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(Peronospora farinosa)
DE LA QUINUA
(Chenopodium quinoa)
EN LA ZONA ANDINA
CGIAR
El CIP pertenece a Future Harvest (Cosecha del Futuro),
un grupo de centros que recibe la mayor parte de su
financiamiento de los 58 gobiernos, fundaciones privadas y
organizaciones internacionales y regionales que conforman
el Grupo Consultivo para la Investigacin Agrcola
Internacional (CGIAR). Future Harvest promueve el
ROYAL DANISH MINISTRY OF FOREIGN AFFAIRS
THE ROYAL VETERINARY AND AGRICULTURAL UNIVERSITY SOLVEIG DANIELSEN TERESA AMES
EL MILDIU
( Peronospora farinosa)
DE LA QUINUA
(Chenopodium quinoa)
EN LA ZONA ANDINA
Manual prctico para el estudio de
la enfermedad y del patgeno
ii
INDICE
PGINA
INTRODUCCION 1
EL MILDIU DE LA QUINUA 3
1. EL PATOGENO 3
1.1. Sistemtica 3
1.2. Morfologa 3
1.3. Ciclo de vida 4
1.4. Epidemiologa 6
1.5. Variacin gentica de Peronospora farinosa 6
2. LA PLANTA 7
2.1. Sntomas 7
2.2. Fuentes de resistencia en quinua 9
2.3. Evaluacin de la enfermedad 10
3. GLOSARIO 12
4. LITERATURA CONSULTADA 15
PROTOCOLOS 17
Protocolo 1. Produccin y mantenimiento de inculo 18
Protocolo 2. Aislamientos monospricos 20
Protocolo 3. Almacenamiento de aislamientos 21
Protocolo 4. Prueba de Floxina B para determinar la viabilidad de oosporas 22
Protocolo 5. Decoloracin de tejido foliar para observacin de oosporas 23
Protocolo 6. Deteccin de oosporas en semillas de quinua 24
Protocolo 7. Prueba de tipo de apareamiento (cruzamientos) 25
Protocolo 8. Prueba de virulencia en cmara de crecimiento 27
Protocolo 9. Evaluacin del grado de esporulacin y desarrollo de los sntomas 29
Protocolo 10. Evaluacin del mildiu en el campo 31
iii
INTRODUCCION
L a quinua (Chenopodium quinoa Willd.) tiene su origen en los Andes centrales, alrededor del
lago Titicaca, y ha sido cultivada por ms de 7000 aos en la regin andina. Es una planta con
alto poder nutritivo y constituye ancestralmente uno de los alimentos ms completos en la dieta del
poblador andino. A diferencia de muchos productos de la regin, tiene la ventaja de poder
almacenarse en condiciones naturales por mucho tiempo, constituyendo una reserva que se con-
sume a lo largo de muchos meses.
La quinua es una planta rstica, crece a grandes altitudes, donde las condiciones ambientales
son extremas y los suelos son poco frtiles, pero tiene una gran capacidad de adaptacin a climas
ms benignos como los de la costa peruana. La quinua posee una gran variabilidad y plasticidad
gentica que le permite adaptarse a diferentes zonas agroecolgicas.
La quinua tiene gran potencial para el mercado interno y externo tanto por la alta calidad
protica de su grano como por su alto nivel de tolerancia a condiciones adversas como sequa,
heladas y suelos salinos. Durante los ltimos aos el inters por la quinua ha aumentado y hoy en
da se cultiva quinua fuera de su zona de origen, en Amrica del Norte, Colombia, Chile, Argentina
y diferentes pases de Europa.
La planta de quinua como cualquier especie
vegetal y de acuerdo al ambiente donde se
cultive, est expuesta al ataque de una serie de
enfermedades con mayor o menor intensidad.
La enfermedad ms importante de la quinua es
el mildiu, causado por Peronospora farinosa, que
afecta principalmente el follaje (fig. 1) y puede
causar una reduccin considerable en el
rendimiento. Aunque la enfermedad es muy
conocida y ha sido estudiada por muchos aos,
existen muchos aspectos de la enfermedad y de
la interaccin hospedante-patgeno que todava
no son conocidos y requieren ser investigados.
Por ello, se necesita contar con la metodologa
apropiada para manejar el patgeno y estudiar
su interaccin con el hospedante, el efecto del
medio ambiente sobre el desarrollo de la
enfermedad (epidemiologa), la identificacin de
patotipos o razas, la identificacin de factores
de resistencia y tipos de apareamiento, estudios Fig. 1. Planta de quinua atacada por mildiu
sobre la formacin, germinacin y sobrevivencia (Peronospora farinosa)
1
de oosporas, etc, lo que permitir entender cmo influyen estos factores en el proceso de la
patognesis.
El mildiu ha sido ampliamente estudiado en otros hospedantes (Brassica, Arabidopsis, Pisum,
Glycine, Trifolium, Spinacia), pero en el caso de la quinua quedan todava muchos detalles que no
se conocen. Por ello se ha preparado el presente manual, donde se han recopilado tcnicas y
mtodos fitopatolgicos bsicos provenientes de la experiencia personal de los autores, as como
tambin de la de investigadores que han trabajado con esta enfermedad en otros cultivos y que por
semejanza pueden servir como punto de partida para trabajar en quinua. El uso de mtodos
uniformizados y estandarizados facilita el estudio de la enfermedad y permite que los resultados
sean comparables de un lugar a otro.
El presente manual contiene informacin que puede ser utilizada por investigadores interesados
en el estudio de la enfermedad: mejoradores, fitopatlogos, agrnomos, tcnicos, estudiantes y
agricultores interesados en la materia.
La primera parte incluye informacin bsica sobre las caractersticas del patgeno y el desarrollo
de la enfermedad. La segunda parte contiene protocolos para el manejo del patgeno a nivel de
laboratorio y escalas para evaluar la enfermedad en pruebas de laboratorio y campo.
Queremos agradecer a Judith Echegaray por su participacin en el desarrollo de las tcnicas
descritas en el manual, a Jos Luis Reyes por sus contribuciones al glosario, a Victor Mercado y
Candelaria Atalaya por su ayuda en la toma de fotos, a Sven-Erik Jacobsen por proporcionar
informacin general sobre el cultivo de quinua, y a Ed French y Luis Salazar por sus valiosos
comentarios y correcciones al manuscrito. Por ltimo, estamos agradecidos por el apoyo econmico
proporcionado por la Seccin de Fitopatologa, Instituto de Biologa de Plantas, Universidad Real de
Agricultura y Veterinaria de Dinamarca.
2
EL MILDIU DE LA QUINUA
1. EL PATOGENO Son de crecimiento determinado y cuando
1.1. Sistemtica alcanzan el tamao definido forman los
El mildiu de la quinua es causado por esporangios, por esta circunstancia todos los
Peronospora farinosa f.sp. chenopodii (Fr.) Fr., un esporangios son de la misma edad.
Oomicete, que pertenece a la familia Los esporangios son deciduos (a la madurez se
Peronosporaceae, orden Peronosporales, cuyos desprenden del esporangiforo), ovales, con una
miembros son parsitos obligados (biotrficos) papila apical translcida; miden entre 25.7 y 31.9
altamente especializados que parasitan plantas m de largo y 19.3 a 24.3 m de dimetro (fig. 3).
vasculares causando mildiu en un rango limitado Tienen la pared ligeramente rugosa y el
de especies. protoplasma granulado. Son de color castao
P. farinosa ataca especies de la familia claro translcido y germinan directamente
Chenopodiaceae a la cual pertenecen los gneros formando un tubo germinativo (no producen
Beta, Spinacia y Chenopodium. Un aislamiento de zoosporas como ocurre con otros Oomicetes). Por
P. farinosa slo ataca al gnero del cual ha sido esta forma de germinar se les designa
aislado. Debido a esta especializacin fisiolgica indistintamente con los nombres de esporangio,
el patgeno est subdividido en 3 grupos segn espora o conidia.
sus hospedantes: P. farinosa f.sp. betae en Beta Las oosporas son esporas sexuales que pueden
spp., P. farinosa f.sp. spinaciae en Spinacia spp., y sobrevivir perodos largos entre cultivos. En
P. farinosa f.sp. chenopodii en Chenopodium spp. quinua las oosporas son transmitidas por semilla y
Recientemente, los Oomicetes han sido suelo, sirviendo as como fuentes de inculo
excludos del reino hongos verdaderos (Fungi) primario para el inicio de epidemias.
debido a diferencias en la composicin de la El oogonio y el anteridio son los gametangios
pared celular y en su ploida. Sin embargo, su femenino y masculino respectivamente. Se
ubicacin taxonmica no est todava bien
definida. Algunos autores los incluyen en el reino
Cromista y otros en el reino Stramenopila.
1.2. Morfologa
La estructura vegetativa del patgeno est
constituida por hifas en las cuales se forman
esporangiforos y esporangios. Las hifas son
cenocticas (sin septa) y multinucleadas, se
desarrollan en los espacios intercelulares de las
hojas del hospedante y proyectan haustorios que
les sirven como rganos de absorcin dentro de
las clulas. El patgeno ataca principalmente la
hoja formando en la cara inferior esporangiforos
que miden entre l67 y 227 m de longitud y entre
11.0 y 14.8 m de dimetro. Los esporangiforos
son arborescentes, dicotmicamente ramificados
4 a 5 veces en ngulo agudo y terminan en 2 3
extremos flexuosos dispuestos en ngulo recto o Fig. 2. Esporangiforo y esporangios de Peronospora
agudo, en los que se insertan los esporangios (fig. 2). farinosa
3
logrado producir oosporas haciendo cruzamientos
entre aislamientos colectados en diferentes
lugares del Per y Bolivia, lo que significa que en
dichos pases existen los dos tipos de
apareamiento necesarios para que se produzca la
estructura sexual. Adems, se han encontrado
oosporas en hojas viejas infectadas colectadas en
campos de diferentes lugares (Huancayo, Puno,
Ayacucho, Cajamarca, Cusco, La Paz), lo que
significa que los dos tipos de apareamiento, P1 y
P2, estn presentes en todas las zonas de mayor
importancia para el cultivo de quinua. Slo en
Lima no se ha detectado oosporas en hojas de
quinua colectadas en el campo, ni en especies
silvestres (C. album, C. murale) infectadas con P.
farinosa.
4
forma en su extremo un apresorio provisto de una del patgeno. Finalmente, la parte afectada se
hifa infectiva que perfora la epidermis y despus necrosifica al tiempo que tambin desaparece la
de un periodo de latencia comienza a crecer parte vegetativa del patgeno.
formando micelio que se desplaza por los Durante la poca de cultivo se pueden
espacios intercelulares del mesfilo. Cinco a seis producir varias generaciones durante las cuales el
das despus de la penetracin, durante los cuales patgeno se reproduce asexualmente
el patgeno se ha desarrollado vegetativamente (esporangios) y produce infecciones sucesivas
dentro del hospedante, se inicia la produccin de (policclicos). Durante este tiempo se establece
esporangiforos que se proyectan hacia la entre hospedante y patgeno una suerte de
superficie inferior de la hoja a travs de los equilibrio que se rompe cuando el tejido foliar
estomas. parasitado comienza a deteriorarse y por lo tanto
Los esporangiforos, una vez que alcanzan su ya no puede proporcionar al patgeno los
desarrollo mximo, forman los esporangios, que nutrientes que necesita para seguir
son las estructuras propagativas del patgeno desarrollndose vegetativamente.
capaces de mantener la epidemia durante todo el El parsito forma estructuras sexuales que
ciclo en que la planta hospedante permanece en aseguran su perpetuidad. Se forman anteridios y
el campo. En este momento la zona afectada oogonios entre los cuales se realiza la
muestra los primeros sntomas de la enfermedad, fecundacin y como resultado se forman las
que consisten en una ligera clorosis como prueba oosporas, que tienen la capacidad de mantenerse
de que las clulas afectadas se estn debilitando y vivas por mucho tiempo dentro del tejido de la
perdiendo su capacidad de sntesis. Este estado cubierta de la semilla, en la hojarasca que queda
coincide con el de esporulacin plena por parte despus de la cosecha o simplemente libres en el
PRIMAVERA C VERANO
Cf
Oosporas
sobre semilla
y en hojas
a
Og
Os
INVIERNO OTOO
Fig. 5. Ciclo de vida de Peronospora farinosa en la zona andina. Cf: esporangiforo, C: esporangio,
a: anteridio, Og: oogonio, Os: oospora (Cortesa Tapia et al., 1979)
5
suelo duespus que se haya descompuesto el
tejido foliar. Las oosporas sirven como fuente
primaria de inculo en la siguiente campaa
agrcola.
En presencia de un hospedante susceptible y
suficiente humedad, las oosporas que han
permanecido inactivas en estado latente, germi-
nan e inician un nuevo ciclo de vida. Hay que
tener presente que durante una campaa agrcola
se pueden producir varios ciclos asexuales del
patgeno pero slo un ciclo sexual (fig. 5).
1.4. Epidemiologa
El estudio de una enfermedad implica el
conocimiento de los distintos factores que Fig. 6. Infeccin primaria de mildiu observada
confluyen para que sta se produzca. El como esporulacin abundante en hojas
cotiledonales de quinua
hospedante y el patgeno son agentes activos en
una enfermedad, pero sta no se producira si las
condiciones del medio ambiente no fueran la misma planta (infeccin secundaria). Los
favorables para el patgeno o detrimentes para la esporangios son estructuras propagativas por
planta. En el caso especfico del mildiu de la excelencia que se producen en forma policclica a
quinua, temperaturas frescas y humedad alta todo lo largo del periodo del cultivo, siempre y
(>80%) son factores determinantes para el cuando haya suficiente humedad y una
crecimiento del patgeno y la diseminacin de la temperatura adecuada para su desarrollo. Se ha
enfermedad en el campo y dentro de una regin. observado en el campo que cuando termina la
La presencia de roco al amanecer y la estacin lluviosa el patgeno deja de esporular. La
persistencia de ste hasta altas horas de la quinua puede ser afectada por mildiu en cualquier
maana permite que las esporas de Peronospora momento de su desarrollo, pero el mayor dao en
germinen y penetren el tejido de la hoja para cuanto a defoliacin y prdida de rendimiento se
continuar con los procesos epidemiolgicos produce con la infeccin temprana.
comunes. La germinacin de los esporangios Se ha encontrado mildiu dondequiera se
depende fundamentalmente de la presencia de siembre quinua (Norte Amrica, Sur Amrica,
humedad relativa alta y persistente, tanto as que Europa) siempre y cuando las condiciones
en aos con poca precipitacin, la enfermedad no climticas lo permitan. En la mayor parte de la
se presenta o no causa mayor dao. zona andina las condiciones ambientales son
La enfermedad puede iniciarse desde que la ideales para el desarrollo del mildiu durante los
planta est pequea, por el inculo presente en el meses de lluvias fuertes (octubre a abril). Una
suelo o en la semilla infectada. En cmara de excepcin es el altiplano sur de Bolivia (los
crecimiento se ha observado esta infeccin salares) donde la precipitacin anual es tan baja
primaria como esporulacin abundante en toda la que el mildiu generalmente no se presenta.
superficie de las hojas cotiledonales (fig. 6). La
infeccin primaria sirve en el campo como foco 1. 5. Variacin gentica de
de infeccin, y la enfermedad se generaliza Peronospora farinosa
durante el periodo de cultivo por medio de El conocimiento sobre la composicin
esporangios que se desplazan por accin del gentica de poblaciones de un patgeno es
viento y caen en plantas sanas o en hojas sanas de importante para cualquier estrategia de control de
6
una enfermedad. La variacin gentica en mayormente mtodos basados en PCR y
poblaciones de patgenos se debe a diferentes secuenciamiento de ADN.
factores, siendo los ms importantes seleccin,
recombinacin sexual y parasexual, migracin,
mutacin y fluctuacin gentica. La variacin 2. LA PLANTA
gentica de P. farinosa en quinua ha sido muy
poco estudiada, pero hay varias razones para 2.1. Sntomas
suponer que existe una gran variabilidad dentro El mildiu afecta principalmente al follaje de la
de las poblaciones de P. farinosa: 1) el hospedante planta. Se hace evidente inicialmente como
tiene un alto nivel de diversidad y plasticidad ligeros puntitos clorticos visibles en la cara
gentica, lo que causa un efecto de seleccin superior de las hojas. Los puntos clorticos crecen
amplia sobre las poblaciones del patgeno, 2) P. y forman reas clorticas grandes e irregulares
farinosa ha sido detectado en quinua en zonas que inicialmente se observan como clorosis en la
geogrficas climticamente muy distintas, lo que cara superior y luego como necrosis.
muestra la capacidad de adaptacin del patgeno, Simultneamente, la zona clortica en la cara
y 3) la presencia del estado sexual de P. farinosa inferior de la hoja se recubre de un afelpamiento
en todas las zonas de mayor importancia para el de color gris violeta constituido por las estructuras
cultivo de quinua, le permite al patgeno esporulativas del patgeno (fig. 7). Generalmente
expandir constantemente su diversidad gentica. al final de la poca lluviosa slo se encuentra
P. farinosa es heterotlico, y la distribucin hojas con manchas necrticas, pero no se observa
geogrfica de los dos tipos de apareamiento la esporulacin caracterstica del patgeno en
indica la probabilidad de que se forme el estado actividad.
sexual y, como consecuencia, nuevos patotipos Los distintos cultivares de quinua reaccionan
por medio de recombinacin. La presencia de de manera diferente a la enfermedad. La reaccin
patotipos (o razas), su distribucin y frecuencia de la planta ante el ataque de Peronospora, o sea
son caractersticas importantes para una la expresin de los sntomas, es influenciada por
poblacin. Varios programas de mejoramiento el genotipo de la planta, por el genotipo del
gentico de quinua se basan nicamente en patgeno y por las condiciones del medio
tamizados de campo para resistencia al mildiu. Si ambiente. As, en los cultivares resistentes puede
se desconoce la composicin gentica de la haber una reaccin de hipersensibilidad en cuyo
poblacin en cuanto a la presencia de patotipos, caso slo se observan pequeas manchas
se corre el riesgo de desarrollar variedades que similares a las causadas por picadura de insectos.
son resistentes slo en ciertas zonas y susceptibles En los cultivares ms susceptibles en cambio, la
en zonas donde prevalecen otros patotipos.
Los tipos de apareamiento y la virulencia son
marcadores fenotpicos para la identificacin de la
variacin genotpica dentro de una poblacin.
Otros marcadores fenotpicos son la resistencia a
metalaxyl e isoenzimas. El uso de marcadores
moleculares permite identificar diferencias
genotpicas a nivel de ADN. Los mtodos ms
comunes para detectar secuencias polimrficas de
ADN son RAPD, RFLP y AFLP. En base al patrn
de bandas (fingerprint) es posible calcular la
similaridad genotpica entre aislamientos. Para la Fig. 7. Masas de esporangios de Peronospora
identificacin de genes especficos se usan farinosa en el envs de la hoja de quinua
7
mancha se agranda sucesivamente tomando una prematura. En otros cultivares la defoliacin es
coloracin amarillenta, rojiza o marrn, menos pronunciada. En el cultivar La Molina 89,
dependiendo del pigmento que predomina en la con resistencia mediana, la defoliacin parece ser
planta (figs. 8 a-f). En una misma hoja es posible un mecanismo de defensa de la planta. Se ha
encontrar varias manchas pequeas, o pocas podido ver en el campo que la infeccin
manchas grandes que comprometen ntegramente temprana en las primeras hojas verdaderas
la lmina foliar. provoca la cada de las mismas, lo cual reduce la
Un efecto conocido del mildiu es la diseminacin del patgeno a las hojas nuevas.
defoliacin que causa en la planta. Entre ms En la semilla cosechada se observa a simple
temprana es la infeccin, mayor es el grado de vista granos con una coloracin ligeramente
defoliacin. Sin embargo, no se sabe hasta qu oscura. Estos granos generalmente contienen
punto la defoliacin observada en el campo es oosporas dentro de las clulas de la cubierta,
causada por mildiu. La planta de quinua se defolia aunque el oscurecimiento tambin puede ser
por muchos factores, por ejemplo estrs abitico causado por Alternaria sp.
producido por sequa y heladas, y por senescencia En un campo afectado se observa a menudo la
natural. A nivel de campo es difcil distinguir entre presencia de plantas con desarrollo limitado o
los diferentes factores que causan defoliacin, completamente enanizadas, en algunos casos con
pero se ha podido comprobar que en algunos las hojas distorsionadas y las inflorescencias
cultivares altamente susceptibles (ej. Utusaya), el pequeas y retorcidas. Esto presumiblemente sea
mildiu puede causar una defoliacin de 100% consecuencia de una infeccin sistmica que
(fig. 9) y como consecuencia, maduracin ocurre cuando la infeccin inicial se ha producido
a b c
d e f
8
Fig. 9. Defoliacin en cv. Utusaya causada por mildiu
en estado de plntula por inculo proveniente del resistencia vertical ofrece una proteccin
suelo o de la semilla. completa hacia ciertas razas del patgeno, pero
este tipo de resistencia tiende a romperse relativa-
2.2. Fuentes de resistencia en quinua mente rpido debido a cambios en el patgeno
El mtodo tradicional de control de mildiu en (mutacin, seleccin). La resistencia horizontal da
diferentes cultivos es la aplicacin de fungicidas una proteccin incompleta pero duradera y es
como metalaxyl (Ridomil). Evidentemente, el efectiva contra todas las razas del patgeno.
uso de fungicidas presenta costos adicionales de El proyecto PREDUZA (Proyecto de Resistencia
produccin y provoca desequilibrios en el medio Duradera para la Zona Andina) ha iniciado la
ambiente. Adems, existe el riesgo de que el evaluacin de material gentico en Per y Bolivia
patgeno desarrolle resistencia a metalaxyl, tal para el desarrollo de variedades con un alto nivel
como se ha visto en el caso de Phytophthora de resistencia duradera. Los resultados
infestans (tizn tardo) en papa. La mayora de los preliminares muestran que la susceptibilidad a
productores de quinua son pequeos o medianos mildiu est asociada con la precocidad del
agricultores que tradicionalmente usan pocos material, siendo ms susceptibles los cultivares
insumos en su produccin. precoces y ms resistentes los tardos. Sin em-
La resistencia gentica ofrece la ventaja de ser bargo, hay observaciones contradictorias de lugar
un mtodo de control menos costoso para el a lugar y de ao a ao, probablemente debido a
agricultor, nada nocivo para el medio ambiente y diferencias en la presin de la enfermedad y en
que asegura una produccin sostenible. Dentro presencia de patotipos entre un lugar y otro. Un
del germoplasma de quinua existe una amplia problema adicional es la falta de mtodos
variabilidad con respecto a la resistencia al estandardizados para la evaluacin de la
mildiu, pero hasta ahora no se conoce la base enfermedad. Una manera de superar estas
gentica de esta resistencia, ni si es controlada dificultades puede ser el tamizado para resistencia
por genes mayores (resistencia vertical) o por bajo condiciones controladas de luz, temperatura,
genes menores (resistencia horizontal). La humedad, concentracin de inculo, y el uso de
9
plntulas u hojas separadas (fig. 10, protocolos 8 rea foliar afectada de todo o de una parte del
9). Este mtodo, adems de controlar el nivel de follaje.
inculo y las condiciones de crecimiento, es Debido a la manera de diseminacin del
rpido, econmico, permite probar un gran mildiu de la quinua en el campo por medio del
mmero de accesiones o lneas a la vez, y los viento, la incidencia no es un parmetro
datos son comparables de un ao a otro. El apropiado para distinguir entre cultivares o
tamizado en el campo debera hacerse en las tratamientos. En cultivares con alto nivel de
ltimas fases del mejoramiento en zonas con una resistencia, la incidencia de mildiu en aos
presin alta de mildiu. propicios para el desarrollo de la enfermedad
frecuentemente alcanza el 100%. La severidad
2.3. Evaluacin de la enfermedad explica mejor el desarrollo de la enfermedad en
Para estudiar la epidemiologa de una trminos de intensidad.
enfermedad o identificar factores de resistencia y La mayora de las escalas de evaluacin del
virulencia, es necesario contar con un mtodo de mildiu en quinua que existen, se basan en el
evaluacin confiable y reproducible. La evalua- porcentaje del rea foliar afectada. Una escala de
cin consiste en darle un valor a los daos que 0 a 10 (0 = ninguna infeccin, 1 = 1-10% rea
causa la enfermedad en la planta. La resistencia o foliar afectada, 2 = 11-20% etc.) est basada en la
el efecto de un tratamiento se mide comparando evaluacin del rea foliar afectada de toda la
la cantidad de patgeno o sntoma por planta, o planta, mientras otra escala de 0-5 (0 = sin
por parte de planta con la cantidad presente en infeccin, 1 = 1-20%, 2 = 21-40% etc.) est
una planta susceptible (testigo). basada en la evaluacin del rea foliar afectada
La incidencia de una enfermedad indica el del tercio medio de la planta.
porcentaje de plantas afectadas, mientras que la No existe un mtodo estandarizado y por lo
severidad indica el grado de la enfermedad, tanto los datos son poco comparables. En el caso
generalmente expresado como el porcentaje del de la quinua, este tipo de escala puede no ser
Susceptible Resistente
Fig. 10. Tamizado para resistencia al mildiu en placas petri con agar agua usando
hojas de quinua. Se evala el grado de esporulacin con una escala de 0 a 5
10
muy precisa, considerando el tamao de la planta Esto requiere un mnimo de 3 evaluaciones por
y el grado de error conectado a la evaluacin, que campaa.
vara mucho de persona a persona. Lo ideal en La frmula general para el cculo de (AUDPC)
este caso es adoptar un mtodo que se adapte a es:
las necesidades de la investigacin que se est
realizando y que minimice los errores de n-1
evaluacin. Cualquier mtodo que se use, siempre AUDPC = (yi + yi+1)/2 (ti+1 ti)
va a estar sujeto a cierto error. i
Un estudio realizado para comparar ocho
mtodos de evaluacin de mildiu en quinua: 1) donde n es el nmero de evaluaciones, y es la
Severidad en toda la planta; 2) Severidad en el severidad y t es el nmero de das despus de la
tercio inferior; 3) Severidad en el tercio medio; 4) siembra en que se hace la evaluacin. Se incluye
Severidad en el tercio superior; 5) Severidad en (t, y) = (0, 0) como la primera evaluacin (fig. 11).
tres hojas por planta; 6) Escala 0 10; 7) Escala 0
5; 8) incidencia, mostr que el nivel de mildiu
medido como severidad con los mtodos 1 a 5
estuvo correlacionado al rendimiento y que no
%)
hubo mucha diferencia entre stos. Por el
contrario, el nivel de mildiu medido con los Severidad (%
mtodos 6 a 8 estuvo menos correlacionado al
rendimiento y no permiti destinguir claramente
la resistencia entre cultivares.
Para disminuir el error y uniformizar los datos,
hemos ideado el mtodo de evaluacin descrito
en el protocolo 10, el cual est basado en el
porcentaje de rea afectada de tres hojas por
planta (una de cada tercio, y escogidas al azar). El
valor que se da por planta es el promedio de las Fig. 11. Curvas de progreso de la enfermedad para
tres hojas evaluadas. calcular el AUDPC
Para describir el desarrollo de la enfermedad a
lo largo de la poca del cultivo e identificar
diferencias entre cultivares se puede calcular un El AUDPC es til para comparar el desarrollo
valor del rea bajo la curva de progreso de la de la enfermedad bajo distintas condiciones
enfermedad, descrito originalmente en ingls climticas y para evaluar la susceptibilidad/
como area under disease progress curve resistencia de germoplasma, incluyendo siempre
(AUDPC), en base a mediciones de severidad. un cultivar altamente susceptible como testigo.
11
3. GLOSARIO
12
Incidencia Porcentaje de plantas infectadas Plasticidad gentica La capacidad de cambiar
Infeccin sistmica Presencia difundida del por el estmulo debido a un alto nivel de
patgeno dentro de la planta heterogeneidad gentica
Inculo Propgulos, grmenes, material Ploida Nmero de juegos de cromosomas en
infeccioso una clula
Inculo primario Propgulos que inician la RAPD (Random Amplified Polymorphic
infeccin en un campo de cultivo DNA) ADN Polimrfico Amplificado al azar
Inculo secundario Propgulos que causan Recombinacin parasexual Intercambio de
infecciones repetidas durante el tiempo que el ADN entre cromosomas homlogos sin pasar por
cultivo permanece en el campo un proceso sexual.
Isoenzima Una de varias enzimas que tienen Recombinacin sexual Proceso durante la
la misma especificidad enzimtica, pero que reproduccin sexual (meiosis) en el cual hay
defieren en p.e. pI o peso molecular intercambio de ADN entre cromosomas
Latencia a. Perodo en el cual el patgeno se homlogos
encuentra inactivo. b. Perodo desde la infeccin Resistencia horizontal Resistencia no
hasta que se manifiesta la esporulacin especfica, activa contra muchas razas del
Mesfilo Conjunto de tejidos que se encuentra patgeno, gobernada por genes menores (r)
entre ambas epidermis de las hojas Resistencia vertical Resistencia especfica de
Micelio Conjunto de hifas que forman la alto grado, que slo es efectiva contra algunas
estructura vegetativa de los hongos razas del patgeno. La resistencia vertical est
Migracin Movimiento masivo de un gobernada por genes mayores (R)
patgeno de una regin a otra RFLP (Restriction Fragment Length Polymor-
Mutacin Cambio espontneo en el ADN phism) Polimorfismo en el Largo del Fragmento
Necrosis Muerte de clulas o tejidos de Restriccin
Oogonio Gametangio femenino entre los Secuenciamiento Anlisis de la secuencia de
Oomicetes nucletidos en un gen o un fragmento de ADN
Oomicetes Una clase de Ficomicetes Seleccin Reproduccin diferencial de ciertos
constituida por las algas biflageladas y los genotipos del patgeno debido a ej. la interaccin
organismos que causan mildius especfica con las variedades del cultivo
Oospora Espora sexual formada a travs de la Senescencia Proceso de envejecimiento
fertilizacin de dos gametangios, oogonio y Septa Tabique transversal que individualiza
anteridio dos clulas vecinas
Papila Protuberancia superficial ms o menos Severidad El grado de la enfermedad medido
translcida en un extremo del esporangio como porcentaje de rea afectada de toda la
Parsito obligado Ver biotrfico planta o una parte de la planta
Patgeno Organismo que causa enfermedad Talo Conjunto de estructuras o de clulas que
Patotipo Una subdivisin de un patgeno conforman el cuerpo de un microorganismo. Fase
caraterizada por su reaccin patognica en uno o somtica
varios hospedantes Tamizado Pruebas que se realizan para
PCR (Polymerase Chain Reaction) Reaccin determinar la resistencia o susceptibilidad de un
en Cadena de la Polimerasa cultivo
13
Tipos de apareamiento o grupos compatibles Variacin genotpica El nmero de genotipos
Caracterstica gentica de un organismo y su frecuencia dentro de una poblacin
heterotlico que determina su capacidad de Virulencia Grado de patogenicidad.
unirse sexualmente con otros individuos de la Capacidad de producir enfermedad. Fuerza de
poblacin. Para formar una espora sexual ataque de un patgeno
(oospora en el caso de Oomicetes) deben Zoospora Espora asexual provista de uno o
aparearse dos aislamientos de diferentes tipos de dos flagelos que facilitan su desplazamiento en un
apareamiento medio lquido
14
4. LITERATURA CONSULTADA
Alandia, S., V. Otaz, B. Salas. 1979. Edreva, A., R. Delon, J.C. Coussirat. 1998.
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16
PROTOCOLOS
17
Protocolo 1
Consideraciones
La produccin y mantenimiento del inculo es una prctica rutinaria en todo laboratorio y permite tener
inculo disponible para las pruebas que sean necesarias, por ejemplo para pruebas de resistencia del
husped, para realizar estudios sobre las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas del patgeno, tipos de
apareamiento, as como para investigar lo concerniente a las diferencias a nivel molecular.
Si no se dispone de una cmara de crecimiento, se puede producir y mantener el inculo de P. farinosa
bajo condiciones de invernadero o cobertor, siempre que las temperaturas no sean extremas.
Procedimiento
Coleccin de aislamientos
Colectar en el campo hojas que tengan preferiblemente una sola lesin con esporulacin
reciente y colocarlas en placas petri con papel filtro hmedo o con agar agua
Si no fuera posible encontrar hojas con una sola lesin, cortar la parte de la hoja que contiene
una lesin
Si la lesin presenta esporulacin abundante se puede iniciar la propagacin inmediatamente
(Paso 1), en caso contrario hay que incubarla en cmara hmeda por un da o por el tiempo que
sea necesario, hasta 7 das
Cosechar esporangios frescos (7-10 das) colocando las hojas con esporalacin fresca dentro de
un vaso o de un tubo que contenga agua destilada (en cantidad arbitraria). Los esporangios
deben cosecharse dentro de los 10 das siguientes a la inoculacin, debido a que el tejido de la
hoja comienza a descomponerse despus de este tiempo
Agitar la mezcla suavemente y pasarla por 4 capas de gasa. Centrifugar a 3000 g por 5 - 10
minutos
Descartar cuidadosamente el sobrenadante (dejar l 2 ml en el tubo ya que el sedimento no
siempre es visible)
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Protocolo 1
Lavar los esporangios con agua dos veces ms en el tubo y volver a centrifugar con el objeto de
eliminar sustancias inhibidoras de la germinacin (opcional)
En caso necesario ajustar la concentracin de los esporangios. Para simple mantenimiento, la
concentracin no es crtica
Inocular (ver abajo) plntulas de quinua u hojas sueltas (4 6 semanas de edad). La suspensin
de esporangios no debe conservarse por ms de unas pocas horas
En caso de plntulas, cubrirlas con plstico transparente con el objeto de mantener la humedad
y evitar la indeseada diseminacin de los esporangios. Para las hojas sueltas, el agar agua
mantiene la humedad conveniente
Dejar las macetas/placas petri cubiertas con un plstico negro durante 20 - 30 horas.
Quitar el plstico negro e incubar por 7 10 das a l5 20C con un fotoperodo de 12 horas.
Despus de la incubacin en oscuridad, las placas conteniendo las hojas se colocan una sobre
otra (opcional), se aseguran entre s con una cinta adhesiva y se ponen un una bandeja alineadas
lateralmente para que el agua que se condensa dentro de la placa no inhiba la esporulacin en
la superficie inferior de las hojas (ver fig. 12)
Fig. 12. Posicin de placas petri con agar agua para Fig. 13. Propagacin de inculo de Peronospora
la propagacin de inculo de Peronospora farinosa farinosa. Placa petri con hojas mostrando esporu-
lacin del patgeno
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Protocolo 2
AISLAMIENTOS MONOSPORICOS
Consideraciones
Cuando se recoge material infectado en el campo es probable que contenga ms de un genotipo del
patgeno por lo que es necesario hacer aislamientos monospricos con el objeto de individualizarlos y
purificar el inculo. Generalmente se consigue aislamientos puros usando el mtodo descrito en el
protocolo 1 (1 lesin = 1 aislamiento), pero puede haber casos de mezcla de aislamientos que requieren
pasar por un proceso de purificacin haciendo aislamientos monospricos.
El procedimiento es bastante tedioso, as que para evitar cargas de trabajo innecesarias, el investigador
debe considerar si ste es un requisito indispensable para su investigacin.
Procedimiento
Dejar caer una gota de una suspensin de esporangios sobre una lmina portaobjetos recubierta
de una pelcula de agar agua al 5%
Usando un microscopio compuesto (objetivo 10 ) coger un solo esporangio con una aguja de
laboratorio y transferirla a una hoja colocada con la superficie inferior hacia arriba en una placa
petri conteniendo agar agua al 1%
Dejar las hojas inoculadas en incubacin bajo condiciones estndar (ver protocolo 1) hasta que
se produzca esporulacin evidente
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Protocolo 3
ALMACENAMIENTO DE AISLAMIENTOS
Consideraciones
Para conservar el material colectado en el campo por tiempo indefinido, hay que seguir ciertas pautas,
porque siendo Peronospora un parsito obligado (biotrfico) que slo puede vivir y desarrollarse en tejido
vivo hay que mantenerlo ya sea en plantas vivas o en congelacin. El mantenimiento en plantas vivas o
en hojas desglosadas se usa sobre todo para trabajos inmediatos, en cambio cuando se trata de
colecciones en las que hay que mantener viable el material por mas tiempo, la nica forma de
conservarlo es en congelacin o en nitrgeno lquido.
Procedimiento
Alternativa 1: Almacenamiento de hojas infectadas a -20C
Colocar las hojas con esporangios frescos en tubo plstico, bolsa plstica, o dentro de una placa
petri conteniendo agar agua o papel filtro hmedo y almacenar a -20C. Es preferible que el
enfriamiento se haga lentamente
Para preparar inculo a partir del material almacenado, descongelar las hojas lentamente,
ponerlas en agua destilada y luego extraer los esporangios por lavado de acuerdo al
procedimiento estndar (protocolo 1)
Los esporangios pueden ser congelados y descongelados por una sola vez
Cuando la temperatura de almacenamiento es constante, sin fluctuaciones, los esporangios se
mantienen viables hasta por 6 meses
21
Protocolo 4
Consideraciones
Las oosporas son estructuras de sobrevivencia del patgeno y pueden mantenerse viables por mucho
tiempo en el tejido de la cubierta de la semilla de quinua y en los restos de tejido foliar que quedan en el
suelo despus de la cosecha. La prueba de viabilidad de las oosporas usando floxina es aplicable
nicamente para suspensiones purificadas de oosporas.
Cuando se quiere iniciar una infeccin controlada o cuando se quiere saber la cantidad de inculo
efectivamente infectivo es necesario conocer primero la cantidad de oosporas viables presentes en el
inculo inicial. Este mtodo es til para estudios sobre la sobrevivencia de las oosporas.
22
Protocolo 5
Consideraciones
El tejido parasitado puede contener oosporas si es que proviene de lugares donde ambos tipos de
apareamiento se encuentran presentes, pero para observarlas, especialmente en las hojas, hay que
macerar el tejido afectado o decolorarlo. La maceracin o desintegracin del tejido permite que las
clulas se separen y junto con ellas se individualicen las oosporas. Otra forma de observar las oosporas
es decolorando el tejido de la hoja hasta dejarlo transparente.
Procedimiento
Alternativa 1
Alternativa 2
Colocar dos capas de papel filtro en una placa petri y saturarlas con una mezcla de etanol 96% y
cido actico glacial (3:1 v/v)
Colocar las hojas de quinua sobre el papel humedecido y dejarlas por 24 h para que el tejido se
decolore
Observar las oosporas en un microscopio compuesto (objetivo 10)
23
Protocolo 6
Consideraciones
Las semillas de quinua pueden ser portadoras del inculo inicial para que se desarrolle la enfermedad en
una siguiente campaa agrcola, por lo tanto para estar seguro que se est iniciando una investigacin
con material completamente exento de infeccin es necesario analizar la semilla para presencia de
oosporas. Por otro lado, la deteccin de oosporas en semillas forma parte de estudios sobre la
importancia de las oosporas en el inicio y desarrollo de la enfermedad.
Procedimiento
Deteccin directa
En la superficie de la semilla
Dentro de la semilla
Macerar las semillas lavadas de acuerdo con el mtodo de hervido en NaOH (ver protocolo 5).
El hervido hace que la cubierta de la semilla se desprenda
Examinar al microscopio compuesto 100 cubiertas y 100 semillas procesadas para detectar la
presencia de oosporas. Alternativamente, fijar en parafina semillas enteras con el fin de hacer
cortes al micrtomo para observar la existencia de oosporas en el interior de la semilla
Calcular el porcentaje de semillas infectadas con oosporas
Deteccin indirecta
Sembrar en el invernadero 100 semillas de cada muestra en macetas conteniendo suelo estril y
cubrirlas con bolsas de plstico
Observar diariamente las plantas despus de la germinacin para detectar presencia de
esporangios en las hojas cotiledonales (ver fig. 6)
Registrar y eliminar las plntulas que presentan esporulacin. El periodo de observacin dura
alrededor de tres semanas
Calcular el porcentaje de plntulas infectadas
24
Protocolo 7
Consideraciones
Dos aislamientos son compatibles cuando al juntarlos son capaces de formar gametangios (anteridio y
oogonio) y depus de la fecundacin formar oosporas. En pruebas de laboratorio es posible inducir la
produccin de oosporas cuando se logran juntar aislamientos compatibles de diferentes tipos de
apareamiento.
Procedimiento
Ajustar la suspensin de esporangios de cada aislamiento en estudio a 105 esporangios/ml de
agua
Preparar para cada prueba (cruzamiento) 3 placas con agar agua al 1%
1) cuando no se dispone de aislamientos probadores, las hojas en dos de las placas se inoculan
separadamente cada una con uno de los aislamientos a probar (testigos) y las hojas de la tercera
placa se inoculan con una mezcla de los dos aislamientos. Se hacen cruzamientos en todas las
combinaciones posibles. Para 10 aislamientos se hacen 55 combinaciones incluyendo los
testigos. Se anotan los resultados de compatibilidad e incompatibilidad en el siguiente esquema
, como + o -, respectivamente:
Aisl. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2) cuando se dispone de aislamientos probadores, las hojas de una placa se inoculan con el
aislamiento en prueba solo (testigo) y las hojas de una segunda y tercera placa con el aislamiento
en prueba en combinacin con cada uno de los probadores (P1 y P2) separadamente. Para 10
aislamientos son 33 combinaciones incluyendo los testigos:
Aisl. P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
P1
P2
Solo
25
Protocolo 7
Alternativa
Si no se dispone de agar, se pueden colocar las hojas inoculadas sobre un papel de filtro esterilizado y
hmedo dentro de una placa que luego se debe sellar con parafilm. Las condiciones de incubacin son
las mismas que se mencionan prrafos arriba.
26
Protocolo 8
Consideraciones
Cuando se hacen trabajos de mejoramiento y seleccin es importante conocer la virulencia de las
poblaciones de P. farinosa en las reas de utilizacin de las variedades mejoradas.
Para identificar factores de virulencia se necesita un conjunto de lneas o de cultivares diferenciales que
permite distinguir entre aislamientos por su reaccin a los diferenciales.
Las tcnicas propuestas aqu para la prueba de virulencia, se pueden utilizar igualmente para hacer
tamizado para resistencia en germoplasma de quinua o en lneas mejoradas.
Procedimiento
Alternativa 1. Prueba de virulencia usando hojas sueltas
Cortar hojas de plntulas de quinua de 4-6 semanas de edad, colocarlas en una placa petri con
papel filtro humedecido y mantenerlas hasta su uso. Seleccionar hojas de tamao similar
Incluir en la prueba como testigo positivo un cultivar altamente susceptible
Cosechar esporangios de un aislamiento de P. farinosa (ver protocolo 1). Ajustar la concentracin
a 1 105 esporangios/ml
Incluir en cada placa petri con agar agua 4 6 hojas como unidad experimental y considerar 3
4 repeticiones para cada combinacin genotipo aislamiento (a criterio de cada investigador)
Inocular las hojas segn el procedimiento descrito para propagacin de inculo (protocolo 1,
opcin 1 2)
Mantener las placas en oscuridad las primeras 20 horas despus de la inoculacin
Distribuir las placas al azar y colocarlas lateralmente (opcional) (ver fig. 12) en cmara de
crecimiento a 15 20C con 12 h de fotoperodo
Incubar por 7 10 das
Evaluar la severidad de la enfermedad usando el ndice de esporulacin de 0 5 (ver protocolo
9) y/o contando el nmero de esporangios por rea afectada. Calcular el promedio para cada
unidad experimental
Medir el perodo de latencia, de ser posible (nmero de horas a las que la esporulacin se hace
visible)
27
Protocolo 8
Evaluar la severidad de la enfermedad en las dos primeras hojas permanentes de cada plntula
usando el ndice de sntomas de 1 5 (ver protocolo 9). Calcular el promedio para cada unidad
de prueba
28
Protocolo 9
Consideraciones
El grado de esporulacin es una respuesta inequvoca en pruebas de resistencia del hospedante y
virulencia del patgeno. En los cultivares susceptibles la esporulacin es abundante, mientras que en los
cultivares resistentes la esporulacin es mnima o no se produce. En el caso de los mildius el signo de la
presencia del patgeno y el sntoma o dao que se produce se evidencian juntos. De esta manera tanto
la esporulacin visible como la clorosis/necrosis, sirven como parmetros para describir la interaccin.
Procedimiento
Contaje de esporangios
Cortar una fraccin de hoja con un rea definida del centro de una lesin (por ejemplo con un
sacabocado) y extraer los esporangios lavndolos con una suspensin de CuSO4 (0.04M CuSO4/
0.2M acetato de sodio, pH 5.4 con cido actico, diluir en agua 1:1) en un tubo con 10 ml del
lquido y agitar suavemente
Colocar las fracciones de hoja de una unidad experimental (por ejemplo 4) juntas en un tubo.
Los esporangios que se han extrado pueden guardarse en refrigeracin por varios meses
Contar los esporangios y calcular la concentracin por rea de hoja empleando una cmara de
contaje
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Protocolo 9
0 1 2 3 4 5
0 2 = Resistente; 3 5 = Susceptible
Indice de sntomas del mildiu de la quinua en prueba de plntulas (Ochoa et al., 1999):
0 2 = Resistente; 3 5 = Susceptible
30
Protocolo 10
Consideraciones
Evaluar una enfermedad en el campo es una tarea complicada y depende mucho de la persona que hace
la evaluacin. Se han ideado muchas escalas de evaluacin de acuerdo a la enfermedad. Varias escalas
proponen valores de 0 a 5 de 0 a 10 por ejemplo, pero en el caso de mildiu en quinua, es aconsejable
determinar el porcentaje de rea foliar afectada, el cual proporciona valores de mayor grado de
discriminacin. Sin embargo, el tamao y follaje abundante de la planta de quinua dificulta severamente
la determinacin del porcentaje de rea afectada en la planta entera. La evaluacin es muy subjetiva y
los datos poco comparables.
El mtodo que aqu se propone para evaluar el mildiu en plantas de quinua en el campo elimina muchas
fuentes de error porque est basado en la evaluacin de la severidad (procentaje de rea afectada) en
hojas individuales y no en plantas enteras.
La escala propuesta no es una escala rgida, sino que los porcentajes intermedios (15%, 25% etc.) son
igual de aplicables. El valor mnimo que indica presencia de la enfermedad es 1% por definicin.
Si se realiza varias evaluaciones (mnimo 3) durante la campaa, los valores de severidad pueden ser
utillizados para calcular el AUDPC (ver pgina 11) que es un parmetro til para comparar resistencia/
susceptibilidad entre diferentes cultivares de quinua y el comportamiento de cultivares bajo diferentes
ambientes climticos. Para el tamizado en el campo siempre se debe incluir un testigo positivo (un
cultivar altamente susceptible) para tener un indicador del nivel de inculo en el campo.
Procedimiento
De cada parcela se escoge al azar el nmero de plantas que se considera necesario para obtener
un valor representativo. Generalmente entre 6 y 10 plantas por parcela son suficientes
De cada planta se escoge 3 hojas al azar, una de cada tercio
Se evala el porcentaje de rea afectada de cada hoja usando la escala adjunta. El promedio de
las 3 lecturas equivale al valor de la severidad de cada planta
31
Protocolo 10
0% 1% 5% 10%
95% 100%
32
EL MILDIU
(Peronospora farinosa)
DE LA QUINUA
(Chenopodium quinoa)
EN LA ZONA ANDINA
CGIAR
El CIP pertenece a Future Harvest (Cosecha del Futuro),
un grupo de centros que recibe la mayor parte de su
financiamiento de los 58 gobiernos, fundaciones privadas y
organizaciones internacionales y regionales que conforman
el Grupo Consultivo para la Investigacin Agrcola
Internacional (CGIAR). Future Harvest promueve el
ROYAL DANISH MINISTRY OF FOREIGN AFFAIRS
THE ROYAL VETERINARY AND AGRICULTURAL UNIVERSITY SOLVEIG DANIELSEN TERESA AMES