Micropropagacin de plantas

Micropropagacin

Micropropagacin vs. propagacin vegetativa convencional

Tipos de tcnicas de micropropagacin

Etapas de la micropropagacin y principales problemticas

Costos
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Micropropagacin vs. propagacin vegetativa convencional

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MICROPROPAGACIN
Tcnica de propagacin vegetativa de plantas en
condiciones in vitro.
Produccin masiva a precios competitivos.

Cultivo asptico de un explanto en un medio de

cultivo artificial y en condiciones ambientales
controladas.
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convencional

Es posible propagar algunas especies que no se propagan in

vivo.

Se necesita muy poco material de partida.

El crecimiento es mayor por rejuvenecimiento y sanidad.

Se requiere poca rea.

Se elimina el efecto estacional.

Simultneamente se limpia el material.

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Tipos de tcnicas de micropropagacin

Por brotacin de yemas axilares.

Por brotacin de yemas adventicias:

directa
indirecta
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Etapas de la micropropagacin
Por brotacin de yemas axilares.

Eleccin y preparacin de la planta madre (etapa 0).

Establecimiento del cultivo y eleccin del medio de cultivo (etapa 1).

Multiplicacin (etapa 2).

Elongacin y enraizamiento (etapa 3).

Aclimatacin (etapa 4).

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Etapa 0: Eleccin y preparacin de la planta madre.

Crecimiento en condiciones de sanidad

controlada.

Tratamientos de rejuvenecimiento.

Pretratamientos con reguladores de

crecimiento.
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Etapa 0: Eleccin y preparacin de la planta madre.

Yemas epicrmicas
Podas severas
Rebrotes
de raz

Rebrotes de tocn
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Etapa 0: Eleccin y preparacin de la planta madre.

Brotaciones epicrmicas, Brotaciones epicrmicas,

Eucalyptus grandis. Pinus canariensis.
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Etapa 0: Eleccin y preparacin de la planta madre.

Pretratamientos con reguladores de crecimiento.

Pulverizaciones con citoquininas

Reversin a estado semi-juvenil
Incremento en el nmero de brotes

Combinacin con tratamientos anteriores

Rebrotes juveniles,
Giberelinas en algunas especies
Acca sellowiana
(BAP)
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Etapa 1: Establecimiento del cultivo en condiciones

de asepsia.
Objetivo:
Iniciar el cultivo
Mtodo reproducible
% de xito
Compromiso esterilizacin/tasa de
sobrevivencia
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Etapa 1: Establecimiento del cultivo en condiciones de

asepsia.
Procedimiento:

Cortar brotes con caractersticas juveniles.

Lavar con agua y jabn.

Se descartan las hojas, se dejan los pecolos.

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Etapa 1: Establecimiento del cultivo en condiciones de

asepsia.
Procedimiento:

Realizar la desinfeccin:
etanol, hipoclorito de sodio,etc.
tiempos

Realizar tres enjuagues con agua destilada

estril.
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Etapa 1: Establecimiento del cultivo en condiciones de

asepsia.
Procedimiento:

Cortar segementos nodales, descartando los

extremos basal y apical.

Cada nudo contiene un meristemo axilar.

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Etapa 1: Establecimiento del cultivo en condiciones de

asepsia.
Procedimiento:

Introducir un segmento nodal por tubo de

ensayo conteniendo el medio de cultivo.

Tapar y colocar en cmara de crecimiento.

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Etapa 1: Establecimiento del cultivo en condiciones

de asepsia.

Eucalyptus grandis Acca sellowiana Actinidia deliciosa Allium cepa

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Cules son las principales limitantes en esta etapa?

Contaminacin Oxidacin

Hongos
Bacterias
Virus
Mycoplasmas
Microartrpodos y Trips
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Principales causas de contaminacin fngica:

Esterilizacin superficial inadecuada
Manipulacin
Introduccin de esporas por Trips

Se detecta fcilmente a simple vista.

Gneros de hongos ms frecuentes:

Aspergillus
Candida
Cladosporium
Microsporium
Phialophora
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Bacterias:
Principal agente contaminante.
Sntomas sobre el explanto o en el medio de cultivo.
Pueden aparecer luego de varios subcultivos.
Sntomas no visibles, plantas que no sobreviven la aclimatacin.
(Bacterias no patognicas, benficas)

Gneros de bacteria ms frecuentemente observados en cultivos de tejidos in vitro.

(Leifert & Waites, 1990)

Agrobacterium 3%
Bacillus 13 %
Enterobacter 12 %
Pseudomonas 19 %
Lactobacillus 11 %
Staphylococcus 26 %
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Cmo puede solucionarse?

Hongos: Adecuada desinfeccin

Bacterias: Antibiticos

Uso humano y animal

Efecto bacteriosttico/bactericida

Virus: Cultivo de meristemas y termoterapia

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Oxidacin:

Amarronamiento del explanto y/o el medio.

Inhibicin del crecimiento y muerte del explanto.
Ms marcado en especies que naturalmente tengan altos niveles de
taninos u otros compuestos fenlicos.

Causas:

Accin de enzimas oxidasas que son liberadas o sintetizadas en

respuesta a heridas.
Sustratos distintos segn el tejido.
Fenoles se oxidan a quinonas que a su vez tienen alto poder
oxidante sobre protenas.
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Cmo puede solucionarse?

Agua estril 2-3 hs previo a la introduccin.

Empleo de antioxidantes en el ltimo enjuague o en
el medio de cultivo (cido ctrico, ascrbico).

Transferencias frecuentes (cada dos o tres das) a
medio fresco.

Carbono activado.

PVP
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Etapa 2: Multiplicacin.
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Etapa 2: Multiplicacin.

Objetivo:
Mximo coeficiente de multiplicacin
Calidad de plantas

Nmero terico de plantas que pueden producirse en

un ao.
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Etapa 2: Multiplicacin.
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Etapa 2: Multiplicacin.
Procedimiento:

Extraer los explantos que brotaron en la etapa

previa.

Cortar separando brotes individuales o

segmentos nodales (segn el hbito de
crecimiento de la especie).
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Etapa 2: Multiplicacin.

Procedimiento:

Separar los brotes por tamao.

Colocar en medio de multiplicacin.

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Etapa 2: Multiplicacin.

Medio de cultivo:
Hormonas

Efecto de los reguladores de crecimiento en la sobrevivencia y

multiplicacin de Salix sp.
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Etapa 2: Multiplicacin.

Todos los medios contienen ANA (0,3 M).

Grigoriadou, 2002.
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Etapa 2: Multiplicacin.

Efecto de los reguladores de crecimiento en la

multiplicacin de Malus sp. (4 semanas en cultivo).

Xu, 2007.
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Etapa 2: Multiplicacin.

Hbito de crecimiento:
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Cules son las principales limitantes en esta etapa?

Variacin somaclonal
Variacin gentica heredable, que surge
en plantas producidas por cultivo de
tejidos.
Desventaja importante cuando el objetivo
es la fidelidad clonal.

Cmo puede solucionarse?

Reducir el nmero de repiques.
Uso racional de reguladores de crecimiento.
Evitar el 2,4 D.
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Cules son las principales limitantes en esta etapa?

Hiperhidricidad (Vitrificacin)

Desorden fisiolgico, metablico y morfolgico

inducido por las condiciones de estrs durante el cultivo in vitro.
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Etapa 3: Elongacin y enraizamiento.

Elongacin: es necesaria en especies con hbito

de multiplicacin en roseta.

Tratamientos:

Medio sin citoquinina.

Uso de carbn activado.

Uso de giberelinas.

Crecimiento en oscuridad.
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Etapa 3: Elongacin y enraizamiento.

Enraizamiento:

In vitro o ex vitro

Auxinas: AIB, ANA

Sustratos

Enraizamiento ex vitro de A. flaccida. Enraizamiento in vitro de A. sellowiana.

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Principal problemtica en esta etapa.

Capacidad de enraizamiento dependiente del genotipo.

Conexin raz parte area

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Etapa 4: Aclimatacin
Objetivo:
Optimizar la transferencia del ambiente in vitro a condiciones de
invernculo o campo.
Minimizar prdidas y acelerar el proceso.

PLANTAS OBTENIDAS IN
VITRO: PROCESO GRADUAL:

Hojas delgadas

Disminucin de la HR

Tallos dbiles

Races dbiles y poco
Crecimiento autotrfico
funcionales

Condiciones spticas.

Conexin tallo-raz incompleta

Baja tasa fotosinttica
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Etapa 4: Aclimatacin
Procedimiento:
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Etapa 4: Aclimatacin
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Etapa 4: Aclimatacin

Plantas in vitro presentan poca capacidad de retencin de agua.

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Etapa 4: Aclimatacin

Dark respiration and net photosynthesis measured at 80 mol m-2 s-1 (PPFD)
during acclimatization of micropropagated (A) Spathiphyllum and (B) Calathea,
for in vitro (open symbols) and ex vitro (closed symbols) formed leaves.
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Acca sellowiana, Guayabo del pas

Etapa 0 Etapa 1 Etapa 2

Etapa 4
Etapa 3
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Micropropagacin por brotacin de yemas adventicias.

Mtodo directo: Saintpaulia ionantha. Violeta africana
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Micropropagacin por brotacin de yemas adventicias.

Mtodo indirecto: Prunus sp.

Feeney, 2007.
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Micropropagacin por brotacin de yemas adventicias.

Formacin de callo/brotes a partir de explantos foliares en Arndano,

en respuesta al agregado de citoquinina.
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Dificultades que presentan las especies leosas in vitro.

Menor capacidad regenerativa

Efecto de dormancia en yemas

Induccin de rejuvenecimiento

Menor tasa de multiplicacin

Mayor oxidacin inicial del explante

Desinfeccin ms dificultosa

Enraizamiento y aclimatacin limitantes

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Costos de la micropropagacin
Capital para la instalacin del laboratorio
Costo de la mano de obra
Costo de los materiales
Caractersticas del comportamieno in vitro del material a propagar
Facilidad de establecimiento, rejuvenecimiento, etc.
Tasa de multiplicacin
Enraizamiento in vitro/ex vitro

Prdidas que ocurren en cada etapa del proceso

contaminacin
hiperhidricidad
% plantas que no enraizan
% plantas que no sobreviven la aclimatacin
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Costos de la micropropagacin

Componente del costo %

Costo capital 27.3

(Edificaciones y equipamiento)
Salarios 63.8
(Laboratorio, invernculo, oficina)
Funcionamiento
(Prod. Qumicos, energa, agua, 8.9
mantenimiento, imprevistos)

En base a un laboratorio que produce 3 millones de plantas al ao

(800 a 1400 m2).