Ao de la Diversificacin Productiva y del

Fortalecimiento de la Educacin

TEMA: DETERMIACION Y METODOS PARA DETERMINAR LA

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

CURSO: ANALISIS DE LOS PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

PROFESOR(A): Mg. BARRAZA JAUREGUI, GABRIELA DEL CARMEN

INTEGRANTES: VILCA SALAZAR DIEGO

PINEDA VILLANUEVA KEISSY

LIZARRAGA ALVAREZ EDWARD

SOLANO RODRIGUEZ EDGAR

PAJARES MEDINA MERCEDES

NICACIO VALDEZ ISAAC

E.A.P.: Ing. Agroindustrial

CICLO: IV
 ANALISIS DE LOS PAI

INDICE
INDICE Pag.1

INTRODUCCION Pag. 2

DETERMIACION Y METODOS PARA DETERMINAR LA Pag. 3

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

1.- ENSAYOS BASADOS EN LA REACCIN POR Pag. 4

TRANSFERENCIA DE ELECTRONES (ET)

MTODO ABTS Pag. 4

MTODO DPPH Pag. 5

METODO FRAP Pag.6

MTODO DMPD Pag.6

2.- ENSAYOS BASADOS EN LA REACCIN POR Pag.7

TRANSFERENCIA DE TOMOS DE HIDRGENO (HAT)

MTODO ORAC Pag.7

MTODO TRAP Pag.8

METODO TRABS Pag.9

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Pag.9

CAPACIDAD DE ABSORCIN DE RADICALES DE OXGENO
(ORAC)

DISCUSIONES Pag.12

CONCLUSION Pag.13

RFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Pag.14

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INTRODUCCION

Los antioxidantes son un grupo de vitaminas, minerales y colorantes de compuestos

vegetales que impiden el efecto perjudicial de los radicales libres por eso debemos
incluir las frutas, verduras, legumbres, cereales integrales y hortalizas en nuestra dieta
diaria.
La falta de antioxidantes puede repercutir en nosotros, en nuestra salud, de la
siguiente forma:
Envejecimiento prematuro producido por la acumulacin de radicales libres.
Problemas en el sistema nervioso, vindose afectado en disminucin el impulso
nervioso, los reflejos, la memoria y el aprendizaje, si llega a disminuir la
irrigacin sangunea a nivel nervioso se puede llegar a padecer demencia senil.
Problemas en el sistema cardiovascular, como arteriosclerosis.

Con este previo conocimiento decidimos elaborar el siguiente trabajo basndonos en

las siguientes razones:
La baja seguridad que ofrece el consumo de antioxidantes sintticos.
La eficacia antioxidante de una variedad de agentes fitoqumicos.

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DETERMIACION Y METODOS PARA DETERMINAR LA

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

Los antioxidantes se encuentran en cantidades que varan en alimentos tales como

vegetales, frutas, cereales del grano, legumbres y nueces. Algunos antioxidantes tales
como licopeno y el cido ascrbico se pueden destruir si son almacenados mucho
tiempo, o por coccin prolongada.

Otros compuestos antioxidantes son ms estables, por ejemplo los antioxidantes

polifenlicos en alimentos tales como cereales, trigo integral y t

En general los alimentos procesados contienen menos antioxidantes que los alimentos
frescos y crudos, puesto que los procesos de la preparacin exponen el alimento al
oxgeno.

La medida de antioxidantes no es un proceso directo, como ste es un grupo diverso

de compuestos con diversas reactividades a diversas especies reactivas del oxgeno.

La capacidad antioxidante pueden ser divididos en dos categoras:

Ensayos basados en la reaccin por transferencia de electrones (ET)

Ensayos basados en la reaccin por transferencia de tomos de hidrgeno

(HAT)

Para ser ms especficos, a continuacin presentamos una tabla sobre los ensayos
pertenecientes a cada una de las categoras de anlisis:

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1.- ENSAYOS BASADOS EN LA REACCIN POR TRANSFERENCIA DE

ELECTRONES (ET)

MTODO ABTS
Segn la metodologa desarrollada por RE, R.y descrita por KUSKOSKI el radical ABTS+
se obtiene tras la reaccin de ABTS (7 mM) con persulfato potsico (2,45 mM,
concentracin final) incubados a temperatura ambiente (25C) y en la oscuridad
durante 16 h. Una vez formado el radical ABTS+ se diluye con etanol hasta obtener
un valor de absorbancia comprendido entre 0,70 (0,1) a 754 nm (longitud de onda de
mxima absorcin). Las muestras filtradas (antocianos) se diluyen con etanol hasta que
se produce una inhibicin del 20 al 80%, en comparacin con la absorbancia del
blanco, tras aadir 20 L de la muestra. A 980 L de dilucin del radical ABTS+ as
generado se le determina la A754 a 30C, se aade 20 L de la muestra (dilucin de
antocianos) y se mide de nuevo la A754 pasado 1 minuto. La absorbancia se mide de
forma continua transcurridos 7 minutos. El antioxidante sinttico de referencia, Trolox,
se ensaya a una concentracin de 0-15 M (concentracin final) en etanol, en las
mismas condiciones, lo que se hace tambin con cido ascrbico (0-20 mg/100 mL).
Los resultados se expresan en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox) y en
VCEAC (actividad antioxidante equivalente a vitamina C), en este ltimo caso por
tratarse de alimentos.

Constituye la base de uno de los mtodos espectromtricos que han sido aplicados
para medir la actividad antioxidante total de soluciones o sustancias puras y mezclas
acuosas.

Un formato ms apropiado para el ensayo consiste en la tcnica de decoloracin, en la

cual el radical es generado directamente en una forma estable antes de la reaccin con
los antioxidantes.

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MTODO DPPH
Este mtodo, desarrollado por BRAND-WILLAMS, se basa en la reduccin de la
absorbancia medida a 515 nm del radical DPPH, por antioxidantes. Con
modificaciones el mtodo descrito por KIM et al.[23], se basa en la medida de la
absorbancia del radical DPPH 100 M (3,9 mL) disuelto en metanol al 80%, a la
longitud de onda de 517 nm. Se aade 0,1 mL de la muestra o patrn, la mezcla se
homogeniza cuidadosamente, y se mantiene en la oscuridad durante 30 minutos. Las
medidas de absorbancia a 517 nm se realizan antes de aadir la muestra (A0) y
pasados los 30 y 60 minutos (Af). La concentracin de DPPH en el medio de reaccin
se calcula a partir de una curva de calibrado obtenida por regresin lineal. Los
resultados se expresan en TEAC, o sea, actividad equivalente a Trolox (M/g de
muestra peso fresco). El antioxidante sinttico de referencia Trolox, a una
concentracin de 0,08-1,28 mM en disolucin de metanol al 80%, se ensaya en las
mismas condiciones, expresndose los resultados en TEAC y VCEAC.

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Las desventajas de este mtodo son:

La diferencia en el mecanismo de reaccin que normalmente ocurre entre

antioxidante y radicales peroxilo.
DPPH es un radical del nitrgeno de larga vida, lo cual no guarda similitud con
los radicales peroxilo altamente reactivos y transitorios 17 involucrados en la
peroxidacin lipdica.
la reaccin de DPPH con eugenol fue reversible, lo que podra resultar en
falsas lecturas (bajas) para la capacidad antioxidante de muestras que
contengan eugenol y otros fenoles que guarden un tipo de estructura similar.

METODO FRAP
Ensayo FRAP, se basa en el poder reductor de un antioxidante. Mide la capacidad
de reduccin el ion frrico (fe3+) al ion ferroso (fe2+); formando un complejo azul.
El ndice inicial absoluto de la reduccin de la ferrilmetilmioglobina determinado
por espectroscopa (caracteriza a flavonoides individuales)

El complejo amarillo de Fe3+ complejo azul de Fe2+

Una absorcin alta a una longitud de onda de 700 nm.

El reactivo FRAP es una mezcla de 0.1 mol/l de buffer acetato de sodio (ph 3.6), 10
mmol/l tptz y 20 mmol/l de cloruro frrico (10:1:1, v:v:v). Una vez mezcladas, 900
l de la disolucin FRAP y 90l de agua y 30 l de muestra. Se midi la absorbancia
inmediatamente despus de la adicin de la muestra cada 20 s durante 10 minutos
a 593 nm a 25 c.

El blanco consiste en 120 l de agua y 900 l de reactivo.

La absorbancia final de las muestras, fueron comparadas con una curva estndar
de trolox (100-1000 mol/l).

Los resultados fueron expresados como mol de trolox equivalente por gramo de
muestra fresca .21.

MTODO DMPD
Mtodo con reproducibilidad interensayo alta, til para medios no lipdicos parecido al
del mtodo ABTS

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El radical libre se genera a partir de DMPD en presencia de una solucin oxidante de

cloruro frrico , y a pH cido, con un mximo de absorbancia a 505 nm

Se determina la actividad antioxidante aplicando el mtodo propuesto por FOGLIANO.

Este se basa en aadir 1 mL de la disolucin de DMPD 100 mM a 100 mL de disolucin
tamponada con cido actico/ acetato de sodio 0,1 M (pH 5,25). Tras la adicin de 0,2
mL de una disolucin de cloruro frrico 0,05 M (concentracin final de 0,1 mM) se
forman radicales cationes coloreados (DMPD). Un mililitro de esta disolucin se
traslada a una cubeta midindose su absorbancia, comprendida entre 0,90 (0,1), a
506 nm. Se aade 50 L de una disolucin patrn de antioxidante o de muestras
diluidas y transcurridos diez minutos (a 25C) se hace otra medida de absorbancia a
506 nm. La disolucin tamponada de acetato se utiliza como blanco de referencia. Los
resultados se expresan en TEAC, o sea, actividad equivalente a Trolox (en mM o M) o
bien en VCEAC, actividad equivalente a vitamina C (mg/L o mg/100 g).

2.- ENSAYOS BASADOS EN LA REACCIN POR TRANSFERENCIA DE

TOMOS DE HIDRGENO (HAT)

MTODO ORAC
El mtodo ORAC consiste en medir la disminucin en la fluorescencia de una protena
como resultado de la prdida de su conformacin cuando sufre dao oxidativo
causado por una fuente de radicales perxido (roo).
El mtodo mide la capacidad de los antioxidantes en la muestra para proteger la
protena del dao oxidativo. La protena usada es la fluorescena.
El anlisis se debe realizar a temperatura ambiente y las muestras deben ser
protegidas de la luz y almacenadas a 4 C luego de su preparacin.

Preparacin de reactivos

Solucin buffer de Fosfato 10Mm: Pesar 0,276g de Na2HPO4.12H2O y 0,035g de

NaH2PO42H2O, llevar a volumen en un baln volumtrico de 100 mL. P
Fluorescena 1M: Preparar inicialmente una solucin de fluorescena a 1 mM, para
esto se debe pesar 3,76 mg de Fluorescena y se lleva a volumen con la solucin buffer
de Fosfato en un baln volumtrico de 10 mL (si es necesario calentar a una
temperatura no mayor a 50C). Luego hacer la dilucin a 1 M segn la cantidad que
sea requerida para realizar el ensayo.
Solucin de AAPH 250mM: Pesar 678 mg y llevar a volumen con solucin buffer de
fosfato en un baln volumtrico de 10 mL.

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Desarrollo del mtodo

Pesar exactamente 5 mg de trolox y llevarlos a baln volumtrico de 10 mL,

solubilizarlos completamente en la solucin buffer de fosfato y llevar a volumen de
esta manera se obtiene una solucin a 2000 M (calentar la solucin para diluir mas
fcilmente).
Se realizan las diluciones respectivas para la curva de trolox tomando 5, 12.5, 25, 50,
75, 100L de la solucin anterior y llevando a volumen de 1 mL con agua destilada.
Curva 10 200 g/mL. Si se desea hacer la concentracin de 5g/mL se parte de la
concentracin de 200 g/mL tomando 25 L para mayor exactitud.
Adicionar en estricto orden a cada pozo los siguientes componentes: 150 L de
fluorescena, 25 L de la dilucin respectiva de trolox.
Paralelamente preparar un blanco de ensayo que contenga: 150 L de fluorescena y
25 L de solucin Buffer fosfato.
Preincubar durante 30 min a 37C.
Adicionar a cada pozo 25 L de solucin de AAPH 250mM.
La intensidad de la fluorescencia es medida cada 2 min durante 2 horas con longitud
de onda de excitacin y emisin de 485 y 520 nm respectivamente.

MTODO TRAP
Se trata de una reaccin HAT.

Estas reaccionan directamente con los radicales libres, como pueden ser los
polifenoles, deteniendo el proceso en cadena de oxidacin lipdica (chain- breaking),
son reacciones de transferencia de un tomo de H (Hidrogen Atom Transfer, HAT)

En las reacciones HAT, la reaccin sera de este tipo, siendo X el radical libre y AH el
antioxidante:

X + AH XH + A

El nuevo radical formado es mucho ms estable que el inicial.

Determina la captacin de radicales peroxilo, en este caso generados a partir del ABAP.
La oxidacin es inicialmente inhibida durante un periodo de tiempo lag phase- por el
antioxidante, y lo que se hace es comparar la duracin de este periodo (T) para la
muestra y para el Trolox.

La Figura muestra el descenso en la fluorescencia frente al tiempo que se produce en

ausencia del antioxidante (izquierda) y la lag-phase que se genera al aadir un
antioxidante (derecha), retrasando el inicio de la prdida de fluorescencia.

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METODO TRABS
Mtodo usado para detectar peroxidacin lipdica, este procedimiento mide la
malondialdehido (MDA) formado como producto principal de degradacin de
hidroperxidos generados por la oxidacin de lpidos.

Como producto final de la peroxidacin lipdica predomina el malondialdehido (MDA),

principal sustrato de esta reaccin. El MDA reacciona con el cido tiobarbitrico

En un frasco de vidrio mbar se colocan 5 ml del reactivo de TBA recin preparado

(cido 2- tiobarbitrico 0.02 M en cido actico glacial al 90 %),

0.5 g de mantequilla clarificada El tubo se sumerge en un bao de agua a 90 C

durante 45 minutos.

Tambin se prepara un blanco con el mismo procedimiento anterior.

Luego los tubos son enfriados en agua durante 10 minutos.

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CAPACIDAD DE

ABSORCIN DE RADICALES DE OXGENO (ORAC)
El mtodo ORAC consiste en medir la disminucin en la fluorescencia de una protena como
resultado de la prdida de su conformacin cuando sufre dao oxidativo causado por una
fuente de radicales perxido (ROO). El mtodo mide la capacidad de los antioxidantes en la
muestra para proteger la protena del dao oxidativo. La protena usada es la fluorescena El
mecanismo de la reaccin se basa en la transferencia de un tomo de hidrogeno del
antioxidante al radical libre. Por esto, se utiliza el radical iniciador, el AAPH, para generar el
radical peroxil ROO. Un mol de AAPH, pierde un mol de nitrgeno, para generar dos moles de
radical AAPH a una rata constante. En una solucin saturada de aire, el radical AAPH reacciona
rpidamente con el oxgeno para dar un radical peroxil ms estable, ROO. La prdida de
fluorescencia de la FL es el indicador de la extensin de la oxidacin con el radical peroxil. En
presencia de un antioxidante, RRO capta, preferiblemente, un tomo de hidrgeno del

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antioxidante estable. Como consecuencia, la disminucin de la fluorescencia de la FL por

accin del radical peroxil es disminuida o inhibida.

1. Principio del mtodo

Determinar de la capacidad antioxidante en una muestra determinada.

2. Rango de trabajo

El mtodo permite determinar los moles equivalentes de Trolox en un rango de 5 a 200 ug/ml,
en donde el analito utilizado como referencia tiene un comportamiento lineal. Si las muestras
lo requieren debern ser diluidas para alcanzar una concentracin que se encuentre en el
rango establecido.

TROLOX: Es un anlogo hidrosoluble del alfa-tocoferol. En virtud de su alta solubilidad en agua

y su amplia disponibilidad comercial, el Trolox es universalmente empleado como estndar en
las curvas de comparacin de diversos ensayos de actividad antioxidante (como ORAC, TEAC).

3. Equipos, reactivos, materiales y elementos de proteccin

Espectrofotmetro
Microplaca Costar UV
Centrfuga
Balanza analtica
Balones volumtricos
Beakers
Pipetas, micro pipetas y puntas
Agua destilada
Na2HPO412H2O
NaH2PO42H2O
Solucin buffer de Fosfato 10mM
Fluorescena 1M
Solucin de AAPH 250mM
Trolox
Hexano
Acetona

4. Puntos de control

El anlisis se debe realizar a temperatura ambiente y las muestras deben ser protegidas de la
luz y almacenadas a 4 C luego de su preparacin.

5. Preparacin de reactivos

Solucin buffer de Fosfato 10Mm: Pesar 0,276g de Na2HPO4.12H2O y 0,035g de

NaH2PO42H2O, llevar a volumen en un baln volumtrico de 100 mL. p

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Fluorescena 1M: Preparar inicialmente una solucin de fluorescena a 1 mM, para

esto se debe pesar 3,76 mg de Fluorescena y se lleva a volumen con la solucin buffer
de Fosfato en un baln volumtrico de 10 mL (si es necesario calentar a una
temperatura no mayor a 50C). Luego hacer la dilucin a 1 M segn la cantidad que
sea requerida para realizar el ensayo.
Solucin de AAPH 250mM: Pesar 678 mg y llevar a volumen con solucin buffer de
fosfato en un baln volumtrico de 10 mL.

6. Desarrollo del mtodo

1. Pesar exactamente 5 mg de trolox y llevarlos a baln volumtrico de 10 mL,

solubilizarlos completamente en la solucin buffer de fosfato y llevar a volumen de esta
manera se obtiene una solucin a 2000 M (calentar la solucin para diluir ms
fcilmente).

2. Se realizan las diluciones respectivas para la curva de trolox tomando 5, 12.5, 25, 50, 75,
100L de la solucin anterior y llevando a volumen de 1 mL con agua destilada. Curva 10
200 g/mL. Si se desea hacer la concentracin de 5g/mL se parte de la concentracin de
200 g/mL tomando 25 L para mayor exactitud.

3. Adicionar en estricto orden a cada pozo los siguientes componentes: 150 L de

fluorescena, 25 L de la dilucin respectiva de trolox.

4. Paralelamente preparar un blanco de ensayo que contenga: 150 L de fluorescena y 25

L de solucin Buffer fosfato.

5. Pre incubar durante 30 min a 37C.

6. Adicionar a cada pozo 25 L de solucin de AAPH 250mM.

7. La intensidad de la fluorescencia es medida cada 2 min durante 2 horas con longitud de

onda de excitacin y emisin de 485 y 520 nm respectivamente.

Preparacin de la muestra (para muestras slidas)

1. Preparar la muestra teniendo en cuenta que para muestras con alto contenido de grasa
se debe desengrasar.

2. Filtrar una alcuota de 5 mL a travs de una membrana de nylon (0.45 um), almacenar a
4C y proteger de la luz.

3. Hacer diluciones en agua de 1:10 y/o 1:100

Preparacin de la muestra (para muestras lquidas)

1. Tomar 10 mL de muestra y centrifugar a 3000 rpm/15 min para remover residuos

slidos

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2. Filtrar una alcuota de 5 mL a travs de una membrana de nylon (0.45 um), almacenar a
4C y proteger de la luz.

3. Hacer diluciones de 1:10 y/o 1:100

7. Clculo y reporte de resultados

La proteccin del antioxidante se mide a partir del rea de fluorescencia bajo la curva
(AUC) de la muestra en comparacin con la AUC del blanco, donde el antioxidante no est
presente. La AUC se calcula mediante la siguiente expresin:

Donde:

I=nmero de ciclos

F=unidades de fluorescencia

CT= tiempo de cada ciclo en minutos. En este caso, CT=2

El rea limpia bajo la curva (AUC limpia) se encuentra por diferencia entre el AUC de la
muestra y el AUC del blanco. Esta AUC limpia (y) se representa delante de la concentracin
de Trolox como patrn (X) obteniendo la recta de regresin lineal, a partir de aqu, se
calculan los moles equivalentes de Trolox (ET) por litro de muestra.

Donde:

ABC AH: rea bajo la curva en presencia de antioxidante.

ABC Trolox: rea bajo la curva de Trolox.

[Trolox]: Concentracin de Trolox.

[AH]: Concentracin de Antioxidante.

DISCUSIONES

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Las principales caractersticas de un compuesto o sistema antioxidante son, la

prevencin o deteccin de una cadena de propagacin oxidativa, mediante la
estabilizacin del radical generado y la regeneracin del antioxidante radicalario
ayudando as a reducir el dao oxidativo en el cuerpo humano (Namiki, 1990)

La actividad antioxidante no puede ser medida directamente, pero puede

determinarse por los efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidacin
controlado. segn Clarkson, (1995)

Los antioxidantes derivados de las plantas desde el punto de vista fitoqumico pueden
ser taninos, lignanos, estilbenos, cumarinas, quinonas, xantonas, cidos fenlicos,
flavones, flavonoles, catequinas, antocianinas y proantocianinas los 2 cuales debido a
sus propiedades redox pueden actuar como donadores de hidrgenos y de esta
manera prevenir o retrasar el desarrollo de enfermedades degenerativas (marwah et
al., 2007).

Se crea que el ensayo de DPPH involucraba una reaccin de transferencia de un tomo

de hidrgeno, pero Foti y colaboradores sugirieron que la reaccin que tiene lugar
corresponde a una transferencia de electrones (Foti y col, 2004). Los autores
determinaron que el paso determinante de la velocidad para esta reaccin consiste en
un proceso rpido de transferencia de electrones de un anin fenxido al DPPH. Que el
DPPH sustraiga un tomo de hidrgeno a partir del antioxidante fenlico neutral
resulta una va secundaria de reaccin, dado que sta ocurre muy lentamente en
solventes tales como metanol y etanol. Adems, los autores indicaron que cidos o
bases presentes como contaminantes en el solvente pueden influenciar
dramticamente el equilibrio de ionizacin de fenoles, alterando los valores de las
constantes de velocidad de reaccin medidas. Adems de las diferencias mecansticas
entre la reaccin de transferencia de tomos de hidrgeno que ocurre normalmente
entre antioxidantes y radicales peroxilos, DPPH es un radical nitrogenado de larga vida,
que no guarda relacin con los radicales peroxilos altamente reactivos involucrados en
la peroxidacin lipdica. Muchos antioxidantes que reaccionan rpidamente con
radicales peroxilos pueden reaccionar lentamente o, an ms, ser inertes frente al
DDPH (Huang y col, 2005). A pesar de estas desventajas, el ensayo de DPPH sigue
siendo una tcnica ampliamente utilizada debido a su simplicidad y a la ventaja de
emplear un radical libre estable disponible comercialmente. Es altamente reproducible
y comparable con otros mtodos como ABTS, reduccin de anin superxido e
inhibicin de peroxidacin lipdica (Villao y col, 2007).

CONCLUSION

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Entre los mtodos qumicos utilizados para determinar la capacidad antioxidante

(captacin de radicales libres), el radical ABTS es uno de los ms rpidos, originando
resultados reproducibles y coherentes. Adems, el ABTS presenta importantes
ventajas; muestra varios mximos de absorcin y una buena solubilidad, permitiendo
el ensayo de compuestos tanto de naturaleza lipoflica como hidroflica. El tiempo de 1
minuto, para el mtodo ABTS, puede ser suficiente para medidas de pulpas de frutos
mientras que para el mtodo DPPH se requiere un tiempo de 60 minutos,
presentndose en algunas muestras diferencias significativas en los resultados, lo que
sugiere la realizacin de estudios adicionales. Los resultados obtenidos con el mtodo
DMPD han sido poco reproducibles y en algunos casos incoherentes.

RFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
RE, R.; PELLEGRINI, N.; PANALA, A. Antioxidant activity applyng an
improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Biol. Med.,
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KUSKOSKI,E.M.; ASUEO, A.G.; TRONCOSCOSO, A.M.; GARCIA-PARRILLA, M.
C.; FETT, R. . Actividad antioxidante de pigmentos antocianicos. Rev. Bras.
Cinc. Tecnol. Alim., v. 24, n.4, 691-693, 2004.
ARNOUS, A;.MAKRIS, D.;KEPALAS, P. Correlation of pigment and flavanol
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Greece. J. Food Comp. Anal., 15, 655-665, 2002
BRAND-WILLIAMS,W.; CUVELIER,M.E.; BERSET,C. Use of free radical
method to evaluate antioxidant activity. Lebensm. Wiss. Technol., 22, 25-30,
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Pearrieta J.M., Alvarado J.A., kesson B. and Bergensthl (2005) Total
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Singleton V.L., Rossi, J.A. (1965) Colorimetry of Total Phenolics with
Phosphomoldybic- Phosphotungstic Acid Reagents, Am. J. of Enol. and Vitic.
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