Prdida de Impronta y elevada expresin de wild type p73 en

Adenocarcinoma Humano Gstrico

Min-Ju Kang, Bum-Joon Park, Do-Sun Byun, Jae-II Park, Hyo-Jong Kim, Jae-Hoon Park,
Sung-Gil Chi.
INTRODUCCIN ABSTRACT
Aunque el cncer gstrico es uno de El gen p73 localizado en 1p36.3
los tumores maliciosos ms codifica para una protena con
comunes, la patognesis de esta significante similitud a p53. Para
enfermedad y los eventos genticos investigar la penetracncia de p73 en
moleculares que contribuyen a su carcinogenesis gstrica, se analiz la
desarrollo son poco conocidos. expresin, tipo de alelo y mutacin
Recientemente, el primer homlogo de p73 en cinco lneas celulares y 75
del P53, denominado P73 se ha tejidos. Aunque se observaron niveles
clonado en 1P63. P73 comparte extremadamente bajos de expresin
secuencias notablemente idnticas a de p73 en todos los tejidos gstricos
la unin del ADN, transactivacin y no cancerosos y 4 de 5 lneas
oligomerizacin de dominios de P53. celulares, una significante elevacin
La sobreexpresin transitoria de P73 de la expresin de p73 fue detectada
induce la detencin del ciclo celular en 37 de 39 tejidos de carcinoma
en G1 y apoptosis en P53 () y activa (94.9%). Ms all, un incremento de
la transcripcion de genes sensibles a un tumor especfico de p73 fue
P53 como P21waf1. P73 es expresado identificado en 14 de 16 (87.5%) de
monoalelicamente en lneas celulares los sets. El anlisis de los tipos de
del neuroblastoma y tipos de alelos usando polimorfismo StyI o
tumores. As como en la sangre BanI relev que 5 de 21 (23.8%)
perifrica normal, apoyando que la informative* carcinomas, pero
nocin de P73 se imprime ninguno de los 19 casos no
paternalmente con respecto a las cancerosos expresan p73
deleciones discretas en bialelicamente, sugiriendo que la
neuroblastomas. activacin transcripcional de un alelo
A pesar de una sorprendente silente en un subset de canceres. En
semejanza a P53, P73 se expresa a donde la transcripcin de un alelo
bajos niveles en tejidos normales y activo fue marcadamente inducido
no es inducido por irradiacin UV o por una privacin de serum o
actinomicina D. que se sabe que formacin de grupos de las clulas,
induce P53 y reegula de diferentes tratamiento con 5-aza-2deoxicitidina
maneras los genes de clulas diana. activ un alelo silente con una
Adems la inactivacin de p73 no se posterior regulacin de un alelo
requiere para el desarrollo de activo, apoyando impronta gnica y
tumores inducidos por virus y autorregulacin del gen. Delecin
ninguna de las oncoprotenas virales allica o mutacin del gen no fue
inactivadas por p53, como adenovirus encontrada, y tampoco se reconoci
E1B 55K, antgeno T de SV40 y el asociacin de la expresin de p73
virus del papiloma humano E6 con estados mutaciones de p53 o
desestabiliza p53. Estudios recientes expresin de p21Wasf1. Tomando to
han demostrado que la tirosina esto, este estudio discute que p73 no
kinasa c-AbI fosforila p73 y estimula es objetivo de alteraciones genticas
la transactivacin mediada por p73 y en carcinogenesis gstrica y sugiere
desajuste de la apoptosis que la sobre expresin ed p73 podra
dependiente de reparacin. La ser gatillada por estrs psicolgico
habilidad de c-AbI para fosforilar a acompaado con el crecimiento de
p73 es notoriamente aumentado por tumores, como hipoxia o privacin de
la irradiacin gamma o cisplatina. nutrientes.
P73 participa en la respuesta
hiperplsticos y 20 tejidos no
cancerosos) fueron obtenidos desde
39 pacientes con cncer gstrico y
16 de pacientes sin cncer mediante
una reseccin quirrgica en el Centro
Mdico de la Universidad de Kyung
Hee (Sel, Corea). Especmenes de
tejido fueron congelados en N2
lquido y guardados a -70C hasta su
uso. 5 lneas celulares de carcinoma
gstrico (SNU-1, SNU-5, SNU-16, AGS,
y KATO-III) fueron obtenidas del
Banco de lneas celulares de Corea
(Universidad Nacional de Sel, Sel,
Corea) o de la Coleccin Americana
de Cultura (Manassas, VA). 5 lneas
humanas celulares, derivadas desde
neuroblastoma (IMR32 y SK-N-SH),
carcinoma de mama (MCF7) y
leucemia (HL60 y U937) fueron
incluidas para validar el alcance
cuantitativo de RT-PCR para la
expresin de p73. Para alcanzar la
demetilacin, las lneas celulares con
5-Aza-dC (Ca. Sigma Chemical,
St.Louis, MO) a una concentracin de
2 UM por 2 a 5 das.
Anlisis cuantitativo de PCR
Nuestras estrategias basadas en PCR
y secuencias de primers de
oligonucleotidos fueron usados para
la cuantificacin y expresin del
estatus genmico de p73 fueron
descritas anteriormente. Brevemente,
la expresin de p73 fue analizada
usando primers p73-1 y p73-14, y
GADPH fue usada como un estndar
de expresin endogena. Para
deteccin de variantes de splicing
alternativo alfa y beta fueron usados
primers p73-11 y p73-9. Para anlisis
de cuantificacin de DNA/PCR, se
usaron intrones especficos primers
p73-E2S y p73-12 para la
amplificacin del exon 2 regin del
gen, y primers G3 (sentido 5) y G5
(antisentido 5) fueron usados para la
amplificacin del intrn de la regin 5
de GADPH. Cuantificacin fue
alcanzada por densitometra de los
apopttica al dao de DNA mediante
el mecanismo de c-AbI. Estos
estudios indican que p53 y p73 no
son funcionalmente equivalentes y
estn implicados en vas celulares
distintas. P73 es monoalelicamente
expresado por una alta impronta y se
plante () que la inactivacin
funcional de p73 podra requerir solo
un nico evento que es una prdida
principal o mutacin del alelo
expresado. Sin embargo, mutaciones
de p73 se han encontrado para ser
extremadamente raro en los
cnceres humanos primarios,
incluyendo tumores que muestran la
prdida de heterozigosidad en 1p36.
Adems la sobreexpresin biallica
de p73 se ha observado
frecuentemente en diversos tumores
humanos, incluyendo pulmn,
prstata y cncer al rin con la
actividad transcripcional del alelo
silente. Estas observaciones
sugieren que p73 no es un gen
supresor de tumores to fit a two-hit
model of tumorigenesis or is not the
relevant target of 1p36 deletions.
Para investigar la penetrancia de p73
en carcinognesis gstrica, nosotros
analizamos los niveles de expresin,
expresin especfica de alelos y
alteraciones mutantes de p73 en 75
tejidos y 5 lneas de clulas. Aqu se
demuestra que p73 no es un blanco
de las alteraciones gnicas en la
carcinognesis gstrica y tambin
muestra que p73 de tipo salvaje es
frecuentemente sobreexpresado en
tejidos de carcinoma por la induccin
transcripcional de un alelo activo y/o
la activacin de un alelo silente.
MATERIALES Y MTODOS
Tejidos gstricos, lneas celulares y
tratamiento con 5 Aza-dC.
Un total de 75 tejidos gstricos
(incluyendo 35 adenocarcinomas, 3
adenomas, 6 hamartomas, 7 plipos
que el nivel de expresin
determinado por la RT-PCR es
consistente con el anteriormente
caracterizado genoma y estado de
expresin del gen. Curiosamente, la
expresin de p73 no fue detectada en
lneas celulares gastricas, excepto en
SNU-16. Para hacer frente a que la
ausencia de la expresin de mRNA
resulta de la supresin de genes, el
nivel genmico de p73 se determin
por DNA/PCR cuantitativo. Como sea,
no se reconoci diferencia
significativa en niveles de p73 entre
las cinco lneas celulares. Anlisis de
alelos del gen tambin demostr que
AGS es heterocigoto para
polimorfismos StyI y BanI y SNU-1 y
KATO-III son heterocigotos para
polimorfismo BanI (Figs. 1 y 2). As
nuestros resultados muestran que
mRNA p73 no es detestable en 4 de
las 5 lneas celulares a pesar de la
evidencia de la delacin allica del
gen.
Expresin monoallica de p73 en
tejidos normales.
Previos estudios demostraron que la
expresin de p73 es extremadamente
baja en tejidos normales,
posiblemente por el silenciamiento
transcripcional de un alelo debido a
la impronta genmica. Para definir si
p73 es improntada en el estomago, se
analiz el nivel de expresin y el
origen allico de transcritos de p73
en 33 tejidos no cancerosos
incluyendo 20 tejidos normales, 6
hematomas y 7 plipos
hiperplsticos. Como es mostrado en
la Fig. 1A, todos los tejidos no
cancerosos mostraron una muy baja
detectable expresin de p73. Para
anlisis de tipos de alelos transcritos
de p73 es estos tejidos, exones 2 y 5
regiones de los transcritos fueron
amplificados usando nest-PCR y los
productos fueron digeridos con
enzimas StyI o BanI. Las lneas
geles teidos de etidio y bromuro e
integraciones de las curvas
representando cada espcimen
fueron comparados para luego
realizar el ajuste para GADPH.
Integracin y anlisis fueron
realizadas usando un software de
analiza molecular.
Expresin allica de p73
Ensayos de tipos de alelos usando
polimorfismo StyI en exn 2 fue
realizado como descrito previamente.
Para alelo typing usando un
polimorfismo BanI el exon regin 5
fue amplificado por primers p73-15
(sentido 5) y p73-2 (antisentido 5),
para transcriptos.
Anlisis no isotpico RT-PCR-SSCP
El anlisis no isotpico de RT-PCR-
SSCP de toda la regin codifican del
transcripto de p73 fue llevado a cabo
como se report previamente.
RESULTADOS
Expresin de p73 en lneas celulares
de Carcinoma Gstrico
Para explorar la candidatura de p73
como un supresor en carcinoma
gstrico, inicialmente se evalu la
expresin de niveles de p73 mRNA en
5 lneas celulares de carcinoma
gstrico (SNU-1, SNU-5, SNU-16, AGS,
y KATO-III). Como se report
previamente, se examinaron niveles
de expresin en 5 lneas celulares
humanas caracterizadas p73 las
cuales fueron examinadas para
validacin de nuestro alcance en RT-
PCR cuantitativa. IMR32, SK-N-SH y
MCF7, los cuales llevaban, uno, dos y
tres alelos de p73, respectivamente,
fueron incluidos como controles de
expresin, y U937 y HL60 fueron
elegidos para ejemplificar no
expresores. Como se muestra en la
Fig. 1A, los niveles predichos de p73
fueron observados en lneas celulares
expresoras, donde no expresin fue
detectada en U937 y HL60, indicando
Induccin de p73 por privacin de
serum
Para ganar ms entendimiento de la
base molecular de la induccin de
p73, se examin la respuesta
transcricional del gen p73 a varios
estmulos en 4 tejidos gstricos
mostrando no expresin de p73
mRNA. Sin embargo p73 mRNA no fue
inducido daando el DNA con agentes
como etoposide****, una significante
y rpida alza de expresin de p73 fue
encontrada en todas las lineas
celulares siguiendo con la privacin
de serum (Fig.2), En adicin,
induccin de p73 en SNU-16 fue
asociada con la formacin de grupo
de clulas (datos no son mostrados).
Allelotyping anlisis para 3 lneas
celulares informativas demostraron
que los transcritos de p73 inducidos
por privacin de serum fueron
originados de un alelo activo [alelo
StyI(+) en AGS, alelo BanI(-) en SNU-1,
y alelo BanI(+) en KATO-III]. Por lo
tanto, este resultado apoya an ms
el silenciamiento transcripcional de
un alelo en estas clelas y sugiere
que p73 podra ser regulada en
tejidos con cancer en respuesta a
estrs fisiolgico como privacin de
nutrientes o hipoxia.
Activacin de un alelo silente por
tratamiento con 5 Aza-dC
Para explorar la implicancia de la
hipermetilacin en el silenciamiento
transcripcional del gen p73, se
trataron las cuatro lneas no
expresoras con el agente demetilante
5 aza-dC. Como es mostrado en la
Fig.3, una significante aumento de
expresin de p73 fue detectada en
todas las clulas tratadas.
Allelotyping anlisis revel que en
transcritos inducidos de p73 fueron
originados de un alelo silente [alelo
StyI (-) en AGS, alelo BanI(+) en SNU-
1, y alelo BanI(-) en KATO-III],
indicando la importancia funcional de
celulares IMR32 y MCF7 fueron
incluidas como controles para
allelotypes StyI de alelos A/T y G/C,
respectivamente (Fig. 1B). Anlisis de
DNA genmico revel que 19 (13
tejidos normales, 3 hematomas y 3
plipos hiperplsticos) de los 33
tejidos no cancerosos son
heterocigotos para StyI o BanI y
todos estos 19 expresan p73
monoalelicamente. Estos resultados
indican que un alelo de p73 es
transcripcionalmente silente y el otro
alelo es expresado en
extremadamente bajos niveles en el
estomago.
Sobreexpresin de wild-type p73 en
carcinomas gstricos.
Comparado con tejidos no
cancerosos, se encontr una
significante alza de expresin de p73
en 37 de 39 (94.9%) carcinomas y 2
de 3 (66.7%) adenomas (Fig. 1A). Ms
all, sobreexpresin especfica de
tumor fue identificada en 14 de 16
(87.5%) de matched sets. Donde la
variante p73alfa mRNA fue
claramente observada, p73beta
mRNA fue apenas detectable (no fue
mostrado en los resultados). Entre
los 39 sobreexpresores, 21 (53.8%)
fue heterocigoto para StyI o BanI y 5
(23.8%) de estos fueron encontrados
que expresan p73 bialelicamente
(Fig.1B). Expresin de p73 mostr la
no correlacin con caractersticas
histopatologicas de tumores.
PCR/DNA cuantitativo y RT-PCR-SSCP
anlisis mostraron no deleccioenes
allicas y mutaciones, eccepto los
previamente descritos polimorfismos
(17). Colectivamente, estos datos
sugieren que wild-type p73 es
frecuentemente sobreexpresado en
tejidos con carcinoma gstrico,
posiblemente debido a la induccin
de un alelo activo y/o la activacin
transcripcional de un alelo silente.
monoallica de p73 en tejidos gstricos
normales y el tratamiento 5Aza-dC llev a la
activacin de la transcripcin de un alelo
silencioso suponiendo la impronta genmica
de p73 en el estmago. Sin embargo, no se
observ delecion allica o mutacion de p73 y
la expresin es notoriamente elevada en
carcinomas y la expresin bialelica fue
encontrada en un subconjunto de tumores.
Curiosamente la induccin transcripcional de
un alelo activo fue seguida por la activacin de
un alelo silente por el tratamiento 5Aza-dC,
resultando una significativa elevacin de p73.
Este hallazgo sugiere que la liberacin de la
impronta de p73 podra conducir a una
sobreexpresin biallica de p73 en clulas
tumorales posiblemente mediante
autorregulacin de la transcripcin de genes.
Colectivamente, estos resultados indicaron
que p73 es poco probable que sea un gen
supresor de tumor que conforma 2 golpes o
xitos de modelo de tumorigenesis.
Actualmente no hay evidencias genticas que
la inactivacin de p73 es requerida para la
transformacin o la progresin maligna de
tumores humanos, excepto los estudios
recientes del silenciamiento epigentico de
p73 en determinados tipos de neoplasias
hematolgicas como leucemias linfoblsticas
agudas, linfomas y linfomas de Burkitt.
Recientemente, Yoshikawa examin las
alteraciones mutacionales de p73 en 54 lineas
celulares de cncer humano y encontraron 3
lneas celulares de pulmn con mutaciones de
p73. Sin embargo, no hay evidencias de
mutaciones de p73 en el cnceres primarios
del pulmn plantean la posibilidad que las
mutaciones ocurren en cultivo celular. Nuestro
anlisis RT-PCR SSCP sugiere que las
mutaciones en p73 podran ser raras en
cncer gstrico. Adems no fue reconocida
ninguna correlacin de la expresin de p73
con el estado mutante de p53 o los niveles de
expresin de p21Waf1. As, nuestro resultado
es incompatible con la hiptesis de que la
interrupcin de los resultados normales de la
funcin de p53 en la regulacin compensatoria
o perjudicial de p73 () o que la
sobreexpresin de p73 de tipo salvaje puede
imitar a p53 mutante, actuando as como un
factor dominante negativo en clulas
tumorales de p53.
2 de 3 lneas celulares de pulmn con
mutaciones de p73 tambien han sido
reportados para llevar mutaciones de p53.
Entonces surge la pregunta de por qu p73 de
tipo salvaje es elevada en una variedad de
la metilacin en el silenciamiento
transcripcional de uno de los alelos
de p73. Interesantemente, sin
embargo, los transcritos de un alelo
activo aumentaron despus de un
tratamiento con 72-h, sugiriendo que
la transcripcin de p73 puede ser
estimulada directa o indirectamente
por los elevados productos proteicos
de p73.
No correlacin con el estado de p53 o
expresin p21Wasf1
Siguiente se examin la posible
la relacin de la expresin de p73 con el
estado mutacional de p53. Prdida de
expresin de mRNA o alteracin en la
secuencia de p53 fue detectada en 8
de 23 (34.8%) carcinomas, y 6 (75%)
de estos mutantes que llevan p53
mostraron baja o casi niveles que no
se detectaban de expresin de
p21waf1. Sin embargo, no se
reconoci asociacin de la expresin
de p73 y el estado mutaciones de p53
o niveles de expresin de p21waf1 en
estos carcinomas, tanto como las
cinco lneas celulares que se
examinaron (data no mostrado).
DISCUSIN
En el presente estudio, nosotros demostramos
que p73 de tipo salvaje es frecuentemente
sobreexpresado en tejidos de carcinoma
gstrico mediante la induccin monoallica de
un alelo activo y/o activacin de un alelo
silente, sugiriendo que diferente a p53, p73
podra no ser un blanco de las alteraciones
gnicas en carcinognesis gstrica y que la
sobreexpresin de p73 ms que un supresor
de tumores puede contribuir a la
tumorignesis. Este resultado es consistente
con los recientes reportes de una expresin
mas intensa de p73 en el pulmn, prstata y
tumores de vejiga que en los tejidos normales
y la perdida de la impronta genmica en
carcinomas de clulas renales.
La impronta genmica de p73 plantea la
posibilidad que la prdida de un alelo activo
transcripcionalmente por un solo evento puede
ser suficiente para contribuir a la
carcinognesis humana. en este estudio el
anlisis de alelos revel la expresin
tumores slidos. Nuestra observacin de la
induccin de p73 por la privacin de suero o
formacin de grupo de clulas plante la
posibilidad que la sobreexpresin de p73 est
asociada con condiciones desfavorables de
crecimiento dentro de los tumores. ()
Estudios recientes tambin han demostrado
que la expresin de p73 es dependiente de
condiciones fisiolgicas y que la expresin
monoalelica de p73 no se mantiene
estrictamente en los tumores. En este
contexto nosotros especulamos que el estrs
fisiolgico acompaado con excrecencia de
tumores slidos cancerosos, como hipoxia,
privacin de nutrientes o desequilibrios entre
las seales que regulan el crecimiento, puede
provocar la transcripcin de p73, conducir a la
apoptosis o inhibicin del crecimiento de
clulas tumorales. Sin embargo, la ausencia
de la inactivacin mtacional de p73 en
tumores humanos, sugiere que la induccin de
p73 no puede ser suficiente para suprimir la
progresin maligna de tumores. Tomados en
conjunto, nosotros mostramos aqu que p73
de tipo salvaje es frecuentemente
sobreexpresado en tejidos de carcinoma
gstrico, el cual argumenta que la inactivacin
de p73 no es un blanco de las alteraciones
genticas en carcinognesis gstrica. Se
requiere trabajo adicional para determinar la
importancia biolgica de p73 elevada en el
crecimiento y apoptosis de clulas tumorales
gstricas.