Procedimiento:
Realizar las lecturas de absorbancia para cada una de las muestras a 800 nm.
Construir el grfico de absorbancia vs [Cu2+].
Se utilizar una columna Dowex (catinica), previamente equilibrada con agua
destilada.
Se siembran 5 ml de la solucin madre y se eluye con HCl 0,2 N, y se toman fracciones
de 2 ml. A cada fraccin se le agregan 3 ml de agua destilada y 0,5 ml de HClO4 (c). Medir
absorbancia en cada muestra. Consignar los valores en una tabla.
Resultados
Con la curva de calibracin calcular la concentracin de cobre en cada fraccin. Consignar en
una tabla [Cu2+] vs volumen eludo. Representar el cromatograma ([Cu2+] vs volumen eludo).
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1.7) Cromatografa de Intercambio Inico
Objetivo:
Aplicar la tcnica de intercambio inico a la desionizacin de una muestra de agua de dureza
conocida , por medio de intercambio aninico y catinico.
Resumen:
Se utilizar una columna de resina catinica para retener, primero y eluir despus, una
muestra de agua, y luego una columna de resina aninica.
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Cromatografa de Exclusin Molecular o Permeacin en Gel
Objetivo:
Familiarizarse con el uso de las resinas de exclusin o tamices moleculares. Su utilizacin
para caracterizacin de peso molecular.
Resumen:
La cromatografa de permeacion en gel es un mtodo de purificacin de polmeros naturales y
sintticos, que separa molculas en funcin de sus tamaos moleculares. La matriz slida que
se va a utilizar en la practica esta constituida por un polmero de dextrano entrecruzado con
epiclorhidrina. Es un polisacrido altamente hidrofilico, al igual que el almidn, que se hincha
en contacto con un solvente acuoso. Su nombre comercial es el de Sephadex G-100. Se
fabrica en partculas esfricas porosas con distinto grado de entrecruzamiento y por lo tanto
con diferentes capacidades de separacin de molculas.
Las propiedades ms importantes del Sephadex G-100 son;
Separa protenas en el rango de 4000 150000 Da
Retiene una cantidad de agua de 10 ml +/- 1 ml por gramo de Sephadex seco
Su densidad es de 1.04g/ml
La forma de gel se consigue por hidratacin
Reactivos:
Sephadex G-100
Solucin de NaCl 0.9 %
Buffer acetato 0,2 M (pH 6)
Solucin de azul Dextrano: 0,3 % p/v en buffer
Solucin de mioglobina: 0,1% p/v en buffer
Solucin de Catalasa: 0,1 % p/v en buffer
Solucion de Albumina: 0.1% p/v en buffer
Solucion de Vitamina B12
Materiales e instrumental:
Columna cromatogrfica
pipetas
tubos de ensayo
Procedimiento:
Preparacin de la columna
Se mezcla una cantidad adecuada de Sephadex con la fase movi l(NaCl 0.9%) para permitir la
hidratacin y formacin del gel. Una vez hidratado se vierte dentro de la columna
cromatografica poco a poco y sobre las paredes de la misma para evitar la formacin de
burbujas. La altura de la columna preparada debe ser de aproximadamente 10 cm.A
continuacin se hace pasar suficiente cantidad de fase movil para lograr un buen
empaquetamiento de la columna.
Es importante antes de verter el gel en la columna colocar un trozo de lana de vidrio en la base
de la misma para evitar que el gel se vaya con la fase movil.
Caracterizacin de hemoglobina:
Como eluyente se usa una solucin 0,5 M en NaCl y 0,1 M en buffer acetato (pH 6). Como
patrones se utilizarn solucin de azul Dextrano (0,3 % p/v en buffer), solucin de mioglobina
(0,1% p/v en buffer) y solucin de hemoglobina (0,1% p/v en buffer).
La columna se equilibrar con el buffer salino. Aplicar 1 ml de solucin de hemoglobina (1 %
p/v en buffer) sobre el lecho de la columna, teniendo cuidado de no agitar el Sephadex. Abrir la
llave de la columna permitiendo que la muestra penetre dentro de la resina (tener cuidado de
que no se seque porque se quebrara). Agregar suficiente cantidad de buffer, despus de
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cerrar la llave. Abrir la llave dejando que el lquido fluya fuera de la columna, La muestra de
hemoglobina se mover lentamente a travs de la columna y la banda comenzar a
extenderse. Mantener siempre suficiente cantidad de buffer para impedir que se seque.
Recoger fracciones de eludo de 1 ml cada una (en tubos numerados). Seguir recogiendo
fracciones hasta que no haya color en los tubos.
Repetir la operacin con 1 ml de una mezcla conteniendo igual volumen de mioglobina y azul
Dextrano. Observar la separacin, recogiendo fracciones de 1 ml, como en el caso anterior
seguir hasta desaparicin de color.
Observar contra un fondo blanco todos los tubos y determinar la fraccin de color ms intenso.
Anotar a qu nmero de tubo corresponde. (Esto coincide con el volumen de elucin para cada
muestra pues se recogieron fracciones de 1 ml cada una). Para el azul dextrano este volumen
define el volumen muerto (Vo), o sea el volumen requerido para eluir un compuesto que no
penetra en los poros del gel. El azul dextrano tiene un peso molecular de 2.106 daltons y el G-
75 excluye cualquier material con peso molecular mayor de 50000 daltons.
Consignar los volmenes de elucin para las tres muestras.
Resultados:
Construir un grfico de volumen de elucin vs log PM (peso molecular). Para el azul dextrano
considerar un peso molecular de 50000, para la mioglobina considerar 17000. De acuerdo a la
teora, estos puntos pertenecen a una misma recta. De sta determinar el peso aparente de la
hemoglobina.
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Espectrofotometra
Dosificacin de Protenas:
Introduccin:
La reaccin del Biuret est basada en la formacin de un complejo azul prpura entre los
enlaces peptdico y el ion Cu2+ en medio alcalino. Este complejo absorbe luz en el espectro
visible (=540 nm).
Este mtodo tiene la ventaja de que es poco influenciado por la composicin aminoacdica de
las protenas presentes en la muestra ya que es una reaccin en la que interviene
directamente el enlace peptdico. Sin embargo, se trata de un mtodo que, comparado con
otros mtodos disponibles, resulta poco sensible, ya que cada ensayo requiere una cantidad
de protena superior a 0,1 mg. Adems, son numerosos los compuestos que interfieren, entre
otros, sacarosa, Tris, glicerol, EDTA.
Reactivos:
Patrn de protenas. Albmina 10mg/ml
Reactivo de Biuret. Disuelva 3,8 gr de CuSO4.5H2O y 6.7 gr de NaEDTA en 700 ml de
agua destilada. Mientras se agita aadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1 gr de KI como
estabilizante.
Mtodo:
Aadir 1 ml del reactivo de Biuret a los tubos estndar y a las muestras problemas como se
indica en la tabla. Dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos y leer absorbancia a 545
nm frente al blanco de la reaccin.
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Reactivos Resultados
Tubos Estndar(ul) H2O(ul) Biuret(ml) A 545 nm [protena]
Blanco 0 100 1
1 25 75 1
2 50 50 1
3 75 25 1
4 100 0 1
Muestras
M1 100 0 1
M2 100 0 1
M3 100 0 1
En 1927, Folin y Ciocalteu pusieron a punto un reactivo que lleva su nombre y que es la base
del mtodo descrito ms tarde por Lowry en 1951. An hoy, el mtodo de Lowry es
ampliamente empleado. En este ensayo tiene lugar una serie de reacciones de oxidacin /
reduccin cuyos detalles no se conocen con precisin. Transcurre en por lo menos dos pasos.
En el primer paso, se forma el complejo del biuret. Las condiciones de este ensayo favorecera
la reduccin del Cu2+ del complejo para dar Cu+ y enlaces peptdicos oxidados, en el segundo
paso, el Cu+ reduce el reactivo de Folin-Ciocalteu (inicialmente de color amarillo), lo cual da
lugar a varios compuestos de color azul que pueden ser detectados a 750 nm.
El componente activo del reactivo de Folin-Ciocalteu es el cido mixto fosfomolibdotngstico:
3H2O-P2O5-13WO3-5MoO3-10H2O.
La reduccin de este reactivo se manifiesta por la prdida de uno, dos o tres tomos de
oxgeno del tungstato y/o del molibdato, obtenindose las especies de color azul. Adems de
la reaccin del complejo biuret formado en la primera etapa, tambin contrubuyen a la
reduccin del reactivo las cadenas laterales de algunos aminocidos (Tyr, Trp, y en menos
medida Cys-Cys, Cys e His). Este ensayo es mucho ms sensible que la simple formacin del
complejo biuret. Pueden medirse cantidades de protena del orden de unos pocos
microgramos.
La susceptibilidad a la composicin aminoacdica de las protenas es una de las desventajas
del mtodo. Adems, algunos agentes reductores frecuentemente utilizados en preparaciones
de protenas (-mercaptoetanol, ditiotreitol) y quelantes de metales (EDTA), interfieren el
ensayo.
Reactivos:
Solucin alcalina de carbonato de sodio (Na2CO3 20 g/l en NaOH 0,1 M)
Solucin de sulfato de cobre-tartrato sdico potsico (5 g/l CuSO4.5H2O en tartrato
sdico potsico 10 g/l). Preprese en fresco mezclando las dos soluciones por separado.
Solucin alcalina. Preprese el mismo da mezclando 50 ml de la primera solucin con
1 ml de la segunda.
Reactivo de Folin-Ciocalteau. Diluya el reactivo comercial con un volumen igual de
agua, el mismo da que se va a utilizar. Esta es una solucin de tungstato de sodio y
molibdato de sodio en cido fosfrico y cido clorhdrico.
Patrn de protena. Solucin de albmina 0,2 mg/ml
Mtodo:
A 1 ml de la muestra agregue 5 ml de solucin alcalina. Mezcle vigorosamente y deje reposar
a temperatura ambiente por 10 minutos o ms. Agregue 0,5 ml del reactivo diluido de Folin-
Ciocalteau en forma rpida y mezclando inmediatamente. Despus de 30 minutos lea la
absorbancia contra el blanco apropiado a 750 nm.
Determine la concentracin de protenas de una solucin problema despus de preparar una
curva patrn.
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3) Absorcin ultravioleta de protenas y aminocidos:
Las protenas contienen grupos funcionales que absorben luz en el UV y por lo tanto pueden
ser utilizados para medir concentraciones por espectrofotometra. En particular, algunos
residuos aminoacdicos absorben luz en el UV cercano. Por otra parte, el enlace peptdico en
si mismo presenta un mximo de absorbancia a 190 nm.
Reactivos:
Protenas (albmina y casena 5 g/l)
Aminocidos (tirosina, triptofano y fenilalanina en agua 0,1 mM). Ajuste a pH 7,0 con
HCl 10 mM y NaOH 10 mM.
Mtodo:
Haga un grfico del espectro de absorcin de los compuestos usados en el intervalo 190
400 nm. En el extremo inferior de longitudes de onda, debe diluirse la solucin de protenas
aproximadamente 1/200.
Cules aminocidos absorben ms fuertemente a 280 nm ?
1. Objeto
Determinar el contenido de protenas de una muestra utilizando el mtodo de Bradford.
2. Resumen
El mtodo de Bradford c onsiste en la utilizacin de la reaccin entre la protena y el
Coomassie Brilliant Blue G-250, que reacciona con aquella dando un color caracterstico. La
posterior medicin de la absorbancia para distintas concentraciones de protena permite
construir una curva de calibracin.
3. Reactivos
cido fosfrico 85 % (p/v)
Etanol 95%
Solucin de Coomassie Brilliant Blue G-250: 100 mg se disuelven en 50 ml de etanol 95%.
Solucin de NaCl 0,15 M. Se agregan 100 ml del cido fosfrico. Diluir a un volumen final
de 1 litro. La solucin final es: 0,01 % (p/v) de Coomassie Brilliant Blue G-250, 4,7 % (p/v)
etanol, y 8,5 % (p/v) en cido fosfrico.
Soluciones de protena (SAB: seroalbmina bovina) al 0,1 % en 0,15 M NaCl.
4. Materiales e Instrumental
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Espectrofotmetro
Micropipetas
Tubos de ensayo
Cubetas de plstico o vidrio (visible)
5. Procedimiento
La solucin de protena conteniendo 10 a 100 g de protena en un volumen de hasta
0,1 ml se coloca en tubos de 12x100 mm. Se lleva a 0,1 ml con el buffer apropiado. Se
agregan 5 ml del reactivo y se mezcla por inversin o vortex. Se mide la absorbancia a 595 nm
despus de 2 minutos y antes de 1 hora en cubetas de 3 ml contra un blanco preparado con
0,1 ml del buffer apropiado y 5 ml del reactivo. Se grafica absorbancia vs la masa de protena
(g), resultando una curva que ser usada para la resolucin de una muestra incgnita que
ser entregada por el personal docente.
Tabla N 6
Tubo N (por duplicado)
Blanco 1 2 3 4 5 6 M1 M2
SAB (l) 0 20 40 50 60 80 100 - -
muestra (l) - - - - - - - 50 100
NaCl (l) 100 80 60 50 40 20 - 50 -
reactivo (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5
SAB: seroalbmina bovina.
6. Resultados
Informar el contenido en protenas de la muestra incgnita.
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ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)
1. Armar el molde formado por dos vidrios, bien desengrasados, separados por
espaciadores del espesor deseado.
2. Preparar 15 ml de la solucin correspondiente al gel separador segn la porosidad
deseada y verter en el molde . Dejar polimerizar. La polimerizacin debe tardar entre 10
y 15 min, en caso contrario, descartar.
3. Preparar 5 ml de la solucin correspondiente al gel concentrador, verterla en el molde
hasta 0,5 cm del borde. Inmediatamente colocar el peine adecuado. Dejar polimerizar.
Si la placa no se utiliza en el da debe guardarse en cmara hmeda a 4C.
4. Retirar el peine cuidadosamente, eliminando los restos de la solucin no polimerizada,
lavando con agua destilada.
5. Colocar la solucin buffer Tris-glicina pH 8,3 del reservorio electrdico en el
compartimiento inferior de la cuba en un volumen tal que permita el contacto con el gel
Sembrar el volumen apropiado de la muestra ( alrededor de 20l por calle)
6. Conectar la fuente de poder y trabajar a 20 mA hasta que la muestra atraviese el gel
concentrador y a partir de ese momento, a 25 mA o ms, siempre que no se supere un
voltaje de 250V.
7. Finalizar la corrida cuando el azul de bromofenol alcance el borde inferior del gel.
8. Teir con azul brillante de Coomassie de 5 a 10 horas.
9. Decolorar por sucesivos pasajes en solucin decolorante.
10. Conservacin:
A. En solucin de glicerol al 10% en H20
B. Por secado del gel empleando un equipo apropiado.
C. Por secado del gel entre membranas de celofn.
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Mezclar el volumen adecuado de muestra con solucin buffer de muestra (Tris-HCl 0,125 M,
1% SDS, 1% -mercaptoetanol, gotas de azul de bromofenol y sacarosa 10%), de tal manera
que la relacin protena:SDS sea 1:5 p/p. Colocar en bao a 100C durante 1 min.
NOTA: Utilizar guantes para el armado de los geles debido a que la Acrilamida es muy toxica
Tris 45,4g
HCl 1M 48,0ml
Agua destilada c.s.p. 1000,0ml
Titular hasta pH 8,8 con HCl 1M si es necesario.
Tris 15,0g
Llevar a pH 6,8 con HCl 1 M
Agua destilada c.s.p. 1000,0ml
Buffer de los reservorios electrdicos para SDS PAGE (Tris 0,025 mM glicina 0,192
mM, pH 8,3)
Tris 3,0g
Glicina 14,4g
SDS 1,0g
Agua destilada c.s.p. 1000,0ml
acrilamida 30,0g
N,N mutilen bis archilamida 0,8g
Agua destilada c.s.p. 100,0ml
Agitar para disolver. Filtrar por Whatman N1
Conservar en frasco oscuro recubierto con papel metalizado, a 4C.
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Solucin lavadora o decolorante c.s.p. 100,0ml
Solucin decolorante
cido actico: metanol: agua destilada 1:3:6 v/v
Resultados: Establecer los Rf de los patrones de peso molecular y determinar los PM de las
protenas incgnita
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