Mtodo para la determinacin de Salmonella spp. en alimentos.

OBJETIVOS

Aplicar adecuadamente la tcnica descrita en la Norma Oficial Mexicana para la

deteccin del gnero Salmonella.
Explicar el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin de Salmonella
en alimentos.

GENERALIDADES

Al inicio del siglo XIX, patlogos clnicos en Francia documentaron la asociacin de la

ulceracin intestinal humana con un agente contagioso; la enfermedad fue denominada
como fiebre tifoidea y posteriormente investigadores Europeos aislaron y caracterizaron
al bacilo tifoideo responsable de sta, mientras que en los Estados Unidos, Salmon y
Smith en 1885, aislaron de carne de puerco a Bacillus cholerae-suis, ahora conocido
como Salmonella enterica serovar Cholaraesius.

Salmonella spp. es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo perteneciente a la

familia Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este gnero son capaces de
moverse por medio de flagelos pertricos, existen variantes no mviles, S. enterica
serovar Pullorum y S. enterica serovar Gallinarum, as como cepas no mviles debido a
la presencia de flagelos disfuncionales. Las especies de Salmonella son
quimioorgantrofas, con habilidad para metabolizar nutrientes por las vas fermentativa
y respiratoria. Las bacterias crecen ptimamente a 37C y pueden catabolizar la D-
glucosa y otros carbohidratos con produccin de cido y gas. Estos microorganismos
son oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como nica fuente de
carbono, generalmente producen cido sulfhdrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y
no hidrolizan la urea. La mayora de estas caractersticas se utilizan para la
identificacin bioqumica de cepas aisladas de Salmonella.

De acuerdo con la definicin contempornea, una cepa de Salmonella tpica produce

cido y gas a partir de la glucosa en el agar hierro tres azcares, pero no es capaz de
utilizar lactosa y sacarosa en ste medio, o en medios slidos selectivos tales como
verde brillante, xilosa lisina desoxicolato y/o entrico de Hekten. Las especies tpicas
de Salmonella producen en agar hierro lisina, una rpida reaccin alcalina por la
descarboxilacin de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad gentica observada
en este microorganismo ha originado mutaciones, e intercambio intra e intergenrico de
plsmidos lo cual ha reducido los biotipos tpicos de Salmonella. En muestras clnicas y
de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que no descarboxilan la
lisina, que incluso hidrolizan la urea, que producen indol y que crecen rpidamente en
KCN. Esta situacin ha llevado a reevaluar el esquema de identificacin del gnero, e
incluso a utilizar tecnologas moleculares para establecer loci genticos y/o productos
nicos para el gnero Salmonella.

La identificacin bioqumica de Salmonella se realiza generalmente junto con una

confirmacin serolgica. Esta tcnica laboriosa implica la aglutinacin de los antgenos
superficiales bacterianos con anticuerpos especficos para el gnero. Estos incluyen los
lipopolisacridos (LPS) somticos (O) en la superficie externa de la membrana externa,
los antgenos asociados con los flagelos pertricos (H) y el antgeno capsular (Vi), este
ltimo presente solamente en Salmonella serovar Typhi, Paratyphi C y Dubln.

La amplia distribucin de Salmonella spp. en el medio ambiente, aunada a las prcticas

agrcolas utilizadas en la industria crnica, pesquera, de moluscos, lctea y el reciclaje
de la materia prima como alimento para ganado, ha favorecido la continua permanencia
de este patgeno humano en la cadena alimenticia. El sector avcola se sita como la
principal fuente de Salmonella spp. y enmascara la importancia como vehculos de
infeccin de las carnes de puerco, de res, de cordero, leche y sus derivados.

Las frutas y verduras han ganado notoriedad en aos recientes como fuentes de
salmonelosis humana. Esto se presenta como una consecuencia de diversos factores
como: la fertilizacin de sembrados con lodos sin tratamiento o efluentes de drenajes
potencialmente contaminados con Salmonella spp. resistente a antibiticos, la irrigacin
de los campos y el lavado de frutas y verduras con aguas contaminadas, la
manipulacin excesiva por los trabajadores, la exposicin a la contaminacin ambiental
de especies y condimentos durante el secado y la resistencia del microorganismo a
valores de pH bajos.

El desarrollo incompleto del sistema inmune en recin nacidos e infantes, el abatimiento

en la respuesta inmunolgica en individuos de la tercera edad, y la baja produccin de
cidos gstricos en estos sectores de la poblacin facilita la colonizacin intestinal y
distribucin sistmica del microorganismo. Se ha demostrado que la ingesta de
solamente algunas clulas de Salmonella pueden ser infecciosas. La dosis infectiva en
humanos flucta entre 1 a 10 clulas.

La composicin qumica del alimento es otro factor determinante en la salmonelosis

adems de la heterogeneidad inmunolgica en la poblacin humana y la virulencia de
las cepas infectivas. Un denominador comn de los alimentos involucrados, es la
presencia de un alto contenido de grasa en alimentos como el chocolate, el queso y la
carne. Se ha sugerido que las clulas de Salmonella englobadas en las micelas
lipdicas pueden resistir el efecto ltico de los cidos gstricos.

Las infecciones por Salmonella en humanos pueden originar varias condiciones

clnicas, incluyendo fiebre entrica (tifoidea), enterocolitis e infecciones sistmicas por
microorganismos no tifoides. La fiebre entrica es una infeccin grave asociada con las
cepas tifoidea y paratifoidea, las cuales estn particularmente bien adaptadas para
invadir y sobrevivir en los tejidos del husped. Las manifestaciones clnicas de la fiebre
entrica aparecen despus de un periodo de incubacin de 7 a 28 das y pueden incluir
diarrea, fiebre prolongada con variaciones en la misma, dolor abdominal, dolor de
cabeza, y debilitamiento. El diagnstico de la enfermedad radica en la deteccin del
agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o en heces al inicio de la
sintomatologa clnica. El tratamiento incluye el uso de cloramfenicol, ampicilina, o
trimetroprim con sulfametoxasol para eliminar la infeccin sistmica. En pases
subdesarrollados como el nuestro, el uso indiscriminado de estos antibiticos ha
originado la existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad
cuando se presenta un brote de este tipo.

La infeccin en humanos con Salmonella spp. no tifoide provoca enterocolitis, sta

aparece de 8 a 72 h despus de tener contacto con el patgeno invasivo. La condicin
clnica es auto limitante y la evacuacin de heces tpicas diarreicas no sanguinolentas y
dolor abdominal se presentan a los 5 das. El tratamiento solo implica reemplazo de
fluidos o electrolitos. El uso de antibiticos est contraindicado ya que prolonga la
sobrevivencia y la excrecin intermitente del microorganismo.

Este microorganismo se identific originalmente en hospitales y laboratorios clnicos y

los mtodos empleados para su deteccin, se adaptaron posteriormente al anlisis de
alimentos. Las modificaciones a los mtodos, consideraron dos aspectos principales, el
primero es el debilitamiento o dao a las clulas bacterianas presentes, debido al
proceso al que se somete el alimento (por ejemplo: tratamiento trmico, secado, etc.) y
segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.

Para diferentes tipos de alimentos, existen distintos protocolos para el aislamiento de

Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas
de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos
selectivos y diferenciales, identificacin bioqumica y confirmacin serolgica de los
microorganismos.

FUNDAMENTO

La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un

esquema general que consiste de 5 pasos bsicos:
Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio
nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas,
logrando de esta manera una condicin fisiolgica estable.
Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte
dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por
otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra.
Seleccin en medios slidos, este punto se deriva directamente del anterior y se
utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes
a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual caracterstico de colonias
sospechosas.
Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los
cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.
 Serotipificacin, es una tcnica inmunolgica (antgeno-anticuerpo) que permite la
identificacin especfica de un microorganismo.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

NOTA

Los medios de cultivo que a continuacin se presentan son los utilizados en el

procedimiento general. Para los medios de cultivo utilizados durante
preenriquecimientos especficos consultar las modificaciones en el inciso 1.0.

1 matraz Erlenmeyer de 500 mL de capacidad, conteniendo 225.0 mL de caldo

lactosado a.
1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo selenito-cistina b.
1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo tetrationato b.
1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo Vassiliadis-
Rappaport b.
1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) c.
1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar bilis verde brillante (VB) c.
1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar entrico de Hekten (HE) c.
1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar sulfito de bismuto (SB) c.
1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar para Salmonella y Shigella (SS) c.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm conteniendo 3.0 mL de agar hierro-triple azcar
(TSI) o agar hierro Kligler (KIA) solidificado e inclinado d.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar hierro-lisina (LIA) inclinado
d
.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea o caldo Surraco e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea rpido (puede
utilizarse en sustitucin del caldo urea o Surraco) e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de medio sulfuro-indol-manitol (SIM)
e
.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar citrato de Simmons inclinado
e
.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo manitol e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo malonato e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo rojo de metilo-Voges
Proskauer (RM-VP) e.
2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 5.0 mL de caldo soya tripticasena e.
2 cajas de Petri con 20.0 mL de agar infusin cerebro corazn e.
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

1 frasco gotero con solucin salina isotnica estril d.

1 frasco gotero con solucin de verde brillante al 0.1% b
1 frasco gotero con solucin yodo yoduro de potasio b
1 frasco gotero con solucin salina formalizada e.
1 frasco gotero con reactivo de Kovacs f.
1 frasco gotero con solucin de rojo de metilo r.
1 frasco gotero con solucin reactivo de Voges-Proskauer N 1 (VP1; solucin
etanlica de alfa-naftol al 5% P/V) f.
1 frasco gotero con solucin reactivo de Voges-Proskauer N 2 (VP2; hidrxido de
potasio al 40% P/V) f.
Juego de colorantes para la tincin de Gram d.

BIOLGICOS

Suero anti Salmonella O (somtico) polivalente d.

Suero anti Salmonella H (flagelar) polivalente d.
Suero anti Salmonella Vi d.

MATERIAL Y EQUIPO

Balanza granataria a.
1 caja de Petri de vidrio estril a.
1 bolsa de stomacher o un vaso de licuadora estril a.
Utensilios necesarios para la manipulacin de muestras: cucharas, cuchillos,
tenedores, estriles a.
Stomacher o motor para licuadora a.
Pipetas de vidrio de 1 mL, estriles con filtro de algodn b.
Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d, e, f
Asa microbiolgica c, d, e.
Mecheros de Bunsen a, b, c, d, e.
Portaobjetos d.
Pipetas Pasteur estriles con filtro de algodn d, e.
Microscopio ptico d, e.
Incubadora a 35C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1C
a, b, c, d, e
.
Incubadora a 42C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1C
b
.
NOTAS
a
Material necesario al inicio de la prctica.
b
Material necesario a las 24 h. de iniciada la prctica.
c
Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica.
d
Material necesario a las 72 h. de iniciada la prctica.
e
Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica.
f
Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica.
 DETERMINACIN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS

Incubar 18- 24
h a 37C

Siembra con asa

bacteriolgica en caldo
Pesar 25 g de muestra en Homogeneizar con 225 mL tetrationato o Vassiliadis
condiciones de asepsia de solucin diluyente y Caldo Selenito cistina
segn el tipo de muestra

Incubar 18- 24
h a 37C

Aislamiento en medios selectivos y

diferenciales (XLD, SS. Hecktoen, VB,
Incubar 18- 24 Sulfito bismuto)
h a 37C

Incubar 18- 24
h a 37C

Bsqueda de colonias Resultados caractersticos

tpicas. Consultar Realizar bioqumicas
cuadro 1 presuntivas Kligler y
LIA
 Incubar 18- 24
h a 37C
Resultados
Confirmacin positivos para Siembra de bioqumicas
serolgica Salmonella complementarias: malonato
citrato, RM-VP, urea, SIM,
manitol
PROCEDIMIENTO

El siguiente mtodo se basa en el anlisis de 25.0 g de la muestra, que se

considera como una unidad analtica, en una proporcin de 1:9 de muestra/caldo.
Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin de
1:9 en el medio de preenriquecimiento. La mnima muestra recomendada es de
25.0 g, es decir, una unidad analtica. Para algunos casos donde el riesgo es
mayor, se utilizan dos unidades analticas (50.0 g) o ms.

1. Preenriquecimiento.

1.1. Procedimiento general para la preparacin de muestras

NOTA IMPORTANTE

El presente procedimiento se basa en la tcnica general para la deteccin de

Salmonella en alimentos. Sin embargo, deben consultarse los siguientes
incisos para realizar las modificaciones pertinentes al preenriquecimiento
dependiendo del alimento a analizar, los cuales se presentan en el
complemento de la presente prctica.

1. Pesar en una bolsa de Stomacher estril, en rea asptica 25.0 g de muestra a

analizar.
2. Verter 225.0 mL de caldo lactosado estril en la bolsa.
3. Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg a velocidad media
en el Stomacher.
4. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de
boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura
ambiente con la tapa perfectamente cerrada.
5. Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH.
6. Ajustar si es necesario, a un pH de 6.8 0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estriles.
7. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz
8. Incubar la muestra homognea a 35 2 C durante 24 h.

2. Enriquecimiento selectivo.

1. Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de

preenriquecimiento y agitar suavemente.
2. Transferir 1.0 mL del cultivo de preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de
1 mL, estril) a un tubo con 10.0 mL de cada uno de los siguientes medios de
enriquecimiento:
Caldo tetrationato (antes de su uso, deber activarse aadiendo al medio
base 0.2 mL de solucin yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solucin de
verde brillante al 0.1 %)
Caldo selenito cistina
 Caldo Vassiliadis-Rappaport (en sustitucin del caldo tetrationato)

3. Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o

caldo Vassiliadis-Rappaport a 35 1 C durante 24 h. Para alimentos altamente
contaminados debern incubarse los medios de enriquecimiento a 42C por el
mismo periodo

3. Aislamiento diferencial.

NOTA

La metodologa descrita en esta seccin deber realizarse para cada uno de los
caldos de enriquecimiento descritos en el inciso 2, es decir para los cultivos
desarrollados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo Vassiliadis-
Rappaport.

1. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado.

2. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiolgica estril y sembrar
en estra por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri, en cada uno de los
siguientes medios selectivos:
a) Agar XLD
b) Agar VB
c) Agar HK
d) Agar SB
e) Agar SS
f) Agar Mac Conkey
3. Incubar las cajas ya sembradas en posicin invertida a 35 2 C durante 24 2 h.
4. Observar las caractersticas macroscpicas de las colonias en los medios
slidos selectivos.
5. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de
acuerdo con las caractersticas especficas de desarrollo en cada uno de los
medios (Consultar el Cuadro 1).
6. Almacenar en refrigeracin de 5 a 8C, las placas con medios selectivos por si
es necesario tomar ms colonias.
7. Realizar una tincin de Gram a las colonias sospechosas.
8. Registrar las caractersticas morfolgicas tanto macroscpicas como
microscpicas; anotando la forma de la colonia, su color, color del medio
circundante, morfologa al Gram, etc.
9. Realizar una purificacin de las colonias seleccionadas, sembrando
nuevamente en estra por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri
conteniendo un medio idntico del que se tom la colonia.

4. Pruebas bioqumicas preliminares

NOTA
Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analtica (25.0 g).
Seleccionar colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.

4.1. Agar triple azcar hierro o agar Kligler hierro

1. Registrar las caractersticas del medio TSI o KIA antes de la inoculacin (color
del medio).
2. Por duplicado tomar suavemente una porcin del centro de la colonia con asa
bacteriolgica recta y estril e inocular por picadura y estra en un tubo con
agar triple azcar hierro (TSI) o agar de Kligler (KIA) inclinado.
3. Incubar el medio TSI o KIA a 35 2 C durante 24 h.
4. Consultar el Cuadro 2 para la interpretacin de los resultados.

4.2. Agar lisina hierro.

1. Hacer la misma operacin que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.), tomando la
asada de la misma colonia con la que se sembr en estos medios, pero
sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA).
2. La interpretacin de resultados puede ser consultada en el Cuadro 2.
3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de
Salmonella en los medios TSI (o KIA) y LIA para realizar las pruebas
bioqumicas complementarias.
4. Los cultivos desarrollados en TSI o KIA que no parecen de Salmonella pero
que presentan reacciones en LIA tpicos deben trabajarse como cultivos
presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitir detectar S.
arizonae y cepas atpicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa.
Descartar solamente los cultivos que muestre reacciones atpicas en ambos
medios.

5. Pruebas bioqumicas complementarias

5.1. Caldo urea (convencional)

1. Con asa bacteriolgica recta estril, tomar del crecimiento del tubo TSI/KIA o
LIA e inocular en el tubo con caldo urea o caldo Surraco.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos
que den la prueba negativa.

5.2. Caldo urea (rpida)

1. Con asa bacteriolgica estril, tomar dos asadas de crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o LIA e inocular
tubos de caldo urea (rpida).
2. Incubar a 37 0.5 C durante 2 h en bao de agua.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).
4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos
que den la prueba negativa.

5.3. Agar citrato de Simmons

1. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o
LIA e inocular por estra en el tubo con agar citrato de Simmons.
2. Incubar a 35 2 C durante 96 2 h.
3. Interpretar los resultados (Consultar Cuadro 2).

5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad)

1. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular por puncin vertical en el tubo con medio de SIM.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 h.
3. Para verificar la produccin de indol, adicionar al tubo con medio SIM que
presente crecimiento de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovacs.
4. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).

5.5. Caldo RM-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)

1. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular el tubo con caldo RM-VP.

5.5.1. Prueba de Voges-Proskauer (VP)

1. Para la prueba de Voges-Proskauer incubar a 35 2 C durante 48 2 h.

2. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estril un mililitro de cultivo.
3. Adicionar a este cultivo, 0.6 mL de reactivo de VP1 (alfa-naftol etanlico al 5
%), agitar y agregar 0.2 mL del reactivo VP2 (hidrxido de potasio al 40%).
4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).
5. Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto que
la reaccin se lleve a cabo en presencia de oxgeno.
6. Interpretar los resultados despus de 2 h. de incubacin a temperatura
ambiente (Consultar Cuadro 2).

5.5.2. Prueba de Rojo de Metilo

1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 2 C el resto del medio

RMVP durante 48 h ms (96 h. de incubacin en total a partir de la inoculacin
del medio RMVP).
2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solucin indicadora de rojo de
metilo.
3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar Cuadro 2).
5.6. Caldo malonato (para confirmar la presencia de S. arizonae)

1. Con asa bacteriolgica recta estril, tomar crecimiento del medio TSI/KIA o LIA
e inocularlo en el tubo que contiene caldo malonato.
2. Incubar a 35 2 C durante 40 2 h.
3. Interpretar los resultados despus de incubar (Consultar Cuadro 2).

5.7. Caldo manitol

1. Con asa bacteriolgica recta estril, tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e
inocular en el tubo que contiene caldo manitol.
2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h.
3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2).

NOTA

Las pruebas bioqumicas se pueden interpretar en el Cuadro 2, sin embargo se

sugiere que se consulten otras referencias, adems de las ya expresadas aqu,
con el fin de determinar la especie del gnero en cuestin, esto quiere decir que
no necesariamente se encuentre en el alimento analizado la Salmonella, pero s
puede encontrarse otra Enterobacteria, el que es indispensable identificar.

En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioqumicas ms generales

de Salmonella.

6. Identificacin serolgica.

6.1. Investigacin de los antgenos somticos de Salmonella (suero anti

Salmonella O polivalente).

1. Colocar con una asa bacteriolgica, dos gotas separadas de solucin salina
estril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa
para aglutinacin.
2. Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en
TSI/KIA o LIA.
3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella O polivalente y
mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.
4. Agitar inclinando la lmina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un
minuto.
5. Observar bajo una buena iluminacin y sobre un fondo oscuro la reaccin.
6. Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva.
7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretacin de los resultados.
NOTAS

La suspensin del cultivo en la que no se adicion el suero anti Salmonella O

polivalente se considerar como el control negativo para poder interpretar el
resultado.
Cuando la aglutinacin es positiva con el suero anti Salmonella O polivalente,
puede determinarse el subgrupo empleando sueros inmunes para los
diferentes subgrupos (los mas frecuentes son B, C, D y E).

Si la aglutinacin con el suero anti Salmonella O polivalente es negativa,

utilizar el suero anti Salmonella Vi polivalente y efectuar la prueba en las
mismas condiciones ya descritas. Si hay aglutinacin con Vi calentar a
ebullicin y repetir nuevamente la prueba con el suero anti Salmonella O
polivalente.

6.2. Investigacin de los antgenos flagelares de Salmonella (suero anti

Salmonella H polivalente) .

1. Para ensayo el antgeno flagelar en el mismo da, inocular el crecimiento del

cultivo de TSI/KIA o LIA en agar infusin cerebro corazn (BHI).
2. Incubar a 35C durante 4 a 6 h.
3. Para ensayo del antgeno flagelar al da siguiente inocular una asada del
cultivo desarrollado en el tubo de TSI o KIA, en un tubo de 13 x 100 mm
conteniendo 5.0 mL de caldo soya tripticasena.
4. Incubar a 35 2 C durante 24 h.
5. Adicionar al cultivo (ya sea de agar infusin cerebro corazn o caldo soya
tripticasena), 2.5 mL de solucin salina formalizada.
6. Colocar 0.5 mL del suero antiflagelar H polivalente en un tubo de ensayo para
serologa (12 x 75 mm).
7. Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado (el obtenido en el punto 5 de este
inciso).
8. Preparar un control de solucin salina mezclando 0.5 mL de solucin salina
formalizada con 0.5 mL del antgeno formalizado.
9. Incubar las mezclas en bao de agua a una temperatura entre 48 y 50 C.
10. Observar en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora.
11. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinacin en la muestra de
prueba pero no en el control.
12. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las
mezclas muestre aglutinacin.
13. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecfica.
14. La interpretacin de los resultados se puede observar en el Cuadro 3.
CUADRO 1. Colonias tpicas de Salmonella spp. en medios slidos
selectivos.
MEDIO SELECTIVO Color antes de la Caractersticas
inoculacin coloniales de
Salmonella spp.
Agar Verde Brillante Oscuro, color marrn Rosas o rojas pueden ser
(VB) transparentes, rodeadas
de medio enrojecido. Las
bacterias fermentadoras
de lactosa son amarillas
Agar Sulfito Bismuto Opaco, verde plido Caf, grises o negras; con
(SB) o sin brillo metlico.
Algunas veces presencia
de halo caf o negro.
Agar Xilosa Lisina Claro, color rojo brillante Rosas o rojas pueden ser
Desoxicolato (XLD) transparentes, con o sin
centro negro. En algunos
casos completamente
negras
Agar para Salmonella y Claro, color rosa Translcidas en ocasiones
Shigella (SS) opacas. Algunas con
centro negro. Las colonias
fermentadoras de lactosa
son rojas
Agar entrico Hekten Oscuro, color verde Verdes o azul verdes con
o sin centro negro. En
algunos casos
completamente negras
CUADRO 2. Reacciones bioqumicas de Salmonella.
Medio a Color antes de Color despus de
Resultado
inocular/incubar inocular/incubar
Kligler: + Naranja Fondo tubo amarillo
Fermentacin Crecimiento
Glucosa
Kligler: c Naranja Pico de flauta naranja.
-
Fermentacin Crecimiento
Lactosa
Kligler: Produccin + Naranja Ennegrecimiento
de H2S Crecimiento
Agar LIA: Lisin + Prpura tenue Prpura intenso
descarboxilasa Crecimiento
Agar LIA: H2S + Prpura tenue Ennegrecimiento
Crecimiento
Agar LIA: + Prpura tenue Fondo tubo amarillo
Fermentacin Crecimiento
Glucosa
Caldo Surraco: - Rosa Rosa-violeta
Ureasa mexicano Crecimiento
Caldo Surraco: - Rosa Amarillo
Fermentacin Crecimiento
sacarosa
Medio SIM: d Amarillo tenue. Crecimiento en
+
Movilidad Semislido, superficie y picadura,
translcido turbiedad/difusin
fuera de picadura
Medio SIM: Indol - Amarillo tenue. Con reactivo Kovacs:
Semislido, Formacin de anillo
translcido rojo en superficie
Medio SIM: H2S + Amarillo tenue. Ennegrecimiento
Semislido, Crecimiento
translcido
Caldo RMVP: Prueba + Amarillo tenue, Con indicador rojo de
de rojo de metilo translcido metilo: Rojo
Caldo RMVP: Prueba - Amarillo tenue, Con reactivos VP1 y
Voges-Proskauer translcido VP2: Anillo rojizo
Agar Citrato a+ Verde Azul
V
Simmons Crecimiento
Caldo malonato c Verde Azul
-
Caldo manitol rojo + Rojo Amarillo
fenol
Caldo dulcitol rojo b Rojo Amarillo
+
fenol
Caldo KCN - Sin desarrollo Desarrollo
Caldo manitol rojo + Rojo Amarillo
fenol
Observacin
Bacilos cortos Gram-negativos, no esporulados
microscpica
a
+,90% o ms positivos en 1 2 das;- 90% o ms negativos en 1 2 das; v,
variable.
b
La mayora de los cultivos de S. arizonae son negativos.
c
La mayora de los cultivos de S. arizonae son positivos.
d
Excepto S. entrica serovar Pullorum y S. entrica serovar Gallinarum y cepas
con flagelos disfuncionales
CUADRO 3. Reacciones serolgicas de Salmonella.
Reacciones bioqumicas Reacciones serolgicas Interpretacin
Tpica Antgeno O, Vi o H Cepas consideradas como
Positivo Salmonella
Tpica Todas las reacciones
positivas
Tpica No probada Puede ser Salmonella
Reacciones atpicas Antgeno O, Vi o H
Positivo
Reacciones atpicas Todas las reacciones No debe ser considerada
negativas Salmonella

RESULTADOS

1. Interpretacin de resultados.

Consultar los resultados obtenidos en los cuadros para la identificacin de los

gneros y especies de las bacterias investigadas.

2. Informe de resultados.

Reportar presencia o ausencia de Salmonella spp. o la especie identificada en

25.0 g o mL de alimento, o en la cantidad de muestra inicialmente pesada (mayor
a 25.0 g o mL).

COMPLEMENTO

Preenriquecimientos especficos en diversos grupos de

alimentos para la deteccin de Salmonella spp. (contina de
inciso 1)

1.2. Preenriquecimiento para huevo en polvo, claras de huevo en polvo,

huevos lquidos pasteurizados y congelados, frmulas infantiles y
mezclas preparadas en polvo como harinas para hot cakes, galletas,
donas, biquets y pan.

Si el alimento est congelado, no descongelar sino hasta el momento del

anlisis.
Descongelar en un bao de agua a 45C agitando continuamente en un lapso
de 15.0 min. aproximadamente, o bien se somete a una temperatura entre 2 y
5C durante 18.0 h.
1.2.1. Productos lquidos

Realizar el preenriquecimiento como se indica en el procedimiento general

(inciso 1.1.)

1.2.2. Productos en polvo

1. Pesar 25.0 g de muestra y transferirla a una porcin del caldo lactosado

(aproximadamente 15.0 mL), para permitir la humectacin lenta del alimento.
2. Homogeneizar poco a poco con una varilla de vidrio estril y agregar ms caldo
lactosado hasta completar 225.0 mL
3. Continuar igual que el procedimiento general (inciso 1.1.)

1.3. Preenriquecimiento para productos no pasteurizados congelados de

huevo

1. Descongelar la muestra como se indica en 1.2.

2. Pesar aspticamente y por duplicado 25.0 g de muestra.
3. Colocar una de las muestras en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo
selenito cistina
4. Colocar la segunda muestra en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo
tetrationato, sin verde brillante.
5. Ajustar si es necesario el pH a 6.8 0.2 con hidrxido de sodio 1N o cido
clorhdrico 1N.
6. Al matraz que contiene el caldo tetrationato, adicionarle 2.25 mL de verde
brillante al 0.1% y 4.5 mL de solucin yodo-yoduro. Mezclar bien.
7. Incubar a 35C durante 18 a 24 h, o en caso de tratarse de alimentos
fuertemente contaminados incubar a 42C por el mismo periodo.

1.4. Productos que contienen huevo en su formulacin: (pastas para sopa,

rollos chinos, etc.); ensaladas preparadas (jamn, huevos, pollo, atn, pavo);
frutas frescas, congeladas o secas; crustceos (camarones, cangrejos, jaibas,
langostinos, langostas) y pescado

1. Preferentemente no descongelar la muestra antes de su anlisis, si esto es

necesario, proceder igual que en el inciso 1.2.
2. Pesar 25.0 g de muestra y adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estril.
3. Licuar el alimento durante 2.0 min.
4. Transferir la mezcla homogeneizada en el matraz que contena el medio de
preenriquecimiento.
5. Continuar con la incubacin como se indica en el procedimiento general (inciso
1.1.)

1.5. Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada.

1. Seguir el procedimiento general para el pesado de la muestra y adicionarla
lentamente a un matraz Erlenmayer con 225.0 mL de solucin verde brillante al
0.1%, procurando que el polvo quede en la superficie del lquido y se hidrate
suavemente.
2. Dejar la mezcla en reposo por 60 min.
3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

1.6. Queso

1. Preenriquecer como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.),

utilizando solucin amortiguadora de peptona como medio de cultivo.

1.7. Casena

1. Seguir la metodologa sealada en el procedimiento general (inciso 1.1.).

2. Licuar durante 2 min.
3. Ajustar cuidadosamente el pH a 6.8 0.2

1.8. Coco

1. Proceder como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), ajustar el pH

a 6.8 0.2.
2. Adicionar hasta un mximo de 2.25 mL de tergitol aninico 7 estril
(121 1C/15 min.) y mezclar bien. Tambin puede utilizarse tritn X-100 estril.
Usar la cantidad necesaria de estos detergentes utilizando el volumen mnimo
para que se inicie la formacin de espuma. Puede ser para el tritn X-100 de
dos a tres gotas.
3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

Levadura seca

1. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando como medio de

preenriquecimiento caldo soya tripticasena estril.
2. Mezclar para formar una suspensin homognea
3. Ajustar el pH a 6.8 0.2
4. Terminar el procedimiento como se indica en el inciso 1.1.

1.9.1. Levadura seca inactiva.

1. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2

1.9.2. Levadura seca activa

1. Mezclar la muestra incubada (inciso 1.9.)

2. Transferir 1.0 mL a cada tubo de 10.0 mL de caldo tetrationato (con 0.2 mL de
solucin yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solucin de verde brillante al
0.1%) y 10.0 mL de caldo lauril-triptosa.
3. Incubar los medios de enriquecimiento a 35C por 24 h 2 h

1.10. Carnes, sustitutos de carnes, derivados crnicos, sustancias de origen

animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso)

1.10.1. Productos procesados trmicamente y productos secos.

1. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta la homogeneizacin.

2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse.
3. Despus de reposar, mezclar bien y ajustar el pH a 6.8 0.2.
4. Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las similares
proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco (inciso 1.8.)
La cantidad de los mismos depender en gran medida de la composicin del
alimento. Los detergentes no sern necesarios en los productos glandulares en
polvo.
5. Incubar las muestras como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

1.10.2. Productos crudos o altamente contaminados.

1. Pesar porciones de 25.0 g de producto por duplicado en dos vasos para

licuadora o en dos bolsas de Stomacher.
2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y pesar
directamente el producto en matraces Erlenmayer estriles de 500 mL.
3. Adicionar 225.0 mL de caldo selenito-cistina o 225.o mL de caldo tetrationato
(sin verde brillante) a cada muestra pesada.
4. Licuar por dos min. y pasar aspticamente a matraces Erlenmayer de 500 mL.
5. Dejar reposar y ajustar el pH a 6.8 0.2
6. Adicionar al caldo tetrationato, 2.25 mL de solucin de verde brillante 0.1% y
4.5 mL de solucin yodo-yoduro de potasio
7. Mezclar el matraz con los reactivos aadidos.
8. Incubar como se describe en el procedimiento general (inciso 1.1.).
9. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2. para
muestras en general.

1.11. Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate)

1. Pesar aspticamente 25.0 g de muestra en un vaso de licuadora o bolsa de

Stomacher, y agregar 225.0 mL de leche descremada reconstituida estril.
2. Licuar por dos min.
3. Continuar igual que en el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta despus de
ajustar el pH.
4. Adicionar 0.45 mL de la solucin de verde brillante al 0.1% y mezclar bien.
5. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

1.12. Especias

1.12.1. Pimienta negra, pimienta blanca, semilla de apio, comino, perejil seco,
romero, tomillo, chile en polvo, pprika o pimentn, ajonjol, hojuelas de
vegetales (vegetales secos)

1. Pesar aspticamente 25.0 g de muestra y verter en un matraz Erlenmeyer con

tapn de rosca de 500 mL con 225.0 mL de caldo soya tripticasena estril y
mezclar bien.
2. Continuar con el procedimiento como en el inciso 1.1.

1.12.2. Ajo en polvo u hojuelas; cebolla en polvo u hojuelas

1. Pesar aspticamente 25.0 g de la muestra y verter en un recipiente de tapn

de rosca de 500 mL con 225.o mL de caldo soya tripticasena estril
adicionado con sulfito de potasio y mezclar bien.
2. Continuar con el procedimiento general (inciso 1.1.)
1.12.3. Pimienta de Jamaica (Pimienta Inglesa), clavo de especia, canela y
organo

1. No se conoce un mtodo para neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias.

Diluir por lo tanto ms all de su poder de toxicidad.
2. Examinar la pimienta, canela y organo en una proporcin 1:100
muestra/caldo, y el clavo a 1:1000 muestra/caldo.
3. Continuar con el procedimiento descrito en el inciso 1.12.1.

1.13. Gelatina
1. Pesar aspticamente 25.0 g de muestra en un recipiente de boca ancha y
tapn de rosca de 500 mL.
2. Adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estril con 5.0 mL de solucin acuosa
de gelatinasa al 5.0% y mezclar bien.
3. Dejar reposar 60 min.
4. Continuar como en el procedimiento general (inciso 1.1.)

BIBLIOGRAFA

Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para

la determinacin de Salmonella en alimentos.

Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy

Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C.

DAoust J., Maurer J. & Bailey J.S. (2001). Salmonella Species. In: Food
Microbiology. Fundamentals and Frontiers. Doyle M., Beuchat L.R. & Montville
T.J. (Eds.) 2d. ed. ASM Press USA: 141-157.

Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th

ed. Arlington, VA: AOAC.

Andrews W.H., Flowers R.S., Silliker J., & Bailey S. (2001) Salmonella. In:
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 th ed.
Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington: 357-380.

International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)

Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed.

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