Bioqumicas y biofsicas Research Communications 487 (2017) 488 mi 493

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Research Communications bioqumicos y biofsicos

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Transformacin de bacteria patgena crustceo eriocheiris espiroplasmas y la expresin

de amarillo Florida protena fluorescente

Natsuho Terahara un , Isil Tulum un , segundo , Makoto Miyata un , segundo , *

un Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de la ciudad de Osaka, 3-3-138 Sugimoto, Sumiyoshi-ku, Osaka 558-8585, Japn
segundo El Instituto de Investigacin Avanzada de la OCU para las Ciencias Naturales y Tecnologa (OCARINA), la Universidad de la ciu dad de Osaka, Sumiyoshi-ku, Osaka 558 a 8585, Japn

informacin del artculo abstracto

Articulo de historia: eriocheiris espiroplasmas, la causa de la enfermedad de cangrejo temblor, es una bacteria pared -menos, en relacin con micoplasmas, medir 2.0 mi 10.0 metro
Recibido el 10 de marzo de 2017 Aceptado el 26 de de m de largo. Cuenta con una forma de la clula helicoidal y un mecanismo de natacin nico que no uti lice Florida agelos; en vez, se mueve por el cambio
marzo de 2017 Disponible en Internet el 28 de marzo de
de la helicidad celular a una torcedura viaja desde la parte frontal hasta la cola. S. eriocheiris parece utilizar un sistema quimiotctica novela que se basa
2017
en la frecuencia de comportamientos de natacin reversin en lugar del sistema de dos componentes convencionales, que generalmente es esencial
para la quimiotaxis bacteriana. Para identificar los genes implicados en estos nuevos mecanismos, hemos desarrollado un siste ma de transformacin
Palabras clave:
mediante el uso de oric plsmido que alberga el gen resistente a la tetraciclina, tetM,
Espiroplasma Oric plsmido

que est bajo el control de un promotor fuerte para una protena abundante, factor de elongacin -Tu. La transformacin ef fi ciencia alcanzado fue de
mollicutes
1,6 10 5 unidad formadora de colonias (CFU) por 1 metro g de ADN, lo que permite la expresin de la mejorada amarillo Florida protena fluorescente
Mycoplasma
EYFP
(EYFP).

Nadando 2017 los autores. Publicado por Elsevier Inc. Este es un artculo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND
licencia ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

1. Introduccin
espiroplasmas es un gnero de bacterias que pertenecen a la clase mollicutes, que incluye
patgenos animales y vegetales tales como la
Mycoplasma y fitoplasmas especies y se caracterizan por genomas pequeos y la falta de una capa
de peptidoglicano [1] . espiroplasmas especies, patgenos para las plantas superiores y los
artrpodos, formar una forma de la clula helicoidal y nadar en medios viscosos mediante la
propagacin de pares de pliegues a lo largo de su cuerpo celular de delante hacia atrs, un
mecanismo que no est relacionado con otros sistemas de motilidad ( Higo. 1 A y vdeo S1)
[2 mi 5] .
de vdeo complementario relacionado con este artculo se puede encontrar en
http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2017.03.144 .
eriocheiris espiroplasmas se ha aislado del cangrejo chino, sinensis Eriocheir, y ha tenido
efectos desastrosos en la acuicultura en China en los ltimos aos [6] . Crece ms rpido que otros espiroplasmas
especies y nada hasta fi cinco metro m por segundo en un medio viscoso, una velocidad que es
ventajoso para el estudio del mecanismo de la natacin. La morfologa distinta de espiroplasmas es fi definida
por una estructura interna y una estructura en forma de pesa en la parte delantera
* Autor correspondiente. Departamento de Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad de la ciudad de Osaka,
Sumiyoshi-ku, Osaka 558-8585, Japn.
Correos electrnicos: natsuholy@gmail.com (N. Terahara), iciltlm@gmail.com
(I. Tulum), miyata@sci.osaka-cu.ac.jp (M. Miyata).
extremo conectado por una Florida en la cinta y rodeado de una espiral fi lamento
[7,8] . La estructura de la cinta que recubre el interior de la hlice debe estar vinculado a la helicidad
celular y la torcedura que viajan con sus cambios conformacionales. Como el cambio en la helicidad
se produce en el extremo frontal, la estructura de pesa de gimnasia puede estar implicada en este
interruptor, posiblemente a travs de la generacin de par motor a la parte de conexin. los Florida en
cinta se compone de una protena abundante interna, Fib, y al menos cuatro clases de MreB, un
homlogo bacteriano de la actina eucariota [8 mi 10] . Diecisis protenas tambin han sido
identificados fi ed como los componentes de la estructura interna. S. eriocheiris comportamientos
quimiotcticos exposiciones, como el cambio de la frecuencia de inversin de los movimientos, que
no utilizan el sistema de dos componentes convencional (TCS) que la mayora de las bacterias
utilizan [11] . La quimiotaxis de S. eriocheiris tambin se caracteriza por el cambio en la frecuencia de
inversin de la direccin de natacin, que es un comportamiento quimiotctico similar a la de otras
bacterias mviles, aunque no se han encontrado genes de TCS en el genoma de espiroplasmas [ 8,12]
.
La manipulacin gentica es una herramienta poderosa para la identificacin fi cacin de
protenas inmicrobiological estudios. oriC- plsmidos basados se consideran una herramienta
prometedora para los estudios genticos de bacterias limitados por la escasez de vectores genticos
adecuados y ya se han aplicado con xito en los estudios de muchos Mycoplasma y espiroplasmas especies
[13 mi 15] . los oric regin se compone de la dnaA gen que codifica una helicasa responsable de la
iniciacin de la replicacin del ADN y la Florida regiones Anking contienen de 7 a 10 cajas DnaA
putativos

http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2017.03.144
0006-291X / 2017 los autores. Publicado por Elsevier Inc. Este es un artculo de acceso abierto bajo la licencia CC BY -NC-ND licencia ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).
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Higo. 1. S. eriocheiris la observacin de clulas y la optimizacin de las condiciones de transformacin. (A) Representacin esquemtica de S. eriocheiris clula helicoidal. La clula nada en la direccin del extremo cnico, como se indica por una flecha abierta. Las

flechas negras y los tringulos negros indican la direccin de helicidad celular y torceduras entre regiones helicoidales izquierdo y diestro, respectivamente. El pequeo panel muestra una clula observado usando obscuro fi microscopa de campo. (B) Formacin de fi lm y

manchas bajo diferentes concentraciones de suero y agar. Film y manchas cubren la superficie del medio en el panel de la izquierda. La superficie y colonias de la mediumwere slido observaron despus de 5 das de incubacin. (C) El crecimiento celular monitorizado por

la concentracin de ATP (izquierda) y CFU (derecha). El tiempo de duplicacin se estim en alrededor de 150 min. (D) La tasa de supervivencia est representado por CFU. La constante de tiempo para la electroporacin se calcul a partir resistencia multiplicada por

capacitancia. La supervivencia del 10% se indica mediante un tringulo abierto.

(5 0- TTATCCACA-3 0), que son los sitios de unin para las protenas DnaA [diecisis] . Un sistema de
transformacin utilizando oriC- plsmidos basados ha sido desarrollado para citri espiroplasmas, un
patgeno para los ctricos y artrpodos [15] , Pero la lenta tasa de crecimiento de esta especie es
desventajoso para la manipulacin de genes avanzadas.
En el presente estudio, hemos desarrollado un sistema de transformacin de
S. eriocheiris mediante el uso oric plsmidos, lo que permiti la expresin de Florida protena
fluorescente en las clulas.
regin, incluyendo promotor spiralin y el codn inicial de tetM
fue reemplazado con el ampli fi fragmentos ed, utilizando el En-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit
(Takara Bio), produciendo los plsmidos pTSeT, pTSeF, y pTSedK, respectivamente. El gen de
codones optimizados de mejora amarillo Florida protena fluorescente ( opt-EYFP) fue amplificado fi ed
de pMobopt travs de PCR usando optEYFP-infusin-F y los cebadores optEYFP-infusin-R [18 mi 20]
. El pTSeT se linealiz mediante PCR inversa usando pTSeO-TetM-F y pTSeT-tufP-inverso-R
cebadores, y el opt-EYFP
gen se inserta en una posicin entre el TUF promotor y

2. Materiales y mtodos tetM en pTSeT utilizando el En-Fusion EcoDry PCR Cloning Kit, resultando en un plsmido, pTopt.

2.1. Cepas y condiciones de cultivo

2.3. Transformacin de S. eriocheiris

La cepa de tipo, TDA-040725-5 T ( CCTCC M 207170 T DSM 21848 T) de S. eriocheiris se
cultiv en medio R2 a 30 C [6,17] . los Escherichia coli cepa, las clulas estelares de In-PCR de fusin El mtodo de transformacin utilizado fue modi fi ed del mtodo utilizado generalmente para Mycoplasma
EcoDry Cloning Kit (Takara Bio, Shiga, Japn), y DH5 un fueron utilizados para la manipulacin del y S. citri [ 20 mi 22] . La principal modificacin fi cationes eran optimizacin del medio slido y el uso de
ADN. condiciones ms fuertes para la electroporacin. S. eriocheiris se cultiv en medio R2 lquido hasta
que la fase tarda exponencial (

2.2. construccin de plsmidos
S. eriocheiris ADN genmico se prepar utilizando el Sistema de Genomic-tip (Qiagen, Hilden,
Alemania). Los cebadores y plsmidos utilizados en el presente estudio se enumeran en Tabla S1 . los oric
regin de
S. eriocheiris fue amplificado fi ed a partir de ADN genmico aislado a travs de PCR usando el Bam HOLA-transfirieron a un 2 mm cubeta de electroporacin previamente enfriado. La electroporacin se realiz
oriC- aguas arriba-F y Bam HOLA- oriC- cebadores aguas abajo-R. los oric secuencia de Mycoplasma
pulmonis en pMPO1 entre el Bam sitios HI fue reemplazado por el de S. eriocheiris,
resultando en un plsmido, pTSeO [13] . Las regiones promotoras predichos y las secuencias de ORF
que codifican la NORTE- terminales once aminocidos de factor de elongacin-Tu ( tufA), protena Fib ( fi
segundo), y DnaK ( dnaK) fueron ampli fi ed a partir de ADN genmico aislado mediante PCR usando
cebadores TufP-F y TufP-R, FibP-F y FibP-R, y DnaKP-F y DnaKP-R, respectivamente. El
pTSeOwas linealizado mediante PCR inversa utilizando cebadores pTSeOTetM-F y
pTSeO-promotor-aguas arriba-R, y el 320-bp
10 8 CFU / ml). Las clulas se recogieron por centrifugacin a
11000 gramo a las 4 C durante 10 min y thenwashed dos veces en un volumen equivalente de
tampn de electroporacin [sacarosa 272 mM y HEPES 8 mM (pH 7,4)]. Las clulas se suspendieron
en 100 metro l de tampn de electroporacin a una concentracin de aproximadamente 10 9 clulas
por ml, se mantuvieron en hielo con 0,5 metro g de ADN de plsmido durante 30 min, y se
usando un sistema de electroporacin Gene Pulser II y el mdulo de pulso Controller II (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA). condiciones de electroporacin optimizada de 2,5 kV, 25 metro F y 600 T
fueron usados. Inmediatamente despus de la electroporacin, 900 metro se aadi l de medio de
R2 previamente enfriado, y las clulas se mantuvieron durante 3 horas a 30 C para excrecencia. Las
alcuotas de 200 metro l se colocaron en placas sobre un medio de R2 slido que contiene 10% de
suero de caballo, 1,5% de agar y los antibiticos apropiados y se cultiv a 30C durante 18 mi 20 das.
Sobre la base de una prueba resistente a los medicamentos de S. eriocheiris, 0.7 metro g / ml de
tetraciclina
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Higo. 2. oric plsmidos utilizados en este estudio. El plsmido pTSeO se obtuvo mediante la sustitucin de la oric regin de M.
pulmonis en pMPO1 con la de S. eriocheiris. Los plsmidos pTSeT, pTSeF, y pTSedK fueron construidos mediante la
sustitucin de la regin de 320 pb que incluye el promotor spiralin de tetM en pTSeO con las regiones promotoras
predichos para factorTu alargamiento ( tufA), protena Fib ( fi segundo), y chaperon molecular ( dnaK), adjunta con su NORTE-
secuencias terminales, respectivamente.
se aadi sobre el medio slido. Las placas se observaron bajo un microscopio estereoscpico
SZX2-ILLT (Olympus, Tokio, Japn) y fotografiado. Para aislar los transformantes, las colonias
individuales en agar se seleccionaron y se homogeneizaron usando BioMasher (Iwai productos
qumicos, Tokio, Japn). El crecimiento celular se monitoriz mediante la evaluacin de la
concentracin de ATP como se describe anteriormente [8,20,23] .
2.4. En la PCR vivo
Se aislaron colonias individuales, se homogeneizaron, y se incubaron durante 4 mi 6 das en
medio lquido que contiene 0,5 metro g / ml de tetraciclina en 30 C. El crecimiento celular se control
utilizando rojo de fenol como el indicador de pH. El cultivo se transfiri a un medio lquido fresco que
contiene 0,5 metro g / ml de tetraciclina y se incub hasta que se observaron cambios en fenol rojo.
Las clulas se recogieron por centrifugacin a 16.000 gramo durante 10 min, se suspende en agua,
se calent a 95 C durante 10 min para lisar las clulas, y luego se usa como plantillas para
en vivo PCR. los fi primera PCR se realiz usando cebadores Colop-tet-F1 y Colop-tet-R3
complementarias a la tetM secuencia. El protocolo de PCR inclua 5 min a 95 C, luego 30 ciclos de 1
min a 95 C, 30 s a 45 C, y 1,2 min a 68 C, y fi nalmente 4 min a 68 Se aadi dimetil sulfxido
(DMSO) a una fi concentracin final de 5%. La segunda PCR se realiz utilizando cebadores y la
ColoPtet-F2 y ColoPtet-R2 fi productos de PCR primeras como las plantillas. El segundo protocolo de
PCR inclua 5 min a 95 C, luego 30 ciclos de 1 min a 95 C, 30 s a 55 C, y 15 s a 68 C, y fi nalmente 4
min a 68 C. Los productos fueron examinadas usando un sistema de electroforesis microchip MultiNA
(Shimadzu, Kyoto, Japn) y se secuencian
utilizando BigDye versin 1.1 y un Analizador Gentico 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
La secuencia obtenida lee fueron alineados en contra de la tetM secuencia.
2.5. Microscopio fluorescente
Para observar EYFP, los transformantes aislados fueron transferidas a un medio lquido fresco
que contiene 0,5 metro g / ml de tetraciclina y se incubaron a 30 C mientras se monitoriza el rojo
fenol. Las clulas se recogieron por centrifugacin a 11.000 gramo durante 10 min, y se suspendieron
en tampn PSF [75 mM de fosfato de sodio que contiene un 5% (w /
v) de sorbitol y 0,1% (v /) fructosa w (pH 7,3)] que contiene 0,6% de metilcelulosa (MC) para
conseguir la densidad celular original. las clulas se colocaron en cubreobjetos se lavaron con
etanlico saturado KOH, se mantuvieron a 22 mi 27 C durante 10 min para fijar las clulas sobre el
vidrio, y luego
fi fijado por una mezcla de 3,0% de paraformaldehdo y 0,1% de glutaraldehdo durante 10 min a 22 mi 27
C y 1 h a 4 C. El fi Se observaron las clulas bajo un jos IX71 Florida microscopio de fluorescencia
equipado con un YFP fi unidad de filtro (T-MYFPHQ) y una configuracin de contraste de fases
(Olympus, Tokio, Japn) [18 mi 20,24] .
3. resultados
3.1. Optimizacin de las condiciones de transformacin
El proceso de transformacin fue modi fi ed del mtodo utilizado generalmente para Mycoplasma y
espiroplasmas, especialmente S. citri
[20 mi 22] . Themajor modi fi cationes en la presente studywere una menor concentracin de suero y
una mayor concentracin de agar en el medio slido y el uso de condiciones ms graves para la
electroporacin. Durante el cultivo prolongado en medio de crecimiento slido, algunos Mycoplasma estructuras
especies formweb, llamado fi lm y manchas. Estas estructuras pueden ser el resultado de actividad
de la lipasa, que se descomponen fosfolpidos derivados de suero de caballo contenida en el medio
de crecimiento, y forman una con Florida capa uente de las clulas en la superficie de solidmedium [25,26]
. Por lo tanto, en general, la formacin de fi lm y las manchas se pueden evitar por la reduccin en la
concentracin srica [20] . Sin embargo, S. eriocheiris formado estas estructuras en slo dos das de
incubacin que no podran evitarse ef fi cientemente solamente por una reduccin en la concentracin
de suero del 15% al 10%. Fue sucedido por una modificacin adicional fi cacin de aumentar la
concentracin de agar de 0,8 a 1,5% ( Higo. 1 SEGUNDO). En el caso de Mycoplasma y espiroplasmas,
las clulas en la fase exponencial tarda (10 midto 8 CFU / ml) tena alta ef transformacin fi ciencia [21] .
A continuacin, examin el crecimiento de S. eriocheiris midiendo CFU y la concentracin de ATP en
el cultivo, que se ha demostrado que es linealmente relacionada con el nmero de clulas de S.
eriocheiris.
Las clulas inoculadas con una dilucin de 100 veces mostraron fase de crecimiento exponencial con
el tiempo de duplicacin de alrededor de 150 min a 30 C ( Higo. 1 DO). El CFU mostr que el nmero
de clulas alcanz el mximo despus de 20 h de incubacin en medio lquido, en consonancia con
el resultado de la medicin de la concentracin de ATP.
Hemos tratado de transformar S. eriocheiris mediante el uso de las condiciones de
electroporacin para S. citri transformacin (2,5 kV, 1000 T, y 3 metro F) y una cubeta con una
separacin de 4 mm como se inform anteriormente [21] . Debido a que los estudios reportados han
tenido xito en la transformacin de clulas usando las condiciones de electroporacin en la que
alrededor de 10 mi 20% de las clulas sobrevivieron, que eligi este nmero como un estndar.
Hemos probado diferentes condiciones y concluimos que la tasa de supervivencia 10% se puede
lograr bajo las condiciones de electroporacin de 2,5 kV, 600 T, y 25 metro F con 2 mm cubeta
brecha, las condiciones ms graves que los reportados para S. citri ( Higo. 1 RE) [21] .
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Higo. 3. resultados de transformacin. imgenes (a) Campo de colonias de tipo salvaje y las colonias transformadas con pTSeT. Las colonias de tipo salvaje y transformantes despus de 5 y 18 das de incubacin, respectivamente, se muestran con Magni fi
imgenes cados en los paneles de la derecha. (B) ef Transformacin fi deficiencias de los plsmidos construidos. La transformacin con pTSeO no tuvo xito. (C) El crecimiento celular de los aislados. Las colonias se aislaron y se inocularon en R2 fresco
mediumwith 0,5 metro g / ml de tetraciclina. El crecimiento celular se control utilizando rojo de fenol. (RE) En vivo PCR para con fi rm transformacin. El esquema se muestra a la izquierda. Los productos de PCR se analizaron mediante un sistema de
electroforesis microchip se muestran a la derecha con las posiciones de marcador indicados a la izquierda. La longitud esperada de los segundos productos de PCR es de 222 pb. (Para la interpretacin de las referencias de color en este fi leyenda figura,
se remite al lector a la versin web de este artculo).

Higo. 4. Expresin de opt-EYFP en las clulas mediante el uso de oric plsmido. (A) El plsmido pTopt se construy insertando 700 pb opt-EYFP clonado a partir de pMobopt en la regin de pTSeT bajo el control de TUF promotor. (B) Las imgenes de
campo de transformantes de pTSeT (superior) y pTopt (inferior) observado usando Florida microscopa de fluorescencia. Contraste de fase y Florida uorescencia imgenes se fusionan. Los transformantes de pTSeT sin EYFP gen se muestra como control
negativo. (C) Magni fi ed imgenes de transformantes de pTopt. Contraste de fase y Florida uorescencia imgenes se fusionan.

3.2. Construccin de oriC plsmidos con diferentes promotores
los oric secuencia de M. pulmonis en el plsmido, pMPO1, fue reemplazado con el de S.
eriocheiris, que era ampli fi ed a partir del ADN genmico, resultando en un plsmido, pTSeO ( Higo. 2 )
[13] . Para examinar la resistencia a las drogas de S. eriocheiris, gentamicina, kanamicina,
y se aadieron al medio slido. La tetraciclina fue eficaz a menos de 1,0 metro g / ml, mientras que
gentamicina y kanamycinwere no eficaces incluso a las concentraciones de 150 y 100 metro g / ml,
respectivamente. Por lo tanto, hemos utilizado la tetraciclina
gen resistente, tetM, como un marcador de seleccin. El pMPO1 lleva originalmente tetM como un
marcador de seleccin bajo el promotor de spiralin, una protena de la superficie abundante en S.
citri, y el promotor spiralin se utiliz para la construccin de vectores para Mycoplasma y espiroplasmas
especies. Se realiz la transformacin de S. eriocheiris
tetraciclina
la con el plsmido pTSeO que lleva el promotor spiralin para S. citri
y han fracasado. A continuacin, reemplazamos la regin que incluye el promotor y el codn inicial
de tetM con los promotores predichos de tres protenas, factor de elongacin-Tu (codificado como tufA),
protena Fib ( fi segundo), y DnaK ( dnaK) abundante en S. eriocheiris, adjunto con la ORF
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secuencia de codificacin de la NORTE- once amino terminales cidos, resultando en plsmidos
pTSeT, pTSeF, y pTSedK, respectivamente. Esto se realiz debido a que la protena pro fi l de S.
eriocheiris lisado de clulas no contena la expresin de spiralin, contrariamente a otra espiroplasmas
especies [8] .
3.3. Transformacin de S. eriocheiris
S. eriocheiris las clulas fueron transformedwith themodi fi plsmidos ed, pTSeT, pTSeF, y
pTSedK utilizando el mtodo de electroporacin optimizado. Las clulas electroporadas se
sembraron en medio slido que contiene 0,7 metro g / ml de tetraciclina. Las colonias de
transformantes aparecieron alrededor de 18 das, mientras que las colonias en el control aparecieron
en 5 das ya que las clulas se sometieron a electroporacin sin plsmido y se inocularon sin
antibiticos ( Higo. 3 UN). Se encontr que la velocidad de propagacin de la colonia de tipo salvaje
para incrementar de forma montona, pero colonias transformantes se extendi a cabo de una forma
de terrones. La transformacin ef fi deficiencias se examinaron mediante recuento de las colonias
transformadas sobre placas de agar despus de 18 das ( Higo. 3 SEGUNDO). La ms alta ef fi deficiencia
se logr mediante pTSeT que alberga el TUF
promotor.
La transformacin fue con fi confirmado por en vivo PCR de los aislados, que fueron
seleccionados al azar de medio slido y se inocul en medio lquido que contiene 0,5 metro g / ml
de tetraciclina ( Higo. 3 DO). Las clulas cultivadas se recogieron por centrifugacin, se suspendieron
inwater, y se calent durante 10 min a 95 C para lisar las clulas. los en vivo PCR se llev a cabo
usando las clulas lisadas como plantillas y los cebadores complementarios a las regiones
conservadas de la tetM gen de plsmidos. los fi primera PCR ampli fi ed los 1854 bp fragmentos de
PCR y sus productos se utilizaron para la segunda PCR como plantillas. Se observaron los 222
fragmentos esperados pb despus de la segunda PCR, y sus secuencias correspondan a la tetM gen
de los plsmidos usados ( Higo. 3 RE). Sobre la base de estos resultados, se concluye que
S. eriocheiris fue transformado con xito.
3.4. Expresin de Florida protena fluorescente
los Florida tcnica de etiquetado protena fluorescente es una estrategia ampliamente utilizado
para la visualizacin de la localizacin subcelular de las protenas en las clulas vivas [18 mi 20] . Aqu,
se dise un plsmido que alberga EYFP para aplicar este mtodo en S. eriocheiris. En el estudio
anterior, la EYFP
gen se codones optimizados para lograr una mayor Florida la intensidad de fluorescencia, debido mollicutes
incluso Mycoplasma y espiroplasmas
genomas tienen 60 mi 77% AT contenidos [27] . El codn optimizado EYFP, opt-EYFP, fue clonado a
partir de un plsmido, pMobopt, y se inserta en pTSeT en el sitio bajo el control de TUF promotor,
dando como resultado el plsmido pTopt ( Higo. 4 UN). Las colonias transformantes se formaron
despus de 18 das con 2,3 10 7 UFC / metro g ef transformacin fi ciencia. los
Florida seal fluorescente se observ claramente en los grupos de clulas y dbilmente en clulas
individuales, que es el resultado de ms corto dimetro celular vara de 0,1 a 0.2 metro m ( Higo. 4 B
y C).
4. Discusin
La ms alta ef transformacin fi deficiencia de S. eriocheiris, alrededor
1.6 10 5 UFC / metro g, se logr con el plsmido en el que pTSeT
tetM estaba bajo el control de la TUF promotor. este ef fi deficiencia era menor que la de S. citri pero
superior a la otra mollicute especies
[14] , Lo que sugiere la posible aplicacin de este sistema para otras manipulaciones de genes
incluyendo la complementacin y la interrupcin gnica utilizando transposones [13,15] . los Florida sistema
de etiquetado protena fluorescente se puede aplicar inmediatamente a rastrear los comportamientos
de los 16 componentes de la protena de la maquinaria de la natacin, recientemente identi-
fi ed a travs de fraccionamiento de protenas basado en microscopa electrnica y espectrometra de
masas [8] .
Fondos
Este trabajo fue apoyado por becas-en-Ayudas a la Ciencia fi Investigacin c en el rea prioritaria
de la armonizado supramolecular Maquinaria Motilidad y su nmero de Diversidad [24117002
subvencin a
MM] y por subvenciones-en-Ayudas a la Ciencia fi c Investigacin (B) [24390107 nmero de concesin
a MM], del Ministerio de Educacin, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnologa de Japn.
Estafa Florida icto de inters
Los autores declaran no hay aire Florida icto de intereses.
Expresiones de gratitud
Nos gustara dar las gracias a Caio MM Cordova en la Universidad de Blumenau, Brasil, por su
generoso regalo del plsmido pMPO1 [13] Y Taro Nakamura en el Osaka City University til para el
debate.
Apndice A. Los datos complementarios
Los datos suplementarios relacionados con este artculo se pueden encontrar en http: //
dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2017.03.144 .
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