Libro Biotecnologia 2 PDF

CURSO DE
BIOTECNOLOGA
APLICADA
7 Edicin
DIRECCIN DEL CURSO

DR. JUAN BUEREN Y DR. JOS LUIS MOTELLN
7 Curso de BIOTECNOLOGA APLICADA

Fundacin
Centro Nacional de
Investigaciones
Cardiovasculares
Carlos III
Este curso es posible gracias a una aportacin educacional de
Madrid, 13-16 de febrero de 2007

Grupo
saned
SANED 2007
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BIOTECNOLOGA APLICADA
ndice
NDICE
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Tcnicas de anlisis masivo de la expresin de genes ......................... 5

Miguel A. Piris. Programa de Patologa Molecular. CNIO. Madrid
Protemica y Medicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Fernando Vivanco. Departamento de Inmunologa. Fundacin Jimnez Daz
Inmunoterapia humoral .......................................................... 31

Dr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University
Introduccin a la inmunoterapia celular .......................................... 41

Jos R. Regueiro. Departamento de Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad
Complutense. Madrid
Eduardo Martnez Navas. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid
Clulas embrionarias pluripotentes ............................................. 57

Miguel Torres. Cientfico titular del Departamento de Inmunologa y Oncologa.
Centro Nacional de Biotecnologa. CSIC-Pfizer
Trasplante celular y terapia regenerativa con clulas madre .................. 65

Felipe Prsper. Servicio de Hematologa y rea de Terapia Celular. Clnica
Universitaria. Universidad de Navarra
Avances en terapia regenerativa ................................................. 89

Mara Dolores Herreros Marcos, Isabel Pascual Miguelez, Jacobo Trbol Lpez,
Damin Garca Olmo
Ctedra UAM-CELLERIX de Terapia Celular y Medicina Regenerativa
Unidad de Terapia Celular del Hospital Universitario La Paz. Madrid
Nanobiotecnologa: herramientas diagnsticas y teraputicas ................ 103

Laura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrnica
(IMM-CNM). CSIC
Vectores de transferencia en terapia gnica .................................... 119 1

Jess M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones oncolgicas
Curso de BIOTECNOLOGA APLICADA 7 edicin
ndice
Terapia gnica en enfermedades monognicas y cncer ...................... 137

Juan A. Bueren1 y Antonio Bernad2
1Divisinde Hematopoyesis y Terapia Gnica. CIEMAT
2Departamento de Inmunologa y Oncologa
Centro Nacional de Biotecnologa. CSIC
Farmacocintica de los medicamentos obtenidos por Biotecnologa . . . . . . . . . 157

Alfonso Domnguez-Gil Hurl. Servicio de Farmacia. Hospital Universitario de
Salamanca
Aplicaciones de la Biotecnologa Recombinante Vegetal a la teraputica

humana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Fernando Ponz. Departamento de Biotecnologa. INIA, Madrid
Innovacin tecnolgica y nuevas terapias: obtencin de anticuerpos

monoclonales totalmente humanos: panitumumab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
Jos Luis Motelln. Amgen S.A.
Evaluacin de medicamentos biotecnolgicos en la Agencia Europea

de Medicamentos (EMEA). BWP (Grupo de Biolgicos) y CHMP
(Comit de Medicamentos de uso Humano) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Sol Ruiz y Gonzalo Calvo. Agencia Espaola de Medicamentos y Productos Sanitarios
Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised

pharmacotherapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl MPharm. Department of Hospital
Pharmacy, Erasmus University Medical Centre Rotterdam. The Netherlands
2
Introduccin
INTRODUCCIN
U
n ao ms nos complace presentar una nueva edicin
del curso de Biotecnologa Aplicada. La buena acogi-
da y el entusiasmo de ponentes y asistentes en cursos
previos nos ha servido de incentivo para trabajar en esta sexta
edicin.
El rpido avance que durante los ltimos aos han experi-
mentado nuestros conocimientos en los mltiples campos de la
Biologa y la Medicina ha puesto a nuestro alcance una infor-
macin abundante y crtica que crece de manera exponencial. Nunca anterior-
mente habamos podido observar, desde una perspectiva tan mltiple y diversa,
el complejo escenario existente en la investigacin y el desarrollo de nuevos
tratamientos. Nuevos problemas necesitan nuevas soluciones y, ahora ms que
nunca, la innovacin teraputica se presenta como la clave para la consecucin
de nuevos tratamientos eficaces y seguros.
La bsqueda de nuevas aproximaciones en investigacin y desarrollo se ha
beneficiado de las aportaciones de nuevas y revolucionarias herramientas, entre
las que la Biotecnologa brilla con luz propia. Ella nos ha permitido, por pri-
mera vez en la historia, ser capaces de producir mediante manipulacin genti-
ca los compuestos deseados y crear o modificar nuevos frmacos, siguiendo un
diseo determinado para mejorar sus propiedades teraputicas.
Los productos biotecnolgicos han pasado de ser una parte minoritaria en
el arsenal teraputico, a ser cada vez ms indispensables en el tratamiento de
millones de pacientes. Gracias a esta incorporacin de la Biotecnologa a la
prctica clnica habitual, enfermedades graves pueden ser hoy da tratadas con
xito, y pacientes con una deteriorada calidad de vida pueden realizar ahora sus
tareas cotidianas.
La Biotecnologa alcanza hoy mltiples campos de la investigacin mdi-
ca, en los que hemos asistido gracias a ella a notables avances. As ha ocurrido
por ejemplo en el campo del diagnstico, en el descubrimiento de nuevas dia-
nas celulares, en la potenciacin de protenas naturales y en la mejora de trata- 3
mientos previos biotecnolgicos que permiten aumentar su eficacia y tolerabili-
Introduccin
dad. Un buen ejemplo de ello son las nuevas tecnologas que han permitido de-
sarrollar anticuerpos totalmente humanizados, o pequeas molculas de sntesis
qumica que actan sobre mltiples dianas teraputicas.
La Biotecnologa ha recorrido un largo camino, pero las posibilidades que
puede brindar en el futuro son enormes. La interdependencia absoluta entre to-
das las partes implicadas hace de la buena combinacin de esfuerzos y siner-
gias entre todas estas partes el factor, probablemente, ms importante para se-
guir avanzando. El reto est en potenciar la innovacin y la defensa de la
calidad de los productos biotecnolgicos. Slo a travs de la continua y estre-
cha interaccin entre los diferentes sectores de la investigacin, tanto pblicos
como privados, con profesionales del mbito clnico, ser posible encontrar
nuevos horizontes en este campo. Para que nuestro pas logre ser puntero en
este sector, todo ello deber estar potenciado por un ambiente de apoyo a la in-
novacin dentro del marco macroeconmico.
En el marco de esta colaboracin, el Curso de Biotecnologa Aplicada en
su 7 edicin que ahora se presenta ofrece de nuevo la oportunidad de que pro-
fesionales de diversos sectores: centros de investigacin, farmacia hospitalaria,
clnicos y la industria biofarmacutica se renan en una plataforma de forma-
cin sobre los aspectos ms relevantes ligados con la investigacin biotecnol-
gica, especialmente desde el punto de vista ms bsico y tcnico en busca de
nuevas perspectivas y aplicaciones prcticas de la investigacin biotecnolgica,
y explorar las nuevas lneas de trabajo que han de arrojar, en breve plazo, nue-
vas opciones teraputicas de relevancia cientfica y clnica.
Agradecemos su inters por esta nueva edicin del curso y esperamos que
encuentren esta iniciativa til y provechosa.
Jos Luis Motelln

Juan Bueren Roncero
4
Tcnicas de anlisis masivo de la expresin de genes
TCNICAS DE ANLISIS MASIVO

DE LA EXPRESIN DE GENES
Miguel A. Piris. Programa de Patologa Molecular. CNIO. Madrid
Los conocimientos sobre el genoma humano hacen posible

la utilizacin de tecnologas en Genmica y Protemica,
capaces de analizar la diversidad y complejidad de cada
tipo de cncer, enfocadas hacia el diagnstico molecular
de tumores, adecuando la terapia a cada paciente y
contribuyendo a la identificacin de genes relevantes en
cncer espordico y familiar1.
De inters particular es la aplicacin de los sistemas de
anlisis molecular masivo a la prediccin de respuesta a
tratamientos individuales. Numerosos estudios han
demostrado la capacidad de generar estos modelos
predictivos aplicados a supervivencia, metstasis, respuesta
a tratamientos concretos2-5. Todos ellos, en mayor o menor
grado, adolecen del mismo defecto, la insuficiente
reproducibilidad de los resultados generados, cuando son
aplicados en un contexto distinto; es decir, en otros centros,
por otros especialistas, o usando una tecnologa diferente4,6.
SISTEMAS DE ANLISIS MOLECULAR MASIVO
Matrices tisulares (tissue arrays)
Permiten utilizar en bloques parafinados sistemas de anlisis masivo. Para

ello crean un nuevo bloque de parafina en el que se insertan en posiciones pre-
definidas hasta 800 cilindros de 600 a 1000, procedentes de biopsias de aguja
efectuadas sobre bloques de parafina preexistentes.
Es un sistema adaptado para investigar un marcador o un panel de marca- 5
dores relacionados en una serie amplia de muestras, til en IHQ, FISH, HIS,
complementario a microarrays de cDNA. Indicaciones tpicas de esta tcnica

son control de calidad, anlisis de nuevos anticuerpos, estudio molecular de
cnceres de pequeo tamao, establecimiento de modelos predictivos basados
en expresin de protenas.
La posibilidad de digitalizar el resultado de las inmunotinciones, as como
de cuantificar la expresin de una marcador preciso, abre el camino de un uso
ms ambicioso de las matrices tisulares (MTA)7,8.
SNPs
Variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del genoma debi-

das a sustituciones de una base. Hay actualmente descritos por encima de tres
millones en todo el genoma -SNP Consortium (TSC) & Human Genome Pro-
ject (HGP)-, con una densidad mnima de 1 SNP/1.9 kb. De ellos, hay 60.000
SNPs en exones, lo que refleja una mayor densidad de los mismos en regio-
nes exnicas, ms investigadas, hasta una densidad de 1 SNIP/1.08 kb. El
numero de polimorfismos existente est en el rango de 10 a 15 millones por
individuo9,10.
El anlisis de SNPs permite realizar estudios de gentica de poblaciones,
estudio de genes candidatos para asociacin con enfermedades precisas, anli-
sis de resistencia a frmacos, sensibilidad/toxicidad a drogas, as como infor-
mar de la predisposicin individual a contraer enfermedades complejas, multi-
gnicas 9,10 . As, la mejora en las posibilidades de deteccin masiva de
polimorfismos abre el camino a estudios que relacionen variabilidad gentica
con riesgo a formas precisas de cncer y sensibilidad individual a drogas.
CGH-Arrays
Hay diferentes opciones para arrays de CGH, esencialmente BACs u

oligonucletidos. BACs son cromosomas artificiales humanos conteniendo
secuencias de DNA de longitud variable entre 100 a 200 kb. Hay actualmen-
te clones disponibles para todo el genoma, que cubren el genoma con una
alta densidad. Su uso permite el diagnstico preciso de deleciones, duplica-
ciones, inserciones y reordenamientos. La disponibilidad de miles de BACs
6 ha permitido el desarrollo de chips de BACs (CGH-arrays), que permiten
detectar duplicaciones y deleciones con una sensibilidad de 100 Kb 11. Para
ello se realiza hibridacin comparativa entre DNA de un paciente/DNA suje-

to sano, o DNA tumoral/DNA constitucional. Un ejemplo de ello es la re-
ciente publicacin de un array de BACs especifico para la LLC-B, desarro-
llado por P Lichter12.
Existen tambin microarrays comerciales de CGH basados en oligonucle-
tidos, con resolucin ms fina que los basados en BACs y un alto potencial en
investigacin y diagnstico13.
Matrices de cDNA (Oncochip) u oligonucletidos
Un microarray de DNA es un sistema miniaturizado en el que fragmentos

de DNA se inmovilizan en soportes slidos. Desde un punto de vista de longi-
tud de la sonda usada, hay 2 tipos de microarrays de DNA: microarrays de cD-
NA que presenta sondas de cientos de bases y arrays de oligonucletidos con
sondas de 20-25 bases o 50-80.
Estos chip o microarrays consisten en un soporte slido, por ejemplo un
portaobjetos, sobre el que un robot ha impreso de manera ordenada miles de
cDNAs especficos (u oligonucletidos) representantes de otros tantos genes.
Por analoga con el trmino chip micro-electrnico (dispositivo con una alta
densidad de circuitos electrnicos), en biologa molecular tambin se ha utili-
zado el trmino de biochip de expresin para denominar a los arrays de DNA,
ya que son dispositivos de pequeo tamao (chip) en los que se alcanza una
gran densidad de material biolgico (bio) inmovilizado sobre una superficie
slida. Un chip puede ser hibridado simultneamente con dos sondas de
cDNA marcadas diferencialmente (por ejemplo con los fluorocromos Cy3 y
Cy5) generadas a partir del RNA mensajero de las muestras a comparar (por
ejemplo, tejido normal versus tejido tumoral), o bien ser marcado con un ni-
co fluorocromo.
Despus de la hibridacin, y utilizando un scanner, puede medirse para ca-
da spot de cDNA la intensidad de cada uno de los fluorforos, siendo el nivel
de seal detectado proporcional al nmero de copias de mRNA en la muestra;
de modo que el cociente de la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) constitu-
ye una medida de la expresin gnica diferencial relativa al cDNA representa-
do en el chip ("ratios" de expresin).
El alto grado de integracin del array permite, en un solo ensayo, obte-
7
ner multitud de valores de expresin gnica relativa para distintas condicio-
nes biolgicas, lo que convierte a esta tcnica en una herramienta de alto

rendimiento para trabajos en el rea de la genmica funcional. El gran volu-
men de datos generados debe ser tratado con herramientas y mtodos bioin-
formticos14,15.
ANLISIS DE RESULTADOS DE MICROARRAYS
Los datos generados en estos experimentos precisan de anlisis bioinfor-

mtico, que esencialmente pretenden:
Agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada.
Identificar genes cuya expresin se asocia a eventos especficos.
Asignar funcin biolgica a los genes resultado del experimento.
Identificar cambios tiempo-dependientes, ordenados a lo largo del tiempo.
Simplificar series de genes al mnimo numero de datos posible.
Asignar riesgos especficos derivados de la expresin de genes concretos.
Diversas herramientas informticas estn disponibles para este objetivo,
entre otras las desarrolladas en el CNIO (GEPAS) y alojadas en la pagina web:
http://gepas.bioinfo.cnio.es/index.html
LIMITACIONES DE LOS MICROARRAYS DE DNA
Como otras tcnicas usadas en investigacin, los microarrays tienen limi-

taciones, como:
1. Secuencias no verificadas. Hay un proceso constante de reasignacin y
edicin de las secuencias inicialmente descritas. No obstante, las ltimas ver-
siones de los sistemas ms comercializados contienen muy escasos errores de
asignacin.
2. Dificultad de trasladar datos cuantitativos a estados funcionales. Nive-
les altos de expresin de ARN o protena no necesariamente implican activa-
cion funcional del gen preciso, y de hecho ocasionalmente implican secuestro o
anulacin funcional. En este sentido, conclusiones elaboradas a partir de datos
generados por estudios de microarrays deben de ser entendidos como hiptesis
necesitadas de verificacin experimental.
8 3. Ruido biolgico. Sistemas celulares crticos estn caracterizados por
una alta redundancia. En parte, la variabilidad Inter.-experimental es depen-
diente de fenmenos azarosos, u oscilaciones cclicas, no relacionadas con el

objeto del experimento.
4. Falta de estandarizacin de tcnicas de anlisis. La mayora de las
plataformas usadas para anlisis genmico han alcanzado un alto gado de ro-
bustez, pero an adolecen de una reproducibilidad subptima, cuando los resul-
tados obtenidos con diversas plataformas son comparados entre s. El impres-
cindible gold standard en validacin de datos sigue exigiendo comprobar el
valor de los datos obtenidos en una nueva poblacin de casos.
PCR CUANTITATIVA
Aunque sobre un nmero menor de genes, existen actualmente plataformas

comerciales que permiten investigar un numero limitado de genes en sistemas
de PCR a tiempo real, dotados de una alta sensibilidad y reproducibilidad. Adi-
cionalmente, datos cada vez mas numerosos muestran que esta tcnica es apli-
cable, en determinadas condiciones, a RNA extrado de material parafinado.
El carcter multignico de alguno de estos anlisis (realizados sobre plata-
formas o tarjetas de hasta 384 pocillos) ha llevado a su denominacin como
chips de baja densidad.
La alta reproducibilidad de estos experimentos facilita la expansin de esta
tecnologa y su uso en la aplicacin clnica de datos surgidos de anlisis reali-
zados con microarrays de alta densidad. As, existen en la actualidad diversos
ensayos clnicos enfocados a la prediccin de respuesta a terapia basada en da-
tos de expresin obtenidos con PCR en tiempo real, por ejemplo en carcinoma
de mama.
DETECCIN DE PROTENAS COMO MARCADORES SRICOS
Mltiples grupos de investigacin coinciden en el objetivo de identificar

marcadores sricos informativos de riesgo de contraer enfermedades especfi-
cas, o adecuados para el seguimiento de enfermedad residual mnima16. La idea
no necesita apenas justificacin, el anlisis de suero es una tcnica mnima-
mente invasiva, que permite monitorizar con frecuencia cambios previos al
diagnstico clnico o a lo largo de la enfermedad. Resultados iniciales obteni-
9
dos en cncer de ovario, pncreas o prstata alentaron esta lnea de trabajo,
usando SELDI-TOF-MS. Sin embargo, estos estudios han demostrado una baja
reproducibilidad y una elevada tasa de falsos positivos, lo que prejuzga su uso
como tcnica de anlisis rutinario en anlisis de poblaciones a riesgo de contra-
er enfermedades especficas17,18.
DETECCIN DE FOSFOPROTENAS EN CLULAS INDIVIDUALES
Recientes datos experimentales coinciden en que tanto el mecanismo de

accin de drogas, como la sensibilidad a las mismas, es desvelado con mayor
precisin recurriendo a anlisis de protenas inducidas por la accin de estas
drogas, bien en modelos o pacientes. As, agentes que daan el DNA inducen
fosforilacin de sensores de dao a DNA, mientras que agentes cuya diana est
constituida por rutas de traduccin de seal inducen cambios en el estado de
fosforilacin de protenas crticas en estas rutas. La disponibilidad de anticuer-
pos contra diferentes estados funcionales de estas protenas permite usar la ci-
tometra de flujo como tcnica de anlisis de estos cambios, con la ventaja de
que esto nos permite reconocer la existencia de cambios sutiles en subpobla-
ciones celulares minoritarias19-21.
APLICACIONES EN FARMACOGENMICA
Las matrices de cDNA permiten tambin establecer el llamado perfil gen-

mico de un frmaco, o firma molecular del mismo, adems de establecer fir-
mas moleculares predictivas de sensibilidad/resistencia. Aunque desde un punto
de vista clnico tiene mayor inters identificar marcadores iniciales, al diagns-
tico, de sensibilidad a drogas precisas, alcanzar este objetivo tropieza con los
mecanismos de accin mltiples de la mayora de las drogas en uso, as como
con la existencia de mltiples sistemas redundantes de promocin de la super-
vivencia de las clulas neoplsicas. En la prctica, se ha demostrado que los
cambios inducidos por drogas son ms informativos que alteraciones molecula-
res al diagnstico3. Estos cambios pueden ser analizados in vitro -clulas tumo-
rales expuestas a la accin de drogas precisas- o in vivo - cambios en el tiempo
en clulas leucmicas tras tratamiento-.
10 De hecho, el tratamiento con un frmaco concreto de una lnea celular es-
pecfica permite identificar el conjunto de genes inducidos en respuesta a ese
frmaco. Estos genes muestran variabilidad en funcin de la droga, estirpe ce-

lular, alteraciones gnicas precisas e intervalo de tiempo transcurrido hasta el
anlisis. Su conocimiento permite proponer mecanismos de accin de una dro-
ga precisa.
Uno de los objetivos en anlisis farmacogenmico es la identificacin de
pacientes sensibles o resistentes a drogas concretas. La resistencia a una droga
depende de mltiples factores, incluyendo sobreexpresin de genes de resisten-
cia a drogas, incremento en la reparacin de DNA, o alteraciones en la sensibi-
lidad celular a quimioterapia, afectando a mltiples rutas. Marcadores de resis-
tencia o sensibilidad identificados en modelos experimentales en el laboratorio
o en pacientes aislados pueden perder inters cuando se estudian sobre series
largas de pacientes. Consecuentemente, es preciso analizar la relevancia clnica
de los genes as identificados en series de pacientes tratados de forma randomi-
zada.
Una aplicacin extremadamente relevante de estos estudios es la identifi-
cacin de dianas teraputicas y el anlisis de rutas. Esencialmente, la informa-
cin derivada de estos estudios brinda la oportunidad de proponer nuevas dia-
nas que, despus de validacin experimental, permitan el desarrollo de drogas
racionalmente dirigidas.
FUTURO EN LA APLICACIN DE TCNICAS DE GENMICA

Y PROTEMICA
El alto potencial aplicado a investigacin y diagnstico de estas tcni-

cas an precisa de numerosos estudios adicionales, previamente a su aplica-
cin clnica masiva. Este carcter novedoso y el alto nivel de complejidad
de estos experimentos queda subrayado por el hecho de que an se publican
muchas ms revisiones o comentarios editoriales sobre tcnicas de genmica
y protemica que resultados originales. No obstante, cabe esperar que la
aplicacin clnica de estas tcnicas siga en incremento, cubriendo primero
una etapa de identificacin de marcadores diagnsticos y, posteriormente,
propuesta y validacin de dianas teraputicas. El desarrollo de estas tcnicas
de anlisis molecular masivo, al mismo tiempo, est ofreciendo un reto para
el desarrollo de sistemas de anlisis estadstico de mltiples variables y vali-
11
dacin de datos.
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13
Protemica y Medicina
PROTEMICA Y MEDICINA
Fernando Vivanco. Departamento de Inmunologa. Fundacin Jimnez Daz
La medicina molecular se est desplazando muy rpidamente

de la genmica a la protemica ya que, al permitir el estudio
de tejidos, clulas y lquidos biolgicos, las alteraciones en las
protenas constituyen autnticas firmas moleculares de los
procesos patolgicos. Aunque todava est en desarrollo en
muchas reas, la protemica ya est madura para empezar a
ser trasladada a la clnica. La protemica clnica favorece la
deteccin precoz de la enfermedad, su monitorizacin, el uso
de terapias ms efectivas y un entendimiento ms profundo y
global de la patognesis. La utilizacin de perfiles proteicos
diagnsticos y pronsticos, de suero y de tejidos, constituye
una autntica revolucin que puede cambiar el panorama de la
analtica clnica, acercndose a la medicina personalizada.
Adems, es un atajo para la deteccin de biomarcadores (hay
mas de 500 nuevas protenas con inters clnico identificadas
por protemica, frente a las 150 protenas actualmente
utilizadas como marcadores clnicos) y dianas diagnsticas y
teraputicas, en un mercado claramente en expansin. Los
perfiles proteicos de muestras tratadas con frmacos
permiten, adems, identificar posibles efectos secundarios
desconocidos, ya que permite detectar todas las protenas
que el frmaco altera. La protemica clnica es ya una realidad
de la Medicina del siglo XXI. En Espaa es un rea sin
desarrollar, que debera ir implantndose en todos los grandes
hospitales y centros de investigacin biomdica.
INTRODUCCIN
Una de las consecuencias ms beneficiosas derivadas del conocimiento del

15
Genoma Humano ha sido el gran impulso que se ha producido en el desarrollo
de la Protemica. La descripcin del genoma de los organismos (Genmica)

aporta un conocimiento esencial para el estudio de cualquier proceso biolgico.
Sin embargo, tal conocimiento es tan necesario como insuficiente, porque las
funciones celulares dependen en ltima instancia de los productos finales de los
genes: las protenas y sus interacciones, asociaciones macromoleculares, vas de
sealizacin, etc. De esta forma, la era post-genmica de la medicina molecular
se est desplazando rpidamente de los listados de genes, la transcriptmica y la
genmica funcional, a la protemica. sta ha dejado de ser (como en sus ini-
cios) la produccin de listas de protenas que incrementan o decrecen su expre-
sin como causa o consecuencia de diversas condiciones o alguna patologa.
Actualmente, la protemica implica el conocimiento global de las protenas, su
estructura y funciones, interacciones y modificaciones postraduccionales, rutas
de sealizacin, localizacin intra e intercelular, etc., para generar el mapa celu-
lar que permita entender los procesos biolgicos en condiciones normales y pa-
tolgicas (lo que ha venido a denominarse la biologa de sistemas). En suma, la
protemica es una actividad cientfica lo suficientemente madura, co-
mo para ser aplicada a la clnica humana con notables beneficios.
Figura 1. Esquema de las
relaciones entre genoma y El proteoma comprende el conjunto de todas las protenas que
proteoma. Mientras que el resultan de la expresin del genoma de las clulas, tejidos u organis-
genoma es comun a todas mos. No es algo esttico como el genoma (relativamente) sino una
las clulas y coleccin dinmica de protenas que refleja tanto el programa gen-
relativamente esttico, el
tico propio de la clula como el efecto de su entorno (Figura 1).
proteoma est cambiando
Comparado con el genoma, el proteoma proporciona una visin ms
constantemente en
respuesta a las
realista del status biolgico y se espera, por tanto, que tenga una
condiciones de cada mayor utilidad que el anlisis genmico, para evaluar y conocer la
momento. enfermedad, su progresin y la respuesta al tratamiento farmacolgi-
co. As, la protemica es el puente entre la
mera descripcin de la secuencia de los ge-
nes y el comportamiento celular.
Cada gen puede producir varias formas
moleculares de una(s) protena(s) que poste-
riormente son modificadas post-traduccio-
nalmente. Se han descrito ms de 200 tipos
de tales modificaciones qumicas (glicosila-
16 cin, prenilacin, fosforilacin, acetilacin,
etc.), pudindose dar varias en una misma
protena de manera permanente o transitoria. Tales modificaciones afectan a su

estructura y propiedades funcionales, vida media, localizacin intra y extrace-
lular, interacciones protena-protena, etc. El proteoma viene definido, por tan-
to, en trminos de secuencia, estructura, abundancia, localizacin, modifica-
cin, interaccin y funcin de las protenas y constituye el fenotipo
caracterstico de cada clula o tejido. Esta informacin no puede obtenerse del
genoma ni del transcriptoma (conjunto de ARN mensajeros transcritos), por lo
que el estudio de los proteomas es imprescindible y complementario de los da-
tos genmicos. Entre las muestras biolgicas ms importantes cuyo conoci-
miento del proteoma es esencial se encuentran los lquidos fisiolgicos (suero),
ya que no tienen cidos nucleicos. Por otra parte, las protenas son la diana de
ms del 90% de los frmacos, por lo que su estudio cobra mayor relevancia.
La protemica se define habitualmente como el anlisis del conjunto de
las protenas que componen las clulas y se lleva a cabo mediante tres tipos
fundamentales de estudios:
A) Identificacin y catalogacin de las protenas (y sus modificaciones
post-traduccionales) que constituyen los distintos proteomas, cuya in-
formacin, almacenada en bases de datos, es un elemento esencial para
el resto de estudios protemicos.
B) Protemica de expresin diferencial, cuya finalidad es el estudio com-
parativo de una clula (o muestra biolgica) en dos condiciones distin-
tas (un control sano frente al patolgico, o tratado y sin tratar con un
frmaco, etc.) para detectar las protenas que sufren modificaciones
qumicas o alteraciones en sus niveles de expresin. Permite identificar
protenas que puedan representar biomarcadores pronsticos, diagnsti-
cos y de seguimiento de una enfermedad y que, con frecuencia, pueden
ser nuevas dianas teraputicas.
C) Protemica del mapa celular, cuyo objetivo es el estudio de las interac-
ciones protena-protena, asociaciones macromoleculares, rutas de se-
alizacin, etc. Pretende construir un mapa fsico de las interacciones
existentes entre las protenas celulares, haciendo uso de tcnicas es-
tructurales (rayos X, resonancia magntica nuclear) y cinticas y de
herramientas bioinformticas.
Una de las reas con mayor actividad actualmente en protemica es la
identificacin de nuevos biomarcadores para el diagnstico y la prevencin de
17
las enfermedades prevalentes, cncer, cardiovasculares, neurolgicas, etc. Los
avances en las estrategias diagnosticas convencionales (tcnicas de imagen,

RMN, PET), estn suponiendo una notable mejora, pero no poseen ni la sensi-
bilidad ni la especificidad requerida para detectar estados preclnicos, y adems
su coste es muy elevado. Es bien conocido que mas del 50% de los infartos
agudos de miocardio ocurren sin sntomas previos y que ms del 60% de los
pacientes con cncer de mama, pulmn, colon y ovario, presentan ya metsta-
sis cuando son diagnosticados, y en ese estadio, las teraputicas convencionales
tienen un xito muy limitado. Hay, por tanto, una necesidad urgente de identifi-
car nuevos biomarcadores que eviten estas situaciones. Un marcador biolgico
(biomarcador) es una molcula o caracterstica, que puede ser medi-
do objetivamente y evaluado como un indicador de un proceso bio-
Figura 2. Esquema del lgico normal o patolgico, o de la respuesta farmacolgica a una
funcionamiento de la intervencin teraputica. La bsqueda de biomarcadores puede lle-
microdiseccin mediada varse a cabo en tejidos, en clulas (circulantes) o en lquidos fisiol-
por lser. Parte izquierda: gicos (fundamentalmente plasma o suero). En el caso de los tejidos
observacin al microscopio
(biopsias por ejemplo) uno de los mayores obstculos es la heteroge-
del corte de tejido y
neidad celular, que puede complicar mucho el diseo y sobre todo
seleccin de la zona de
inters. Centro: disparo del los resultados de los anlisis protemicos, al no tratarse de poblacio-
lser sobre la zona nes celulares homogneas. Sin embargo, recientemente se ha desa-
seleccionada que catapulta rrollado una tcnica muy til para la obtencin y purificacin de es-
a las clulas al tubo de tirpes celulares puras a partir de cortes de tejidos, denominada
recogida. Parte derecha:
microdiseccin, mediante captura con lser que se ilustra en la Figu-
ampliacin de la figura del
ra 2. Las preparaciones celulares homogneas as obtenidas son muy
centro donde se observa el
grupo de clulas que son
apropiadas para el anlisis protemico. Sin embargo, el tipo de
selectivamente extradas muestra idneo para los estudios clnicos es el plasma o el suero, del
del tejido. que puede obtenerse un perfil o patrn del conjunto de las protenas
(y/o pptidos) presentes en cada momento y
que puede contener biomarcadores que refle-
jen el estado patolgico y que posean valor
diagnstico y/o pronstico. Sin embargo, el
estudio de los proteomas o de los perfiles
proteicos de los lquidos biolgicos (ver ms
adelante), presenta un grado de complejidad
considerable que no existe en los estudios
18 genmicos, debido fundamentalmente a las
siguientes causas:
a) El amplsimo rango dinmico de la concentracin de protenas en teji-

dos y especialmente en el plasma humano. Entre la concentracin de
albmina (milimolar; 50 mg/ml) y algunas interleuquinas (picomolar;
1-5 pg/ml) hay una diferencia de ms de 10 logs. Ninguna tcnica ana-
ltica ni protemica abarca mas de 4-5 rdenes de magnitud. Adems,
20 protenas representan el 99% del contenido total de las protenas
plasmticas, lo que dificulta enormemente el anlisis de las protenas
presentes a baja concentracin, donde con frecuencia se en-
cuentran los potenciales biomarcadores. Para el anlisis de
Figura 3. Deplecin de las
plasma es necesario deplecionar de estas protenas mayorita-
seis protenas mayoritarias
rias (Figura 3). del plasma utilizando un
b) La presencia de diferentes formas moleculares de cada pro- cromatgrafo lquido
tena e isoformas. Muchos genes producen mltiples mR- (FPLC) y una columna de
NAs, mediante diversos mecanismos (splicing alternativo, afinidad que posee
mRNA editing, modificaciones co- y post traduccionales). anticuerpos especficos

frente a las 6 protenas. Al
En promedio, en humanos, se estima que un gen genera al
aplicar el plasma sobre la
menos 3-4 protenas, por lo que considerando 30.000 genes,
columna la mayora de las
pueden esperarse un mnimo de 100-200.000 protenas. Ob- protenas fluyen sin ser
viamente no todas las protenas estarn presentes en todas retenidas ("low abundant
las clulas, tejidos, etc., pero el plasma contiene una gran re- proteins") y
presentacin de muchas de ellas. posteriormente las
protenas mayoritarias son
c) Diversidad estructural. Dada su presencia en distintos entor-
eluidas ("high abundant
nos (solubles, membranas, matriz, etc.) las protenas son de
proteins"). En la parte
naturaleza muy diversa. Solo en tamao pueden variar desde inferior se muestra el
50 aminocidos (hay 2.500 anotados en el Swiss-Prot) hasta anlisis mediante 2-DE de
casi 10.000 aminocidos, como la Nesprina 1 (8746 aa). ambas fracciones.
Adems, hay que considerar la pre-
sencia de mltiples modificaciones
postraduccionales que afectan a la
funcin, localizacin, etc., de las
protenas.
d) Una gran mayora de las protenas
no actan solas sino en asociacin
con otras, creando por un lado, aso-
ciaciones macromoleculares, y por 19
otro, participando en multitud de ru-
tas de sealizacin, metablicas, etc. El conocimiento de las interaccio-

nes proteicas y la descripcin del mapa celular es esencial para enten-
der la fisiopatologa de cualquier sistema biolgico.
Sin embargo, el conocimiento de los proteomas ofrece la visin ptima de
lo que ocurre en la clula, tejido, lquido fisiolgico, etc., por lo que es necesa-
rio su determinacin.
PROTEMICA CLNICA
A pesar de la complejidad antes citada, el rpido y notable desarrollo de

la Protemica en los ltimos aos, ha conducido a su aplicacin a los proce-
sos patolgicos o Protemica Clnica. La protemica est especialmente "ca-
pacitada" para el estudio de la enfermedad porque se puede aplicar a las clu-
las, tejidos y lquidos biolgicos. La aplicacin clnica de la protemica
implica el uso de las tecnologas protemicas para todos aquellos aspectos que
puedan beneficiar a los pacientes: desde la bsqueda de nuevos marcadores de
enfermedad o de perfiles proteicos diagnsticos, hasta la descripcin de facto-
res predictivos y preventivos que permitan un tratamiento y seguimiento tera-
putico personalizado.
La Protemica Clnica se ocupa de la identificacin sistemtica y exhausti-
va, a gran escala, de patrones proteicos de enfermedad y la aplicacin de esos
datos a los pacientes (estudio de la enfermedad, susceptibilidad, prevencin,
seleccin de terapias, seguimiento de los tratamientos, etc.). Dada la compleji-
dad de los procesos patolgicos, la integracin de las nuevas tecnologas prote-
micas con las bases de datos clnicas y las tcnicas analticas clsicas, sera
altamente beneficioso para la comprensin y el tratamiento de la enfermedad.
Entender, por ejemplo, las alteraciones tempranas en diversas enfermedades (t-
picamente en cncer o en los sndromes coronarios agudos), produce una nota-
ble mejora en la prevencin e identificacin de pacientes con riesgo y/o en es-
tado preclnico. La Protemica Clnica pretende definir patrones de protenas
que puedan generar informacin de valor clnico acerca de la susceptibilidad,
diagnstico, pronstico y terapia de la enfermedad. Testar hiptesis clnicas re-
levantes, frente a conjuntos de datos (masivos) derivados de medidas proceden-
20 tes de tcnicas de alto rendimiento como las protemicas, y poblaciones huma-
nas fenotipadas correctamente, es una funcin esencial de la protemica
clnica. Para que la protemica clnica impacte de manera real en la mejora de

la salud debe descubrir y seleccionar patrones proteicos, validarlos en estudios
poblacionales muy amplios y trasladarlos a la prctica clnica.
Aunque no se describe aqu, no debe olvidarse que el aprovechamiento
ptimo de la relacin entre patrones proteicos y enfermedad, depende a su vez
de la integracin con la informacin sobre la variacin gentica y la expresin
gnica (arrays de DNA, genotipado, SNPs, etc.).
OBJETIVOS DE LA PROTEMICA CLNICA
La finalidad de la Protemica Clnica est, actualmente, centrada en al

menos los siguientes tipos de actividades:
Identificacin de biomarcadores
La bsqueda e identificacin de biomarcadores individuales se lleva a

cabo siguiendo la metodologa protemica clsica de separacin de protenas
(2-DE, DIGE, cromatografa multidimensional y electroforesis ca-
pilar) y su identificacin por espectrometra de masas (MS; MAL- Figura 4. Esquema del
anlisis protemico
DI-TOF, ESI-Q-TOF o ESI-Trap, MALDI-TOF/TOF). Su estrate-
diferencial. La
gia fundamental es el anlisis de la expresin diferencial de
comparacin de los geles
protenas entre controles y muestras patolgicas (Figura 4), de 2-D permite identificar las
proteomas completos (lisados celulares) o subproteomas especfi- protenas
cos (mitocondrias, membranas, etc.). Recientemente se est utili- diferencialmente
zando la cromatografa lquida (en una o varias dimensiones) apli- expresadas.
cando diversos mtodos de protemica

cuantitativa que permiten la comparacin
de los perfiles proteicos de varias muestras
simultneamente (iTRAQ, SILAC, etc.).
Un aspecto fundamental es la determina-
cin de las modificaciones postraducciona-
les y su potencial implicacin en patologa.
En muchos casos los biomarcadores se
convierten simultneamente en nuevas dia- 21
nas teraputicas.
Obtencin de perfiles proteicos
Consiste en el estudio sistemtico, a gran escala, de las protenas de una

muestra para la identificacin de patrones o perfiles proteicos (huellas dactilares
proteicas), con carcter diagnstico (discriminatorio) y/o pronstico. Los escasos
biomarcadores identificados, y aprobados (por la FDA) en los ltimos aos, son
un reflejo de la estrategia habitual de testar una protena individual, o llevar a ca-
bo anlisis en pequea escala, etc. Aunque existen excepciones (paraprotenas de
los mielomas, dficit de 1-antitripsina) es muy posible que no existan marcado-
res nicos de las enfermedades complejas, por lo que la estrategia protemica de
estudiar paneles proteicos supone un paso cualitativo de gran trascendencia. Este
estudio se puede llevar a cabo mediante al menos tres estrategias:
Figura 5. Diferentes formas

A) Perfiles proteicos de plasma o suero
de representar el
resultado del anlisis Se lleva a cabo analizando el suero/plasma de los pacientes con
mediante SELDI-TOF de una la patologa objeto de estudio (cardiovascular, neurodegenerativa, in-
muestra de suero. En el fecciosas, cncer, etc.) y alternativamente en otros lquidos fisiolgi-
panel superior se muestra
cos (lavado broncoalveolar, lquido cefalorraqudo, orina). Se utiliza
el resultado experimental
la tcnica denominada SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser De-
y en los dos inferiores tras
su procesamiento
sorption/Ionization-Time of Flight) para la generacin de los perfiles
informtico. Slo se proteicos, que combina la retencin de las protenas del suero en
muestra la seccin biochips con la determinacin de sus masas moleculares mediante
correspondiente a las MS, permitiendo generar grficos donde se representa la abundancia
masas (m/z) comprendidas frente a la masa molecular de las protenas, a modo de cdigo de ba-
entre 3000 y 7000 m/z.
rras proteicos constituidos por miles de lne-
as que caracterizan el suero de cada indivi-
duo (Figura 5). La comparacin de los
perfiles normales (individuos sanos) con los
obtenidos del suero de pacientes con distin-
tas patologas (se est utilizando en cncer y
en patologas cardiovasculares, neurodege-
nerativas, osteoarticulares, respiratorias, in-
fecciosas...) permite obtener perfiles prons-
22 ticos, diagnsticos, de seguimiento, de
tratamiento farmacolgico, etc. Su poder
discriminatorio es muy superior al de marcadores nicos con los que se han

comparado (por ejemplo, PSA en cncer de prstata, protena C reactiva en in-
feccin e inflamacin). Como el anlisis mediante SELDI-TOF utiliza muy po-
ca muestra (1 l) y, adems, es muy rpido (se pueden analizar cientos de
muestras al da) y automatizado, su potencial en clnica analtica es enorme y
puede ir sustituyendo muchas de las tcnicas habituales de los laboratorios de
bioqumica clnica (enzimo-inmunoanlisis), que son ms lentos, ms caros
(utilizan anticuerpos fluorescentes), usan mayor cantidad de muestra y slo in-
forman de un nico marcador, frente a los miles que proporciona el SELDI-
TOF. A pesar de sus indudables ventajas, el sistema SELDI-TOF decrece su
sensibilidad y exactitud en la determinacin de la masa para protenas mayores
de 70 kDa, lo que es el caso de muchas de las protenas plasmticas humanas
(se conocen ms de 3.000 actualmente). Por otra parte, su reproducibilidad no
es bien conocida, dado el todava reducido nmero de investigadores que utili-
zan esta plataforma; adems, en muestras tan complejas como el plasma huma-
no, el sistema de fraccionamiento inicial en los chips de retencin necesita es-
tandarizarse mejor, por lo que se estn definiendo actualmente unos estndares
cuantitativos de referencia. Sin embargo, el nmero de potenciales biomarcado-
res de enfermedad, identificados mediante SELDI-TOF, no deja de aumentar de
manera constante. Algunas de las crticas al sistema SELDI-TOF tienen un ori-
gen ms econmico que cientfico, dado el enorme mercado por el que compi-
te, el de la bioqumica clnica.
B) Perfiles proteicos de tejidos: MS-Imaging
En tejidos, pueden obtenerse perfiles o imgenes (mapas) bidimensionales

de protenas (MS-Imaging), aplicando directamente la MS sobre cortes histol-
gicos del tejido (cortes habituales sobre portaobjetos para microscopia ptica,
de 5-20 m de grosor), utilizando el MALDI-TOF o el MALDI-TOF/TOF. El
mapa bidimensional se obtiene haciendo incidir el lser (que "barre" la superfi-
cie de la muestra) del espectrmetro sobre los cortes histolgicos recubiertos
de matriz (compuestos orgnicos que cristalizan atrapando las protenas en el
cristal y absorben la energa del lser, siendo el conjunto sublimado) y anali-
zando las protenas que son vaporizadas. Tpicamente se obtienen 500-1.000
seales de protenas individuales en cada punto del tejido, con masas entre 2-
23
70 kDa. De esta forma se obtiene la masa (m/z) de las molculas (pptidos,
protenas) presentes en cada zona del tejido.

Seleccionando una masa dada (m/z) en los
distintos espectros de las diferentes zonas, se
genera un mapa bidimensional de la distri-
bucin de esa protena (esa m/z) a lo largo
del corte de tejido (a modo de cartografa
proteica). Se pueden obtener dos tipos de
datos: Perfiles proteicos (mediante una apli-
cacin puntual de matriz y adquisicin de
datos de cada punto) e Imgenes (recubrien-
do todo el tejido y haciendo un barrido del
Figura 6. Representacin
mismo con el lser) (Figura 6).
esquemtica de los
fundamentos del MS- Las imgenes son generadas mediante un software especfico
Imaging. Sobre el corte de que clasifica y agrupa las protenas y compara diversas muestras,
tejido recubierto de permitiendo obtener imgenes tridimensionales de la distribucin de
matriz, se hace incidir un las protenas del tejido. Este software tambin puede integrarse con
lser que va recorriendo la
software de anlisis histolgico, permitiendo la cuantificacin de su-
superficie del tejido y logra
perficies e intensidades, as como la superposicin con imgenes de
vaporizar las protenas
presentes en cada punto de
microscopia (histoqumica e inmunohistoqumica). Esta tecnologa
la superficie, obtenindose implica un tipo de informacin totalmente nuevo para la descripcin,
un espectro de masas de clasificacin y caracterizacin de muestras histolgicas, que est
cada punto. Seleccionando permitiendo la identificacin de biomarcadores, la localizacin de
una masa (m/z) dada (que protenas especficas y en el campo de la oncologa, por ejemplo, la
corresponder a una
reclasificacin de tumores. La tcnica es compatible con los mto-
protena particular) a lo
dos de tincin clsicos, lo que permite la integracin de ambos tipos
largo del tejido (en sus
correspondientes de datos. El MS-Imaging puede aplicarse a preparaciones homog-
espectros), puede neas de clulas, obtenidas del propio corte histolgico mediante mi-
reconstruirse una imagen o crodiseccin por captura con lser, incrementando as su resolucin.
mapa bidimensional de la Esta tecnologa puede complementar, o sustituir, muchas de las tc-
presencia de dicha
nicas manuales actuales (microscopia ptica, fluorescencia) en los
protena.
departamentos de anatoma patolgica de los hospitales.
Una tcnica muy similar (SIMS-TOF; secondary ion mass spectrometry)
permite el anlisis (identificacin y caracterizacin) de molculas de bajo peso
molecular presentes en la superficie de una muestra (determinacin del meta-
24 boloma). Hasta hace pocos aos no se utilizaba con muestras biolgicas debi-
do a la alta fragmentacin que produca sobre los componentes biolgicos. Sin
embargo, el desarrollo de nuevas fuentes de

iones como los clsteres de metal lquido
(oro o bismuto) han ampliado el rango de
masa que puede ser analizado hasta los
1.000 Da. Esta limitacin en el reducido
rango de masas analizado es compensada en
parte por la alta resolucin obtenida (subce-
lular; hasta 200 nm/pixel) y por no necesitar
la utilizacin de ningn tipo de matriz (evi-
tando interferencia y deslocalizacin de las
muestras, se usa el tejido directamente) lo
Figura 7. Esquema del
que la convierte en una herramienta muy va-
fundamento del SIMS-TOF.
liosa en patologa. Adems, como esta tcnica se aplica para locali- Es similar a lo descrito
zar y mapear en el tejido molculas pequeas, particularmente fr- para el MS-Imaging
macos (y su colocalizacin con protenas), es de gran inters para la (Figura 6), salvo que la
industria farmacutica. fuente de lser se
Los fundamentos del SIMS-TOF Imaging son muy semejantes a sustituye por una fuente
de iones (bismuto) y que
los descritos anteriormente para MALDI Imaging, siendo la princi-
las molculas liberadas del
pal diferencia las fuentes de ionizacin. Los iones primarios se gene- tejido corresponde a
ran utilizando un dispositivo denominado "liquid metal ion gun", compuestos de bajo peso
siendo seleccionados los clsteres de iones incidentes en base a su molecular (<2000 Da). No
masa y carga, focalizndolos en la muestra. El impacto de los iones es necesario aplicar la
primarios en cada punto de la muestra (corte de tejido) genera iones matriz sobre el tejido.
de la misma (secundarios), que son extraidos mediante un campo
elctrico entre la muestra y las lentes de extraccin. Cuando los iones secunda-
rios alcanzan el detector son convertidos en seales digitales y representados
en forma de un espectro de masas para cada posicin de la superficie de la
muestra (x,y). Para cada ion detectado se puede representar su intensidad a lo
largo del tejido en forma de imagen tridiemensional, mostrando su abundancia
relativa, utilizando el mismo software que en el MALDI Imaging (Figura 7).
C) Micromatrices (chips o arrays) de protenas
La obtencin de perfiles proteicos, tanto de suero (u otros lquidos fisiol-

gicos) como de clulas o tejidos, puede tambin obtenerse a partir de la utiliza- 25
cin de chips (o micromatrices) de protenas. Este es el sector de mayor creci-
miento en el mercado protemico, especial-

mente en el rea de la protemica funcional
(anlisis de las propiedades bioqumicas y
celulares de las protenas). No deben con-
fundirse los chips de protenas (micromatri-
ces de protenas capturadas o depositadas en
una superficie) con la miniaturizacin (y au-
tomatizacin) de las distintas tcnicas bioa-
nalticas protemicas (2-DE, electroforesis
capilar, cromatografas) que se estn desa-
rrollando en formato tipo chip ("the lab-on-
Figura 8. Esquema del
a-chip") basados en la tecnologa de micro-
anlisis comparativo de
dos muestras (marcadas fludica. Los chips de protenas pueden clasificarse segn muchos
con dos fluorforos parmetros (modo de fabricacin, qumica de la superficie, especifi-
diferentes, Cy3 y Cy5) cidad, densidad, etc.). Sin embargo, es mejor sistematizarlos en dos
mediante chips o grandes grupos, en base a lo que capturan o analizan:
microarrays
(micromatrices) de
Chips analticos: se utilizan para determinar las protenas presen-
anticuerpos.
tes en una muestra (perfil de expresin) y su cuantificacin. La disolu-
cin de la mezcla de protenas a analizar se aplica sobre el chip, que
contiene agentes de captura que actan como sondas. Los agentes de captura ms
conocidos son los anticuerpos (Ab) en sus distintas modalidades: monoclonales
completos, Fab, scFv, afibodies (Ab sintticos), dominios de Ab, etc. (Figura 8).
El uso de Ab no est exento de problemas: inespecificidad, reacciones cruzadas,
orientacin, afinidad, etc. Otra alternativa son los chips de antgeno para analizar
el perfil srico de Ab (y autoAbs en enfermedades autoinmunes), como los chips
de alergnos para la deteccin de IgEs en respuestas alrgicas.
Recientemente se estn generando una pltora de agentes de captura distintos
a los Abs, como pptidos, molculas orgnicas, polmeros sintticos, oligonucleti-
dos, aptmeros, ribozimas, trinectinas (derivados de la fibronectina), MIPs (mole-
cular imprinted polymers: compuestos que se polimerizan sobre las protenas cre-
ando moldes para su uso posterior), etc. A pesar de esta diversidad, la captura de
las protenas (y los mtodos de deteccin) constituye el gran problema de los chips
proteicos: no existen todava agentes de captura de alta calidad que puedan inmovi-
26 lizarse en la superficie de un chip y que permitan unir, detectar y cuantificar una
mezcla compleja de protenas. Este problema est retrasando no slo el desarrollo
de los chips proteicos, sino de la industria protemica en general. La investigacin

protemica est generando multitud de biomarcadores potenciales y nuevas dianas
teraputicas, pero tiene el cuello de botella del cribado y la validacin de frmacos
y los chips de protenas parece el mtodo adecuado para solucionarlo.
Los chips de fase reversa son de especial relevancia en Medicina porque
permiten determinar las protenas implicadas en las rutas de sealizacin celu-
lar en las biopsias de los pacientes. En ellos, las biopsias (tpicamente de tumo-
res o cardacas) se lisan y se depositan en diluciones sucesivas como microgo-
tas (utilizando los mismos robots que para la fabricacin de los chips de ADN);
posteriormente, son revelados con Abs validados (que reconocen protenas fos-
foriladas y kinasas, a fin de determinar el grado de activacin de las diferentes
rutas de sealizacin), obtenindose informacin cualitativa y cuantitativa para
cada paciente, lo que permite un tratamiento personalizado. Existen actualmen-
te cerca de 1.000 Abs validados. Mediante estos arrays puede determinarse si-
multneamente el estado de fosforilacin de las protenas implicadas en las
principales rutas de sealizacin intracelular. En este tipo de chip se depositan
pequeos volmenes (nl) de lisados de tejidos (biopsias de tumores, segmentos
de cartidas procedentes de las endarterectomas) o de clulas obtenidas me-
diante LCM de los mismos tejidos, sobre una superficie plana (portaobjetos)
usando un microarrayer. Cada microgota contiene el conjunto de todas las pro-
tenas, fosforiladas y no fosforiladas, contenidas en una muestra. Las protenas
de inters (fosforiladas) se detectan con anticuerpos especficos y se comparan
con las no-fosforiladas. Con arrays de alta densidad pueden detectarse miles de
muestras en un porta. La utilizacin de los arrays de fase reversa permite as
obtener un tipo de informacin molecular nico e individualizado de cada
muestra, y por tanto de cada paciente. Este nuevo tipo de array proporciona
perfiles de sealizacin intracelular, incluyendo las modificaciones postraduc-
cionales, datos que no son accesibles mediante tcnicas genmicas.
Chips funcionales: estos chips se utilizan para determinar actividades bio-

qumicas e interacciones moleculares. Las protenas de inters se inmovilizan
en el chip y se analizan sus funciones biolgicas e interacciones incubndolas
con distintas molculas (otras protenas, metabolitos, sustratos de enzimas,
DNA, etc.). Los dos problemas principales de estos chips son la produccin de
colecciones extensas de protenas y su mantenimiento en forma activa en el
27
chip. Sin embargo, para grupos de protenas con caractersticas funcionales si-
milares (factores de transcripcin, receptores, kinasas) hay un gran campo por

desarrollar en clnica humana.
Anlisis y procesamiento de datos: Bioinformtica
La enorme cantidad de datos que se estn generando mediante la enumera-

cin de los componentes celulares (genes y protenas), sus funciones e interac-
ciones, a partir de la genmica y la protemica, est transformando la Biologa
y la Medicina. Esta informacin est siendo recopilada en diversas bases de da-
tos como las relativas a los geles 2-D de protenas, proteomas de las distintas
estirpes celulares y sus subproteomas, etc. Se estn desarrollando multitud de
herramientas informticas dedicadas al anlisis de imagen de los geles 2-D, a
la interpretacin de los espectros de masas, a la secuenciacin de las protenas
de forma automtica fiable, a los mtodos de cuantificacin, etc. Uno de los
objetivos fundamentales de la protemica clnica es la utilizacin de herra-
mientas bioinformticas (y bioestadsticas) para el almacenamiento y procesa-
miento analtico de los datos masivos generados por protemica. Su finalidad
esencial es el desarrollo y aplicacin de mtodos de jerarquizacin y clustering,
visualizacin de datos, algoritmos estadsticos multivariable, para definir los
perfiles especficos de las distintas patologas. Una necesidad inmediata es la
creacin de bases de datos de protenas implicadas en las distintas patologas,
sus interacciones, participacin en rutas de sealizacin, etc., as como su rela-
cin con los datos genmicos. La aplicacin de estos mtodos a gran escala no
est desarrollada y deben implementarse para poder definir claramente cul es
el patrn "normal"(no existe actualmente) y poder discriminar, posteriormente,
los patolgicos y su gradacin. Esto es esencial para poder definir y establecer
test multiparmetricos. Adems, hay que desarrollar mtodos que integren de
forma efectiva la informacin procedente de diversos niveles biolgicos (perfi-
les proteicos, niveles o concentraciones, imgenes histolgicas, datos clnicos,
etc.). Es evidente que el anlisis masivo de datos, y la integracin de los distin-
tos niveles de informacin, slo puede llevarse a cabo mediante una plataforma
bioinformtica protemica, que constituye uno de los elementos claves de cual-
quier unidad de Protemica Clnica.
Sin embargo, lo ms destacado es la aparicin de nuevas herramientas in-
28 formticas y bases de datos, con una orientacin totalmente diferente, fisiolgi-
ca y funcional, que intentan integrar el catalogo de protenas y genes, para re-
flejar el comportamiento celular, analizando las rutas de sealizacin, las inte-

racciones protena-protena, los biomarcadores, los perfiles proteicos, etc. Ade-
ms, esos datos deben ser integrados con los de la Medicina clsica (historia
clnica, analtica, imgenes de rayos X y resonancia magntica nuclear, histolo-
ga, tratamiento) para obtener un verdadero valor fisiopatolgico. De esta for-
ma, se estn generando autnticas plataformas bioinformticas dedicadas a in-
tegrar todos los datos relativos a patologas concretas. En Espaa, sta es un
rea incipiente.
Creacin de bancos de muestras clnicas (suero, tejidos)
Tanto los ensayos clnicos como los estudios de validacin de biomarcado-

res o de perfiles proteicos necesitan colecciones amplias de muestras biolgicas
y sus protocolos de obtencin y recogida de muestras, conservacin, uso, etc.
Tales estudios son particularmente necesarios para demostrar la especificidad
diagnstica del perfil proteico, esto es, su ausencia en los controles (incluyendo
otras enfermedades) y su presencia en la enfermedad estudiada. Se contemplan
dos tipos de grupos de muestras:
a) Grupos reducidos de muestras clnicas muy bien caracterizadas, para la
fase de descubrimiento de biomarcadores o perfiles y estudios piloto.
b) Grandes colecciones de muestras clnicas bien caracterizadas necesarias
para la validacin de los biomarcadores o perfiles y el progreso hacia
su uso clnico de rutina.
CARCTER MULTIDISCIPLINAR DE LA PROTEMICA CLNICA
Con lo expresado hasta aqu, parece obvio que la protemica clnica debe
llevarse a cabo por equipos multidisciplinares, con mdicos clnicos y anato-
mopatlogos, qumicos de protenas, expertos en MS, bioinformticos, farma-
clogos, etc. Con frecuencia, los anlisis protemicos proporcionan una avalan-
cha de datos de difcil evaluacin. Una de las funciones esenciales de los
equipos multidisciplinares es la priorizacin de patrones candidatos que han de
ser validados. La fiabilidad de los datos, avalados en las bases de datos, su po-
tencial valor clnico y un riguroso anlisis bioinformtico, son algunos de los
29
criterios que deben seguirse en la priorizacin.
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30
Inmunoterapa humoral
INMUNOTERAPIA HUMORAL
Dr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University
El uso de anticuerpos monoclonales es actualmente una

modalidad teraputica de enorme importancia en el
tratamiento de pacientes con enfermedades neoplsicas.
Los anticuerpos se han utilizado como agentes nicos o
conjugados con agentes radioactivos o como vehculos de
frmacos y toxinas. Actualmente existen anticuerpos frente
a receptores de factores de crecimiento, factores de
crecimiento per se y otras dianas celulares como antigenos
de membrana. Estos frmacos han demostrado actividad
clnica en pacientes con tumores de de mama, colon,
pulmn, linfomas y leucemias. reas de investigacin y
desarrollo incluyen la generacin de agentes con mejores
propiedades farmacolgicas y menos txicos.
INTRODUCCIN
El desarrollo de anticuerpos con fines teraputicos ha crecido de forma

importante en la ltima dcada. Inicialmente se utilizaron anticuerpos de origen
murino. Estas molculas tienen el inconveniente de que generan una respuesta
immunolgica frente a ellos. Los anticuerpos murinos se pueden transformar
en molculas humanizadas de forma que no son reconocidos por el sistema im-
mune. Los anticuerpos humanos o "humanizados" se caracterizan tambin por
una mayor vida media. Ms recientemente, se han desarrollado estructuras con
capacidad para reconocer multiples antgenos, y con distintos tamaos y pro-
piedades. Junto a la creciente identificacin de dianas teraputicas, el uso de
anticuerpos tanto "desnudos" como conjugados con toxinas, frmacos y com-
puestos radiactivos ha aumentado notablemente. Los anticuerpos ms frecuen-
temente utilizados en el tratamiento contra el cncer son las IgG. Los avances
en gentica humana y molecular han permitido la sntesis de fragmentos de
31
IgG. Estos anticuerpos modificados se caracterizan por tener distinta afinidad
antignica, nmero variable de sitios de unin al antgeno y distintas propieda-

des farmacolgicas. Las ms utilizadas son los fragmentos variables de cadena
nica (scFV) que estn compuestos por las cadenas variables pesadas y ligeras
unidas por un pptido. Estas molculas tienen un peso molecular de 25 kDa
y son eficaces como vehculos de radionucletidos. Tambin se han desarrolla-
do estructuras de mayor envergadura como los llamados diabodis y minibodis.
El menor peso molecular de estas estructuras facilita su eliminacin renal y es-
pecificidad en la localizacin tumoral con menor toxicidad que la asociada con
IgG completas.
MECANISMOS DE ACCIN DE LOS ANTICUERPOS

MONOCLONALES COMO AGENTES TERAPUTICOS
Los anticuerpos monoclonales ejercen sus actividades de forma muy di-

versa y vara en funcin de las dianas afectas. Los anticuerpos dirigidos contra
receptores de factores de crecimiento, como el receptor del factor de creci-
miento epidrmico, inhiben la unin de ligandos con sus receptores y, en con-
secuencia, inhiben las funciones del receptor resultando en inhibicin de la
proliferacin celular y apoptosis. Los anticuerpos tambin generan actividad
antitumoral a travs de mecanismos inmunolgicos, induciendo anticuerpos an-
tiidiotipo, citotoxicidad dependiente de celulas (ADCC) y citotoxicidad media-
da por complemento. Como se ha mencionado anteriormente, los anticuerpos
tambin se utilizan como vehculos de otros agentes teraputicos como frma-
cos, toxinas y sustancias radioactivas. En estos casos, los mecanismos de ac-
cin estn en funcin de las molculas asociadas.
LIMITACIONES DEL EMPLEO DE ANTICUERPOS TERAPUTICOS
Inicialmente, los anticuerpos teraputicos usados en Oncologa eran anti-

cuerpos murinos. Una de las limitaciones ms importantes de estos frmacos es
la generacin de HAMA (human antimouse antibodies). Este problema limita
el nmero de tratamientos que los pacientes pueden recibir. Tcnicas ms mo-
32 dernas han permitido la generacin de anticuerpos quimricos que comparten
estructuras humanas y murinas y que tienen menor immunogenicidad. Actual-
mente, es posible la generacin de anticuerpos totalmente humanizados que no

generan HAMA. Un segundo problema es la unin del anticuerpo a antgenos
circulantes con la consiguiente reduccin en la disponibilidad del anticuepo pa-
ra llegar al tumor. Otras limitaciones a la distribucin de los anticuerpos en el
tejido tumoral incluyen las alteraciones en la vasculatura de los mismos, eleva-
da presin hidrosttica y la distribucin heterognea de los antgenos dentro de
los tumores. Adems, la inmunoterapia humoral se ve limitada por las dificul-
tades de acceso de las clulas efectoras a los tejidos tumorales. Finalmente, es
bien conocido que los tumores secretan sustancias que disminuyen la respuesta
inmunolgica.
ANTICUERPOS TERAPUTICOS
Neoplasias hematolgicas
CAMPATH-1: El CAMPATH-1 es un anticuerpo moclonal especfico fren-

te al antigeno CD52, un glicopptido que se expresa en linfocitos B y T. Se ha
empleado en pacientes con leucemia mieloide crnica (LMC), leucemia pro-
mieloctica y linfomas no Hodgkin (LNH) as como para depleccionar de clu-
las T la mdula en transplantes alognicos. El frmaco tiene aproximadamente
un 50% de respuesta en pacientes con LMC resistente a fludarabina. En pa-
cientes con enfermedad no tratada el frmaco ha demostrado tambin actividad
en pacientes con enfermedad no tratada, si bien la actividad es menor en pa-
cientes con afectacin esplnica y de ganglios linfticos. En pacientes con
LNH se ha estudiado una versin humanizada del anticuerpo. Un 20% de pa-
cientes respondieron, aunque de forma transitoria. Las principales toxicidades
observadas fueron anemia, trombocitopenia e infecciones oportunistas.
Rituximab: El rituximab es un anticuerpo monoclonal humanizado frente
al antigeno CD20. En estudios fase II, el frmaco result en un 40-50% de res-
puestas objetivas en pacientes con recidivas de LNH de bajo grado con muy
buena tolerancia. En algunas ocasiones, el tratamiento con rituximab result en
reacciones infusionales caracterizadas por fiebre, escalofros, lisis tumoral, pla-
quetopenia, broncoespasmo e hipoxemia. Estos sntomas se suelen resolver con
tratamiento de soporte y los pacientes pueden continuar el tratamiento sin se-
33
cuelas. En raras ocasiones se han descrito reacciones cutneas de gran intensi-
dad, siendo algunas incluso fatales. En pacientes con linfomas de grado alto e
intermedio, las respuestas fueron de un 30% con independencia de la dosis em-
pleada. En combinacin con quimoterapia CHOP, el ndice de respuestas es
mayor del 90% con hasta un 55% de respuestas completas de larga duracin.
Es importante resaltar que pacientes con translocacion del gen blc2 negativiza-
ron dicho marcador en sangre medido por PCR. En pacientes ancianos, el trata-
miento combinado de quimioterapia con rituximab ha demostrado superioridad
al tratamiento con quimioterapia sola. En linfomas de bajo grado, el tratamien-
to combinado de rituximab y fludarabina result en un 93% de respuestas glo-
bales, con una duracin de ms de 14 meses. Una observacin importante en el
desarrollo clnico del rituximab es que la presencia de clulas CD-20 positivas
circulantes puede afectar a la actividad del frmaco, actuando como un santua-
rio en el que se deposita el anticuerpo, pudiendo necesitar dosis ms altas del
mismo. De hecho, en otros estudios se ha observado una relacin entre niveles
sricos del anticuerpo y actividad clnica, de forma que pacientes con enferme-
dad avanzada puedan necesitar una dosis de anticuerpo ms alta. En casos oca-
sionales, los pacientes desarrollan resistencia a rituximab debido a la prolifera-
cin de poblaciones linfocitarias sin expresin del antgeno. En estas
situaciones se puede considerar la combinacin de este agente con otros frma-
cos dirigidos contra las poblaciones linfocitarias emergentes.
Tumores slidos
Trastuzumab: El Her2/Neu, tambin llamado ErbB2, es uno de los miem-

bros de la familia del receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR).
Este receptor de membrana se encuentra sobreexpresado, debido a una amplifi-
cacin gentica en el 30% aproximadamente de pacientes con cncer de mama.
El trastuzumab (Herceptin), tambin conocido como herceptin, es una versin
humanizada del anticuerpo murino 4D5. El anticuerpo va dirigido frente a epi-
topos en el dominio extracelular del Her2. En estudios de fase II, en pacientes
con carcinoma de mama avanzado, el tratamiento con este frmaco result en
un 10-15% de respuestas objetivas, y aproximadamente, 9 y 13 meses de tiem-
po a la progresin y supervivencia respectivamente. El frmaco es activo en
aquellos tumores que sobreexpresan el Her2, determinado bien mediante im-
34 muhistoquimica o mediante amplificacin gentica por FISH. En combinacin
con quimioterapia, el tratamiento con trastuzumab ha mostrado superioridad
frente al tratamiento con quimioterapia sola en pacientes con cncer de mama

avanzado. En un estudio fase III, el tratamiento combinado de herceptin con
paclitaxel o ciclofosfamida-adriamicina demostr superioridad en repuestas ob-
jetivas as como supervivencia. El tratamiento combinado con antraciclinas re-
sult en casos de disfuncin miocrdica y no se recomienda su utilizacin. Re-
cientemente se han publicado los estudios de herceptin en pacientes con
carcinoma de mama operado en combinacin con quimioterapia. Estos estudios
han demostrado una mejor supervivencia libre de enfermedad en pacientes tra-
tadas con este frmaco, lo cual ha resultado en la aprobacin de los mismos
para uso clnico. La mejor supervivencia de las pacientes tratadas indica que
posiblemente se logre un mayor nmero de curaciones de la enfermedad.
Cetuximab: El EGFR, o sus ligandos, est sobreexpresado en la gran mayo-
ra de los tumores slidos epiteliales y es una diana muy interesante para el desa-
rrollo de frmacos antitumorales. Farmacolgicamente se han desarrollado dos
estrategias contra esta diana, que se basan en el uso de anticuerpos monoclonales
contra el dominio extracelular del receptor o molculas pequeas dirigidas frente
al domino intracelular del mismo. Ambas estrategias han demostrado ser efecti-
vas y actualmente se estn aprobando frmacos inhibidores de este receptor en
estas dos categoras. Los anticuerpos monoclonales bloquean la interaccin del
ligando receptor e inhiben la funcin del mismo. Adems, los anticuerpos mono-
clonales inducen la degradacin del receptor, siendo este otro mecanismo de ate-
nuacin de la seal. A nivel celular, estos eventos producen una inhibicin de la
proliferacin celular. Estudios preclnicos han demostrado, adems, que estos fr-
macos reducen la expresin del factor de crecimiento del endotelio vascular, con
lo que se produce una disminucin del potencial angiognico. En estudios precl-
nicos se ha visto tambin que los anticuerpos monoclonales frente al EGFR ejer-
cen efectos sinrgicos con quimioterapia y radioterapia.
Actualmente existen varios anticuerpos de esta clase en desarrollo. Los
ms avanzados son el cetuximab (Erbitux), aprobado para el tratamiento de
pacientes con carcinoma de colon refractario a irinotecn en combinacin con
este agente, en combinacin con radioterapia en pacientes con carcinoma epi-
dermoide de cabeza y cuello con enfermedad localmente avanzada as como en
pacientes con enfermedad avanzada como agente nico. En diferentes estudios
clnicos se ha observado que este anticuerpo tiene actividad como agente nico
y en combinacin con irinotecn en pacientes con cncer de colon avanzado.
35
En un reciente estudio fase III, la combinacin de cetuximab con irinotecn re-
sult ser superior a cetuximab slo en pacientes con cncer de colon avanzado
que haban progresado al tratamiento con irinotecan. El frmaco tiene tambin
actividad en otros tumores tanto como agente nico como en combinacin con
quiotereapia y radioterapia. En particular, varios estudios recientes han demos-
trado que este frmaco tiene actividad como agente nico en pacientes con tu-
mores de cabeza y cuello. Asimismo, la adicin de cetuximab al tratamiento
con quimioterapia basada en platino en pacientes con carcinoma de cabeza y
cuello resistentes a esta quimioterapia result en un aumento de las respuestas
objetivas. Finalmente, en un estudio fase III, la combinacin de cetuximab con
radioterapia result superior a la radioterapia sola en pacientes con carcinoma
de cabeza y cuello localmente avanzado. La toxicidad principal observada con
este frmaco cutanea y se manifiesta como acne. En estudios clnicos se ha ob-
servado, de forma muy interesante que los pacientes que desarrollan toxicidad
cutanea tienden a evolucionar mejor.
El otro anticuerpo monoclonal aprobado para uso clnico es panitumumab.
Este anticuerpo, a diferencia de cetuximab, es totalmente humano, lo cual dis-
minuye la indicencia de reacciones de hipersensiblidad. En un reciente estudio
fase III en pacientes con carcinoma de colon resistente a tratamiento con qui-
mioterapia, el panitumumab result en un aumento significativo en el tiempo a
la progresin frente a placebo. Estos resultados han llevado a la aprobacin cl-
nica de panitumumab para pacientes con carcinoma de colon refractario a qui-
mioterapia.
Edrecolomab: El anticuerpo 17-1A (Panorex) reconoce el antgeno Ep-
CAM. El anticuerpo desarrollado clnicamente es un anticuerpo humanizado
que tiene una larga vida media, induce ADCC y no produce HAMA. Debido a
observaciones preclnicas que indican una mayor actividad del anticuerpo
cuando se combina con citokinas como interfern, interleukinas y factores de
crecimiento hematopoyticos, este anticuerpo se ha desarrollado en combina-
cin con estos otros agentes. Los estudios clnicos realizados con esta molcula
han dado resultados conflictivos. La combinacin con citoquinas ha resultado
en mejores respuestas inmunlogicas, pero no en mejores respuestas clnicas.
Los estudios iniciales en pacientes con estadio III de cncer de colon demostra-
ron un aumento en la supervivencia del grupo tratado con anticuerpo frente al
control. Estudios posteriores en pacientes con estadio II de cncer de colon y
36 en combinacin con quimioterapia en pacientes con estadio III no han confir-
mado dicha actividad.
Bevacizumab: El VEGF es uno de los mediadores ms importantes de la

angiognesis. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal dirigido contra este
factor de crecimiento que ha sido recientemente aprobado para el tratamiento
de pacientes afectos de carcinoma de colon en combinacin con quimiotera-
pia. El frmaco ha demostrado en estudios fase III en pacientes con carcino-
ma de colon avanzado, mama y pulmn un mayor ndice de respuestas objeti-
vas y mejor supervivencia. La droga tiene tambin actividad en pacientes con
carcinoma de pulmn y est siendo extensivamente estudiada en estas otras
enfermedades. Los principales efectos secundarios ms notorios han sido hi-
pertensin, hemorragias (tumorales, epistaxis, hemoptisis) y cuadros de per-
foracin intestinal.
RADIOINMUNOTERAPIA
Radioinmunoconjugados
En esta modalidad teraputica, los anticuerpos se utilizan como vehculos

de sustancias radioactivas. Los anticuerpos utilizados pueden ser anticuerpos
sin actividad teraputica per se o con actividad teraputica, como por ejemplo
rituximab. La gran disponibilidad actual de anticuerpos y radioistopos con
propiedades fsicas y biolgicas muy diversas permite mucha flexibilidad en
la combinacin de los mismos, de manera que es posible generar reactivos de
muy diversa ndole. Hasta recientemente, el nico radioistopo disponible era
el 131I. Ms recientemente est disponible tambin el 90Y, cuyo uso est au-
mentando de forma progresiva. Estos agentes se clasifican en dos grandes ca-
tegoras dependiendo del tipo de energa que emiten, alfa o beta. Estas sustan-
cias se han utilizado mayormente en el tratamiento de neoplasias
hematolgicas. Tositumomab (Bexxar) est compuesto por 131I -anti CD 20.
Dosis mieloablativas de este agente han sido eficaces en el tratamiento de pa-
cientes con linfoma refractario a tratamiento convencional y tambin ha de-
mostrado actividad a dosis ms bajas en pacientes con linfomas refractarios.
Ibritumomab (Zevalin) combina un anticuerpo frente al CD20 con 90Y. El es-
tudio ms relevante con este frmaco es un estudio randomizado fase III en
pacientes con linfoma de bajo grado. Ciento cuarenta y tres enfermos se ran-
37
domizaron a recibir tratamiento con ibritumomab o rituximab resultando en un
mayor ndice de respuestas objetivas tanto completas como parciales en el

grupo tratado con ibritumomab. Otros frmacos RAIT incluyen Lym-1 y
M195. Esta modalidad teraputica se ha ensayado tambin en tumores slidos
con menor xito hasta el momento.
CONCLUSIONES
Los anticuerpos monoclonales se han establecido como una importante

modalidad teraputica y actualmente existen varios aprobados para el trata-
miento de pacientes con diversos tipos de tumores. Los anticuerpos ofrecen
una gran versatilidad en cuanto a su posible utilizacin como agentes nicos o
combinados con radioinmunoconjugados, frmacos y toxinas.
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39
Introduccin a la inmunoterapia celular
INTRODUCCIN A LA INMUNOTERAPIA CELULAR

Jos R. Regueiro. Departamento de Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid
Eduardo Martnez Navas. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid
QU ES LA INMUNOTERAPIA?
La inmunoterapia es la utilizacin de he-

rramientas inmunolgicas para tratar enferme-
dades como las que se indican en la Figura 1.
Cncer (Blattman 2004).
Infecciones (Casadevall 2004).
Enfermedades inmunitarias.
Por exceso de respuesta a antgenos.
Propios: autoinmunidad (Stein-
man 2004, Feldmann 2004).
Ajenos: alergia, rechazo (Hu
ggins 2004, Waldmann 2004). Figura 1.
Por defecto de respuesta a patgenos: inmunodeficiencias.
LA INMUNOTERAPIA FUNCIONA (Blattman 2004)

41
La extraordinaria capacidad de reconocimiento del sistema inmunita-
rio ya se puso de manifiesto en siglos anteriores con la inmunoprofilaxis,
Figura 2. Figura 4.
que ha permitido erradicar, por ejemplo, la viruela o el sarampin. De

igual manera, la inmunoterapia ha demostrado en los ltimos aos que
funciona, como acreditan los ejemplos que se citan en la Figura
Figura 3: Manipulacin de la 2. Por ejemplo, el linfoma no-Hodgkin se trata con xito con
inmunidad adaptativa anticuerpos monoclonales anti-CD20, ya que la clula tumoral
humoral. (A) Los antgenos expresa CD20 y, por tanto, queda marcada para su eliminacin
tumorales pueden inducir, sistemtica y concienzuda merced a todos los mecanismos des-
mediante vacunacin, la
tructivos que la
produccin por los linfocitos
inmunidad dedica
B de anticuerpos capaces
de eliminar tumores o normalmente a los
mejorar la presentacin de patgenos (Figura
sus antgenos por las 3). La Figura 4 re-
clulas dendrticas (DC). Los sume algunos de
monoclonales, como el anti-
ellos y otras estra-
CD20 o anticuerpos
tegias que aprove-
biespecficos, reconocen
tumores y activan diversas
chan la exquisita
clulas efectoras. BCR/lg, B especificidad de
cell receptor; Ag:Ab, los anticuerpos.
antgeno:anticuerpo. (B) Los Otro ejemplo es el
monoclonales pueden uso de anti-CD25
eliminar tumores por
para tratar el re-
mecanismos independientes
chazo renal agudo,
de clulas efectoras. MAC,
42 que es debido al
membrane attack complex.
Tomado de Blattman 2004. reconocimiento de
Figura 5. Figura 6.
Figura 7. Figura 8.
las clulas renales por los linfocitos T alognicos (Figura 5). Como dichos
linfocitos expresan CD25 para su expansin (Figura 6), el tratamiento los
elimina eficazmente sin daar a otros linfocitos T. Los linfocitos T, en es-
te caso autorreactivos, son los responsables de la sntesis de un importante
mediador de la inflamacin (TNF) en patologas autoinmunitarias como
la esclerosis mltiple (Figura 7) o la artritis reumatoide. Es dicho media-
dor el que bloquean los anticuerpos anti-TNF, que tanto xito han tenido
en esta enfermedad. En realidad, los mecanismos implicados en la inmu-
noterapia de la aloreactividad podran aplicarse a todas las inmunopatas
(Figura 8), ya que en todas existen linfocitos "malos" (alo, auto o alerre- 43
activos).
LA INMUNIDAD ADAPTATIVA ES MUCHO MS

QUE LOS ANTICUERPOS
Los ejemplos precitados tienen en comn que se aprovechan de la enorme

diversidad de los anticuerpos, normalmente dirigidos contra los patgenos, para
eliminar o bloquear la causa de la patologa tratada (sea sta el tumor, el linfocito
malo o la citocina, Figura 9). Pero los linfocitos T tambin tienen esa capacidad,
an no explotada suficientemente, aunque su concepto de antgeno (pptido ex-
terno o interno presentado por molculas MHC) difiere del que tienen los linfoci-
tos B (eptopo externo del antgeno nativo, Figura 10). Adems los linfocitos T,
especialmente los Th, tienen una enorme capacidad reguladora de la inmunidad
Figura 9. Figura 10.
44
innata y adaptativa, y entre

otras cosas son los responsables
de la propia funcin de los B
(Figura 11, 12). Por tanto, inten-
tar redirigir la actividad defensi-
va anti-patgeno de los linfoci-
tos T y sus clulas auxiliares
sobre el tumor, el linfocito malo
o la citocina, es una estrategia
con enormes posibilidades tera-
puticas (Figura 13).
Figura 13.
QU ES LA INMUNOTERAPIA CELULAR?
La inmunoterapia celular es la utilizacin de clulas como herramien-

tas inmunolgicas para tratar las enfermedades que se listan ms arriba,
especialmente el cncer (Paul 1998 y Figura 14). La Figura 15 propone al-
gunos ejemplos, ms deseos que realidades salvo quiz el tratamiento de la
leucemia por trasplante de mdula sea compatible. La tcnica se resume
en la Figura 16: se obtienen precursores hematopoyticos del paciente, que
se limpian ex vivo de posibles clulas tumorales, y se congelan. Entretan-
to, el paciente se trata agresivamente para erradicar el tumor, y despus se
reconstituye con los precursores congelados. Los recientes avances en la
45
reconstitucin del linaje T, que es el

ms importante clnicamente, mejorarn
previsiblemente esta opcin teraputica
(van den Brink 2004). Tambin se puede
aplicar el procedimiento a enfermedades
autoinmunitarias graves (esclerosis ml-
tiple, artritis reumatoide resistente a
otros tratamientos), ya que los linfocitos
autorreactivos, como la leucemia, pue-
den ser eliminados dentro y fuera del
paciente (Sykes 2005).
Figura 16.
DAME UN BUEN ANTGENO Y ELIMINAR EL CANCER
Aunque el sistema inmunitario ha evolucionado para defendernos de los pat-

genos, y parece poco preocupado por los tumores (o por constituir una molesta ba-
rrera frente a los trasplantes), lo cierto es que elimina con rapidez tumores siempre
que tengan un buen antgeno asociado. Dos ejemplos: el virus de Epstein-Barr y
los idiotipos (regiones variables de las Igs) en linfomas B de bajo grado (Figura
17), aunque hay otros (Figura 18). El caso del virus de Epstein-Barr es muy ilustra-
tivo (Figura 19), ya que infecta a casi toda la poblacin e in vitro transforma a los
linfocitos B (su diana) para que crezcan indefinidamente. Pero in vivo se mantiene
a raya por los linfocitos Tc principalmente. La inmunosupresin lo puede liberar de
46
Figura 19.
Figura 20.
este control permitiendo la proli-
feracin de los linfocitos B in-
fectados, que con el tiempo pue-
Figura 21. den acumular mutaciones que
los hacen tumorales (Figura 20). La Figura 21 explica el mecanismo de las vacunas
antitumorales con idiotipos del BCR del linfoma, que se convierten por sobreex-
presin en antgenos tumorales (de distribucin mucho ms restringida que CD20,
por cierto, y por tanto mucho ms especficos). Sin embargo, pocas veces hay un
buen antgeno tumoral (ver ltimo prrafo del siguiente apartado).
INMUNOTERAPIA CELULAR DEL CNCER
Por tanto, la inmunoterapia celular pretende convencer a los linfocitos Tc (y

Th) de que destruyan a las clulas tumorales (propias, aunque descarriadas) como
si estuvieran infectadas por EBV (Figuras 22, 23). Para ello, utiliza clulas diver- 47
sas: linfocitos alognicos de mdula sea, clulas dendrticas, las propias clulas
Figura 23.
Figura 22.
tumorales modificadas, o linfo-

citos propios (T, NK NKT,
Figuras 24, 25) (Plunkett 1999).
Figura 24.
Linfocitos alognicos
Las preparaciones de mdula

sea alognica contienen siempre
cierto porcentaje de linfocitos T
maduros (Figura 26). Mientras
que los precursores se diferencian
en el timo del receptor para dar
lugar a linfocitos T autotolerantes
restringidos por el MHC del re-
ceptor, los linfocitos contaminan-
48 tes pueden contener una propor-
cin variable de linfocitos T Figura 25.
alognicos, que son los responsables de la reaccin injerto contra husped en los tras-
plantes de mdula no purgada de linfocitos. Esta reaccin es ms peligrosa que la re-
accin alognica de los linfocitos T del receptor contra el injerto de mdula y su pro-
genie (que puede provocar el rechazo del injerto), ya que puede comprometer la vida
del receptor. Por esa razn se suele purgar la mdula alognica con monoclonales an-
ti- CD2, CD3, CD5, CD7 o CD52 en el caso de pacientes sin cncer. Pues bien, esa
misma actividad anti-husped aparentemente indeseable es la responsable del efecto
injerto contra leucemia, que elimina con efectividad a todas las clulas tumorales por
razones alognicas, las mismas que operan en el rechazo renal (Figura 27), pero aho-
ra dirigidas contra el tumor. Este efecto antitumoral de las clulas T alognicas ha si-
do claramente demostrado en dos enfermedades: leucemia mieloide crnica (CML) y
la enfermedad linfoproliferativa de linfocitos B inducida por el virus de Epstein-Barr
(EBV). Pero, en este caso, la razn por la que el
tumor es eliminado es porque, en realidad, no
es propio. Tambin se ha demostrado el efecto
beneficioso del rechazo del husped en algunas
enfermedades autoinmunitarias (Sykes 2005).
Clulas dendrticas y tumorales

(Irvine 2000, Berzofsky 2004a)
Las clulas dendrticas y tumorales au-

tlogas (Figura 28) son tambin objeto de 49
las estrategias de inmunoterapia celular que Figura 28.
a menudo se denominan vacunas celulares. El diseo es sencillo (Figuras 29,

30): consiste en hacer crecer las clulas dendrticas ex vivo a partir de monoci-
tos (si es que al resultado se le puede llamar clulas dendrticas), madurarlas y
cargarlas con lisados del tumor, o vectores virales que expresen antgenos tu-
morales, o pptidos antignicos de origen tumoral (Curti 2004, Figura 31). Se
espera que as las clulas dendrticas carguen en su MHC pptidos tumorales y,
al reinyectarse al paciente, consigan disparar una respuesta vigorosa de linfoci-
tos Tc (y Th) antitumorales. Ms recientemente se ha demostrado en ratn que
los antgenos tumorales podran expresarse con vectores en precursores hema-
topoyticos que, al diferenciarse en dendrticas, activaran a los linfocitos T an-
titumorales (Cui 2003). Otra estrategia complementaria es modificar las propias
50
clulas tumorales con vectores que produz-

can localmente molculas inmunoestimula-
doras (por ejemplo, citocinas, o bien mol-
culas coestimuladoras, como B7/CD80) con
la esperanza de que, al volver al enfermo,
estimulen una fuerte respuesta presentadora
en las clulas dendrticas y, por tanto, una
respuesta Th y Tc muy potente (Figura 30),
o bien una respuesta directa por parte de es-
tas ltimas (Figura 32). Otra estrategia es
utilizar el propio tumor autlogo o bien uno
Figura 33.
alognico del mismo tipo (Cancervax).
Linfocitos T, NK, NKT (Khanna 1999, Kessels 2001, Alvarez-Vallina 2001)
Por ltimo, la extraordinaria capacidad de los linfocitos propios para

eliminar clulas infectadas ha propiciado su aplicacin a la eliminacin de
tumores, con diversas estrategias (bsicamente despabilar linfocitos, Figura
34). Una es la transferencia adoptiva de grandes nmeros de linfocitos T
anti-tumor generados in vitro por estimulacin con citocinas como la IL-2,
a partir de linfocitos infiltrantes o TIL (B). Los resultados de las fases I y
II de estos ensayos fueron bastante desesperanzadores, aunque recientemen-
te las estrategias linfoablativas han hecho renacer las esperanzas (Rosen-
berg 2004). Otra es la modificacin gentica de los linfocitos T, antes de su
transferencia adoptiva, para que expresen
nuevos receptores de reconocimiento tu-
moral (TCR, anticuerpos biespecficos o
quimricos), o de proliferacin autocrina,
o protenas que bloquean las seales inhi-
bidoras que limitan las respuestas T (D y
Figura 35).
El tratamiento con IL-2 tambin se ha em-
pleado para la transferencia adoptiva de linfoci-
tos NK expandidos in vitro (las LAK, Figura
36). La -galactosilceramida es un anlogo del 51
ligando natural de los linfocitos NKT que per- Figura 34.
Figura 36.
Figura 35.
mite expandirlos y que ha acredi-

tado su potencial antitumoral.
En el caso de los linfocitos
T y las clulas dendrticas, exis-
ten dos problemas importantes Figura 37.
(Figura 37): el riesgo de autoin-
munidad, y la necesidad de que exista un verdadero antgeno tumoral. Este ltimo
obstculo no puede destacarse lo suficiente, porque confunde enormemente el pa-
norama cientfico. CD20, CEA (antgeno carcinoembrionario), AFP (alfa feto pro-
tena) no son verdaderos antgenos tumorales, ya que se expresan normalmente en
el enfermo en cantidades que garantizan la autotolerancia. Por tanto, es muy dif-
cil convencer al sistema inmunitario que los considere ajenos, a no ser que se le
proporcione un sistema de reconocimiento generado en otra especie, para la que s
son verdaderos antgenos (por ejemplo un anti-CD20 de ratn). En cambio, los
antgenos (inmungenos para ser ms precisos) de los oncovirus (EBV, HTLV-I) o
la p53 mutada o el antgeno oncofetal s son verdaderos antgenos tumorales, ya
52 que para ellos no existe autotolerancia y puede, por tanto, estimularse la inmuni-
dad contra las clulas tumorales que los portan (Coggin 2005).
INMUNOTERAPIA CELULAR DE OTRAS ENFERMEDADES
Pero la inmunoterapia celular, al menos en teora, tendra una enorme apli-

cacin potencial en diversas patologas, como se sugiere en la Figura 38. Por
ejemplo, clulas dendrticas cultivadas con un antgeno de melanoma deberan
generar in vivo linfocitos Tc anti-melanoma. O expandiendo linfocitos Tc aut-
logos anti-EBV in vitro debera poderse tratar la mononucleosis (Khanna 1999,
Berzofsky 2004b). Una vacuna celular a base de los linfocitos T responsables
de la artritis reumatoide, el asma o el rechazo podra eliminarlos completamen-
te. Pero tambin injertar TCR anti-EBV, o -tumor, o -linfocito malo puede redi-
rigir a linfocitos normales contra las dianas implicadas en cada una de esas pa-
tologas (Figura 39).
Por ltimo, las inmunodeficiencias (ID)
congnitas son desafortunados experimentos
de la Naturaleza que afectan a la inmunidad.
Resulta especialmente apropiado que puedan
curarse mediante afortunados experimentos
diseados por el ser humano. Ya fue as en
1968, cuando una ID ligada al cromosoma X
se convirti en la primera enfermedad huma-
na curada con xito por trasplante de mdula
sea, un procedimiento teraputico que aho-
ra es estndar para muchas otras patologas,
Figura 38.
incluido el cncer. Naturalmente, se observa-
ron efectos adversos graves, como la enfer-
medad del injerto contra el husped. Ms de
30 aos despus, la misma ID ha sido la pri-
mera en ser curada por terapia gnica. Hay
obstculos que superar, como ha demostrado
la leucemia de clulas T desarrollada por on-
cognesis insercional en tres pacientes. La
propia inmunidad puede ser un obstculo pa-
ra la terapia gnica cuando se dirige contra
el vector o incluso la protena teraputica. 53
Pero la terapia gnica seguir adelante. El
Figura 39.
cncer, las enfermedades infecciosas, inclui-
do el sndrome de la inmunodeficiencia adquirida, y otras enfermedades cong-

nitas, son las siguientes de la lista. Los beneficios globales sern probablemen-
te ms que los riesgos, como se demostr para el trasplante (Regueiro 2004).
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55
Clulas embrionarias pluripotentes
CLULAS EMBRIONARIAS PLURIPOTENTES

Miguel Torres. Cientfico titular del Departamento de Inmunologa y Oncologa
Centro Nacional de Biotecnologa. CSIC-Pfizer
INTRODUCCIN
El cuerpo humano se compone de una gran variedad de clulas especiali-

zadas en diferentes funciones. Esta especializacin determina una divergencia
extrema en la apariencia externa y capacidad funcional de cada una de las cla-
ses de clulas que componen un organismo. Por ejemplo, una clula sea difie-
re extraordinariamente en su apariencia externa de una neurona y no podra re-
alizar sus funciones especializadas. La composicin y diversidad celular de
nuestro cuerpo, salvo excepciones, est presente en el momento de nacer y nos
acompaa hasta la muerte. Sin embargo, a pesar de su gran heterogeneidad, to-
das nuestras clulas descienden de una nica clula embrionaria: el zigoto. Du-
rante el desarrollo embrionario ocurren dos importantes procesos que conducen
a la composicin final del recin nacido; por un lado el zigoto se multiplica
por divisin, generando el nmero de clulas necesarias para la construccin
del organismo, y en paralelo, distintos linajes celulares se diferencian en pobla-
ciones celulares que adoptan las caractersticas propias de su identidad.
Una vez diferenciadas, las clulas disponen de un periodo de vida limitado
y deben ser reemplazadas por otras nuevas para mantener la funcin de los teji- 57
dos y rganos del individuo. En el embrin temprano existe una poblacin de
clulas, las clulas troncales embrionarias, capaz de diferenciarse en cualquier

tipo celular del organismo, y por lo tanto, capaz de aportar todos los tipos celu-
lares necesarios para la construccin de los distintos tejidos y rganos. En el
individuo ya desarrollado, son las clulas troncales adultas las que heredan esta
capacidad y aportan a cada tejido u rgano un flujo constante de nuevas clulas
que sustituyen a las envejecidas o daadas por enfermedad o accidente, regene-
rando rganos y tejidos. Sin embargo, la capacidad de regeneracin es muy va-
riable segn el tejido; desde casi nula en el caso del Sistema Nervioso Central,
o muy reducida en el caso del pncreas, hasta muy activa en el caso de la piel,
el sistema hematopoytico o el hgado. Esta circunstancia determina que la pr-
dida o deterioro de una poblacin celular concreta durante la vida adulta sea,
en muchos casos, insustituible de manera espontnea.
La carencia de las funciones realizadas por las clulas daadas provoca el
sufrimiento de enfermedades crnicas como la diabetes, el Parkinson, la escle-
rosis mltiple, etc. o la prdida de determinadas funciones, como las parlisis
sufridas tras una lesin de mdula. Una de las soluciones para resolver este ti-
po de enfermedades sera la disponibilidad de clulas embrionarias totipotentes,
capaces de especializarse en las funciones perdidas durante la vida adulta. Sin
embargo, las clulas troncales embrionarias se encuentran de manera natural en
el embrin en estadio de blastocisto, en nmero muy limitado y en una ventana
de tiempo muy restringida. Por esta razn, la posibilidad de usarlas depende de
la capacidad de aislar y multiplicar las clulas troncales embrionarias de mane-
ra controlada en el laboratorio.
LAS CLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS: OBTENCIN,

CARACTERSTICAS Y APROXIMACIONES TERAPUTICAS
EXPERIMENTALES
El aislamiento y cultivo de clulas troncales embrionarias se consigui por

primera vez a partir de blastocistos de ratn en el ao 1981 (Figura 1), cono-
cindose universalmente como clulas ES (segn la denominacin inglesa
"Embryonic Stem")1,2. Las clulas aisladas mostraron caractersticas excepcio-
nales; por un lado se multiplican indefinidamente en cultivos in vitro, y a la
58 vez, si se les proporciona las condiciones adecuadas, se diferencian dando lu-
gar a las distintas clulas especializadas del organismo. Las conclusiones deri-
vadas del cultivo y

uso de las clulas ES
en el ratn son con-
tundentes. Clulas
ES mantenidas en
cultivo por periodos
prolongados son ca-
paces de mezclarse
con clulas de un
embrin en desarro-
llo, contribuyendo
clulas sanas y fun-
cionales a todos los
tejidos de un animal
adulto (Figura 2). A
pesar de haber acu-
mulado un nmero
indefinido de divi- Figura 1. Establecimiento
siones in vitro, las clulas ES no parecen "envejecer", ya que los ani- de lneas de clulas
males generados a partir de stas clulas no presentas sntomas de troncales embrionarias.
envejecimiento prematuro. Estas caractersticas se relacionan con una

alta actividad telomerasa y con la expresin de otros marcadores re-
lacionados con el mantenimiento del estado indiferenciado y prolife-
rante. Figura 2. Contribucin
En 1998 se consigui por primera vez obtener y propagar in de las clulas ES a la
formacin de quimeras
vitro lneas de clulas pluripotentes aisladas de blastocistos y de
de ratn con colonizacin
gnadas fetales humanas3,4. Al igual que sus homlogas de ratn,
de la lnea germinal.
59
las clulas pluripotentes embrionarias humanas se multiplican indefinidamen-

te en cultivos artificiales, pero si se les proporciona las condiciones adecua-
das, se diferencian dando lugar a las distintas clulas especializadas del orga-
nismo. Los cultivos de clulas ES humanas representan por lo tanto una
fuente ilimitada de clulas jvenes capaces de contribuir a cualquier tejido
del organismo adulto5,6.
En modelos experimentales animales se han producido ya varios ejem-
plos del potencial teraputico de las clulas ES. Se ha descrito, por ejemplo,
la diferenciacin de clulas ES de ratn hacia msculo cardaco y su im-
plantacin con xito en el corazn de un animal adulto7. En estudios simila-
res, se han observado mejoras de lesiones medulares y enfermedades neuro-
degenerativas trasplantando, respectivamente, poblaciones de neuroblastos o
gliales diferenciadas in vitro a partir de clulas ES de ratn 8,9. Tambin se
han conseguido derivar clulas beta-pancreticas funcionales a partir de c-
lulas ES, mediante un proceso de diferenciacin y purificacin. La posterior
implantacin de estas clulas en modelos experimentales de diabetes ha eli-
minado los sntomas de la enfermedad, demostrando la eficacia de la aproxi-
macin10.
LIMITACIONES PRESENTES A LA APLICACIN DE LAS

CLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS EN TERAPIA HUMANA
Existen al menos tres problemas conocidos que impiden prever qu enfer-

medades se beneficiarn de la nueva tcnica y cundo ser posible su aplica-
cin.
En primer lugar, las clulas ES de ratn forman teratocarcinomas al ser
implantadas en estado indiferenciado en animales de laboratorio. Este problema
desaparece si se implantan despus de su diferenciacin total o parcial in vitro,
por lo que cualquier protocolo de transferencia de clulas ES deber incluir un
paso previo de diferenciacin in vitro.
Un segundo problema para la aplicacin teraputica de las clulas ES re-
side en la dificultad de obtener clulas diferenciadas a un linaje celular puro.
Cuando se estimula su diferenciacin, las clulas ES son capaces de originar
60 cualquier tipo celular, pero raramente lo hacen de manera homognea, sino
que dan lugar a poblaciones de clulas en que se mezclan distintos tipos es-
pecializados. Idealmente deberamos ser capaces de controlar las vas elegi-

das por las clulas ES cuando se diferencian 6,11. Gracias a experimentos en
clulas en cultivo y a modelos animales como el ratn, hoy conocemos genes
de diferenciacin que controlan estas vas. Por ejemplo, existen genes miog-
nicos que determinan la diferenciacin hacia msculo, neurognicos que in-
ducen la diferenciacin hacia neuronas, genes que determinan los distintos ti-
pos celulares pancreticos, otros implicados en determinar los diferentes tipos
celulares de la hipfisis y un largo etctera. La activacin controlada de ge-
nes de diferenciacin en las clulas ES podra producir el tipo celular desea-
do para cada aplicacin. Un ejemplo prctico de esta aplicacin es la estimu-
lacin de la produccin in vitro de clulas troncales hematopoyticas a partir
de clulas ES de ratn por la sobreexpresin del factor de transcripcin
HoxB412. Alternativamente, se pueden exponer los cultivos a factores difusi-
bles capaces de instruir a las clulas sobre la va de diferenciacin a seguir.
Muchos de estos factores de crecimiento tienen ya aplicaciones teraputicas y
su utilizacin sera fcil y directa. Algunas de estas aproximaciones se han
aplicado ya con xito para dirigir la diferenciacin de clulas ES a determi-
nados linajes in vitro11.
El tercer problema sera que las clulas implantadas podran sufrir el mis-
mo tipo de rechazo inmune que se produce en el trasplante de rganos. Antes
de su utilizacin habra que establecer bancos de distintas lneas celulares com-
patibles con el sistema inmune de cada uno de los posibles receptores, una ta-
rea abordable con la tecnologa disponible en este momento, pero sin duda la-
boriosa. Una posibilidad en este contexto sera utilizar tcnicas de clonacin
por transferencia nuclear, mediante lo cual se pueden generar lneas de clulas
troncales personalizadas a partir de clulas somticas de cada individuo13. Esta
aproximacin se ha demostrado viable en animales de experimentacin y sera
la solucin definitiva al problema del rechazo.
COMBINACIN DE TERAPIA CELULAR Y TERAPIA GNICA POR

MUTAGNESIS DIRIGIDA: UNA VENTAJA TERAPUTICA DE
LAS CLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS?
En aquellos casos en que una poblacin celular determinada est daa-

61
da debido a un defecto gentico congnito o adquirido, el autotransplante,
simple o por clonacin, no sera eficaz. Por otro lado, el trasplante de clu-
las sanas ajenas planteara los problemas de rechazo antes mencionados. De
nuevo, el modelo experimental de ratn ofrece una posible solucin idnea
a este problema. La tecnologa de clulas ES en el ratn se ha explotado
fundamentalmente como una va para la produccin de animales modifica-
dos genticamente14,15. La repercusiones de esta aplicacin han sido, y se-
rn en el futuro, de gran importancia. Baste mencionar la disponibilidad de
modelos de ratn que reproducen patologas humanas como el cncer, la es-
clerosis mltiple o la diabetes, o el avance en el conocimiento sobre cmo
los genes determinan los distintos linajes celulares que componen el orga-
nismo. Gracias a esto, las tcnicas de modificacin dirigida del genoma del
ratn se han desarrollado enormemente, y en la actualidad permiten realizar
de manera "limpia" mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, sustitu-
ciones, translocaciones, inversiones, mutaciones inducibles etcEl poten-
cial teraputico de estas aproximaciones sera extraordinario en el caso de
que se pudieran aplicar a la reparacin del genoma en clulas ES humanas.
La reparacin gentica mediante estas tcnicas representara la terapia gni-
ca idnea, al reestablecer un genoma intacto, en lugar de aadir material
gentico de manera incontrolada. Este tipo de modificaciones genticas se
han realizado extensivamente en clulas ES de ratn, pero se pueden reali-
zar en cualquier lnea celular establecida. Sin embargo, por el momento, no
se ha tenido xito al intentar aplicarlas en clulas troncales humanas, ya sea
adultas o embrionarias. En caso de no conseguir aplicar estas tcnicas en
clulas troncales, existira un argumento aadido en favor de la utilizacin
de la clonacin teraputica, ya que se podra realizar la correccin gentica
en una lnea establecida de clulas somticas y utilizar sus ncleos como
donadores para obtener, primero blastocistos y luego clulas troncales co-
rregidas. En un experimento paradigmtico, que supera todas las limitacio-
nes previsibles a la aplicacin teraputica de las clulas ES16, se han com-
binado las diferentes aproximaciones mencionadas en este artculo para
sanar ratones inmunodeficientes a causa una mutacin en el gen Rag-2.
Mediante biopsia, se obtuvieron ncleos celulares de los ratones adultos in-
munodeficientes y, por trasplante nuclear, se clonaron blastocistos gentica-
mente idnticos al ratn original. Posteriormente, de estos blastocistos se
62 derivaron clulas ES y se corrigieron por modificacin dirigida, reparando
el defecto en el gen Rag-2. A continuacin, se utiliz una combinacin de
diferenciacin espontnea, y dirigida por el gen selector HoxB4, para obte-

ner in vitro clulas troncales hematopoyticas reparadas. Finalmente, se
trasplantaron las clulas obtenidas en los ratones deficientes en Rag-2, re-
constituyendo establemente un sistema inmune completamente sano.
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
En resumen, la disponibilidad de clulas ES humanas representa un gran
avance que proporciona accesibilidad ilimitada a tejidos especializados y a
su proceso de diferenciacin. De manera inmediata, representan un modelo
excelente para el estudio de los procesos de generacin de diversidad celular
en nuestro organismo y para la caracterizacin de frmacos que puedan diri-
girlos. Los resultados de los ensayos teraputicos realizados en animales mo-
delo permiten pensar en la aplicacin a corto/medio plazo de la tecnologa
de clulas troncales embrionarias en terapia humana. Una de las
perspectivas ms prometedoras en este campo es la combinacin
del uso de clulas troncales embrionarias con la reparacin gen- Figura 3. Esquema
mica dirigida, lo que representara la terapia gnica ideal. En cual- propuesto para la
aplicacin de nuevas
quier caso, existen limitaciones tcnicas a la aplicacin teraputica
estrategias en terapia
de las clulas troncales embrionarias que impiden determinar con
celular.
certeza qu enfermeda-
des se van a beneficiar
de las nuevas terapias y
en qu plazos. La com-
binacin de la tecnolo-
ga de clulas troncales
embrionarias con la clo-
nacin teraputica per-
mitir, al menos, elimi-
nar los problemas de
rechazo, y adems, pue-
de ser esencial para
conseguir la reparacin
genmica dirigida (Fi- 63
gura 3).
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Trasplante celular y terapia regenerativa con clulas madre
TRASPLANTE CELULAR Y TERAPIA REGENERATIVA

CON CLULAS MADRE
Felipe Prsper. Servicio de Hematologa y rea de Terapia Celular. Clnica Universitaria
Universidad de Navarra
Uno de los campos de la Medicina que ms expectativas ha

levantado en los ltimos aos es la terapia celular con
clulas madre. El aislamiento de clulas embrionarias
humanas, la aparente e inesperada potencialidad de las
clulas madre adultas y el desarrollo de la terapia gnica
nos lleva a imaginar un futuro esperanzador para un
importante nmero de enfermedades actualmente
incurables. A lo largo de las siguientes pginas vamos a
tratar de dibujar el panorama de la investigacin con
clulas madre, describiendo los principales logros en este
campo as como algunas de las preguntas pendientes de
responder. A pesar de las grandes expectativas, es
fundamental que mantengamos un espritu crtico y realista
a la hora de analizar los avances cientficos en este rea.
INTRODUCCIN
Las primeras evidencias cientficas de que en el organismo adulto existen

clulas madres proviene de experimentos realizados por Till y McCulloch a fi-
nales de los aos 50 centrados en las clulas madre hematopoyticas. Sin em-
bargo, la capacidad de regenerar tejidos en organismos adultos, e incluso de re-
generar organismos completos, como en el caso de planarias, se conoce desde
mucho antes. Clnicamente, hemos explotado la potencialidad de las clulas
madre adultas, concretamente de las clulas madre hematopoyticas, desde ha-
ce ms de 50 aos, y podemos afirmar que gracias al trasplante de mdula sea
(trasplante de clulas madre hematopoyticas) miles de pacientes han podido
ser curados de enfermedades incurables de otra forma. Aunque la forma ms
65
ampliamente utilizada de TC es el trasplante de progenitores hematopoyticos,
el trmino Terapia Celular (TC), en un sentido amplio, incluye cualquier tipo

de tratamiento que utiliza clulas como agente teraputico.
El inters por la utilizacin de las clulas madre, sin embargo, ha crecido
de forma exponencial en los ltimos aos a raz de la identificacin, caracteri-
zacin y aislamiento de las clulas madre embrionarias humanas1 y de las ex-
pectativas, de alguna forma prematuras, de que las clulas madre podran ser
capaces de curar innumerables enfermedades (enfermedades neurodegenerati-
vas, cardacas, endocrinolgicas, etc.) gracias a su enorme potencial de diferen-
ciacin. Desgraciadamente, el debate cientfico sobre las aplicaciones teraputi-
cas de las clulas madre, adultas o embrionarias, se ha transformado en un
debate poltico y meditico en detrimento del ambiente necesario que facilite el
progreso cientfico.
Quiz el mensaje ms importante que me gustara trasmitir es que, a pesar
de las enormes perspectivas que existen en relacin con las clulas madre, es
esencial que seamos capaces de trasmitir un sentimiento de prudencia y pacien-
cia a nuestros enfermos y colegas: las clulas madre pueden llegar a contribuir
al tratamiento de distintas enfermedades, pero estos avances no son esperables
a corto plazo. Solamente, la investigacin seria y continuada podr contribuir a
medio o largo plazo a determinar la utilidad teraputica real de las clulas ma-
dre adultas o embrionarias.
CLULAS MADRE
Una clula madre, o ms adecuadamente denominada troncal, es aqulla

que es capaz de dividirse indefinidamente y diferenciarse a distintos tipos de c-
lulas especializadas, no slo morfolgicamente sino tambin de forma funcio-
nal. Las clulas madre se pueden clasificar segn su capacidad de diferenciarse
a distintos tipos de tejidos o lo que es lo mismo segn su potencialidad: las c-
lulas madre totipotenciales son aquellas capaces de producir tanto tejido embrio-
nario, es decir, un embrin completo, como extraembrionario (placenta y anejos
placentarios). En sentido estricto, solamente los estadios iniciales del zigoto
constituiran clulas madre totipotenciales; las clulas madre pluripotenciales
son aqullas que tienen la capacidad de diferenciarse a cualquiera de los tejidos
66 existentes en un organismo adulto y, por tanto, tejidos procedentes de cualquiera
de las tres capas embrionarias incluyendo las clulas germinales; por ltimo, las
clulas madre multipotenciales seran capaces de diferenciarse a distintos tipos

celulares, pero siempre restringiendo su potencial a tejidos derivados de una
nica capa embrionaria, es decir, tejidos derivados mesodrmicos, ectodrmicos
o endodrmicos2. Desde el punto de vista de su origen dividimos a las clulas
troncales en embrionarias (derivan del embrion, bien del blastocisto o de la
cresta gonadal) y adultas (derivan de alguno de los tejidos adultos).
Clulas madre embrionarias
Las clulas madre embrionarias se han obtenido bien a partir de la masa

celular interna del blastocisto en el estadio de embrin preimplantatorio1, o
bien de las cresta gonadal3. Aunque las lneas de clulas embrionarias de ratn
se utilizan desde hace ms de 20 aos4, hasta 1998 no fue posible obtener clu-
las embrionarias humanas1,3. La posibilidad de obtener y utilizar teraputica-
mente las clulas embrionarias humanas ha disparado las expectativas de la te-
rapia celular con clulas madre.
Las clulas madre embrionarias son pluripotenciales, es decir, son capaces de
proliferar de forma continua sin diferenciarse, siendo prcticamente inmortales, y
adems son capaces de diferenciarse a cualquier tejido del organismo, incluyendo
tejidos somticos (corazn, hgado, hueso, pulmn, cerebro, etc.. y clulas germi-
nales (oocitos y espermatozoides), como se ha podido demostrar recientemente5-8.
Obviamente, la posibilidad de obtener cualquier tipo de tejido, y sin limitaciones
en cuanto a nmero de clulas, ha abierto expectativas de tratamiento de enferme-
dades tradicionalmente incurables (infarto de miocardio, enfermedades neurodege-
nerativas, enfermedad de Parkinson, diabetes y otras muchas).
Sin embargo, las clulas madre embrionarias tienen, a da de hoy, impor-
tantes limitaciones que, de momento, han hecho que no exista ningn estudio
clnico abierto en pacientes. Por una parte, la misma capacidad proliferativa de
estas clulas lleva a que en los distintos modelos animales en los que se han
utilizado, se detecte de forma invariable la produccin de tumores (teratomas y
teratocarcinomas). Con el objetivo de limitar este problema, diferentes grupos
han realizado estudios utilizando clulas embrionarias prediferenciadas con re-
sultados positivos. Junto a este problema, se encuentra el hecho de que el tras-
plante de clulas embrionarias se producira entre dos sujetos inmunolgica-
mente incompatibles, lo cual exigira la utilizacin de medicacin
67
inmunosupresora y los consiguientes efectos adversos. Aunque en este sentido,
la trasferencia nuclear, al menos tericamente, permitira eludir el problema de

histoincompatibilidad, desde el punto de vista econmico e incluso cientfico
no es una solucin viable hoy en da.
Clulas madre adultas
Se conoce desde hace muchos aos que distintos tejidos del organismo tienen
la capacidad de auto-regenerarse, gracias a la existencia de clulas madre residen-
tes en dichos tejidos. Estas clulas madre obtenidas de tejidos adultos poseen las
dos caractersticas de auto-renovacin y diferenciacin que hemos mencionado
anteriormente. Sin embargo, a diferencia de las clulas madre embrionarias, se
considera que su capacidad proliferativa y su potencial de diferenciacin es signi-
ficativamente menor9. Se han identificado clulas madre adultas en la mdula
sea, msculo esqueltico, epidermis, intestino, testculo, hgado, y de forma ms
reciente en tejidos como el sistema nervioso central o el corazn.
Las clulas madre adultas se consideran multipotenciales, es decir, capaces
de diferenciarse a un nmero limitado de tejidos, principalmente en funcin de
su origen embrionario (clulas de origen mesodrmico pueden diferenciarse a te-
jidos derivados mesodrmicos etc.). Sin embargo, cada vez parece ms evidente
que las clulas madre adultas son capaces de generar clulas maduras de tejidos
derivados de capas embrionarias distintas, siendo el caso ms tpico el de las c-
lulas madre hematopoyticas capaces de diferenciarse a hepatocitos, msculo
cardaco, endotelio o incluso a tejidos derivados de las tres capas embrionarias9-
12. Este fenmeno, denominado versatilidad o capacidad de transdiferenciacin
de las clulas madre adultas no est exento de controversia, ya que mientras al-
gunos estudios lo apoyan, otros trabajos recientes cuestionan la existencia de esta
capacidad de transdiferenciacin de las clulas, justificando algunos de los ha-
llazgos de versatilidad en funcin de fenmenos de fusin celular13,14 o incluso
cuestionando abiertamente los resultados experimentales15.
TERAPIA CELULAR CON CLULAS MADRE
A da de hoy, las aplicaciones clnicas de la terapia celular se limitan a las

68 clulas madre adultas. Es posible que en el futuro las clulas madre embriona-
rias se apliquen de forma teraputica, pero hoy en da las limitaciones que he-
mos mencionado anteriormente hacen inviable su utilizacin. Existen, sin em-

bargo, ensayos clnicos con clulas madre embrionarias previstos en un futuro
prximo.
Terapia celular en Endocrinologa
La prevalencia de la diabetes mellitus se est incrementado hasta adquirir

proporciones epidmicas en el mundo. Se estima que actualmente 100 millones
de personas padecen la enfermedad, debido a la incapacidad de las clulas
del pncreas de secretar insulina, hormona fundamental para el control de la
glucemia. En la actualidad, no existe un tratamiento curativo de la diabetes si-
no que el pronstico de los pacientes est supeditado al control de su glucemia
mediante el tratamiento sustitutivo.
Recientemente, los resultados positivos obtenidos mediante el trasplante
de islotes de pncreas en pacientes diabticos ha incrementado el inters por
utilizar clulas capaces de producir insulina. Mientras que el escaso nmero de
islotes, y la imposibilidad de expandir dichas clulas in vitro, impide que el
trasplante de islotes de cadver sea utilizable en un nmero importante de pa-
cientes, la posibilidad de utilizar clulas madre con capacidad de diferenciarse
en clulas productoras de insulina se planteara como una estrategia mucho
ms atractiva16.
En modelos experimentales, se ha podido demostrar que las clulas madre
embrionarias se pueden diferenciar a clulas secretoras de insulina y que cuan-
do estas clulas se implantan en el bazo de ratones, en los que previamente se
ha inducido una diabetes mediante la inyeccin de estreptozotozina, son capa-
ces de inducir una normalizacin de las cifras de glucosa. Uno de los principa-
les problemas para la utilizacin de clulas embrionarias es que en el proceso
de diferenciacin, adems de clulas productoras de insulina, se producen otros
tipos celulares diferentes, que habra que eliminar de forma previa a su utiliza-
cin17.
Aunque hasta el momento no ha sido posible caracterizar la clula madre
pancretica, distintos estudios sugieren el potencial de clulas obtenidas a par-
tir de hgado, conductos pancreticos o islotes pancreticos, o incluso clulas
de mdula sea para producir clulas secretoras de insulina18-19. En cualquier
caso, una de las principales limitaciones con cualquiera de los tipos celulares
69
descritos es que el porcentaje de clulas secretoras de insulina que se puede
obtener es muy pequeo, lo cual limita su aplicacin teraputica. A pesar del

enorme inters en esta rea de investigacin, no existe ningn estudio clnico
publicado utilizando clulas madre en pacientes con diabetes tipo I, aunque las
expectativas sean enormes.
Terapia celular en enfermedades neurolgicas
Las clulas madre tienen un enorme potencial como clulas capaces de re-
construir las neuronas y estructuras daadas en enfermedades como la enferme-
dad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrfica, enfermedad de Alzheimer, es-
clerosis en placas, infartos cerebrales o las lesiones medulares, por mencionar
algunas. El sistema nervioso central aade una dificultad adicional a la terapia
celular. Al ser un rgano con una sofisticada organizacin estructural, las clu-
las implantadas han de ser capaces no slo de injertarse, sino tambin de esta-
blecer nuevas conexiones sinpticas e integrarse con el resto del tejido circun-
dante.
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa
que afecta a ms del 2% de la poblacin mayor de 65 aos. Se caracteriza por
una degeneracin progresiva de las neuronas dopaminrgicas de la sustancia ne-
gra20 que origina la aparicin de los signos y sntomas caractersticos de la en-
fermedad. A pesar del tratamiento farmacolgico, la evolucin de la enfermedad
conlleva complicaciones motoras y psiquitricas que disminuyen la calidad de
vida de los pacientes y dificultan su manejo clnico. La utilizacin de clulas
con capacidad de sintetizar y liberar dopamina y restablecer los circuitos neuro-
nales daados se perfila como nuevas expectativas en el tratamiento de la EP21.
En la EP se han utilizado clulas de origen fetal en ensayos clnicos en humanos
con resultados cuando menos controvertidos22,23. Estudios in vitro e in vivo han
demostrado que tanto las clulas madre embrionarias como las adultas (clulas
madre de mdula sea, clulas madre neurales) son capaces de diferenciarse a
neuronas dopaminrgicas. Sin embargo, no est claro hasta que punto dichas c-
lulas son capaces de restablecer los circuitos neuronales destruidos en la EP y,
por tanto, eliminar los sntomas de la enfermedad.
Las lesiones medulares, principalmente secundarias a traumatismos, son
una de las causas ms frecuentes de patologa neurolgica en edades jvenes.
70 No existe un tratamiento curativo para esta enfermedad incapacitante, por lo
que la posibilidad de utilizar clulas madre para restablecer las conexiones axo-
nales aparece como una estrategia especialmente atractiva. Estudios recientes

sugieren que las clulas madre embrionarias poseen la capacidad de diferen-
ciarse a neuronas motoras y facilitar la recuperacin motora en animales con
lesiones espinales24,25. Sin embargo, parece que el mecanismo por el cual di-
chas clulas contribuyen a restablecer las neuronas motoras estara relacionado
con la liberacin de factores de crecimiento, que contribuiran al recrecimiento
de los axones destruidos. Otros tipos celulares, como las clulas de la gla en-
volvente o las clulas mesenquimales (o estromales) de la mdula sea tambin
han demostrado su capacidad para favorecer el recrecimiento de los axones tal
como se ha demostrado en modelos animales26-28.
La esclerosis mltiple es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada
por la degeneracin de las clulas productoras de mielina (oligodendrocitos) y
que se manifiesta por una afectacin tanto motora como sensitiva como conse-
cuencia de la desmielinizacin de los axones. La posibilidad de favorecer la
formacin de mielina mediante la utilizacin de clulas madre capaces de dife-
renciarse a oligodendrocitos ha sido explorada en modelos animales. Un estu-
dio reciente ha podido demostrar en un modelo de esclerosis mltiple en ratn
(ms concretamente de encefalitis autoinmune experimental), que la inyeccin
de neuroesferas (clulas madre neurales) tanto de forma intravenosa como in-
tratecal promueve la remielinizacin multifocal. Indudablemente, estos resulta-
dos estn muy lejos de justificar experimentos en pacientes, en una enferme-
dad, que aunque incapacitante, tiene una supervivencia prolongada29.
Por la gran incidencia y el elevado coste econmico y humano que gene-
ran, los accidentes cerebrovasculares son uno de los objetivos ms atractivos
para la terapia celular. Las evidencias recientes que indican la presencia de un
proceso de neurognesis tras producirse una isquemia cerebral han estimulado
el inters por utilizar clulas madre para suplementar la regeneracin autloga
que se produce espontneamente30,31. El beneficio de la terapia celular con c-
lulas madres podra deberse al aporte exgeno de clulas con capacidad de
neurognesis o de angiognesis, o debido a la modulacin del microambiente,
estimulando la supervivencia y diferenciacin de las clulas residentes en el te-
jido daado. El trasplante de clulas madre neurales en modelos de rata ha de-
mostrado ciertos beneficios y de hecho se han realizado pequeos estudios en
humanos utilizando neuronas obtenidas a partir de una lnea celular de terato-
carcinoma32-34. Estudios realizados en animales sugieren que las clulas de m-
71
dula sea son reclutadas a las zonas de infarto cerebral y que contribuyen a la
mejora funcional cuando son inyectadas focalmente e incluso intravenosamen-

te. La inyeccin de clulas se asocia con la formacin de nuevos vasos, libera-
cin de factores trficos as como con la expresin de marcadores neurales por
parte de las clulas implantadas.
No son estas las nicas enfermedades neurolgicas susceptibles de benefi-
ciarse de la terapia celular con clulas madre, pero si las ms frecuentes o las
que representan un paradigma, como es el caso de la enfermedad de Parkinson.
Terapia celular en enfermedades cardiovasculares
La cardiopata isqumica es una de las causas ms importantes de mortalidad

y morbilidad en el mundo occidental y un problema de salud pblica. Dentro de
sta, el infarto de miocardio tiene una especial trascendencia ya que el msculo
cardaco posee una limitada capacidad de regenerarse, por lo que la necrosis de
una regin lleva a la formacin de una cicatriz fibrosa. Dependiendo del rea a la
que afecte esta cicatriz, y debido a los mecanismos que condicionan el remodela-
do ventricular, el infarto puede llevar a una disminucin progresiva e irreversible
de la funcin cardiaca, que conduce al sndrome de la insuficiencia cardaca (IC).
La prevalencia de la IC en la poblacin general en EEUU o el Reino Unido es del
orden del 1% y si nos fijamos en los mayores de 75 aos oscila entre el 5 y
10%35. En los ltimos aos se han desarrollado nuevos tratamientos para la fase
aguda del infarto de miocardio (fibrinolisis, angioplastia primaria) que han tenido
un gran impacto en el pronstico de estos pacientes pero que, desgraciadamente,
no han conseguido detener la evolucin de la enfermedad que prosigue hasta el
desarrollo de la IC terminal. Para su tratamiento el nico recurso real del que dis-
ponemos en la prctica clnica es el trasplante cardiaco, cuyas limitaciones ms
importantes son la desproporcin entre el nmero de donantes y receptores poten-
ciales, as como la necesidad de tratamiento inmunosupresor de por vida.
La posibilidad de utilizar clulas madre para regenerar el msculo carda-
co destruido ha abierto enormes esperanzas para un nmero muy importante de
pacientes. Es probablemente en este campo donde la experiencia clnica es ma-
yor, habindose publicado en la actualidad ms de 20 ensayos clnicos de tera-
pia celular en pacientes con infarto de miocardio. Por limitaciones de espacio
nos limitaremos a detallar los tipos de clulas empleadas y algunos aspectos
72 concretos de los resultados obtenidos (se han publicado excelentes revisiones
recientes en este sentido)36-40.
Diversos estudios, inicialmente en modelos experimentales y posterior-

mente en humanos, han utilizado las clulas madre del msculo para regenerar
el msculo cardaco en pacientes con infarto de miocardio (mioblastos esquel-
ticos)41. La plasticidad de las clulas de msculo esqueltico junto con su capa-
cidad de responder a estmulos elctricos sugieren la posibilidad de que clulas
musculares individuales (mioblastos) puedan ser convertidos en fibras muscula-
res capaces de producir trabajo cardaco (cardiomioplastia celular)42. Los estu-
dios iniciales con mioblastos obtenidos de msculo esqueltico han permitido
determinar que dichas clulas son capaces de injertar en el corazn de animales
de experimentacin y contribuir a mejorar la funcin contractil del corazn 43
constituyendo la base de la aplicacin de esta tcnica en pacientes con infarto
de miocardio.
El grupo de Menasche ha sido pionero en la utilizacin de mioblastos es-
quelticos, realizando el primer implante de mioblastos autlogos en un pa-
cientes con un IM en junio del 200044. La estrategia diseada por este grupo, y
posteriormente utilizada por otros grupos, consiste en la obtencin de una biop-
sia muscular del propio paciente entre las 2-3 semanas previas a la ciruga de
revascularizacin en pacientes con IM antiguo. Durante la ciruga se procede al
implante por inyeccin intramiocrdica de las clulas cultivadas in vitro en la
regin peri-infarto. Los estudios realizados por el grupo de Menasche y por
nuestro grupo han permitido demostrar la seguridad del procedimiento y su efi-
cacia45,46. Otros grupos, de forma muy reciente, han utilizado una va de admi-
nistracin percutanea, evitando por tanto la necesidad de la ciruga47. Tanto los
estudios en modelos experimentales como los estudios clnicos indican la capa-
cidad de los mioblastos para implantarse y diferenciarse a clulas msculares
esquelticas, Sin embargo, no se ha podido demostrar que las clulas origina-
das a partir de los mioblastos sean capaces de trasmitir las seales electromec-
nicas derivadas de las clulas musculares cardiacas o de transdiferenciarse a
clulas musculares cardacas.
Estudios recientes apoyan la existencia de diferentes poblaciones celulares
en la mdula sea (MO) con capacidad de diferenciarse a fibras musculares
cardacas, as como a clulas endoteliales, contribuyendo a la angiognesis o
vasculognesis48-53. En la mayora de estos estudios los investigadores han uti-
lizado poblaciones celulares heterogneas, lo que limita de forma importante
las conclusiones, ya que no es posible determinar cules son exactamente las 73
clulas responsables del beneficio teraputico. Frente a estudios en los que se
han utilizado clulas mononucleadas de MO48, el grupo de Anversa y Orlic ha

utilizado poblaciones seleccionadas de clulas madre hematopoyticas de MO
(Lin- Kit+) demostrando la capacidad de dicha clulas de injertarse, diferen-
ciarse a clulas musculares cardacas y endoteliales y contribuir a la mejora de
la funcin cardaca.
Adems de las clulas madre hematopoyticas, en la mdula sea existen
progenitores y clulas madre angioblsticas, identificables por la presencia de
una serie de marcadores y antgenos celulares como CD34, AC133 o el recep-
tor de VEGR tipo 2, expresados a su vez en clulas madre hematopoyticas53-
57. Estudios realizados en modelos animales de isquemia perifrica e IM indi-
can que en la MO existen clulas madre endoteliales con capacidad de
contribuir a la neo-angiognesis, favoreciendo la regeneracin miocrdica49, 53,
58, 59. Estas clulas madre endoteliales pueden ser movilizadas a sangre perif-
rica y contribuir tambin a la angiognesis en extremidades isqumicas59.
Las clulas madre mesenquimales (MSC) son capaces de diferenciarse a
tejidos mesodrmicos como osteoblastos, condrocitos, adipocitos o msculo es-
queltico60 pero, a su vez, estudios recientes indican que las MSC son capaces
de diferenciarse tanto in vitro como in vivo a cardiomiocitos48, 61. In vitro, el
cultivo de MSC en presencia del agente desmetilante 5-azacitidina induce dife-
renciacin hacia clulas con caractersticas fenotpicas y electrofisiolgicas de
msculo cardaco62. Utilizando modelos animales de IM, varios grupos han de-
mostrado que las clulas madre mesenquimales inyectadas en la cicatriz mio-
crdica no slo son capaces de injertarse, sino que adquieren caractersticas de
cardiomiocitos y, lo que es ms importante, contribuyen a mejorar la funcin
cardaca48, 63.
A pesar del nmero de incgnitas existentes, la acumulacin de resultados
derivados de los estudios preclnicos en los ltimos 5 aos ha impulsado el de-
sarrollo de los primeros ensayos clnicos de factibilidad y seguridad de regene-
racin cardaca con clulas madre. Tales ensayos hasta el momento no han es-
tado desprovistos de cierto grado de controversia, derivada de la opinin de
distintos investigadores cuyo argumento es la falta de suficientes evidencias
que apoyen el inicio de la investigacin clnica. No vamos a detenernos en ar-
gumentar las distintas posturas, sino en poner en perspectiva los esfuerzos cl-
nicos realizados. Hasta el momento se han publicado al menos 20 estudios cl-
74 nicos en los que se han utilizado las vas percutnea, intracavitaria o
intramiocrdica, se han implantado clulas mononucleadas de mdula sea, c-
lulas enriquecidas en progenitores hematopoyticos o endoteliales o mioblastos

y los resultados se han monitorizado mediante tcnicas de imagen y funcin
como resonancia, ecocardiografia o tomografa con positrones. Algunos estu-
dios han utilizado pacientes controles con los que comparar los resultados entre
los pacientes que han recibido clulas y los que no, pero en cualquier caso to-
dos los pacientes han recibido adems de las clulas tratamientos adicionales.
La acumulacin de estos resultados apoya la continuidad de los estudios en
marcha y el desarrollo de nuevos ensayos clnicos.
Terapia celular en Oftalmologa
La visin, junto con los otros sentidos, provee la relacin con el mundo
exterior, y es de gran valor para la supervivencia de muchas especies animales
y tiene un gran valor para los hombres. A pesar de su importancia, slo en al-
gunas especies de anfibios se conserva una capacidad de regeneracin impor-
tante de los tejidos del ojo. Es, por tanto, de gran valor conocer en profundidad
los distintos tipos de clulas madre del ojo y sus mecanismos de renovacin y
regeneracin, para intentar terapias capaces de recuperar los distintos tejidos
oculares que se pueden daar. Las estructuras que tienen ms inters desde el
punto de vista de la Medicina Regenerativa son el epitelio corneal, el epitelio
conjuntival y la retina.
La fuente de clulas del epitelio corneal son las clulas madre que se en-
cuentran en la regin del limbo corneal. Estas clulas, que se encuentran en la
zona de transicin entre la crnea y la esclera, tienen todas las caractersticas
de las clulas madre, ya que poseen una gran capacidad de renovacin, que se
mantiene a lo largo de la vida y son capaces de originar clulas hijas que pue-
den sufrir un proceso de diferenciacin terminal a clulas especializadas (64).
Sin embargo, no se ha podido demostrar que estas clulas sean pluripotentes y
parece que slo dan lugar a clulas del epitelio corneal y conjuntival. Actual-
mente no existe un marcador biolgico definitivo de las clulas madre del lim-
bo corneal, aunque se han propuesto varios, como la alfa-enolasa, y ms re-
cientemente el factor de transcripcin p63, aunque ciertamente estos antgenos
pueden aparecer en otras clulas65.
En condiciones fisiolgicas, las clulas madre del limbo corneal son capa-
ces de suplir la necesidad de renovacin de la crnea. Sin embargo, en algunas
75
situaciones patolgicas, como traumatismos, quemaduras, sustancias qumicas,
sndrome de Stevens Johnson o penfigoide ocular, la capacidad de regeneracin

de las clulas limbocorneales se ve desbordada (o se produce una disminucin
o ausencia de stas) y se origina un dao corneal permanente66. Aunque el tras-
plante de crnea es una opcin, no es eficaz en los casos donde es necesario
restaurar el epitelio corneal. Kenyon y Tseng en 1989 fueron los primeros en
llevar a cabo un autotrasplante de limbo conjuntival67. Posteriormente, tras el
conocimiento de las clulas madre corneales, Kinoshita modific la tcnica pa-
ra transplantar clulas madre del limbo corneal en conejos.
Actualmente el trasplante de limbo corneal es una prctica reconocida,
usndose clulas del ojo contralateral cuando el dao es en un solo ojo, y clu-
las de un donante cuando el dao es bilateral. Se pueden usar clulas histocom-
patibles de un donante vivo, o clulas no compatibles de donantes cadver. La
posibilidad de expandir ex vivo estas clulas puede reducir el riesgo de defi-
ciencia de clulas del limbo del ojo sano o del donante68. La combinacin de
clulas del limbo con membrana amnitica se usa con xito para promover una
rpida reepitelizacin de la crnea. En espaa al menos 2 grupos de investiga-
cin (Vall d'Hebron y Clnica Universitaria) han implantado clulas madre lim-
bocorneales con xito en pacientes con insuficiencia limbocorneal completa,
resultando en la re-epitelizacin de la cornea con mejora de la agudeza visual
de los pacientes.
La retina neural y el epitelio pigmentario de la retina se desarrollan duran-
te el periodo postnatal temprano, y no hay evidencia de regeneracin en la
edad adulta. Ha sido ampliamente documentada la presencia de clulas madre
en la retina de peces y anfibios. Sin embargo, hasta el ao 2000 no se haban
identificado clulas progenitoras de la retina en mamferos. Estas clulas se en-
cuentran en muy baja frecuencia en la zona ciliar marginal y tienen muchas
propiedades asociadas con las clulas madre: son capaces de proliferar y expre-
san el marcador neuroectodrmico nestina, son multipotentes y pueden autorre-
novarse. La identificacin de clulas progenitoras de la retina abre la posibili-
dad de su uso para tratamiento en degeneraciones retinianas como la retinitis
pigmentosa, el glaucoma y la degeneracin macular. El xito del uso de clulas
madre retinianas para la regeneracin de la retina depende de la posibilidad de
restaurar los complejos circuitos establecidos en la retina, ya que aunque el en-
tendimiento actual de las conexiones dentro de la retina es muy importante, se
76 conoce menos como se controla el proceso que lleva a estas conexiones entre
las clulas.
Adems, se estn llevando a cabo estudios experimentales con otros tipos

de clulas madre, como clulas madre neurales, clulas madre embrionarias,
clulas madre derivadas de la mdula sea, etc., que tratan de confirmar el po-
tencial del trasplante de clulas madre en este contexto y contribuyen al cono-
cimiento de los mecanismos de diferenciacin y de integracin de las clulas
transplantadas en la retina, que conduzca a un adecuado procesamiento visual.
Terapia celular en enfermedades musculares
El msculo ha sido reconocido recientemente como otra importante fuente

de clulas madre adultas. Las clulas progenitoras musculares ms importantes
son las clulas satlite, que no slo contribuyen a la regeneracin de miofibras,
sino que se han demostrado capaces de diferenciarse en otras lneas celulares
como osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Si embargo, adems de las clulas
satlite, existen otras poblaciones de clulas madre en el msculo con un ma-
yor potencial de diferenciacin. El origen de estas clulas, bien existentes en el
msculo69 o procedentes de otros rganos como la mdula sea70, se desconoce
con precisin, pero en cualquier caso estas clulas seran las progenitoras de
las propias clulas satlite.
La mayora de las lesiones musculares son reparadas espontneamente,
sin que quede deterioro funcional, pero en algunas circunstancias, debido a la
importancia de la herida, sta no cura completamente y se forma tejido cicatri-
cial que impide la recuperacin funcional completa. En estos casos, la cura-
cin de la lesin podra ser mejorada aumentando la regeneracin de fibras
musculares e inhibiendo la fibrosis. El trasplante de clulas progenitoras mus-
culares podra curar esas importantes lesiones. Muchos de los esfuerzos de los
investigadores que trabajan en patologa muscular se centran en determinar la
forma de corregir miopatas congnitas tales como la distrofia muscular de
Duchenne, enfermedad caracterizada por la ausencia de expresin de distrofi-
na, una protena de membrana imprescindible para mantener la integridad es-
tructural de las miofibras. A lo largo de la vida del enfermo se produce una
destruccin crnica del tejido muscular y aunque, inicialmente, las clulas sa-
tlites son capaces de regenerar el msculo, progresivamente van agotando su
capacidad de proliferar. El objetivo del tratamiento sera conseguir clulas
musculares con genoma normal capaces de formar miofibras que se injerten y
77
regeneren el msculo atrofiado.
Se han utilizado modelos experimentales de enfermedad de Duchenne,

ms concretamente en ratones mdx1 (ratones transgnicos deficientes en dis-
trofina) para determinar la capacidad de distintos tipos de clulas madre de
contribuir a regenerar el msculo esqueltico. De forma anloga a la regene-
racin cardaca, los primeros estudios en modelos de distrofia muscular se
realizaron con mioblastos esquelticos, es decir, clulas progenitoras muscu-
lares. Aunque los resultados iniciales en los ao 90 no fueron positivos, per-
mitieron determinar una serie de aspectos como la importancia de la inmuno-
supresin y la forma de administracin de clulas que posteriormente han
sido de gran utilidad a la hora de disear estudios nuevos71. De forma ms
reciente, distintos grupos han utilizado otras fuentes de clulas madre con la
esperanza de poder utilizar una va sistmica de administracin 72, 73. En estos
estudios se ha podido demostrar que utilizando clulas obtenidas de mdula
sea de ratones, un pequeo nmero de clulas contribuyen a formar fibras
musculares con expresin de distrofina. A pesar de intentos posteriores, el
grado de contribucin de las clulas de mdula sea que se ha observado en
los distintos estudios hasta el da de hoy es muy escaso (menor del 1%). Una
de las principales limitaciones para el xito de la terapia celular en pacientes
con distrofias musculares es la escasa supervivencia de las clulas una vez
implantadas, a pesar de que el implante se realice directamente en el mscu-
lo74, asi como el hecho de que el tratamiento se tendra que realizar entre un
donante y un receptor no idnticos y, por tanto, supeditado a problemas de
rechazo inmunolgico.
Terapia celular en Traumatologa
El organismo tiene una importante capacidad de reconstruir los huesos,

cartlagos y tendones daados, gracias a la capacidad regenerativa de las clu-
las progenitoras presentes en las estructuras lesionadas. Por ahora estamos lejos
de conocer el origen y caractersticas fenotpicas de estas clulas progenitoras y
los factores que gobiernan la formacin y remodelacin de los huesos. A pesar
de este desconocimiento, ha sido posible la utilizacin de clulas maduras co-
mo forma de contribuir a la regeneracin de tejidos seos y cartilaginosos y,
concretamente, la utilizacin de clulas de cartlago cultivadas es un ejemplo
78 de cmo el autotrasplante de clulas maduras puede ser un tratamiento eficaz
para la reparacin de la superficie articular75.
Ms atractiva resulta la posibilidad de utilizar clulas madre con capacidad

de diferenciarse hacia tejidos de estirpe mesenquimal, como el hueso o el cart-
lago. Las clulas madre mesenquimales (MSC) se pueden obtener a partir de
mdula sea, pero tambin de grasa e incluso otros tejidos. Son capaces, in vi-
tro, de autorenovarse y proliferar extensamente, sin perder su capacidad de di-
ferenciarse hacia osteoblasto, condrocitos, adipocitos o incluso msculo esque-
ltico segn las condiciones en las que se cultivan. Estas cualidades han
permitido su utilizacin para la reparacin de lesiones seas extensas, normal-
mente utilizando algn tipo de soporte en la colocacin de las clulas. Igual-
mente, tambin se han utilizado para tratar defectos cartilaginosos y lesiones
traumticas, pudiendo sustituir a los injertos de condrocitos, con la ventaja de
su mayor capacidad proliferativa y de supervivencia, al no tratarse de clulas
maduras sino de progenitoras.
Tambin se han utilizado clulas mesenquimales en el tratamiento de ni-
os con osteognesis imperfecta76. En este estudio, los nios recibieron trata-
miento mediante trasplante alognico, pudiendo demostrarse a los meses del
trasplante un mejora muy significativa en la calidad y cantidad de tejido seo
formado y demostrando la capacidad de las clulas mesenquimales injertadas
de generar osteoblastos y sintetizar nueva matriz sea.
Terapia celular en enfermedades hepticas
Un nmero importante de enfermos hepticos puede curarse gracias al

trasplante heptico, que restituye un rgano enfermo por un rgano sano. De
igual forma que en otros tipos de trasplantes de rganos, las dificultades tcni-
cas junto con la escasez de rganos hacen que el nmero de pacientes que se
benefician de esta teraputica sea mucho menor que el nmero de potenciales
candidatos. La posibilidad de utilizar clulas madre de distintos orgenes, o in-
cluso hepatocitos maduros modificados genticamente, aparece como una alter-
nativa de gran inters. Vaya por delante que no existen en la actualidad estu-
dios clnicos de regeneracin heptica con clulas madre y tan slo se han
realizado algunos estudios clnicos utilizando el trasplante de hepatocitos con
escaso xito. Sin embargo, existen estudios experimentales que sugieren la po-
sibilidad de regenerar tejido heptico a partir de clulas madre.
Las clulas madre embrionarias tienen una indudable capacidad de dife-
79
renciarse en hepatocitos maduros in vitro; sin embargo, existen muy escasos
estudios in vivo que hayan podido demostrar la eficacia de las clulas embrio-
narias en la regeneracin heptica, existiendo adems el problema de la genera-
cin de tumores a partir de dichas clulas embrionarias77.
La posibilidad de regenerar tejido heptico con clulas madre hematopoyti-
cas se describi por primera vez por el grupo de Petersen78 en el que observaron
la contribucin de clulas de mdula sea a la regeneracin del hgado a travs
de la diferenciacin hacia clulas ovales. Utilizando un modelo de ratn transg-
nico anlogo a la tirosinemia humana tipo I, Lagasse demostr la capacidad de
las clulas madre hematopoyticas de rescatar animales con dicha enfermedad,
con la consiguiente implicacin clnica79. Aunque como ya hemos comentado no
existen estudios clnicos, s que existen observaciones en pacientes sometidos a
trasplante de mdula sea en los que se ha podido demostrar que clulas deriva-
das del donante son capaces de adquirir caractersticas de clulas hepticas, apo-
yando en humanos las observaciones de Lagasse y Petersen. La principal limita-
cin de estos estudios es que datos posteriores, obtenidos por diversos grupos de
investigacin, sugieren que la mayor parte de los fenmenos de regeneracin he-
ptica, observados a partir de clulas madre hematopoyticas, se deben realmente
a la capacidad de fusin de las clulas trasplantadas con los hepatocitos existen-
tes en el animal, y por tanto no a una autntica transdiferenciacin80. Aunque el
mecanismo que contribuye a la regeneracin de los hepatocitos es de indudable
inters desde el punto de vista biolgico, el hecho de que se trate de fusin celu-
lar o de autntica transdiferenciacin no disminuye su inters desde el punto de
vista clnico. Es decir, incluso en el caso de que las observaciones experimentales
de regeneracin heptica se debieran mayoritariamente a fusin celular, sera po-
sible que resultaran clnicamente beneficiosas en pacientes.
La existencia de un compartimento heptico de clulas madre ya se sugi-
ri hace mas de 40 aos81. Las clulas ovales fueron las primeras candidatas a
clulas madre hepticas. Localizadas en los canales de Hering, son clulas ma-
dre multipotenciales capaces de diferenciarse a hepatocitos as como a epitelio
ductal, y poseen algunos antgenos comunes con clulas de mdula sea. Sin
duda esta poblacin celular tiene cierta capacidad de regeneracin heptica, pe-
ro a da de hoy permanece sin definir si realmente su origen est en el hgado
o, por el contrario, derivan de clulas de la mdula sea.
Estudios recientemente publicados sugieren que una poblacin de clulas ma-
80 dre bien caracterizada, como las clulas madre mesenquimales, pueden contribuir a
la regeneracin heptica. Como hemos mencionado anteriormente, la principal fuen-
te de clulas madre mesenquimales es la mdula sea, si bien es posible derivar di-

chas clulas a partir de otros tejidos, como la grasa. Son clulas no hematopoyticas
de origen mesodrmico en las que, al menos in vitro, se ha podido demostrar su ca-
pacidad de diferenciarse a hepatocitos maduros y funcionales(82). El potencial in vivo
de esta poblacin de clulas madre no esta definido en la actualidad.
CONCLUSIONES
A lo largo de las paginas anteriores hemos tratado de presentar una pers-

pectiva general, quiz un poco superficial, de lo que la terapia celular y las c-
lulas madre podran representar en el futuro. No tenemos ninguna duda de que
las posibilidades son enormes, pero sin embargo es muy importante que sea-
mos conscientes de que estamos todava muy lejos de alcanzar el objetivo de
utilizar clnicamente esta nueva herramienta. Este es el mensaje ms importan-
te que queremos trasmitir: a pesar de las enormes expectativas que existen para
pacientes con enfermedades incurables, es imprescindible eludir el optimismo
exagerado y continuar desarrollando una investigacin de calidad cientfica que
nos permita alcanzar nuestros objetivos.
No sabemos si la terapia celular llegar a curar la diabetes o la enferme-
dad de Parkinson, pero si lo hace seguro que no ser en los prximos 5 aos,
ni con clulas madre adultas ni con clulas madre embrionarias. Los obstculos
existentes son enormes, y es responsabilidad de los mdicos e investigadores
no manipular ni trasmitir esperanzas errneas e infundadas a los pacientes, que
a la larga se volvern contra nosotros.
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87
Avances en terapia regenerativa
AVANCES EN TERAPIA REGENERATIVA

Mara Dolores Herreros Marcos, Isabel Pascual Miguelez, Jacobo Trbol Lpez,
Damin Garca Olmo
Ctedra UAM-CELLERIX de Terapia Celular y Medicina Regenerativa
Unidad de Terapia Celular del Hospital Universitario La Paz de Madrid
El trmino de clula madre se ha hecho tan popular dentro y

fuera del foro cientfico que, en ocasiones, puede parecer
que pierde credibilidad. Por esto es tan importante respetar
las normas del rigor cientfico, por un lado, y filtrar la
informacin que nos llega, por otro, de manera que nuestra
investigacin parta de una base completamente revisada.
En este artculo se ha realizado una actualizacin de la
literatura con dos objetivos: conocer cada uno de los tipos
de clulas madre existentes y las ventajas e inconvenientes
que presentan; saber cul es la aplicacin clnica en
humanos que tienen este tipo de clulas, basndonos en la
revisin de los ensayos clnicos en fase I y II publicados en
la literatura.
INTRODUCCIN
El trmino clula madre o clula troncal (stem cell) se utiliza para definir una
clula indiferenciada con capacidad de autorregeneracin que, a su vez, puede dar
lugar a diferentes lneas de clulas especializadas. Es decir, son clulas con capa-
cidad de divisin asimtrica (Fig. 1). Se describieron inicialmente en el embrin y
son el origen de todas las lneas celulares somticas y germinales que conforma-
rn el nuevo organismo (clulas madre embrionarias totipotenciales); desde el ao
2001 se estn describiendo clulas con caractersticas semejantes en diferentes te-
jidos del organismo adulto (clulas madre adultas) (Silvester et al 2004).
Se conoce como terapia celular al mtodo que intenta curar enfermedades 89
con el uso de clulas vivas. El concepto de Medicina Regenerativa sugiere la
posibilidad de obtener
Autorrenovacin en el laboratorio, a
partir de las clulas
madre, rganos con
todas sus funciones.
Sin embargo, existen
todava barreras im-
portantes en este cam-
Clula madre
po; algunas de ellas
son puramente tcni-
cas o de laboratorio
(desarrollo de mejores
Clula diferenciada procedimientos de se-
leccin y cultivo de
Figura 1. Representacin
clulas) y otras son las barreras que podramos llamar fisiopatol-
esquemtica del concepto
de reproduccin
gicas o mdicas (como la posibilidad de inmunotolerancia de las
asimtrica que caracteriza clulas. Salvar este problema de inmunotolerancia supondra poder
a las clulas madre. realizar trasplantes celulares alognicos sin necesidad de inmuno-
supresin).
En este artculo se intentar contestar a dos preguntas que resultan funda-
mentales para evaluar en qu momento se encuentra actualmente la terapia re-
generativa:
Qu tipo de clulas madre son mejores para el uso teraputico en humanos?
Cules son los ltimos avances en terapia regenerativa en humanos?
QU TIPO DE CLULAS MADRE SON MEJORES PARA EL USO

TERAPUTICO EN HUMANOS?
Las clulas madre embrionarias se obtienen a partir de un blastocisto. Una

vez aisladas de la masa celular interna del embrin en este estadio pueden
mantenerse en cultivo de forma indiferenciada porque se dividen indefinida-
mente. Tericamente podran constituir una fuente de progenitores de clulas
de las tres capas embrionarias: endodermo, ectodermo y mesodermo (clulas
90 pluripotenciales). Sin embargo, no pueden ser usadas en clnica al menos por
cuatro graves problemas: son cancergenas, generan problemas de histocompa-
tibilidad, requieren un gasto imposible de asumir para las patologas que se

pretenden tratar y plantean problemas ticos de gran complejidad.
Las clulas madre adultas se encuentran en tejidos rgano-especficos des-
pus del nacimiento. Al principio se pens que las clulas progenitoras existen-
tes en los tejidos adultos estaban predeterminadas para generar exclusivamente
un tipo de clula especializada de ese tejido. Por ello se las llam clulas mul-
tipotenciales. As, por ejemplo, las clulas progenitoras de las criptas intestina-
les solo podran formar clulas del epitelio intestinal. Sin embargo, en sucesi-
vos experimentos se ha comprobado que hay clulas madre en tejidos adultos
con capacidad de transdiferenciacin, es decir, que son capaces de dar lugar a
mltiples lneas celulares de las tres capas embrionarias. De esta manera, estas
clulas podran ser consideradas verdaderas clulas pluripotenciales. Un buen
ejemplo de ello es que a partir de clulas madre de la mdula sea se han obte-
nido lneas celulares como condrocitos, miocitos o neuronas (Conrad et al.
2005).
El uso de clulas autlogas (del mismo sujeto) o alognicas (de la misma
especie) obtenidas de sujetos adultos parece suponer un camino ms sencillo y
seguro para la terapia celular. Por ello hay que sealar que, hoy por hoy, el uso
de las clulas madre de origen embrionario est alejado de la clnica humana,
por lo que la nica fuente celular en la Medicina Regenerativa actual son los
tejidos del propio ser humano adulto. Actualmente hay cinco fuentes de clulas
madre de uso clnico: la mdula sea, la sangre perifrica, el cordn umbilical,
la biopsia muscular y la grasa (lipoaspirados). La siguiente cuestin es averi-
guar cul es el mejor tejido donante.
La capacidad de algunas clulas del estroma de la mdula sea para dife-
renciarse tambin en otras lneas celulares no hematopoyticas est hoy bien
documentada. Ha sido demostrado por varios autores (Pittenger et al 1999) que
estas clulas pueden diferenciarse in vitro evolucionando a osteoblastos, con-
drocitos o adipocitos en funcin de los factores de crecimiento que se utilicen
para estimularlas. Tambin es interesante la posibilidad de que estas clulas,
tras entrar en la circulacin, puedan migrar a otros lugares del cuerpo donde
pueden diferenciarse y reparar tejido daado. Puede que, en el futuro, el trata-
miento consista nicamente en usar citocinas para incrementar la salida a la
circulacin de las clulas madre de la mdula sea, tal y como han mostrado
resultados prometedores en modelos murinos (Orlic et al. 2003). Por otro lado,
91
no debe olvidarse que el uso de citocinas como factores estimulantes de colo-
nias se ha visto asociado a efectos secundarios que an hoy son difciles de

predecir. El problema es que para obtener poblaciones celulares de la mdula
sea es necesario realizar varias punciones bajo anestesia, que comportan mo-
lestias y riesgos.
Desde 1980 ha sido posible movilizar estas clulas a la sangre perifrica
donde pueden ser recogidas por afresis, un procedimiento que es ms prcti-
co, menos doloroso y asociado a menor riesgo que las punciones (Lewis et al.
2005). Por otro lado, se ha comunicado que las clulas madre procedentes de
sangre perifrica desarrollan el injerto de neutrfilos y plaquetas ms rpida-
mente reduciendo el riesgo de infeccin o hemorragia en el tratamiento de la
enfermedad hemato-oncolgica.
El transplante de clulas de cordn umbilical en adultos presentan las si-
guientes ventajas respecto a las derivadas de mdula sea (Chao et al. 2004): 1.
Fcil disponibilidad (se pueden tener en depsito perfectamente testadas y con
la tipificacin de HLA para su uso inmediato); 2. No existe riesgo para madres
y donantes; 3. Posibilidad escasa de transmitir infecciones, particularmente ci-
tomegalovirus; 4. Pocas posibilidades de desarrollar enfermedad de injerto con-
tra husped; 5. Criterios menos estrictos para el cruce de HLA; 6. El donante
no sufre una agresin. Este tratamiento se ha utilizado sobre todo en enferme-
dades hematolgicas como leucemia mieloide crnica, leucemia aguda o sn-
dromes mielodisplsicos. El transplante de clulas madre del cordn umbilical
expandidas ex vivo est todava en experimentacin.
El crecimiento y la regeneracin del msculo tras una agresin del mismo
denotan la existencia de clulas musculares progenitoras en este rgano (Jan-
kowski et al 2004). Se ha defendido la idea de que la miognesis es atribuible
a precursores musculares circulantes, habindose demostrado en algunos traba-
jos que esta labor la realizan clulas madre dependientes del msculo y tam-
bin de la mdula sea. Esta va sistmica todava se encuentra en investiga-
cin, ya que no se ha logrado evitar las prdidas celulares para conseguir que
las clulas cumplan su objetivo. En cualquier caso, la biopsia muscular se ha
mostrado como una buena fuente de clulas madre (Herreros et al 2003).
El tejido adiposo, como la MO, deriva de la hoja embrionaria mesodrmi-
ca y contiene estroma que puede ser aislado fcilmente. Aqu se han identifica-
do clulas madre denominadas clulas madre derivadas de lipoaspirado
92 (CMDL) (Zuk et al. 2001 y 2002). El proceso de aislamiento de esta poblacin
de clulas madre fue descrito por primera vez por Rodbell en 1964. Ms tarde
el procedimiento fue
mejorado por varios
grupos de investiga-
cin y, finalmente, las
clulas fueron caracte-
rizadas como clulas
madre por el equipo
de Hedrick del "Labo-
ratorio de Bioingenie-
ra y Reparacin Rege-
nerativa" del Servicio
de Ciruga de la Uni-
versidad de California
de Los ngeles (Zuk
et al. 2001).
Figura 2. Clulas
Estas clulas, al igual que las clulas madre mesenquimales de
mesenquimales
la MO, pueden evolucionar hacia lneas osteognicas, adipogni- procedentes de
cas, miognicas y condrognicas. Lo ms sorprendente es que tam- lipoaspirados en cultivo.
bin pueden diferenciarse en clulas de caractersticas neuronales
(Ashjian et al. 2003). Muestran una caracterizacin muy similar a
las derivadas de MO (CD29, CD44, CD71, CD90, CD13, CD105, SH-3 y
STRO-1) pero tambin algunos marcadores especficos (CD49d, CD106,
CD54, CD 34) (De Ugarte et al. 2003). No se han observado diferencias sig-
nificativas entre los dos tipos de clulas respecto a la adherencia estromal, el
crecimiento, la senescencia celular, la capacidad de diferenciarse en diferen-
tes lneas celulares y la eficiencia en la transduccin gentica (De Ugarte et
al. 2003). El proceso de obtencin se inicia con una liposuccin al paciente
que se realiza bajo anestesia local o sedacin. El lipoaspirado se somete a un
proceso de laboratorio mediante el cual se aslan las clulas adecuadas; stas
se cultivan a 37 C hasta que el crecimiento alcanza la subconfluencia (Fig.
2). En ese momento pueden emplearse teraputicamente o ser criopresevadas
para su uso posterior. Este mtodo presenta las siguientes ventajas respecto al
necesario para obtener clulas de mdula sea: 1. Es seguro; 2. La grasa es
un tejido de fcil acceso; 3. Es menos molesto y agresivo que las punciones
medulares; 4. Puede realizarse bajo anestesia local; 5. Las clulas pueden 93
criopreservarse (Mizuno et al. 2003).
Por todo esto, desde nuestro punto de vista de clnicos, las clulas madre
derivadas de lipoaspirado superan incluso a las de mdula sea a la hora de
utilizarlas en terapia humana. Como cirujanos, el mtodo de obtencin nos
resulta sencillo y cotidiano, pero puede ser igualmente alcanzable para cual-
quier especialista que cuente con un cirujano plstico o general en su centro
de trabajo.
Al revisar la literatura actual sobre las clulas madre derivadas de lipoas-
pirado, se observa que la mayora de los trabajos publicados se centran en su
caracterizacin en el laboratorio o en ensayos realizados en animales. De he-
cho, slo se ha comunicado un ensayo clnico realizado en humanos (Garca
Olmo et al. 2005). Esto significa que, a pesar de su manejabilidad y fcil ob-
tencin, el clnico todava no se ha acostumbrado a este tipo de clulas, posi-
blemente por desconocimiento o rutina.
Ahora bien, este modelo celular se est analizando ampliamente en mode-
los experimentales. Se han comunicado estudios en animales que utilizan
CMDL como vehculo de determinados genes. Dragoo y cols. (Dragoo et al.
2003, 2005) aislaron clulas madre derivadas de lipoaspirado de la grasa sub-
cutnea y de la almohadilla infrapatelar y las cultivaron en un medio osteog-
nico. La mitad de estas clulas fueron transfectadas con un adenovirus con el
cDNA para la protena morfogentica bsica (BMP-2). Las clulas, inmersas en
una matriz de colgeno I, fueron inyectadas en una pata trasera de ratones in-
munodeficientes; la otra pata fue inyectada con CMDL no modificadas genti-
camente. Tras 6 semanas se comprob que en la pata donde se inyectaron las
clulas transfectadas, el hueso tena una mineralizacin adecuada y comenzaba
a establecer la cavidad medular.
Por otro lado, Martinez-Estrada y cols. (Martinez-Estrada et al. 2005) con-
siguieron diferenciar CMDL en EPC (clulas progenitoras endoteliales postna-
tales) cultivndolas en un medio hematopoytico. El primer marcador que ex-
presaron fue Flk-1, y progresivamente Ve-caderina y factor de Von Willebrand.
Dado que el bajo nmero de EPC en la circulacin limita su uso en Medicina,
las CMDL pueden ser un gran apoyo.
Adems, es muy prometedor el efecto anti-inflamatorio que presentan las
CMDL. Se ha comparado (Puissant y cols. 2005) el efecto de las clulas madre
derivadas de mdula sea con las CMDL. Las CMDL no provocaron in vitro
94 "alorreactividad" frente a linfocitos incompatibles, es ms, lograron suprimir la
reaccin linfocitaria mixta (MLR) y la proliferacin linfocitaria como respuesta
a mitgenos. Cuando las CMDL y los linfocitos fueron separados por una
membrana permeable estos hallazgos no se repitieron, lo que hace pensar que
es necesario el contacto celular para desencadenar esta reaccin. Aqu surge
una nueva idea respecto a la posibilidad de utilizar estas clulas de manera alo-
gnica a partir de un banco de donantes.
En esta lnea, otro estudio (Aust et al 2004) investig el rendimiento celu-
lar por milmetro cbico de lipoaspirado y los marcadores de superficie que de-
terminan su fenotipo. Se recogi el producto de lipoaspirado de 18 donantes
mujeres, registrando su edad e ndice de masa corporal (BMI). El rendimiento
celular medio fue de 404.000206.000 clulas por milmetro de lipoaspirado,
de manera inversamente proporcional al BMI pero no a la edad. Las CMDL
eran positivas homogneamente para CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e,
CD59, CD90 y HLA-ABC; y homogneamente negativas para CD11b, CD45 y
HLA-DR. La ausencia del marcador panhematopoytico CD45 indica que las
clulas no derivaban de clulas madre circulantes. El hecho de obtener una po-
blacin tan homognea procedente de mltiples donantes refuerza tambin la
idea del empleo alognico en un futuro.
Por ltimo, Morizono y cols. (Morizono et al. 2003) examinaron la infec-
cin de las CMDL con vectores como adenovirus, oncoretrovirus y lentivirus,
demostrando la posibilidad de transfectarlas con lentivirus. Las clulas mantie-
nen la expresin transgnica tras diferenciarse en lneas adipognicas y osteo-
gnicas. As, las CMDL y un vector como el lentivirus pueden ser una buena
combinacin como vehculo de la terapia gnica.
Para utilizar las clulas en humanos se han desarrollando ensayos de biosegu-
ridad. Para llegar a realizar estudios en humanos las clulas se han sometido a es-
tudios de caracterizacin por inmunofluorescencia y de crecimiento. Existe un tra-
bajo en la literatura en el cual se ha comunicado que, tras mantenerlas en cultivos
durante mucho tiempo, las CMDL pueden experimentar una transformacin neo-
plsica capaz de desarrollar tumores en el ratn (Rubio et al. 2005). La posibili-
dad de transformacin neoplsica de CMDL humanas in vitro se vio en cultivos
en los que se permiti el crecimiento ms all de la subconfluencia, mantenindo-
los incluso ms de dos meses despus del aislamiento celular. En estas clulas se
demostr la transformacin neoplsica mediante el estudio del cariotipo, que con-
firm la existencia de cambios en el DNA. Se observ, adems, que eran clulas
de crecimiento anmalo o no controlado, capaces de desarrollar tumores al inocu-
95
larse en ratones inmunodeprimidos. Por otro lado, de manera paralela, se cultiva-
ron CMDL evitando el crecimiento ms all del 85% de confluencia celular. En

estas clulas tambin se estudi el cariotipo y se inocularon despus en ratones
deficientes, observndose ausencia de alteraciones en el DNA y de desarrollo de
tumores en los animales. sta es la razn por la cual nuestro grupo siempre ha uti-
lizado clulas del pase 3 o menor, antes de que las clulas lleguen a la subcon-
fluencia. No hemos observado ningn caso de reacciones de rechazo ni transfor-
macin tumoral. Por otro lado, la terapia con clulas madre derivadas de
lipoaspirado, que nuestro grupo utiliza en el tratamiento de fstulas en humanos,
se ha demostrado tan segura que ha sido aprobada por la Agencia Europea del
Medicamento (EMEA) para que este "producto" sea considerado un medicamento
hurfano ("orphan drug"). Adems, este ensayo clnico est registrado en Clinical-
trials.gov, ID: NCT00115466) para el tratamiento de la fstula perianal compleja.
CULES SON LOS LTIMOS AVANCES EN TERAPIA

REGENERATIVA EN HUMANOS?
El uso de clulas madre como terapia en humanos se est extendiendo r-

pidamente en distintos campos de la Medicina. Los grupos que investigaban las
enfermedades hematolgicas fueron pioneros al iniciar este camino. Actual-
mente, los onclogos trabajan en ntima colaboracin con los hematlogos para
tratar enfermedades proliferativas con stem cells. Se ha comunicado un estudio
en fase I/II sobre el tratamiento del cncer de ovario (Frickhofen et al. 2006).
Este tipo de tumor es quimiosensible, pero la mayora de los pacientes mueren
por la progresin del mismo. La quimioterapia cura el 25% de los pacientes,
por ello est justificado el tratamiento con altas dosis. Se incluyeron 48 pacien-
tes con cncer de ovario intratable realizndose una movilizacin de clulas de
sangre perifrica con ciclofosfamida y paclitaxel. Posteriormente las pacientes
se sometieron a dos ciclos de altas dosis de quimioterapia con carboplatino/pa-
clitaxel y carboplatino/melfalan/etoposido. A los 8 aos la supervivencia libre
de enfermedad fue de 13,3 meses y la supervivencia global de 37 meses.
La imposibilidad de regeneracin de los miocardiocitos en la enfermedad
isqumica supone el fallo cardaco congestivo postinfarto y el deterioro de la
funcin del ventrculo izquierdo. Tras demostrar que las clulas madre proce-
96 dentes de la mdula sea y de la sangre perifrica son capaces de evolucionar a
miocardiocitos bajo las condiciones adecuadas, se estn utilizando como tera-
pia de la cardiopata isqumica dentro de varios ensayos clnicos (Schachinger

et aml 2006) (Bardoff et al. 2006) (Emanueli et al. 2005) (Thorin-Trescases et
al. 2005). Este tratamiento parece reemplazar a los miocardiocitos, desarrollar
neoangiognesis y conseguir la remodelacin de la cicatriz. Tambin se ha
comparado el efecto de stem cells derivadas de mdula sea frente a las deriva-
das de sangre perifrica, asocindose a las primeras una mejora significativa
de la eyeccin del ventrculo izquierdo a los tres meses (Assmus et al. 2006).
Las grandes heridas de los quemados se presentan como otro ejemplo de
terapia celular. Gracias a clulas madre procedentes de la mdula sea se ha
conseguido una recuperacin precoz tanto de las reas quemadas, como de las
zonas donde se extrajeron los autoinjertos libres de piel (Rasulov et al. 2005).
Se ha comunicado el tratamiento satisfactorio de lceras del limbo ocular
en pacientes diabticos. Tras realizar una inyeccin en el limbo ocular de clu-
las madre derivadas de sangre perifrica en los pacientes del grupo de trata-
miento se encontr una tasa de cicatrizacin completa del 77,8% frente a un
38,9% de los pacientes tratados con placebo (Huang et al. 2005).
En casos severos de enfermedades autoinmunes se estn utilizando ciclos
de altas dosis de quimioterapia seguidos de transplante de clulas hematopoy-
ticas. Los estudios en fase I y II realizados en 473 pacientes mostraron una
mortalidad del 11% debido a una complicacin del transplante o a la progre-
sin de la enfermedad. El 71% de los pacientes respondieron a la terapia con
una franca mejora de la enfermedad (Gratwohl et al. 2005).
Una de las lneas de investigacin de nuestro equipo es el tratamiento de
fstulas en humanos con clulas madre derivadas de lipoaspirado. Hemos desa-
rrollado un estudio en fase I, con el objetivo de demostrar que la terapia es se-
gura y factible, y un estudio en fase II para conocer la eficacia.
Los resultados del estudio en fase I ya han sido comunicados (Garca-Ol-
mo et al. 2005). Se reclutaron cinco pacientes desde abril del 2002 a noviem-
bre del 2003, tres hombres y dos mujeres. Se realizaron nueve implantes celu-
lares, 4 en fstulas rectovaginales, 4 en fstulas enterocutneas (tres fstulas en
el mismo paciente) y uno en una fstula perianal supraesfinteriana. El segui-
miento mnimo exigido en el protocolo fue de 8 semanas. Finalmente se inocu-
laron con CMDL pase 3 o menor nueve fstulas de cuatro pacientes. Ocho de
las fstulas fueron consideradas como evaluables y fueron seguidas durante un
mnimo de ocho semanas (Tabla 1). Se logr ausencia de supuracin y el cierre 97
del orificio externo con reepitelizacin a la octava semana en seis fstulas
(75,0%); estos pacien-

tes se consideraron
curados. Las otras dos
fstulas slo mostra-
ron un cierre parcial
del orificio externo
con disminucin del
flujo, segn refirieron
los pacientes, pero
con ausencia de reepi-
telizacin. Estos dos
pacientes fueron con-
siderados no curados
(25,0%).
Actualmente se
han cumplido ms de
dos aos de segui-
miento en todos estos
pacientes y ninguno
de los considerados
curados ha presentado
una recidiva de la fs-
tula. No existi rela-
cin entre el nmero
de clulas inyectadas
y la reepitelizacin.
No existi relacin
entre el sexo y la
edad de los pacientes
y la curacin.
Los procedimien-
tos quirrgicos y de
Figura 3. Procedimiento
para el tratamiento de las
implantacin se realizaron de manera habitual y sin dificultades tc-
fstulas en el ensayo nicas aadidas debidas a la inyeccin celular de las nueve fstulas
98 clnico en fase I. tratadas (Fig. 3). No se observaron efectos adversos en ninguno de
los 9 implantes.
Tabla 1. Resumen de los resultados clnicos el fase I. NE, no evaluable; NI, no implantado
N N Tipo de N Das N clulas
implante paciente fstula pase cultivo (x106) Resultado
1 001 Rectovaginal 1 6 6.1 Curado
2 002 Enterocutanea 1 9 9.0 Curado
3 002 Enterocutanea 1 7 8.0 NA
NI 003 Perineal 1 NE NI NA
4 002 Rectovaginal 2 14 10.0 No curado
6 001 Rectovaginal 1 12 20.0 Curado
7 004 Enterocutanea 2 16 30.0 No Curado
8 005 Perineal 2 31 20.0 Curado
No se han observado efectos adversos a largo plazo ni aparicin de tumo-

res u otras enfermedades en los dos aos siguientes a la aplicacin de las clu-
las (Tabla 1).
Por otro lado, hemos concluido el ensayo clnico en fase II que analiza la
eficacia de la terapia con clulas madre derivadas de lipoaspirado para el trata-
miento de fstulas perianales complejas, que est pendiente de publicacin.
Para concluir, ha quedado claro que el tratamiento con clulas madre adul-
tas es una de las lneas de investigacin ms prometedoras actualmente. Lo
ms importante es la gran aplicacin clnica que posee, que esperamos que siga
desarrollndose a este ritmo casi vertiginoso, aunque siempre dentro de las nor-
mas de buena praxis clnica y siguiendo el mximo rigor cientfico.
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101
Nanobiotecnologa: herramientas diagnsticas y teraputicas
NANOBIOTECNOLOGA: HERRAMIENTAS
DIAGNSTICAS Y TERAPUTICAS
Laura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrnica (IMM-CNM). CSIC
La Nanobiotecnologa, convergencia entre la Nanotecnologa

y la Biotecnologa, es la rama de la Nanotecnologa que se
perfila como la de mayor impacto en un futuro prximo
debido a sus importantes aplicaciones, especialmente,
diagnsticas y teraputicas. La deteccin temprana de
enfermedades, su tratamiento precoz a nivel personalizado
y el posterior seguimiento de su evolucin sern posibles en
los prximos aos gracias a la aplicacin de las herramientas
nanobiotecnolgicas que se estn actualmente
desarrollando. Los importantes avances en este campo
podran dar lugar a sistemas de diagnstico y teraputicos
de mayor eficacia que los existentes, lo que redundara en
una mayor calidad de vida para los ciudadanos.
INTRODUCCIN: QUE ES LA NANOBIOTECNOLOGA?
Desde hace unos aos, la Nanotecnologa se esta perfilando como un rea

emergente en ciencia y tecnologa y todo indica que esta disciplina nos conducir
a una nueva revolucin industrial. La Nanotecnologa hace referencia a las tcni-
cas que permiten manipular la materia a escala atmica y molecular. Nano- signi-
fica la milmillonsima parte de un metro. Lo mas interesante de la Nanotecnolo-
ga no es la posibilidad de trabajar con materiales de reducidas dimensiones, sino
el cambio a menudo radical que sufren las propiedades fsicas y qumicas de la
materia cuando se trabaja a escala nanomtrica: la conductividad elctrica, el co-
lor, la resistencia, o la elasticidad, entre otras propiedades, se comportan de ma-
nera diferente a como lo hace el material volumtrico (ver Figura 1).
La Nanotecnologa tiene gran aplicacin en diferentes campos, entre los 103
que destacan los materiales, la electrnica, la Medicina y la energa. As, ya se
est avanzando en
conseguir materia-
les de mayor dure-
za y resistencia,
ordenadores ms
veloces y con ma-
yor capacidad gra-
cias a los micro-
procesadores con
componentes nano-
tecnolgicos, diag-
nsticos mdicos
ms eficaces o
energa abundante
a bajo coste y res-
Figura 1. Comparativa de petuosa con el me-
tamaos entre el mundo dio ambiente. Actualmente ya existen productos nanotecnolgicos
natural y el mundo artificial en el mercado como cosmticos ms eficaces y protectores, raquetas
desarrollado mediante
de tenis ms flexibles y resistentes o gafas que no se rayan, por citar
Micro y Nanotecnologa.
algunos ejemplos.
La irrupcin de la Nanotecnologa en la Biotecnologa y en la Medicina ha
dado lugar a una nueva disciplina que se denomina Nanobiotecnologa y que sin
duda constituir uno de los pilares bsicos de esta nueva revolucin industrial.
La Nanobiotecnologa se define como la aplicacin de herramientas, com-
ponentes y procesos de la Nanotecnologa al campo de la salud, lo que fre-
cuentemente se denomina tambin como Nanomedicina, permitiendo el desa-
rrollo de herramientas para diagnosticar, prevenir y tratar enfermedades cuando
estn todava en estados poco avanzados o en el inicio de su desarrollo. La Na-
nomedicina estudia interacciones a la nanoescala (1 a 100 nm) y para ello utili-
za dispositivos, sistemas y tecnologas que incluyen nanoestructuras capaces de
interactuar a escala molecular y que se interconectan a nivel micro para inte-
raccionar a nivel celular. Uno de los grandes retos en este proceso reside en el
desarrollo de nanoterapias, dirigidas especficamente a los tejidos y rganos
enfermos, evitndose daar a las clulas sanas circundantes.
104 En nuestro mundo industrializado se est observando un progresivo aumento
de graves enfermedades como el cncer, las enfermedades cardiovasculares, la
diabetes o las enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer y Parkinson), para

las que no existen tratamientos definitivos. Por otra parte, debido a la mayor cali-
dad de vida y al aumento de la esperanza de vida, hay un progresivo envejeci-
miento de la sociedad y una mayor incidencia de enfermedades crnicas, lo que
est significando un considerable aumento del gasto de la sanidad pblica.
Es evidente que necesitamos nuevos mtodos diagnsticos y teraputicos
que sean ms rpidos, eficaces y especficos que los actuales y que, adems,
reduzcan al mximo los costes de los anlisis y los servicios. La Nanomedicina
promete resolver algunos de estos grandes retos mediante la capacidad de de-
tectar de forma precoz la presencia de enfermedades (como el cncer) o la ca-
pacidad de regenerar los rganos y tejidos que estn daados dentro del orga-
nismo, proporcionado un diagnstico precoz, una terapia adecuada y un
seguimiento posterior efectivo de la evolucin del paciente. En un futuro prxi-
mo se podr incluso disponer de tratamientos individualizados a distancia en el
propio hogar o lugar de trabajo del paciente.
NANOMEDICINA
La Nanomedicina agrupa tres reas principales: el nanodiagnstico, la libera-

cin controlada de frmacos y la medicina regenerativa, tal como se detalla en la
Figura 2. El nanodiagnstico desarrolla sistemas de anlisis y de imagen para de-
tectar una enfermedad o un mal funcionamiento celular en los estadios ms tem-
pranos posibles tanto in vivo como in vitro. Los nanosistemas de liberacin de fr-
macos transportan los medicamentos slo a las clulas o zonas afectadas para
conseguir un tratamiento ms efectivo y con menos efectos secundarios
y, adems, protegiendo al frmaco de la degradacin antes de llegar a Figura 2. reas de
su destino. La medicina regenerativa pretende reparar o reemplazar te- investigacin en
Nanomedicina.
jidos y rganos daados aplicando
herramientas nanobiotecnolgicas.
A continuacin se detalla el
nivel de desarrollo que se ha con-
seguido hasta la fecha principal-
mente en el rea de nanodiagnsti-
co, as como las principales lineas
105
de investigacin futuras.
Nanodiagnstico
El objetivo del nanodiagnstico es identificar la aparicin de una enferme-

dad en sus primeros estadios a nivel celular o molecular e idealmente al nivel
de una sola clula, mediante la utilizacin de nanodispositivos (nanobiosenso-
res, biochips de ADN, laboratorios-en-un-chip, nanopinzas, nanosondas...). De
esta forma se conseguira una capacidad de respuesta ms rpida para comenzar
el tratamiento adecuado de cada enfermedad o bien de reparar o recrecer los te-
jidos y rganos daados, lo que ofrecera mayores posibilidades de curacin.
Los nanosistemas de diagnstico se pueden aplicar in vitro o in vivo. En
aplicaciones de diagnstico in vitro, los nanodispositivos son capaces de detec-
tar con gran rapidez, precisin y sensibilidad la presencia de patgenos o de-
fectos en el ADN a partir de volmenes muy reducidos de muestras de fluidos
corporales o de tejidos. En aplicaciones de diagnstico in vivo, se pueden desa-
rrollar dispositivos biocompatibles que, por ejemplo, puedan penetrar en el
cuerpo humano para identificar estadios iniciales de una enfermedad, identifi-
car y cuantificar la presencia de un determinado patgeno o de clulas cancer-
genas, etc.
La principal rea del nanodiagnstico son los nanobiosensores, dispositi-
vos capaces de detectar en tiempo real y con una alta sensibilidad y selectivi-
dad agentes qumicos y biolgicos.
Biosensores
Desde que en el ao 1962 surgi el primer concepto de biosensor (biosen-

sor de glucosa, Clark, 1962), el campo de investigacin sobre biosensores ha
ido creciendo de forma exponencial hasta convertirse en un rea fundamental
de trabajo. La masiva introduccin en el mercado de los biosensores de gluco-
sa, que son utilizados diariamente por miles de personas en todo el mundo, su-
puso la prueba ms concluyente de la utilidad de la tecnologa biosensora, al
ayudar a miles de enfermos diabticos a mantener una mejor calidad de vida.
Un biosensor se puede definir como un dispositivo compuesto por dos
elementos fundamentales: un receptor biolgico (por ejemplo protenas, ADN,
106 clulas,...) preparado para detectar especficamente una sustancia basado en la
gran especificidad de las interacciones biomoleculares y un transductor o sen-
sor, capaz de interpre-

tar la reaccin de reco-
nocimiento biolgico
que produce el receptor
y traducirla en una
seal cuantificable. En
la Fig. 3 se muestra el
esquema bsico de fun-
cionamiento de un bio-
sensor. Figura 3. Esquema del
Los dos constituyentes del biosensor estn integrados conjunta- funcionamiento de un
mente y es precisamente esta ntima unin de dos mundos opuestos biosensor.
(el vivo y el inerte) la que le confiere a los dispositivos biosen-
sores sus especiales caractersticas de sensibilidad y selectividad. Es frecuente
confundir el termino biosensor con un dispositivo que mide molculas biol-
gicas, cuando en realidad el nombre biosensor hace referencia a la parte re-
ceptora biolgica que lleva incorporada en su interior.
Adems de la sensibilidad y selectividad, una de las caractersticas funda-
mentales que hace atractivos a los biosensores es la posibilidad de realizar el
anlisis de la sustancia a determinar en tiempo real y de forma directa (sin nece-
sidad de marcador) a diferencia de cualquier anlisis biolgico o clnico que re-
quiere siempre un marcador (ya sea fluorescente o radioactivo). Estas dos carac-
tersticas le confieren a los biosensores la posibilidad de realizar no slo un
anlisis cualitativo (si/no) y cuantitativo, sino tambin la posibilidad de evaluar
la cintica de la interaccin (constante de afinidad, asociacin, disociacin,...) y,
por tanto, elucidar los mecanismos fundamentales de dicha interaccin. Las tc-
nicas de anlisis de laboratorio ms habituales, ya sea de sustancias qumicas o
biolgicas, suelen ser laboriosas, consumen mucho tiempo y en la mayora de la
ocasiones requieren personal especializado para su manejo. Frente a ellas los
biosensores ofrecen la posibilidad de hacer medidas directas, continuas, de for-
ma rpida y con alta sensibilidad. Adems, muchos biosensores ofrecen tambin
las ventajas del pequeo tamao y la portabilidad, lo que posibilita su utiliza-
cin en cualquier lugar, como el hogar o la consulta del mdico. Ello implica
tambin la necesidad de una cantidad de muestra para hacer el anlisis relativa-
mente baja (de micro a nanolitros), lo que es muy importante si se trata de an- 107
lisis de sangre o de ADN o si la muestra es cara o difcil de conseguir.
Son muchos los dispo-

sitivos biosensores que se
han desarrollado y muy va-
riados los mecanismos fsi-
co-qumicos de transduc-
cin que se han empleado
para traducir la interaccin
biolgica de la parte bio
en una seal cuantificable y
til para el usuario. La cla-
Figura 4. Algunos ejemplos
sificacin de los biosenso-
de nanobiosensores que se res viene impuesta tanto por la naturaleza de la biocapa receptora ele-
pueden emplear para el gida como por el tipo del transductor empleado. Para construir un
diagnstico precoz de biosensor se pueden usar diferentes componentes. Como elementos
enfermedades de una biolgicos receptores se pueden emplear enzimas, anticuerpos, recepto-
forma selectiva y con un
res proteicos, secuencias de oligonucletidos, fragmentos subcelulares
alto nivel de sensibilidad.
como mitocondrias, secciones de tejidos animales y vegetales, clulas
completas, etc. y como transductor dispositivos pticos, electroqumicos y meca-
no-acsticos, principalmente. La combinacin de las diversas capas receptoras con
los diferentes transductores ha dado lugar a una gran variedad de biosensores.
El trmino nanobiosensor designa a aquellos biosensores cuyas propie-
dades vienen moduladas por la escala nanotecnolgica con la que estn fabrica-
dos. Es de esperar que los nanobiosensores tengan una sensibilidad mucho ms
alta que la de los dispositivos biosensores convencionales y adems emplean
un menor cantidad de muestra. Por otra parte, podran ser fcilmente introduci-
dos en el interior del cuerpo humano, por lo que proporcionaran datos mucho
ms fiables del estado de salud de un paciente. Dentro de los incipientes desa-
rrollos de nanobiosensores son de destacar los nanobiosensores fotnicos, los
basados en nanopartculas de oro o magnticas, los nanobiosensores basados en
nanotubos de carbono o los biosensores nanomecnicos, que han surgido como
reemplazo de los biochips de ADN, entre los ms importantes (ver Fig. 4).
Biosensores basados en nanopartculas
108 Existen ya numerosos trabajos cientficos que han demostrado la posibili-

dad de detectar la aparicin de las primeras clulas cancerosas utilizando dife-
rentes tipos de nanopartculas.

Una de las ms utilizadas son
las llamadas puntos cunticos
(Quantum Dots), as denomi-
nadas porque su tamao nano-
mtrico provoca un efecto de
confinamiento cuntico en su
estructura (ver Figura 5). Los
puntos cunticos estn fabrica-
dos de material semiconductor
y contienen slo unos cientos
de tomos. Cuando son excita-
dos emiten luz en diferentes
longitudes de onda dependiendo de su tamao, por lo que son extre- Figura 5. Nanopartculas
madamente tiles como marcadores biolgicos. Los puntos cunticos con diferentes propiedades
de emisin segn su
ms empleados son los de CdSe, ya que son fciles de fabricar con el
tamao utilizadas en
tamao deseado mediante procesos qumicos, se pueden producir en
nanodiagnstico. Puede
gran variedad de colores, tienen una emisin excelente (mejor que los observarse el detalle de
marcadores fluorescentes habitualmente usados en biologa), y no se una nanopartcula obtenido
desestabilizan ya que son fotoestables. La emisin de fluorescencia mediante microscopia
de estos puntos cunticos es tan brillante que incluso es posible ob- electrnica (Foto cortesia
del Prof. L.Liz-Marzn,
servar una clula que contenga una nica de estas nanopartculas.
Univ. Vigo).
Hoy en da los puntos cunticos son comerciales y se ha demostra-
do ampliamente su utilidad para la localizacin de tumores en los pri-
meros estadios, lo cual significa que se podra proceder a su extirpacin inmediata.
Pero los puntos cunticos no funcionan por s mismos, es preciso indicar-
les cmo localizar el tumor y para ello hay que recubrir la superficie del punto
cuntico con molculas biolgicas (biorreceptores) con afinidad hacia un com-
puesto especfico de la clula cancerosa. Por ejemplo, hay ciertas protenas o
molculas que se encuentran en mayor proporcin en la superficie de las clu-
las cancerosas (como los receptores de cido flico o la hormona luteinizante)
y sto va asociado con cada tipo de cncer en particular. Cuando los puntos
cunticos recubiertos con el biorreceptor se acercan a una muestra que contiene
dicha protena, ambos se unen. Ahora se puede detectar la interaccin ilumi-
nando los nanocristales con luz ultravioleta y observando su emisin caracters- 109
tica. Hay ya numerosos ejemplos de como los puntos cunticos localizan clu-
las tumorales, como en el caso

del cncer de mama y de gan-
glios linfticos cancerosos. Has-
ta ahora, los experimentos se
han realizado con animales, pe-
ro se preve que una vez autori-
zado por las agencias de salud
correspondientes, estos ensayos
puedan realizarse en seres hu-
manos. La Figura 6 muestra un
ejemplo de tal localizacin.
Al igual que los puntos
cunticos, muchos otros tipos de
nanopartculas pueden usarse pa-
ra la localizacin de tumores, por
ejemplo nanopartculas metlicas
o magnticas. El paso primordial
es disponer del biorreceptor ade-
cuado a la enfermedad que se
pretende detectar y, sobre todo,
Figura 6. Funcionalizacin
ser capaces de recubrir adecuadamente estas nanopartculas con dicho
de puntos cunticos de
receptor que permita la localizacin de las clulas tumorales.
CdSe con biomarcadores
especficos a tumor de
Adems de para realizar un diagnstico, las nanopartculas tam-
prstata e inyeccin bin pueden usarse como mtodo teraputico. As, una vez que las
de los mismos para nanopartculas se unen a las clulas cancerosas, se puede inducir un
la localizacin precoz calentamiento de las mismas mediante un campo magntico de baja
de las primeras clulas intensidad. El calentamiento provoca la destruccin de las clulas tu-
cancerosas (comparacin
morales pero sin causar ningn dao a las clulas o tejidos sanos
entre un ratn enfermo
circundantes. Esta tecnologa para el tratamiento del cncer evitara
y sano).
los graves problemas de efectos secundarios de los actuales trata-
mientos de quimio o radioterapia.
Biosensores plasmnicos
110 El biosensor ptico ms conocido es el Biosensor de Resonancia de Plas-

mn Superficial (SPR), basado en la variacin de reflectividad de una capa me-
tlica en contacto con un

medio biolgico. El bio-
sensor SPR ha sido am-
pliamente desarrollado,
cientos de publicaciones
aparecen cada ao en la
literatura especializada y
numerosas compaias lo
comercializan en diferen-
tes versiones. Este sensor permite detectar de forma directa concen- Figura 7. (Izda.) Esquema
traciones en el rango nanomolar (o cambios de 10-5 en el ndice de de funcionamiento de un

2 biosensor de Resonancia
refraccin, o lo que es lo mismo 1pg/mm depositado en la superfi-
de Plasmn Superficial.
cie del sensor).
(Dcha.) Biosensor de SPR
En el sensor de resonancia de plasmn se deposita una capa comercial (SENSIA, S.L.).
metlica delgada (generalmente una capa de oro de 50 nm de espe-
sor) sobre una cristal. Excitando esta superficie en condiciones de reflexin in-
terna total se obtiene una resonancia para un cierto ngulo de incidencia de la
luz, resonancia que se manifiesta en una absorcin de la luz y, por tanto, un
mnimo agudo en la intensidad de la luz reflejada. La caracterstica ms intere-
sante de este efecto es que el ngulo de resonancia es muy sensible a cualquier
variacin que tenga lugar en la superficie metlica, como puede ser una inmu-
norreacin o cualquier otro tipo de interaccin biomolecular. La interaccin
biomolecular se detecta entonces como una variacin del ngulo de resonancia.
En la Fig. 7 se muestra el esquema de un sensor de SPR y su mecanismo de
funcionamiento.
Especial mencin merece el biosensor de SPR comercializado por Biacore
bajo diferentes modelos, que domina desde hace aos el mercado de los bio-
sensores pticos. Su nica desventaja es su elevado precio y su sofisticada ins-
trumentacin.
Biosensores nanofotnicos
Los biosensores nanofotnicos han demostrado un nivel de sensibilidad

extremo para la deteccin directa de protenas y ADN. En estos sensores (tam-
bin llamados de onda evanescente) se hace uso de la forma particular en que 111
se transmite la luz en el interior de los circuitos pticos: esta transmisin tiene
lugar a lo largo de la guia ptica mediante multiples reflexiones internas. A ca-

da reflexin, una componente de la luz, denominada onda evanescente, se pro-
paga en el medio que envuelve a la gua. La longitud de penetracin de la onda
evanescente es de unos cientos de nanometros y ofrece una oportunidad nica
e ideal para medir cualquier interaccin biomolecular que tenga lugar en su in-
terior. Con estos sensores es posible evaluar concentraciones de protenas a ni-
vel picomolar o variaciones de una nica base en el ADN en tan slo unos mi-
nutos, necesitando volmenes de muestra del orden de los microlitros y, en
algunas ocasiones, las muestras a analizar (orina, suero) no necesitan ni tan si-
quiera ser pretratadas.
Los nanosensores fotnicos tambin permiten la medida en el interior de
una nica clula de su estado metabolico. Para este fin existen nanosensores
que consisten en una fibra ptica muy afilada (su extremo final tiene solo 30-
50 nm) lo que le permite penetrar a travs de la membrana celular sin causar
ningn dao y sin alterar el funcionamiento normal de la clula. La fibra ptica
se biofuncionaliza con receptores especficos antes de su introduccin. Una vez
dentro, la nanosonda puede detectar especies qumicas y sealizar procesos
moleculares en localizaciones especificas del interior de la clula. La deteccin
se realiza a travs de la interaccin del campo evanescente de la luz que circu-
la por la fibra ptica con la interaccin biomolecular, debida al biorreceptor es-
pecfico anclado en la superficie del extremo final de la fibra. Con esta tcnica
se abre la posibilidad de identificar cambios patolgicos dentro de una clula
individual e incrementar nuestro conocimiento sobre las funciones celulares in
vivo como la divisin celular, la apoptosis, funcionamiento de las nanomqui-
nas biolgicas, etc....
Biosensores nanomecnicos
Otro tipo de nanobiosensor con grandes perspectivas en nanodiagnstico

son los biosensores nanomecnicos, que emplean como sistema de transduc-
cin la deflexin nanomtrica de una micropalanca o el desplazamiento de su
frecuencia de resonancia al interaccionar con el sistema biolgico. El cambio
en la posicin y movimiento de la micropalanca inducido por el reconoci-
miento molecular ocurre a escala de unos pocos nanometros y de aqu deriva
112 el nombre de biosensores nanomecnicos. La Figura 8 muestra las imge-
nes de algunos de estos sensores. Las micropalancas tienen un rea sensora
muy pequea (del or-

den de 1000 m 2 ) lo
cual permite el anli-
sis de cantidades de
sustancia inferiores al
femtomol. Adems, se
fabrican con tecnolo-
ga microelectrnica
estndar, lo que pro-
porciona produccin
en masa a bajo coste y
permite la fabricacin Figura 8. Biosensores
de miles de micropalancas en un mismo proceso, que podran ser nanomecnicos empleados
empleadas para la deteccin simultanea de miles de analitos de la en nanodiagnstico. Las
misma muestra. micropalancas se doblan
unos pocos nanmetros
cuando tiene lugar una
Sistemas laboratorio-en-un-chip
reaccin de
reconocimiento molecular
Desarrollos como los nanosensores fotnicos o los nanomecni- en su superficie. El
cos, fabricados a miles gracias a la tecnologa microelectrnica, nanobiosensor de matrices
abren un camino para la fabricacin de nanobiochips genmicos y de micropalancas puede
protemicos, que a diferencia de los actuales biochips, llevan incor- emplearse como biochip
de ADN o protemico
porado un sistema de transduccin de la interaccin (no se necesita-
segn la
ran marcadores fluorescentes) con los que sera posible conseguir
biofuncionalizacion (Foto
en muy poco tiempo una inmensa cantidad de informacin gentica cortesia de los Drs. K.
y protemica, lo que permitir elaborar vacunas, identificar mutacio- Zinoviev, J.A. Plaza, C.
nes indicativas de enfermedades, identificar nuevos frmacos, identi- Domnguez y L.M. Lechuga
ficar patgenos, etc...de forma mucho ms rpida que utilizando las del Centro Nacional de
tecnologas convencionales. Microelectrnica, CSIC).
Pero, a pesar de estos incipientes desarrollos, todava queda

mucho camino por recorrer y, cara al futuro, sera deseable contar con nano-
biosensores que cumplieran la mayora de los siguientes requisitos: robusto,
barato, posibilidad de multianalito, deteccin a niveles de pico/femtomolar o
incluso a nivel de una sola molcula, rpidos y directos, porttiles, de fcil
manejo por parte de personal no especializado, de multiuso o suficientemente 113
barato para ser de un nico uso. El trabajo futuro se encamina tanto al desa-
rrollo de nuevas estrategias de inmovilizacin y de proteccin, para permitir

biosensores completamente reversibles y regenerables y que puedan funcio-
nar in situ en muestras complejas (como es la sangre) y que sean biocompati-
bles para ser implantados in vivo. La inclusin de los nanodispositivos en el
interior del cuerpo humano preservando su funcionalidad ser un logro para-
digmtico en nanodiagnstico. Los nanobiosensores implantados podran fun-
cionar como centinelas dentro del cuerpo humano y emitir una seal de
alarma ante la aparicin de las primeras clulas enfermas. Ya se han obtenido
pequenos avances como pildoras con cmaras de imagen que pueden tragar-
se, sensores que pueden realizar medidas in vivo durante operaciones, etc.
sta ser sin duda una de las grandes reas de trabajo de la Nanomedicina en
los anos venideros (ver Figura 9).
La integracin en sistemas lab-on-a-chip ser otras de las reas funda-
mentales de trabajo, que permitir la descentralizacin de las medidas. El tr-
mino lab-on-a-chip (o laboratorio en un chip) describe el desarrollo de
plataformas integradas y miniaturizadas donde tienen lugar com-
Figura 9. Futuro de la plejas reacciones qumicas y bioqumicas. Estas plataformas se es-
utilizacin de
tn constituyendo como una tecnologa revolucionaria en el sector
nanobiosensores como
clnico. Las micro y nanotecnologas han proporcionado las herra-
sistemas de
nanodiagnstico mientas necesarias para llevar a cabo esta innovacin en el diag-
(Adaptado de General nstico molecular, al permitir la fabricacin e integracin de mi-
Electric). cro/nanobiosensores, microcanales, microactuadores, etc. en un
mismo chip micro-
electrnico. El uso
de estos dispositi-
vos aporta las ven-
tajas de rapidez en
el anlisis, reduci-
dos volmenes de
muestra, alto grado
de automatizacin
y su carcter port-
til y desechable.
Un simple mi-
114 crosistema con na-
nosensores incor-
porados podra ofrecer un diagnstico completo a partir de una gota de san-

gre mediante la identificacin (de otra manera imperceptible) de cambios
moleculares. Esto implica que los anlisis podran hacerse a domicilio. Cuan-
do se empiecen a reemplazar los caros y lentos anlisis de laboratorio por es-
tos anlisis de microchips ms baratos, rpidos y cmodos, el impacto en or-
ganizaciones sanitarias y sus pacientes ser tremendo. De momento, todava
no se cuenta con ningn desarrollo de microsistema biosensor que haya lle-
gado al mercado, pero numerosos laboratorios a nivel internacional trabajan
en esta direccin.
Liberacin controlada de frmacos
La segunda gran rea de actuacin de la Nanomedicina es el desarrollo de

sistemas de liberacin controlada de frmacos. Estos sistemas tienen como mi-
sin transportar el frmaco hasta el lugar donde debe ser liberado. Adems, los
frmacos necesitan ser protegidos durante su trnsito por el cuerpo hasta llegar
al lugar afectado, tanto para mantener intactas sus propiedades fsico-qumicas
como para proteger a las otras partes del cuerpo por las que viaja de
sus efectos adversos. Una vez que el frmaco llega a su destino, ne- Figura 10. Diferentes tipos
cesita liberarse a una velocidad apropiada para que sea efectivo. Este de nanosistemas que
proceso no siempre es ptimo con las medicinas actuales, por lo que pueden emplearse en la
la Nanomedicina est ofreciendo mtodos para mejorar tanto las ca- dosificacin de frmacos.
ractersticas de difusin del frma-
co como las de degradacin del
material encapsulante, permitiendo
que el frmaco se transporte de for-
ma mucho ms eficaz y que su li-
beracin sea igualmente ms con-
trolada. Para la administracin de
frmacos pueden emplearse diver-
sos tipos de nanoestructuras. Entre
ellas cabe destacar la utilizacin de
nanopartculas, nanocpsulas, den-
drmeros, liposomas, micelas, nano-
tubos, conjugados polimricos, etc. 115
(ver Figura 10).
Nanomedicina regenerativa
La Nanomedicina regenerativa es la tercera gran rea de la Nanomedicina

y es una de las reas ms emergentes. La Medicina regenerativa intenta la re-
paracin o reemplazamiento de tejidos y rganos enfermos o daados mediante
la aplicacin de mtodos procedentes de terapia gnica, terapia celular, dosifi-
cacin de sustancias biorregenerativas e ingeniera tisular, estimulando los pro-
pios mecanismos reparadores del cuerpo humano.
La ingeniera tisular intenta generar tejidos in vivo o in vitro, para lo cual ne-
cesita materiales biocompatibles que mimetizen respuestas celulares especficas a
nivel molecular. Gracias al desarrollo de las nanotecnologas, los materiales tie-
nen el potencial de interaccionar con componentes celulares, dirigir la prolifera-
cin y diferenciacin celular y la produccin y organizacin de la matriz extrace-
lular. Entre los materiales que se estn utilizando cabe destacar los nanotubos de
carbono, nanopartculas como nanohidroxiapatita o nanozircona, nanofibras de
polmeros biodegradables, nanocomposites, etc. Tambin se pueden utilizar su-
perficies con nanoestructuracin nanomtrica que acten como incubadoras de l-
neas celulares y que favorecen el proceso de diferenciacin celular.
Gracias a la Nanomedicina, las clulas madre pluripotenciales y los facto-
res de sealizacin sern componentes esenciales de implantes inteligentes y
multifuncionales que podrn reaccionar en funcin del microambiente que le
rodee y facilitar entonces la regeneracin del tejido daado de forma especifica
y en el mismo lugar.
Es de prever tambin que se puedan desarrollar nanoestructuras artificiales
que puedan detectar y reparar daos en el organismo, de la misma forma que
las nanoestructuras naturales lo hacen (por ejemplo los linfocitos de la sangre).
As, se ha propuesto de forma terica la fabricacin de unas nanoestructuras
para sustituir la hemoglobina, denominadas respirocitos. Los respirocitos son
clulas rojas nanofabricadas con una enorme capacidad para transportar oxge-
no y que pueden permitir pasar varias horas bajo el agua sin respirar. Segn los
clculos de su creador, con una inyeccin de respirocitos podramos vivir con
el corazn parado durante 4 horas o bucear durante 2,5 horas. Otros interesan-
tes desarrollos incluyen motores biomoleculares, interruptores moleculares o
116 nanoagujas que penetren en el nucleo de clulas vivas con un alto grado de
precisin para realizar cirugia celular.
CONCLUSIONES
La Nanobiotecnologa es un rea multidisciplinar que puede conllevar

grandes avances diagnsticos y teraputicos proporcionando nuevos mtodos
de diagnstico ms efectivos, mejores sistemas para la administracin de fr-
macos y nanoherramientas para la monitorizacin in situ de parmetros biol-
gicos y reparacin celular. Las nanoterapias, bien mediante la destruccin se-
lectiva de clulas daadas o infectadas o bien mediante la liberacin controlada
de frmacos en el lugar indicado, se perfilan como uno de los grandes avances
a lograr para mejorar la calidad de vida de nuestra sociedad.
El futuro nos deparara microchips implantables que administrarn los fr-
macos en dosis preprogramadas, frmacos que habrn sido elegidos a la carta
segn el perfil gentico de cada individuo gracias al uso de micro/nanochips de
ADN y que trasmitirn sus datos al hospital para tener controlado al paciente
mientras ste hace su vida normal. Ya existen chips subcutneos para medir de
forma continua parmetros cruciales como el pulso, la temperatura y la gluco-
sa, microsensores pticos que se implantan en los tejidos subdrmicos para me-
dir la circulacin en los tejidos despus de una operacin o sensores MEMS
que miden la presin, aceleracin, velocidad y parmetros relacionados en pul-
mones paralizados y que ayudan en el diseo de pulmones artificiales. Ya se
estn fabricando dispositivos laboratorio-en-un-chip y se estn realizando en-
sayos clnicos para liberacin de frmacos con productos nanotecnolgicos. Sin
embargo, los largos procesos de aprobacin en los sectores mdicos y farma-
cuticos pueden significar que los beneficios para la salud solo podrn apre-
ciarse dentro de muchos aos. Aunque quedan muchos problemas por superar,
no hay duda de que la Nanobiotecnologa nos deparar grandes avances que re-
dundarn en una mejora de la calidad de vida de nuestra envejecida sociedad y
que ayudar a vencer a las principales enfermedades (cncer, desrdenes neu-
rodegenerativos y enfermedades cardiovasculares) de nuestro entorno.
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118
Vectores de transferencia en terapia gnica
VECTORES DE TRANSFERENCIA
EN TERAPIA GNICA
Jess M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones Onclogicas
INTRODUCCIN
El concepto de terapia gnica, definida como la introduccin de material

gentico en una clula con el propsito de aliviar o eliminar un proceso patol-
gico, surgi a nivel ideolgico a mediados de los aos 60, incluso antes del de-
sarrollo de la tecnologa del DNA recombinante. Su apoyo experimental co-
menz en los 80 con la aparicin de los vectores retrovirales. Las primeras
demostraciones in vitro de la potencialidad de esta nueva tecnologa generaron
un optimismo desmesurado en la comunidad cientfica que ha provocado, a lo
largo de poco ms de una dcada, el establecimiento de ms de un millar de
ensayos clnicos. Sin embargo, la euforia inicial se ha traducido en prudencia e,
incluso en cierto escepticismo en algunos sectores, al no cumplirse las expecta-
tivas temporales de evolucin y consecucin de resultados. El fallecimiento de
un joven paciente implicado en uno de estos programas, junto con la aparicin
inesperada de varios casos de leucemia inducida tras la integracin del trans-
gen, ha provocado una dura crtica al desarrollo que se est produciendo en es-
te campo. En contraposicin, comienzan a obtenerse las primeras evidencias de
xito terapetico, adems de acumularse datos experimentales prometedores.
119
Por otra parte, la baja toxicidad de los tratamientos y las grandes posibilidades
an por desarrollar, siguen justificando, e incitando, un continuo avance en este

apasionante campo de la investigacin biotecnolgica.
El cuello de botella del desarrollo de la terapia gnica se encuentra en la
obtencin de sistemas eficaces de transferencia gnica. Hasta el momento,
existe una gran variedad de vectores que presentan diversas ventajas e inconve-
nientes, pero ninguno de ellos alcanza el nivel de calidad requerido para que la
terapia gnica obtenga la madurez que le permita ser una alternativa real y
competitiva frente a las terapias tradicionales. La potencialidad sigue siendo
desmesurada. El conocimiento de la totalidad de nuestro material gentico, co-
mo resultado de la finalizacin del proyecto Genoma Humano, abre unas ex-
pectativas ilimitadas. Por ello, necesitamos que los vehculos de transporte del
material gentico se desarrollen suficientemente, de modo que permitan la uti-
lizacin de los genes como nuevos agentes farmacolgicos y se posibilite su
explotacin terapetica.
El objetivo de este trabajo es dar una idea general del estado en el que se
encuentra actualmente el campo del diseo y desarrollo de vectores de transfe-
rencia gnica con aplicacin terapetica. Antes de comenzar conviene recordar
que estamos tratando con un concepto terapetico global, ya que cualquier c-
lula puede ser el objetivo del tratamiento. Adems, la aplicacin terapetica de
material gentico es potencialmente ilimitada, puesto que va ms all de la re-
paracin, sustitucin o compensacin de una alteracin gentica, permitiendo
su utilizacin como agente farmacolgico per se, incorporando nuevas activi-
dades en el organismo que permitiran tanto tratamientos de patologas sin da-
o gentico (enfermedades infecciosas, por ejemplo) como tratamientos pre-
ventivos (vacunas de DNA). Por lo tanto, la diversidad de situaciones en las
que se podra aplicar, justifica el desarrollo de una amplia diversidad de vecto-
res (el tratamiento de cada patologa puede requerir el diseo de un vector es-
pecfico). La obtencin de un vector universal con aplicacin generalizada es
una quimera, ya que diferentes enfermedades pueden tener requerimientos
opuestos. Sin embargo, s se pueden definir las caractersticas de un "vector
ideal" y adaptarlas posteriormente a situaciones concretas:
1. Que sea reproducible.
2. Que sea estable.
3. Que permita la insercin de material gentico sin restriccin de tamao.
120 4. Que alcance concentraciones elevadas (>108 partculas/ml).
5. Que permita la transduccin de clulas tanto en divisin como quiescentes.
6. Que posibilite la integracin especfica del gen terapetico.

7. Que reconozca y acte sobre clulas especficas.
8. Que la expresin del gen terapetico pueda ser regulada.
9. Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
10. Que pueda ser caracterizado completamente.
11. Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios.
12. Que sea fcil de producir y almacenar y a un coste razonable.
Los vectores son slo una parte, aunque fundamental, del sistema terapu-
tico. El sistema en s consta de dos componentes, el "vector" (vehculo de
transporte) y el "cargo" (material transportado). ste, a su vez, se puede subdi-
vidir en otros dos componentes: el "efector" (gen a introducir) y el "soporte"
(los elementos que condicionan su expresin).
El cargo suele ser una estructura de tipo plasmdico (ADN bicatenario y
circular) aunque puede ser de diversa naturaleza y complejidad, desde un sim-
ple oligonucletido hasta un cromosoma artificial, que permite incorporar una
cantidad elevada de material gentico con capacidad de perpetuacin en el
tiempo.
El efector que se utilice depender del efecto que se persiga. Si se preten-
de compensar, sustituir o reparar un gen daado, el efector ha de ser una copia
del gen intacto o un elemento que posibilite su reparacin. Si se pretende indu-
cir un efecto biolgico concreto (eliminar especficamente un tipo de clulas,
bloquear la expresin de un virus, inducir una respuesta inmune...), se pueden
introducir genes naturales que potencien dicho efecto o genes que originen
nuevas actividades que den lugar al efecto perseguido. Es el caso, por ejemplo,
de los genes suicida, que expresan enzimas procesadoras de pro-drogas, capa-
ces de convertir un sustrato inocuo (pro-droga) en una potente droga citotxica.
El sistema ms utilizado es el del gen de la timidina quinasa del virus Herpes
Simplex (HSV), que transforma el glanciclovir en su derivado txico, glanci-
clovir trifosfato. El producto txico es capaz de afectar, adems, a las clulas
adyacentes no transducidas, aumentando su eficacia por el denominado efecto
"bystander".
El soporte es la base para el control de la expresin del transgn e incluye
distintos tipos de elementos reguladores. El primero y fundamental es el pro-
motor, la zona de ADN anterior al gen donde se recluta la maquinaria de trans-
cripcin. La naturaleza del promotor condiciona el tipo de regulacin de la ex-
121
presin gnica. As, se pueden utilizar promotores constitutivamente activos o
Figura 1. Puntos clave

par regular la eficacia
de un vector promotores especficos, que slo son activos en un tipo celular concre-
de transferencia gnica. to. De la misma manera, se pueden emplear promotores inducibles, que
requieren la presencia de un elemento concreto para ejercer su funcin.
ste puede ser un agente de adiccin exgena (control externo) o un agente de-
terminado por caractersticas fisiolgicas especiales (por ejemplo, los promoto-
res sensibles a situaciones de hipoxia). Existen otros elementos del soporte de
diversa importancia, dependiendo de la funcionalidad perseguida. Entre ellos se
encuentran potenciadores y represores de los promotores, secuencias de aisla-
miento ("insulators") que impiden las influencias de secuencias reguladoras
prximas, secuencias de integracin (para permitir la inclusin del material
exgeno dentro del genoma de la clula hospedadora), secuencias de recombi-
nacin homloga (para permitir el intercambio de material gentico con el ge-
noma hospedador en una regin especfica), secuencias de empaquetamiento
(para introducir el material gentico en el interior de un vector viral), o secuen-
cias inmunoestimulantes (secuencias bacterianas del tipo islas CpG no metila-
das, que sirven como coadjuvantes en las vacunas de ADN).
Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material ge-
ntico transportado y de vencer todas las barreras biolgicas hasta alcanzar su
122 destino final, el ncleo de la clula diana, donde tiene lugar la regulacin gni-
ca. Tambin de ellos va a depender la va de administracin a utilizar. En la Fi-
Figura 2. Tipo de vectores

y proceso esquematizado
gura 1 se esquematizan las barreras ms importantes que el vector ha de obtencin.
de solventar en su camino hacia su destino funcional. Entre ellas se in-
cluyen la estabilidad en el medio extracelular (para evitar su eliminacin y de-
gradacin), el reconocimiento de la clula diana (generalmente mediante un re-
ceptor especfico), su unin a la membrana, su internalizacin en la clula
(normalmente utilizando un sistema de transporte vesicular como la endocito-
sis), el escape de los sistemas de degradacin intracelular (lisosomas) y su en-
trada final al ncleo, donde debe desmantelarse para permitir que el material
gentico que transporta gane acceso a su ubicacin final y a la maquinaria de
transcripcin.
Existen dos grandes grupos de vectores: virales y no-virales (Figura 2).
Los primeros incluyen todos aquellos que se han obtenido a partir de un virus,
tratando de eliminar sus caractersticas patolgicas y de adaptarlos a su nueva
funcin como transportadores de material gentico heterlogo. Pretenden apro-
vechar la ventaja que aportan los virus como vectores naturales, que han sufri-
do procesos de evolucin complejos a lo largo de millones de aos para opti-
mizar su funcin de introductores de material gentico en las clulas que 123
invaden. Los vectores no-virales siguen una estrategia opuesta, de sntesis en
lugar de modificacin. Parten de estructuras sencillas, conocidas, e intentan re-

construir desde la base un sistema completamente artificial que posibilite el
transporte efectivo de genes en el interior de una clula. Como resulta obvio,
las opciones son muy diversas, aunque todas ellas tienen en consideracin pun-
tos equivalentes, que han de resolver, en el intento de incorporar todos los ele-
mentos necesarios para la construccin de un sistema de transferencia efectivo.
Ambas estrategias tienen ventajas y desventajas que analizaremos a continua-
cin. Existen tambin algunos casos de vectores biolgicos no virales (bacte-
rianos) como portadores de genes teraputicos, alguno de ellos incluso en ensa-
yos clnicos (para ms informacin, visitar la base de datos de ensayos clnicos
en terapia gnica que facilita el portal de la revista Journal of Gene Medicine:
http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/), pero no van a ser analizados en este
documento.
VECTORES VIRALES
Los vectores de tipo viral son actualmente los ms efectivos, fueron los
primeros en utilizarse en ensayos clnicos a comienzos de 1990 y continan
siendo los ms utilizados en dichos ensayos. Los virus son, de hecho, sistemas
naturales de transferencia gentica. Para modificar un virus y transformarlo en
un vector con potencialidad teraputica, el primer paso es bloquear su capaci-
dad de propagacin eliminando los genes responsables de su replicacin. Nor-
malmente, se suelen establecer lneas celulares que incorporan parte del geno-
ma vrico y que permiten completar el ciclo reproductivo del virus, cuando son
transfectadas con plsmidos que introducen el material genmico complemen-
tario. Estas lneas celulares se denominan "empaquetadoras" y son las herra-
mientas de produccin de los vectores virales. El segundo paso en el proceso
de obtencin de un vector viral es la eliminacin de parte del genoma viral pa-
ra crear espacio donde introducir el material terapetico (gen o genes, ms los
elementos de control). Se han de eliminar genes que no sean esenciales y, espe-
cialmente, aquellos que puedan resultar txicos o perjudiciales para la clula a
tratar.
En general, los vectores virales presentan como ventaja su gran eficacia de
124 transferencia y la posibilidad, en algunos casos, de integrar el transgn en el
genoma de la clula husped. Sin embargo, arrastran importantes limitaciones
que incluyen su falta de especificidad celular en la mayora de los casos, la li-

mitacin del tamao en el material gentico a incorporar, debido a que han de
empaquetarlo en la cpsida, su elevada inmunogenicidad y, sobre todo, el ries-
go biolgico que conllevan (reconstitucin de partculas replicativas por re-
combinacin gentica y oncogenicidad inducida por integracin inespecfica).
De hecho, esto es lo que ha ocurrido en un reciente ensayo clnico, por otra
parte exitoso, de terapia compensatoria en una inmunodeficiencia congnita
tratada con vectores retrovirales portadores de una copia "sana" del gen daa-
do. En este ensayo, la insercin del transgn en el genoma del paciente gener,
en un par de casos, el desarrollo de una leucemia producida por su integracin
cerca del oncogn LMO2, provocando su activacin.
La lista de vectores virales es cada da ms amplia. Aqu solo se muestran
algunos de los ms representativos, y que estn siendo utilizados en ensayos
clnicos.
Vectores retrovirales
Los retrovirus son virus RNA con envuelta y fueron elegidos inicialmente
como prometedores vehculos de transferencia gnica debido a su elevada efi-
cacia de transduccin en un gran nmero de tipos celulares, a que son capaces
de integrarse de forma estable en el genoma de la clula que infectan, sin ex-
presar ninguna protena viral inmunognica, y a que son relativamente poco
patognicos, con populares excepciones como el virus del SIDA (HIV, Human
Immunodeficiency Virus). La mayora de ellos derivan del virus de la leucemia
murina (MuLV). El virus parental posee tres genes, gag, pol y env, que codifi-
can protenas responsables de la replicacin, encapsidacin, transcripcin re-
versa e infeccin. Estos tres genes pueden ser utilizados en trans (facilitados
por las clulas empaquetadoras), permitiendo la generacin de vectores que li-
mitan el genoma retroviral a la seal de empaquetamiento y las secuencias ter-
minales necesarias para la integracin (LTRs, Long Terminal Repeats). De esta
forma se minimiza el componente genmico viral y se maximiza la capacidad
de incorporacin de material gentico heterlogo, aunque el lmite sigue siendo
discreto, unas 7-8 kilobases (kb).
Su mayor limitacin reside en el hecho de que slo son capaces de trans-
ducir eficazmente clulas en divisin, ya que el acceso al ncleo del complejo
125
de preintegracin requiere la ruptura de la membrana nuclear. sto inicialmente
ha sido utilizado como una ventaja para el tratamiento de patologas oncolgi-

cas, generando un cierto grado de especificidad debido al elevado nivel de pro-
liferacin de las clulas transformadas. Sin embargo, limita grandemente su
utilizacin en sistemas tan atractivos como las clulas progenitoras, normal-
mente en estado quiescente. La utilizacin de vectores derivados de otro tipo
de retrovirus, los lentivirus (HIV, SIV...), que s son capaces de infectar e inte-
grarse en clulas quiescentes, abre nuevas posibilidades a estos vectores, aun-
que los riesgos inherentes al uso de los mismos han retrasado su utilizacin en
ensayos clnicos, habindose iniciado recientemente.
Un segundo tipo de inconvenientes reside en la poca estabilidad de las
partculas y su baja tasa relativa de produccin. Esto ha sido parcialmente re-
suelto mediante la sustitucin de la protena de la envuelta por la glicoprotena
G del virus de la estomatitis vesicular que posibilita la obtencin de ttulos de
hasta 109 p.i./ml y estabiliza las partculas. Adems, la utilizacin de clulas
empaquetadoras de origen humano produce vectores resistentes a la inactiva-
cin por complemento.
Finalmente, la carencia de especificidad celular inherente a estos virus
(poseen un rango de infectividad muy amplio) est tratando de resolverse me-
diante la utilizacin de vectores que poseen protenas quimricas en la envuel-
ta. Estas incorporan ligandos heterlogos o anticuerpos monocatenarios que ge-
neran nuevas especificidades y permiten transducir selectivamente una
poblacin celular.
Vectores adenovirales
Los adenovirus son virus DNA sin envuelta con un genoma bicatenario de
hasta 36 kb. Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtencin de vec-
tores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa ni originar tumo-
res en animales. Pueden transducir un nmero bastante amplio de tipos celula-
res distintos, tanto clulas en divisin como post-mitticas, con una eficacia
muy elevada. Sin embargo el genoma viral se mantiene epismico, lo que per-
mite solo una expresin gentica transitoria.
La primera generacin de vectores adenovirales se obtuvo mediante delec-
cin de la regin E1, que bloqueaba su capacidad replicativa y la E3, aparente-
126 mente no esencial. Sin embargo, posteriormente se demostr que la presencia
de E3 incrementaba significativamente la expresin del transgen y disminua la
respuesta inmune, por lo que volvi a introducirse en la segunda generacin de

vectores a expensas de otras regiones como la E4 o la E2A. En ambos casos, la
capacidad del vector para acomodar genes teraputicos no sobrepasaba los 7-8
kb, muy por debajo de la capacidad terica de las partculas originales. Recien-
temente, se ha conseguido eliminar la mayora del genoma viral manteniendo
slo las seales de empaquetamiento y las secuencias terminales (ITRs, Inver-
ted Terminal Repeats), rindiendo vectores con gran capacidad incorporadora
(hasta 35 kb) que se han denominado "vectores sin tripas" (gutless).
La eliminacin de material genmico viral no slo aumenta la capacidad
del vector, sino que disminuye tambin el riesgo de induccin de respuesta in-
mune. De hecho, ste es uno de los problemas ms graves de estos vectores, y
ha sido la causa del fallecimiento accidental mencionado anteriormente. La
mayora de la poblacin humana ha sido infectada en algn momento con ade-
novirus y presenta una respuesta inmunitaria inicial. Existen estrategias inmu-
nosupresoras transitorias y se estn tratando de desarrollar vectores adenovira-
les de origen animal (canino, bovino u ovino). Sin embargo, el problema se
mantiene sin resolver de una forma satisfactoria y el uso de vectores adenovi-
rales se reduce a aplicaciones unitarias.
Una de las mayores ventajas de estos vectores radica en su alta productivi-
dad, con ttulos de hasta 1010 p.i./ml, y su gran estabilidad, que les permiten
ser concentrados adicionalmente para alcanzar valores de 1012 p.i./ml. Esto,
junto con la posibilidad de transducir clulas quiescentes, les ha hecho muy
atractivos para la comunidad cientfica y son el segundo tipo de vectores en
frecuencia de utilizacin en ensayos clnicos.
Su falta de especificidad celular tambin ha sido compensada por el desa-
rrollo de estrategias de redireccionalidad: quimeras que introducen ligandos es-
pecficos en protenas de la cpsida y molculas biespecficas que reconocen
tanto la cpsida viral como el receptor seleccionado, para conferir un nuevo
tropismo celular.
Vectores basados en virus adenoasociados
Los virus adenoasociados son parvovirus humanos no patolgicos. Son pe-

queos virus sin envuelta con un genoma de DNA monocatenario, capaces de
infectar un gran nmero de clulas de origen diverso, tanto en divisin como 127
en su estado quiescente. A diferencia de los adenovirus, pueden integrarse en la
clula husped en una ubicacin especfica (el brazo q del cromosoma 19) eli-
minando la posibilidad de mutagnesis insercional. Otra ventaja adicional es la
carencia de respuesta inmune observada in vivo.
Sus mayores limitaciones se centran en su reducida capacidad de transpor-
te (unos 4.5 kb) y en su tediosa produccin, que requiere la presencia de virus
de apoyo (adenovirus o herpesvirus), dificiles de eliminar completamente. Una
complicacin adicional surgi al comprobar que la eliminacin de parte del ge-
noma viral para permitir la introduccin del transgn se tradujo en la prdida
de la capacidad de integracin especfica. Recintemente se ha descubierto que
la proteina Rep78, en presencia de los ITRs, es capaz de potenciar la integra-
cin especfica en el genoma celular y podra ser la clave que solucionara este
problema.
Finalmente, como hemos visto en los vectores anteriores, la falta de espe-
cificidad celular ha sido tambin tratada empleando la estrategia de molculas
biespecficas.
Tabla 1.
V. Retrovirales V. Adenovirales V. Adenoasociados
Caractersticas
Soporte gnico RNA lineal DNA lineal DNA lineal

bicatenario bicatenario monocatenario
Capacidad transportadora 7-8 kb Hasta 35 kb 4.5 kb
(gutless)
Inmunogenicidad Baja Elevada Baja
Eficacia de transfeccin Elevada Elevada Elevada
Dependencia del estado S No No
de divisin celular (excepto lentivirus)
Integracin del transgn S, aleatoria No S, especfica
Estabilidad Baja Elevada Elevada
Especificidad Baja Baja Baja
Otras Riesgo biolgico Limitado Elaboracin
128 (infect., mutag. a aplicaciones tediosa
insercional) reducidas
Vectores virales quimricos
Una opcin interesante, que cada da se est explotando con mas fre-
cuencia, es la combinacin de varios vectores para compensar las limitacio-
nes que presentan cada uno por separado, a la vez que se aprovechan las ven-
tajas ms destacables que aportan individualmente. Existen diversas
estrategias experimentales de estas quimeras, pero slo voy a mencionar, a t-
tulo de ejemplo, la quimera adenovirus-retrovirus. Consiste en la utilizacin
simultnea de dos tipos de vectores adenovirales: uno que incorpora la ma-
quinaria de empaquetamiento retroviral (gag, pol y env) y otro que introduce
el material gentico equivalente a un vector retroviral (LTRs, seal de empa-
quetamiento y material teraputico). Se aprovecha la elevada eficacia de
transduccin de los vectores adenovirales para cotransfectar con ambos vec-
tores, transformando las clulas dianas en clulas productoras de vectores re-
trovirales. Los vectores as generados son capaces de infectar las clulas ve-
cinas e integrarse en su genoma.
VECTORES NO-VIRALES
El concepto general aplicado al desarrollo de este tipo de vectores se ase-

meja ms al de los productos farmacuticos tradicionales. Se pretende mimeti-
zar el proceso natural de introduccin de material gentico en una clula hus-
ped, utilizando material sinttico y, por lo tanto, conocido y controlable. La
eficacia de estas nuevas "medicinas gnicas" depende de dos niveles de actua-
cin, el sistema de introduccin de los genes (el vector propiamente dicho) y el
sistema de regulacin de su expresin (el soporte). Ambos son fundamentales y
complementarios, pero aqu slo vamos a tratar el primero de ellos.
Los vectores no-virales presentan, en general, una eficacia inferior a la de
sus oponentes (no es fcil competir con sistemas desarrollados por la naturale-
za). Algunas caractersticas virales, como la capacidad de integracin en el ge-
noma husped, estn en proceso de desarrollo. Actualmente se est trabajando
en el empleo de transposones como "Sleepy Beauty", capaz de insertar transge-
nes en cromosomas de mamferos. La explotacin de estrategias alternativas,
que no requieren la integracin del transgn, para asegurar un efecto terapeti-
129
co estable, tambin favorece el desarrollo de estos vectores. Es el caso de los
mtodos de induccin de reparacin de DNA in situ, como la "quimeraplastia",

aunque su eficacia no est claramente establecida.
En cuanto a sus ventajas, destacan su facilidad de manipulacin, mayor
estabilidad, bioseguridad, gran capacidad transportadora, menor inmunogenici-
dad y especificidad celular, en algunos casos. Los tipos de vectores son muy
variados, pero pueden agruparse en categoras, que veremos a continuacin.
Mtodos fsicos
Se basan en la introduccin de DNA en la clula mediante la aplicacin de

un sistema mecnico o elctrico. Alguno de ellos est siendo utilizado en ensayos
clnicos, aunque presentan claras limitaciones, principalmente por su aplicacin
local y el nmero reducido de clulas que afectan. En esta categora se encuen-
tran la microinyeccin (introduccin de DNA en el ncleo celular mediante el
uso de una microaguja), bombardeo de partculas, popularmente conocido como
la "pistola gnica" (proyeccin de micropartculas metlicas recubiertas de DNA
mediante un sistema balstico impulsado por gas), electroporacin de bajo voltaje
(permeabilizacin transitoria de la membrana celular por aplicacin de pulsos
elctricos de alta frecuencia y bajo voltaje) e inyeccin intersticial de DNA des-
nudo. Este ltimo mtodo ha resultado especialmente efectivo en msculo.
Liposomas catinicos (Lipoplexes)
Buscando la similitud con otras formulaciones farmacuticas, y tratando de

aprovechar la experiencia acumulada en sistemas particulados de encapsulacin de
pequeos frmacos en vesculas lipdicas, se trat de aplicar la tecnologa de los lipo-
somas al transporte de cidos nucleicos. Aunque inicialmente se intent encapsular el
DNA en el interior de liposomas, el rendimiento fue pobre y la eficacia se incremen-
t considerablemente al cambiar los liposomas tradicionales por otros basados en l-
pidos catinicos. A diferencia de aqullos, el DNA interacciona con los grupos cati-
nicos de la superficie lamelar y no se incluyen en el interior vesicular. El xito de
este tipo de estrategias ha sido claro desde el principio y actualmente da cuenta del
mayor nmero de protocolos en ensayo clnico dentro de los vectores no virales.
Existe un nmero bastante elevado de estos lpidos tanto en explotacin co-
130 mo agentes de transfeccin como en desarrollo para su utilizacin como vectores
de transferencia en terapia gnica. Entre los ms populares se encuentran DOT-
MA (Lipofectin), DOTAP, DMRIE, DOGS (Transfectam), DOSPA (LipofectAMI-

NA) y DC-Colesterol. Presentan niveles de eficacia aceptablemente altos, una in-
munogenicidad casi nula, una capacidad de transporte de DNA sin restriccin de
tamao, gran estabilidad de almacenaje y sencillez de uso. Sin embargo, son dif-
ciles de caracterizar estructuralmente y no presentan especificidad celular, aunque
ambos puntos estn en desarrollo.
Los lpidos catinicos utilizados estn formados por estructuras anfiflicas,
compuestas de un dominio hidrofbico y una cabeza polar. La naturaleza de es-
ta ltima es la que marca la diferencia entre ellos. Los grupos catinicos ms
frecuentes son aminas cuaternarias y poliaminas (espermina, espermidina, polili-
sina...). Su eficacia de transfeccin depende, en la mayora de los casos, de la
presencia de un lpido neutro adicional, DOPE, que acta como "lpido de apo-
yo", posibilitando la fusogenicidad del liposoma y la entrada del DNA en el ci-
tosol. La compactacin del DNA con policationes, especialmente protamina, an-
Tabla 2.
M. Fsicos Lipoplexes Poliplexes Peptiplexes
Caractersticas
Soporte gnico Cualquiera Cualquiera Cualquiera Cualquiera

Capacidad transportadora Ilimitada Ilimitada Ilimitada Ilimitada
Inmunogenicidad Muy baja Muy baja Baja (en Baja (en
algunos casos) algunos casos)
Eficacia de transfeccin Elevada, pero Media Media Media
muy localizada
Dependencia del estado Relativa Relativa Relativa Relativa
de divisin celular
Integracin del transgn No No No No
Estabilidad Elevada Elevada Elevada Elevada
Especificidad Elevada Baja (con Elevada, en Elevada, en
(aplicacin local) excepciones) algunos casos algunos casos
Otras Aplicacin Experiencia Econmicos, Verstiles, 131
bastante limitada farmacolgica rel. controlables biodegradables
tes de la adiccin del liposoma ha supuesto un incremento importante en la

efectividad del sistema. Otras modificaciones interesantes incluyen la utilizacin
adicional de lpidos aninicos, que activan su capacidad fusognica en el micro-
ambiente cido del endosoma, la inclusin de ligandos o de anticuerpos para ge-
nerar especificidad celular y la optimizacin de formulaciones que eviten su op-
sonizacin, una de las principales limitaciones de su utilizacin in vivo.
Quimeras HVJ-liposomas (Virosomas)
Un concepto muy interesante, desarrollado por un grupo japons, es la ob-

tencin de liposomas quimricos por fusin con el virus hemaglutinante del Ja-
pn (HVJ), tambin llamado virus Sendai. La estrategia consiste en la encapsu-
lacin de complejos DNA-HMG1 en liposomas clsicos (fosfolpidos,
colesterol) y su fusin posterior con HVJ inactivado con luz ultravioleta. De
esta forma se combinan las ventajas del vector no viral con la capacidad de
unin celular y la fusogenicidad aportadas por las protenas de la envuelta vri-
ca. A diferencia de los vectores virales, esta nueva quimera resulta muy poco
inmunognica y permite administraciones repetidas.
Conjugados moleculares (Poliplexes)
Estos vectores se basan en molculas bifuncionales obtenidas por unin co-

valente entre un policatin, (polilisina), que posibilita la unin y condensacin
del DNA, y un ligando o anticuerpo monoclonal, que confiere especificidad celu-
lar. Estas molculas forman complejos con DNA de estructura definida (toroidal)
que permite su fcil captura por la clula, siguiendo una ruta endoctica mediada
por receptor. La ventaja ms clara del sistema es su especificidad. Sin embargo,
la mayor parte de los complejos que entran en los endosomas finalizan en los li-
sosomas, donde son degradados. Esta importante limitacin ha tratado de solu-
cionarse mediante la adiccin de reactivos que bloqueen la acidificacin del en-
dosoma (cloroquina, monensina, bafilomicina A1...) o la incorporacin de
actividades fusognicas que se activen con la disminucin del pH que tiene lugar
en el endosoma. Entre estos ltimos se incluyen adenovirus inactivados con pso-
ralen y luz UV (generan eficacias de transfeccin muy altas) y pptidos fusogni-
132 cos. Para su utilizacin in vivo se necesita la incorporaracin de esta nueva acti-
vidad en los complejos, en lugar de su utilizacin in trans.
Policationes (Poliplexes)
De nuevo, el carcter catinico es la directriz para el desarrollo de un vector

no viral. Este carcter permite, no slo la interaccin con el DNA (polianin), sino
tambin su condensacin y la interaccin de los complejos resultantes con las
membranas celulares, que poseen cargas negativas en su superficie. Para ello se
requiere que los complejos policatin-DNA sean electropositivos, lo que se consi-
gue con un exceso del policatin. Por tanto, la determinacin de la estequiometra
ptima es fundamental para obtener un buen rendimiento de transferencia gnica.
Los policationes ms desarrollados y de mayor eficacia en la actualidad
son los basados en polmeros ramificados. Entre ellos destacan los dendrmeros
de poliamidoaminas (PAMAM) y la polietilnimina (PEI). Los primeros son
estructuras esfricas con una arquitectura muy definida y controlable. La pre-
sencia de grupos protonables con diferentes pKs le confiere un carcter tampo-
nador que bloquea la acidificacin del endosoma, incrementando la eficacia de
escape al citosol. El fraccionamiento parcial del dendrmero, mediante la elimi-
nacin de alguna de sus ramificaciones, ha permitido una mejora sustancial del
vector. El dendrmero fracturado acta como una "esponja" en el interior del
endosoma, posibilitando una liberacin ms efectiva del DNA.
PEI es tambin una alternativa muy interesante. Comparte la funcionalidad
tamponadora de los dendrmeros y su coste de produccin es muy bajo. Sin
embargo, es de naturaleza polidispersa y ms difcil de caracterizar. Actual-
mente se ha conseguido introducir con xito diversos tipos de ligandos, que le
confieren selectividad celular.
Vectores de naturaleza peptdica (Peptiplexes)
Existe un grupo heterogneo de vectores que se basan en estructuras de

naturaleza peptdica. De ellos slo voy a mencionar dos tipos. El primero utili-
za protenas multidominio, basadas en el carcter modular de las toxinas bacte-
rianas. El concepto general es similar al de los conjugados moleculares, pero
con la ventaja de la utilizacin de tcnicas de ingeniera gentica. El sistema
incorpora, en una sola cadena peptdica, diferentes dominios estructurales, que
confieren actividades especficas necesarias para la eficiente introduccin de 133
DNA en las clulas dianas. Las protenas quimricas obtenidas poseen un do-
minio de reconocimiento y unin celular (ligando o anticuerpo monocatenario),

un dominio que posibilita el escape del endosoma (el dominio de translocacin
de la toxina) y un dominio de unin a DNA (especfico o inespecfico). Una de
las ventajas de este sistema es su versatilidad, que le permite la adaptacin a
requerimientos especficos mediante la simple sustitucin de un dominio. Sin
embargo, presenta limitaciones en cuanto a la expresin a gran escala de prote-
nas tan complejas, as como su posible inmunogenicidad.
El segundo tipo est basado en la utilizacin de una estrategia similar me-
diante el uso de pptidos modulares: la aplicacin de pptidos con funcionalida-
des especficas (unin a DNA, reconocimiento celular, fusognesis, tropismo nu-
clear...) como sillares estructurales. De esta forma, se permite el establecimiento
de complejos de tamao controlado (el mnimo posible) y de reducida inmunoge-
nicidad, que han permitido mejorar la eficacia de la transferencia gnica.
Para finalizar, slo quiero recordar que ste es un campo en continuo de-
sarrollo y evolucin, y que an quedan estrategias por explotar. Probablemente,
la solucin no se encuentre en ninguno de los vectores como se conocen en la
actualidad. La combinacin de varios de ellos se est empleando con xito en
algunos sistemas. En cualquier caso, cuantas ms alternativas se exploren, mas
cerca estaremos de la obtencin de un buen vector de transferencia.
En paralelo al desarrollo de vectores, los avances en el diseo del soporte
(promotores inducibles y especficos de tejido, secuencias reguladoras, aislan-
tes gnicos, sistemas de integracin, replicacin epismica en el husped...)
compensan y complementan a aqullos, permitiendo una evolucin integral del
sistema que posibilitar una mayor eficacia y una disminucin de sus limitacio-
nes. Mientras tanto, vamos conociendo con mayor detalle los mecanismos bio-
lgicos que permiten la introduccin de material gentico heterlogo en una
clula y eso repercutir positivamente en el diseo de las nuevas generaciones
de vectores.
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135
Terapia gnica en enfermedades monognicas y cncer
TERAPIA GNICA EN ENFERMEDADES

MONOGNICAS Y CNCER
Juan A. Bueren1 y Antonio Bernad2
1Divisin
de Hematopoyesis y Terapia Gnica. CIEMAT
2Departamento de Inmunologa y Oncologa
Centro Nacional de Biotecnologa. CSIC
INTRODUCCIN
Los avances en el campo de la gentica molecular estn teniendo una im-

portante repercusin en nuestra capacidad para comprender, diagnosticar, y tra-
tar una variedad
de enfermedades
congnitas y ad-
quiridas. As, la
posibilidad de in-
troducir genes en
clulas eucario-
tas ha permitido
dar comienzo a nuevos protocolos de marcado y de terapia gnica Figura 1. Modalidades
humana (TG), que no resultaban abordables hace unos pocos bsicas en las que se
fundamentan los protocolos
aos, y que en esencia se fundamentan en dos estrategias que se 137
de transferencia y terapia
recogen en la Figura 1.
gnica.
En trminos tericos existen dos posibilidades tcnicas para realizar TG.

En primer lugar, podramos plantear una "terapia de sustitucin" en la que el
gen afectado (mutado) fuese sustituido por una versin correcta. Esta aproxi-
macin sera perfecta, puesto que el gen introducido se encontrara en su entor-
no natural y bajo los sistemas de control/regulacin de la expresin fisiolgica.
Sin embargo, debido fundamentalmente al bajo ndice de recombinacin hom-
loga demostrada en las clulas eucariticas (incluidas las de mamfero), sta
aproximacin no se plantea en trminos prcticos, aunque muchos grupos de
investigacin trabajan activamente en el desarrollo de procedimientos para au-
mentar dicho fenmeno (Li J. y Baker M.D., 2000), y se han comunicado algu-
nos intentos con xito (Hatada et al. 2000). En segundo lugar nos encontramos
con la denominada "terapia de adicin", que pretende introducir una construc-
cin de diseo que permita aportar la funcin gnica afectada, generar un cir-
cuito secundario que incida sobre las vas afectadas o promueva una respuesta
fisiolgica que elimine las clulas malignas o defectivas. La mayora de los
protocolos en desarrollo actualmente utilizan esta alternativa, combinando un
sinfn de posibilidades tcnicas que vienen principalmente determinadas por el
tipo de afeccin con la que se enfrenta el equipo de investigacin. El resumen
de la experiencia acumulada hasta el momento indica que no existe una frmu-
la universal de TG. Cada patologa, y por ende cada tipo celular afectado e in-
cluso cada paciente, tiene ms posibilidades de xito con un determinado pro-
cedimiento que con otro, y esto es necesario probarlo en la arena clnica.
En esencia, el proceso de TG se puede realizarse tanto in vivo (inoculando el
vector de transferencia en el paciente), como in vitro. En este caso, la transferencia
gnica se realiza sobre clulas extradas del paciente, las cuales, una vez modifica-
das genticamente, sern reinoculadas en l mismo. En general, los vectores de
transferencia actuales presentan una eficacia de transduccin notablemente superior
cuando stos se utilizan in vitro sobre las clulas diana a transducir, frente a cuando
stos se inoculan in vivo. Por ello, una gran parte de los protocolos actuales de TG
tienen su fundamento en la obtencin, transduccin y reinfusin de las clulas
transducidas. A pesar de ello, los vectores adenovirales, y en menor medida los re-
trovirales, se han comenzado a utilizar in vivo en protocolos de terapia gnica anti-
tumoral, mediante inoculaciones directas en la masa tumoral del paciente.
138 La revista Journal of Gene Medicine ha reportado que a finales del ao

2005 estaban en marcha un total de 678 ensayos clnicos de terapia gnica
en fase I; 219 en fases I/II, 147 en fase II y tan slo 32 en fases II/II III.
Los vectores retrovirales y los adenovirales son los vectores de uso ms fre-
cuente en estos ensayos, pues cada uno de estos vectores se est utilizando
en un 25% de los protocolos. Le siguen los ensayos en los que se utiliza
DNA desnudo (16%), lipofeccin (8%), y el resto est muy repartido entre
ensayos que utilizan vectores adenoasociados, virus vaccinia, y hasta 20 ti-
pos diferentes de vectores.
TERAPIA GNICA DE ENFERMEDADES MONOGNICAS
Criterios para definir el vector de transferencia a utilizar
El xito teraputico de los tratamientos de TG depende fundamentalmente

de dos variables. En primer lugar, resulta necesario insertar eficazmente el trans-
gn en las clulas diana deseadas. Por otra parte, es tambin necesario que el
gen se exprese adecuadamente, produciendo niveles suficientes de la protena
teraputica. En el caso de enfermedades metablicas asociadas a defectos gen-
ticos hereditarios, resulta evidente que la curacin de la enfermedad slo se ob-
tendr cuando a las clulas de los tejidos afectados les llegue de manera estable
en el tiempo niveles umbrales de la protena deficitaria. Una de las aproxima-
ciones ms directas para lograr este objetivo es la de transducir la poblacin ce-
lular afectada y/o sus clulas progenitoras con vectores que permitan la integra-
cin estable del transgn en el genoma celular. En los protocolos clnicos
diseados al efecto, se han utilizado fundamentalmente vectores retrovirales, en
particular los derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV).
En un grupo significativo de aplicaciones clnicas -por ejemplo las relacionadas
con la terapia de la hemofilia- se ha comenzado a hacer uso de vectores adenoa-
sociados (AAV). Tal como ocurre con los vectores retrovirales, estos vectores
permiten la insercin estable del transgn, si bien en este caso suelen ser varias
las copias integradas, con lo que parece que se consiguen mayores niveles de
expresin del transgn en las clulas diana. Los vectores lentivirales constituyen
tambin una herramienta ya considerada para su uso en protocolos clnicos de
TG humana, ya que mediante estos vectores se facilita la integracin del trans-
gn en clulas poco o nada proliferativas, con lo que se confa poder transducir
139
de manera muy eficaz las clulas madre de los diferentes tejidos.
El esquema bsico seguido

en estos ensayos clnicos es el
que se muestra en la Figura 2.
Las clulas de la mdula sea
del paciente se extraen de la
mdula sea, se purifican y se
translucen con los vectores te-
raputicos. Finalmente, la po-
blacin conteniendo clulas
madre corregidas genticamen-
te son infundidas en el pacien-
te, el cual en ocasiones puede
hacer recibido un tratamiento
submieloablativo para facilitar
el prendimiento del inculo.
Figura 2. Correcin gentica
de clulas madre
hematopoyticas de Principales enfermedades monognicas que son
pacientes con objeto de terapia gentica
enfermedades hereditarias.
Hasta que los laboratorios de gentica molecular ofrezcan al-
ternativas eficaces para el tratamiento de mutaciones dominantes,
el tratamiento gentico de las enfermedades metablicas se est centrando en la
terapia de mutaciones monognicas recesivas, en las cuales la expresin de una
copia funcional del correspondiente transgn pueda ser suficiente para la cura-
cin de la enfermedad.
En aquellas patologas metablicas en las que no resulta posible o no es
del todo eficaz la administracin exgena de la protena deficitaria, se han
planteado alternativas de terapia celular o gnica sobre estos pacientes. En rela-
cin a los protocolos clnicos de terapia celular, del orden de treinta enferme-
dades metablicas pueden ser tratadas mediante trasplante de progenitores he-
matopoyticos procedentes de donantes histocompatibles sanos. No obstante,
debido a las limitaciones de donantes histocompatibles y a los riesgos asocia-
dos al trasplante alognico, una larga serie de enfermedades metablicas mono-
gnicas han sido consideradas para su tratamiento mediante la transferencia del
gen deficitario en las clulas que manifiestan la patologa.
140 De todos los protocolos de TG de enfermedades asociadas a defectos mo-
nognicos, a continuacin se muestra el fundamento de algunos de los han sido
ms relevantes, bien por su relevancia histrica, por su eficacia teraputica o

por las expectativas generadas.
Inmunodeficiencias genticas
Entre las inmunodeficiencias consideradas para su tratamiento gentico
son de destacar las inmunodeficiencias severas combinadas asociadas a muta-
ciones en los genes de la Adenosina Deaminasa (ADA) y la inmunodeficiencia
SCID-X1.
La ausencia de la ADA implica una acumulacin del sustrato desoxiadeno-
sina trifosfato en las clulas, resultando particularmente txico para los linfoci-
tos T (Figura 3). sta fue una de las primeras patologas en ser tratadas me-
diante protocolos de TG con vectores retrovirales, primero en el NIH de
Estados Unidos (Blaese et al., 1995; Khon et al., 1998), y luego en el Hospital
S. Raffaelle de Miln (Bordignon et al., 1993; 1995; Ferrari et al., 1992; Aiuti
et al 2002). Las dos alternativas que se han considerado para el tratamiento ge-
ntico de esta enfermedad estuvie-
ron basadas en la transferencia del
gen ADA en las clulas T de pa-
cientes y tambin en clulas madre
hematopoyticas (CMH). En todos
los casos se comprob la presencia
de clulas transducidas en los pa-
cientes y evidencias de mejora en
su inmunocompetencia. Muy re-
cientemente se ha comunicado que
pacientes con deficiencia de ADA,
Figura 3.
que fueron acondicionados con protocolos poco agresivos y trasplan-
Inmunodeficiencia
tados con clulas de mdula sea corregida genticamente, han podi- severa combinada ADA.
do hacerse independientes de la administracin exgena del ADA
bovino y recuperado su funcin inmune (Aiuti et al 2002).
La inmunodeficiencia SCID-X1 representa aproximadamente la mitad de

todas las inmunodeficiencias severas y est asociada a un defecto en la cadena
c, una protena que forma parte de numerosos receptores de interleuquinas (Fi-
gura 4). La TG de estos pacientes se ha realizado mediante la transferencia de
141
la versin funcional del transgn a CMH, utilizando para ello tcnicas optimi-
zadas de transferencia retroviral. Las

CMH se han trasplantado a once pa-
cientes no acondicionados, habindo-
se observado en diez de ellos la apa-
ricin de clulas del sistema inmune
conteniendo el transgn y una eviden-
te mejora clnica de los pacientes,
que les permiti abandonar las unida-
des de aislamiento a las pocas sema-
nas del tratamiento (Cavazzana-Calvo
et al., 2000).
Figura 4. Sealizacin por

receptores de citoquinas
Se considera que este protocolo, desarrollado en Francia por
en la inmunodeficiencia el grupo de A. Fischer, es el primer protocolo de TG de una enfer-
X1-SCID. medad metablica que ha demostrado una eficacia teraputica in-
cuestionable. Desgraciadamente, dos de los once pacientes actual-
mente tratados han desarrollado una leucemia linfoctica como
consecuencia de la activacin del oncogn LMO2 en las clulas que haban in-
corporado el gen teraputico. Esta observacin supone, por tanto, tambin el
primer efecto patognico asociado a una insercin retroviral en un paciente, y
pone de manifiesto la necesidad de evaluar el delicado equilibrio
beneficio/riesgo asociado a la prctica de la TG insercional (Hacein-Bey-Abina
et al 2003) en cada indicacin clnica.
La granulomatosis crnica constituye otra inmunodeficiencia que ha
recibido atencin particular para su tratamiento gentico. Esta enfermedad
se caracteriza por un fallo por parte de las clulas fagocticas para generar
el anin superxido, por lo que se manifiesta mediante un sndrome recu-
rrente de infecciones y formacin de granulomas (Figura 5). Estudios expe-
rimentales sugieren que la correccin gentica de aproximadamente un 5%
de los granulocitos circulantes ser suficiente para reportar un beneficio te-
raputico (Malech et al., 1999). Los estudios clnicos basados en el tras-
plante de clulas CD34+ transducidas sobre pacientes no acondicionados
no han mostrado beneficio teraputico. No obstante, un ensayo clnico co-
menzado en Alemania con pacientes sometidos a un modelo de acondicio-
142 namiento modesto con busulfn ha evidenciado mejora clnica en los dos
pacientes tratados.
Como conclusin
a los estudios realiza-
dos para tratar genti-
camente pacientes con
enfermedades mono-
gnicas, la Figura 6
muestra el nmero de
pacientes con inmu-
nodeficiencias seve-
ras, as como los que
han mostrado eviden-
cias de mejora clni-
ca. De estos estudios
se pone de manifiesto
que existe un nmero
de enfermedades mo-
nognicas, para las Figura 5. Granulomatosis
cuales la terapia gnica co- crnica.
mienza a ser una realidad

teraputica. En este mo-
mento, son las cuestiones
de seguridad las que limi-
tan el mayor desarrollo de
estos ensayos en la clnica
(Ver apartado 4).
Enfermedades
de acumulacin
de sustratos txicos
Un nmero relativa-
mente elevado de genes se
han asociado a este tipo de
Figura 6. Beneficio clnico
enfermedades. De entre todas ellas, la enfermedad de Gaucher es la
de pacientes con
ms frecuente, por lo que sta es la enfermedad de acumulacin li- inmunodeficiencias
sosomal que ha sido objeto de ms estudios de TG. La enfermedad tratados mediante
143
de Gaucher est asociada a una deficiencia en glucocerebrosidasa terapia gnica.
(GC), por lo que se presentan importantes acumulaciones de glucocerebrsido

en macrfagos y en clulas derivadas de los mismos, producindose patologas
de la mdula sea, hgado, bazo y cerebro. Para que la TG de esta patologa sea
eficaz se requerir, por tanto, que las clulas corregidas alcancen rganos hema-
topoyticos y no hematopoyticos. En particular, para el tratamiento de la pato-
loga que afecta a la microgla del sistema nervioso central ser necesario que
las clulas modificadas genticamente migren al SNC y confieran all el efecto
necesario sobre la manifestacin neurolgica. Hasta el momento se han realiza-
do pocos estudios piloto, aunque los mismos se encuentran todava en fases
tempranas de estudio clnico. Otras enfermedades de acumulacin de sustratos,
tales como la mucopolisacaridosis de tipo II (sndrome de Hunter) han recibido
atencin para su tratamiento gentico, aunque su desarrollo no se encuentra tan
avanzado como en el caso de la enfermedad de Gaucher.
Hemofilia
Tanto la hemofilia A, producida como consecuencia de un defecto en la pro-
duccin del factor VIII de coagulacin, como la hemoflia B, asociada al defecto
en el factor IX, han sido consideradas para su tratamiento por TG. Un estudio cl-
nico reciente (Kay et al., 2000) ha mostrado las primeras evidencias de eficacia cl-
nica asociada al tratamiento con vectores AAV que codifican el factor IX. En este
estudio, los vectores AAV se inocularon en el msculo de pacientes de hemofilia
B, obtenindose resultados que sugieren que la hemofilia B podra transformarse
en una enfermedad ms leve mediante la aproximacin gentica propuesta.
Enfermedades asociadas a defectos en la hemoglobina

La talasemia- y la anemia falciforme constituyen las dos patologas de
este grupo ms estudiadas para su tratamiento mediante TG. Constituyen las
dos enfermedades monognicas ms frecuentes, y su patologa molecular ha si-
do ampliamente investigada. El remplazamiento de la globina-, defectiva o
ausente en pacientes con talasemia puede ser curativa. Los altos niveles de
expresin del gen que codifica la globina- normal en las clulas eritroides de
pacientes con anemia falciforme, se confa que sean beneficiosos, debido al en-
samblaje preferente de los tetrmeros y , y la relativa inestabilidad de las
144 cadenas s. La TG de esta enfermedad requerir, sin embargo, muy altos nive-
les de expresin del transgn, lo cual supone una tara todava pendiente.
Anemia de Fanconi
La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosmica recesiva poco
frecuente entre la poblacin, pero de muy mal pronstico. Los pacientes suelen
desarrollar anomalas congnitas mltiples (en un 65% de los casos), fallo de
mdula sea y predisposicin a cncer. En promedio, la manifestacin de la
aplasia se observa alrededor de los 8 aos de edad, siendo la supervivencia me-
dia de estos pacientes de 16 aos. Una de las caractersticas de esta enferme-
dad que la hacen particularmente apropiada para su tratamiento por TG radica
en la ventaja selectiva que parecen tener las clulas corregidas, respecto a las
clulas defectivas en los genes de Fanconi. La AF es consecuencia de mutacio-
nes o deleciones en cualquiera de los ocho genes que en la actualidad se sabe
estn implicados en una funcin celular relacionada con la estabilidad del ge-
noma de estas clulas. Los resultados publicados sobre los ensayos realizados
en fase I no manifiestan beneficios teraputicos evidentes (Liu et al., 1999). No
obstante, nuevos ensayos con protocolos optimizados de transduccin estn ac-
tualmente en marcha.
Fibrosis qustica
El gen de la fibrosis qustica (FQ) est localizado en el cromosoma 7 y
posee un tamao de 6,7 kB. En un 75% de los pacientes enfermos de FQ la
enfermedad se produce por un defecto en la posicin 508. Como conse-
cuencia de las deficiencias de este gen se produce una alteracin fsica y
qumica de las secreciones de las vas respiratorias y de las enzimas pan-
creticas. Como consecuencia del defecto en el transporte del cloro entre
las clulas, las mucosidades se hacen muy densas, dificultando la expulsin
del moco bronquial y facilitando su infeccin con patgenos difciles de
eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la insercin del
gen de la FQ en las clulas respiratorias. Hasta la actualidad se han desa-
rrollado diversos ensayos clnicos en fase I utilizando vectores adenovira-
les, adenoasociados y liposomas (Alton et al., 1998). Los protocolos con
vectores adenovirales han mostrado ventajas respecto a su eficacia de trans-
duccin de las clulas diana; sin embargo, tambin han puesto de manifies-
to su inmunogenicidad, al haberse generado anticuerpos que neutralizaron
la eficacia de los vectores adenovirales. Es de esperar que los protocolos
actuales, con vectores menos inmunognicos y ms eficaces, faciliten la 145
mejora clnica de estos pacientes.
TERAPIA GNICA DEL CNCER (TGC)
En los aos 60 y 70 se sucedieron las primeras propuestas tericas para el

tratamiento de enfemedades humanas mediante la introduccin de material ge-
ntico en los rganos o clulas afectados. En 1968 se report el primer experi-
mento en el que se utiliz un virus oncognico modificado como transportador
de material gentico potencialmente terapetico (Rogers S. y Pfuderer P. 1968).
Hubo que esperar al ao 1979 hasta que apareciera el primer modelo animal
(Andreson W.F. y Fletcher J.C. 1979), lo que catapult la investigacin general
en el rea. Sin embargo, la aplicacin al campo de la terapia en cncer se retra-
s hasta el ao 1987, cuando se abord el tratamiento de leucemias (Howell et
al. 1987; Merz, B. 1987; Bank et al. 1987).
Biologa molecular del cncer

El principal problema al que se en-
frenta la TGC es que, en sus formas
ms habituales, no se trata de una en-
fermedad monognica y las clulas can-
cergenas presentan un gran nmero de
anomalas genticas y cromosmicas.
Por tanto, las filosofas y formas de tra-
bajo habituales en el campo, ms cen-
tradas en conseguir una mayor eficien-
cia de transduccin en los rganos
diana, son slo una parte del problema
en la TGC.
En base a esta premisa general, ha
sido necesario avanzar en el conoci-
miento molecular y fisiolgico del
enemigo a batir, antes de contar con
Figura 7. Bases
herramientas suficientemente eficaces para afrontar el reto que
moleculares del cncer
supone conceptualmente. Actualmente, y contando con que en ca-
(Adaptada de Hanahan
2000). da tipo de tumor humano los circuitos implicados principales
pueden ser distintos, conocemos varios principios de la fisiologa
146 tumoral sobre los que poder incidir con garantas razonables de
xito. Las principales vas afectadas (en solitario o en combina-
cin) en los tumores humanos (Hanahan, D. y Weinberg, R.A., 2000), y en

las que se conocen genes importantes, son las siguientes (ver Figura 7):
1) Bloqueo de los programas de muerte celular programada.

2) Insensibilidad a seales antiproliferativas.
3) Generacin de circuitos de supervivencia alternativos.
4) Proliferacin descontrolada.
5) Invasividad y metstasis.
6) Induccin de angiognesis asociada al desarrollo de tumores slidos.
Todas estas vas pueden cooperar sin solucin de continuidad y dependien-

do del tumor humano concreto, de forma casi aleatoria (al menos poco predeci-
ble), por lo que ha sido necesario acumular esta informacin antes de poder
realizar un diseo teraputico racional. Esta situacin se resume en varias si-
nergias bien caracterizadas en tumores humanos.
Este desarrollo ha llevado a un cambio conceptual del "tumor", asu-

mindose actualmente que se trata de un nuevo "tejido", con necesidades fi-
siolgicas especficas. Frente a la visin "reduccionista" del tumor, asu-
miendo que es un
conjunto de clu-
las, relacionadas
clonalmente pero
heterogneas por
su inestabilidad g-
nica intrnseca, la
nueva visin emer-
gente entiende el
tumor como un
"neotejido" en
constante evolu-
cin, con unas ne-
cesidades cambian-
Figura 8. El tumor como
tes, tanto en trminos metablicos como protectores. El tumor
un tejido complejo.
genera seales y sustancias que "manipulan" su entorno fisiol- 147
Adaptada de Hanahan
gico en su propio beneficio; se est jugando su propia supervi- y Weinberg (2000).
vencia. Los tumores primarios crecen autnomamente hasta que sus necesi-
dades nutricionales les obligan a reclutar ms recursos. Este es un momento
crtico (denominado angiogenic switch) en el que el tumor se estructura
atrayendo clulas de soporte, promueve la neovascularizacin de su entorno
(angiognesis) y atrae clulas inmunes circulantes y las estimula para que
secreten metaloproteasas (p.e.) para favorecer su expansin y extravasacin
(Figura 8).
En cada una de las vas anteriormente descritas se conocen algunos de los

mediadores o reguladores moleculares principales (master genes) sobre los que
se plantean las distintas aproximaciones teraputicas. Dependiendo de cul sea
la va principal y cul el mecanismo molecular afectado, los argumentos y es-
trategias teraputicas son diferentes. A modo de ejemplo, ya que es imposible
ser exhaustivo en el marco de esta charla, comentaremos las principales estra-
tegias desarrolladas y los protocolos tcnicos asociados.
Terapia gnica
del cncer
Lo primero a
tener en cuenta es
que los tratamientos
clnicos contra el
cncer son tremen-
damente eficaces,
eliminando un alt-
simo porcentaje de
las clulas maligni-
zadas. Los proble-
mas fundamentales
derivan bien de la
agresividad de los
Figura 9. Definicin
tratamientos, de la
de dianas en terapia aparicin de quimioresistencias cruzadas, o bien de la existencia de
gnica antitumoral. pequeos focos que no se eliminan y que pueden dar lugar a la rea-
148 Adaptada de Hanahan paricin de los procesos neoplsicos. En la actualidad, la mayora
y Weinberg (2000). de los procedimientos desarrollados en base a la utilizacin de TGC
distan mucho de ser capaces de sustituir a los tratamientos clnicos actuales,

aunque pueden aspirar a combinarse con ellos.
La Figura 9 presenta de forma muy esquemtica las principales estrate-
gias, agrupadas de acuerdo con las distintas vas implicadas en la transforma-
cin tumoral.
En trminos generales, si el principal proceso afectado es la eliminacin de los

mecanismos de control negativo de la proliferacin, se intentan introducir versiones
correctas de estos genes (p.e. los genes p53 o p16; Chen y col, 2000; Swisher S.G.
y Roth, J.A., 2000; Cowen et al., 2000; Kawacabe et al., 2000). Si el defecto con-
siste en la resistencia a los mecanismos naturales de induccin de muerte celular
programada, se intentan expresar genes que la pueden promover o hacerla ms
efectiva (caspasas, FasL, etc). Un buen ejemplo es el tratamiento de gliomas me-
diante la expresin de caspasa-8 con vectores adenovirales (Shinoura et al., 2000)
Si el tumor es muy dependiente de la induccin de neovascularizacin o es muy
propenso a metastatizar, se introducen genes que puedan bloquear o disminuir di-
chos procesos (VEGF-R, anlogos de angiostatina, moduladores de integrinas o
metaloproteasas, etc; Chen et al., 2000; Carmeliet, 2000; Abruzzese et al., 2000).
Los procedimientos empleados para realizar la transferencia gnica son
muy variados y dependen fundamentalmente de la biologa y fisiologa del tu-
mor, pero esta etapa es crtica para el resultado final del tratamiento. Se emple-
an vectores virales (adenovirus, adeno-asociados, virus herpes, retrovirus, y
vectores derivados de lentivirus), vectores no-virales (liposomas, dendrmeros,
pptidos, bombardeo con micropartculas de oro que transportan las construc-
ciones gnicas, etc), y el procedimiento puede ser in vivo o ex vivo.
Como es imposible en esta presentacin hacer una revisin exhaustiva de
todo el panorama en desarrollo del rea, nos restringiremos a aquellas aproxi-
maciones ms especficas del campo o aquellas que ms se han desarrollado.
Una rama especialmente desarrollada en la TGC es la introduccin de genes
pro-citotxicos en las clulas tumorales (fundamentalmente la timidina kinasa del vi-
rus herpes-HSV-TK-, y la protena citidin-deaminasa -CDA-) lo que las susceptibiliza
a distintos compuestos (el ms empleado es el ganciclovir, GCV) de forma diferen-
cial con respecto a las clulas sanas. La administracin de estas sustancias al modelo
animal o al paciente elimina las clulas tumorales transducidas y aqullas que se en-
cuentran en sus cercanas por un fenmeno conocido como "bystander", que est me-
149
diado por la transferencia de la droga metabolizada a las clulas circundantes.
Dos son los modelos tumorales que ms atencin han recabado de las expec-
tativas de la TGC, y lgicamente, son los tumores que peor pronstico presentan
con los tratamientos clnicos actuales: glioma maligno y melanoma avanzados. El
tratamiento de gliomas ha sido evaluado por numerosos autores (revisado por
Klatzman et al., 1998), obteniendo resultados variables. Sandmair y col. han com-
parado la eficiencia del tratamiento, bien utilizando vectores retrovirales, bien con
adenovirus (Sandmair y col. 2000). Sus resultados demuestran claramente que los
efectos secundarios del tratamiento son aceptables, y que los pacientes tratados
con vectores adenovirales han mostrado una duplicacin del tiempo de supervi-
vencia (MRI), 15.0 meses, en comparacin con los pacientes tratados con vectores
retrovirales, 7.4 meses, y el grupo control, 8.3 meses.
De 1998 a febrero de 2000 se han hecho pblicos varios estudios clnicos
(Fase I/II) para el tratamiento de pacientes con melanoma cutneo maligno y me-
tastsico, mediante la administracin intra-lesin de vectores adeno expresando
HSV-TK en combinacin con dosis escaladas de ganciclovir (Klantzman et al.,
1998; Morris et al. 2000). En estos estudios se pretende determinar la dosis mxi-
ma de GCV que puede ser administrada en combinacin con la administracin au-
torizada del vector, evaluar la tasa teraputica objetiva del ensayo y determinar si
existe efecto "bystander" en otras localizaciones lejanas al punto de tratamiento.
Esta estrategia es bastante efectiva, aunque todava presenta algunos in-
convenientes como los derivados de: 1) aparicin de clulas tumorales resisten-
tes al tratamiento, 2) eficiencia del proceso de transferencia y 3) generacin de
inmunogenicidad por la expresin de una protena de origen bacteriano (TK).
De forma adicional existe una rama casi exclusiva de la TGC que lidia
con mejorar la respuesta inmune del organismo frente a los tumores (inmunote-
rapia bioqumica y/o celular). En esta aproximacin se utilizan tambin distin-
tas aproximaciones que se pueden resumir en las siguientes:
1) Aislamiento, amplificacin ex vivo, modificacin gnica (en algunos
casos) y retrasplante en el paciente de linfocitos autlogos del paciente (TILs,
LAKs, ALTs) que presentan afinidad por el tumor (Weijtens et al., 1998; Bol-
huis R.L. y Gratama J.W., 1998).
2) Inmunizacin con DNA de oncogenes tumor-especficos (p.e - neu en
el caso de cncer de mama-; Reilly et al., 2000; Amici et al., 2000).
3) Generacin de vacunas autlogas, utilizando clulas tumorales inacti-
150 vadas, primando clulas dendrticas (revisado por Kirk C. y Mule J., 2000), o
potenciando la inmunogenicidad de las clulas tumorales mediante la introduc-
cin de genes que favorecen el proceso (HGFs, ILs, molculas accesorias, etc).
sta es una de las aproximaciones ms evaluadas, con distintas filosofas. Mi-
ller y col. han demostrado que la administracin intratumoral de clulas dendr-
ticas modificadas con adenovirus que expresan IL-7, aumenta la respuesta in-
mune antitumoral (cncer de pulmn) hasta conseguir su erradicacin (Miller
et al., 2000). El tratamiento del melanoma tambin se ha intentado mediante
tcnicas de vacunacin. Osanto y col. han publicado el tratamiento con xito
de 33 pacientes afectados por melanoma metastsico, mediante su vacunacin
con una lnea celular de melanoma alognica, manipulada para producir IL-2
(Osanto et al., 2000). Otros autores han tratado cinco pacientes con clulas tu-
morales autlogas transducidas para que secreten GM-CSF (Chang et al.,
2000), demostrando una remisin total en uno de los pacientes.
Cualquiera de estas aproximaciones presenta la gran ventaja respecto a los
tratamientos ms convencionales que, al menos tericamente, sera capaz de al-
canzar los reservorios residuales del tumor (santuarios) que no son eliminables
por las terapias convencionales (ciruga, quimio y radioterapia), por lo que los
tratamientos ms prometedores podran ser utilizados en combinacin con los
que actualmente se utilizan en clnica. Desde mi modesta opinin, estas aproxi-
maciones parecen las ms realistas y prometedoras para aumentar el arsenal te-
raputico en la lucha contra el cncer.
Finalmente se han introducidos nuevos vectores virales citotxicos con una
particularidad esencial: se replican y amplifican preferentemente en las clulas tu-
morales (conditional replication-competent vectors). Actualmente existen varios
modelos preliminares (Alemany et al., 2000; Rancourt et al., 1999) que necesitarn
una posterior etapa de refinamiento y de bioseguridad, pero que son muy interesan-
tes. En este ltimo estudio se ha desarrollado un modelo para controlar la produc-
cin de partculas infecciosas tras la infeccin con un vector adenoviral (Ad5dl312)
al que se le haba delecionado la funcin E1A, y sustituido por una funcin de sn-
tesis activada por IL-6. La generacin de partculas infecciosas depende de la pro-
duccin celular de IL-6, por lo que el modelo teraputico tiene un gran inters en
tumores que poseen un ciclo autocrino de IL-6, como el cncer de ovario.
Una variante de esta ltima aproximacin, que todava se encuentra en fa-

se de desarrollo, es la utilizacin de vectores retrovirales replicativos (RRV).
Solly y col. han publicado recientemente un primer estudio en el que comparan
151
la eficacia de transduccin in vivo de los RRV (>85%) en comparacin con los
vectores convencionales (<1%), para modificar masas tumorales desarrolladas

en modelos animales inmunocompetentes; los autores proponen el uso de estos
modelos para el tratamiento de tumores cerebrales en los que han demostrado
una eficiencia 1.000 veces mayor que los adenovirus deficientes en replicacin
(Solly et al., 2003). Si se consiguen derivar vectores RRV condicionales se ob-
tendr una nueva y valiosa herramienta para la lucha contra el cncer mediante
tcnicas de manipulacin gentica.
LA SEGURIDAD EN TERAPIA GNICA
Problemas ocurridos en el tratamiento de la deficiencia

de la Ornitn Transcarbamilasa
Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima cla-
ve del metabolismo de aminocidos -la Ornitn Transcarbamilasa (OTC)- lo
que da lugar a una acumulacin potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.
Puesto que la actividad OTC est normalmente presente en el hgado, se consi-
dera que ste es el tejido diana de vectores que expresen la versin correcta del
gen OTC. En virtud de la eficacia de los adenovirus para infectar clulas hep-
ticas, se propuso utilizar tales vectores para transducir las clulas hepticas de
estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y tambin en animales de
experimentacin, mostraron la eficacia del protocolo propuesto. El tratamiento
de 17 pacientes con dosis progresivamente crecientes del vector no manifest
efectos txicos severos. No obstante, en uno de los pacientes tratados con la
dosis ms alta se manifest un proceso febril seguido de inflamacin heptica
y aumento descontrolado de los niveles de amonio, dando lugar a la entrada en
coma del paciente. Lamentablemente el paciente falleci poco despus, estando
todava en investigacin la causa primaria de su muerte. El fallecimiento de es-
te paciente como consecuencia de la inoculacin del vector viral dispar las
alarmas de los organismos reguladores, principalmente en lo que se refiere a la
inoculacin in vivo de vectores de la familia de los adenovirus. En la actuali-
dad se han generado nuevos vectores adenovirales desprovistos de la mayor
parte del esqueleto viral implicado en la inmunogenicidad de los mismos, por
152 lo que se confa en que su uso prevenga de la generacin de respuestas inmu-
nognicas no previstas.
Incidencia de leucemias en pacientes X1-SCID tratados

mediante terapia gnica
Desgraciadamente, tres de los diez pacientes X1-SCID que han sido trata-
dos en el Hospital Necker, mediante terapia gnica, han desarrollado leucemias
asociadas a la insercin del gen teraputico en la proximidad de oncogenes
(Hacein-Bey-Abina et al. 2003). De particular significado ha sido la observa-
cin que en dos de estos pacientes la insercin se ha observado prxima al on-
cogn LMO2, implicado en leucemias linfocticas. Como se recoge en la Figu-
ra 10, en ninguno de los otros protocolos en marcha, ni tampoco en los
pacientes X1-SCID tratados en Londres, se han observado efectos adversos se-
veros similares.
El conocimiento de las bases moleculares por las cuales se han producido

las leucemias en estos pacientes an est por resolver. No obstante, estas evi-
dencias sugieren la conveniencia de proseguir los trabajos que tienen por obje-
to mejorar la seguridad de
los vectores dirigidos a
tratar pacientes por esta
nueva aproximacin tera-
putica.
Como tambin suce-
di con la quimioterapia o
la radioterapia, los prime-
ros efectos severos adver-
sos asociados a la terapia
gnica tambin han que-
dado ya de manifiesto. En
los prximos aos los in-
vestigadores habrn de ser
capaces de demostrar que Figura 10. Incidencia
la relacin entre el beneficio clnico y el riesgo asociado a la tera- de efectos adversos
pia gnica es positiva para el paciente. Este hecho repercutir en la severos en pacientes
expansin de una nueva herramienta teraputica para pacientes que con inmunodeficiencias
tratados con 153
no tienen otra opcin teraputica eficaz.
terapia gnica.
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155
Farmacocintica de los medicamentos obtenidos por Biotecnologa
FARMACOCINTICA DE LOS MEDICAMENTOS

OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGA
Alfonso Domnguez-Gil Hurl. Servicio de Farmacia. Hospital Universitario de Salamanca
FARMACOCINTICA
Toda sustancia con actividad farmacolgica queda definida no solamente

por su configuracin estructural sino tambin por sus propiedades fsico-qumi-
cas y biolgicas, entre las que se incluye el perfil farmacocintico que cuantifi-
ca, mediante diversos parmetros, los procesos de absorcin, distribucin, me-
tabolismo y excrecin1.
La farmacocintica se ha consolidado durante los ltimos aos como una
disciplina de gran inters sanitario. Su aplicacin se dirige, principalmente, hacia
el desarrollo de nuevos medicamentos y a la optimizacin de los tratamientos
farmacolgicos2. Otras aplicaciones menos conocidas son la deteccin diagnsti-
ca de respuestas anmalas, el anlisis retrospectivo de errores teraputicos o tra-
tamientos inadecuados y las actividades educativas encaminadas a asegurar el
uso seguro y eficaz de los medicamentos. Dentro de la investigacin farmacol-
gica, la farmacocintica puede dirigirse tambin a la resolucin de aspectos clni-
cos concretos como la deteccin de interacciones, problemas de biodisponibili-
dad o a la definicin de parmetros tiles para el diseo de regmenes de
dosificacin individualizados. La farmacocintica es hoy de gran utilidad para to-
157
dos aquellos profesionales implicados en el desarrollo, evaluacin y uso de los
medicamentos. La far-
macodinamia expresa
la variacin del efecto
con la concentracin y
asociada a la farmaco-
cintica constituye la
base para la definicin
de la respuesta en los
tratamientos farmaco-
lgicos.
Figura 1. Relacin de la La actividad intrnseca que presenta un frmaco es condicin
farmacocintica y necesaria, pero no suficiente, para asegurar la eficacia teraputica. El
farmacodinamia
frmaco precisa, necesariamente, alcanzar su lugar de accin, no
con la respuesta
siempre bien definido, en ocasiones difcilmente accesible o cuya ac-
teraputica.
cesibilidad se modifica con la gravedad de la enfermedad. Para ello
se puede requerir, por ejemplo, una biodisponibilidad elevada, una
amplia distribucin tisular o un lento aclaramiento plasmtico. Unas propieda-
des farmacocinticas desfavorables pueden llegar a condicionar el potencial te-
raputico de un nuevo frmaco y aconsejar la interrupcin de los ensayos clni-
cos programados en su desarrollo. La Figura 1 muestra esquemticamente la
contribucin de la farmacocintica y la farmacodinamia en la respuesta a un
tratamiento farmacolgico3.
Es posible establecer distintos tipos de relaciones entre la farmacocintica
y la farmacodinamia de pptidos y protenas de inters teraputico. As, los va-
lores del rea bajo la curva de niveles sricos de algunos agentes trombolticos
se correlacionan directamente con la permeabilidad en el infarto vascular. Un
modelo PK-PD ha sido utilizado para el diseo de las pautas de dosificacin de
reteplasa, un agente tromboltico recombinante.
Con frecuencia no es posible establecer, para pptidos y protenas, una re-
lacin directa concentracin-efecto debido a que la variable medida suele ser la
resultante a dos o ms procesos cinticos que ocurren despus de la fijacin a
receptores. La Figura 2 recoge el modelo PK-PD con respuesta indirecta esta-
blecido para la hormona de crecimiento utilizando diferentes vas de adminis-
tracin4. En algunos casos, se requieren modelos PK-PD complejos para poder
158 definir una relacin entre las concentraciones sricas y la respuesta, como se ha
demostrado con interleuquina-2, eritropoyetina, etc.
Los resultados
obtenidos en los estu-
dios farmacocinticos
junto a los procedentes
de los ensayos de efi-
cacia y seguridad con-
figuran el perfil farma-
colgico de un nuevo
medicamento, permi-
tiendo establecer los
principios bsicos para
Figura 2. Modelo
su correcta utilizacin en la prctica clnica.
farmacocintico-
La investigacin de nuevos frmacos se orienta, con frecuencia, farmacodinmico
a mejorar algunas caractersticas farmacocinticas, especialmente la establecido para la
absorcin gastrointestinal, la distribucin tisular y la velocidad de hormona de crecimiento.
eliminacin. Ello se consigue mediante cambios en la estructura qu-
mica o en la formulacin farmacutica que puede modificar la cintica de libe-
racin, el acceso a los tejidos e incluso los procesos de metabolismo y excre-
cin5. Estos cambios permiten mejorar la efectividad de los tratamientos bien
por cambios en el perfil de la respuesta o facilitando la administracin y mejo-
rando el cumplimiento de la prescripcin.
La estructura qumica que presentan la mayora de los productos biotecno-
lgicos condiciona algunas propiedades, que pueden dificultar su utilizacin te-
raputica y que se refleja en su perfil farmacocintico. Entre ellas destacan la
baja biodisponibilidad por va oral, ciertas exigencias en la distribucin tisular
y celular y un aclaramiento plasmtico elevado.
MEDICAMENTOS BIOTECNOLGICOS
Los medicamentos obtenidos por Biotecnologa constituyen una clase tera-

putica emergente en la clnica que presenta unas caractersticas diferenciales
no solo por su origen, sino tambin por su estructura qumica y algunas propie-
dades farmacocinticas y farmacolgicas.
Aunque la biotecnologa moderna nace en 1953 al conocerse la estructura 159
del cido desoxirribonucleico (ADN), su incorporacin a la teraputica humana
no se produce hasta comienzos de los aos 80 con la utilizacin de la insulina

y de la hormona de crecimiento recombinantes en terapia sustitutiva. Desde en-
tonces se han incorporado al arsenal teraputico unos 100 medicamentos, aun-
que cerca de 700 molculas, para el tratamiento de unas 250 enfermedades, se
encuentran en diferentes fases de investigacin clnica. Diversos analistas clni-
cos coinciden en afirmar que los medicamentos biotecnolgicos llegarn a re-
presentar, en un futuro, el 20-25% de todos los recursos farmacolgicos6.
Los medicamentos biotecnolgicos incluyen protenas obtenidas por inge-
niera gentica, anticuerpos monoclonales producidos mediante la tecnologa
del hibridoma, vectores para el transporte de material gentico, fragmentos de
anticuerpos, oligonucleotidos antisentido, vacunas, etc. Estos productos presen-
tan algunas caractersticas que los diferencia de los medicamentos tradiciona-
les. Su estructura qumica, por ejemplo, es ms compleja ya que se trata, con
frecuencia, de protenas que contienen un nmero elevado de aminocidos (fil-
gastrin 174, somatropina 191, alteplasa 527, etc.) con una determinada secuen-
cia, con especificidad en el nmero y localizacin de los puentes disulfuro e
incorporacin de una o varias molculas de carbohidratos que son necesarias
para la actividad biolgica. La cadena proteica puede presentar, adems, hli-
ces en distinto nmero, tamao y configuracin. Asimismo, algunas protenas
activas requieren la asociacin de varias subunidades proteicas para formar un
gran agregado activo, estructura cuaternaria, como ocurre, por ejemplo con el
interferon--1b formado por dos protenas idnticas de 165 kDa unidas por
uniones no covalentes7.
BIODISPONIBILIDAD ORAL
Los pptidos y protenas presentan una baja biodisponibilidad por va oral,

generalmente inferior al 1%, por lo que en principio no son candidatos idneos
para utilizar esta va de administracin. Ello es debido a su inestabilidad en el
medio fuertemente cido del estmago, al efecto producido por las peptidasas
intestinales, y especialmente a su escasa permeabilidad como consecuencia del
tamao molecular, la carga elctrica y la elevada polaridad. La mayora de las
protenas recombinantes se incluyen dentro de la clase III del sistema de clasi-
160 ficacin biofarmacutica; solamente algunas pertenecen a la clase IV y es ex-
cepcional que algunas biomolculas se incluyan en la clase I. Es decir, los pro-
ductos obtenidos por Biotecnologa suelen presentar una solubilidad en agua

alta o moderada y una permeabilidad intrnseca baja o muy baja8.
La capacidad de los frmacos para atravesar las barreras biolgicas consti-
tuye un parmetro biofarmacutico de gran inters del que depende no slo la
absorcin, sino tambin la distribucin, metabolismo y excrecin. Aunque las
diferentes membranas biolgicas presentan unas caractersticas especficas, los
principales constituyentes siempre son: fosfolpidos, colesterol, esfingolpidos y
glicolpidos. Por tanto, para que un frmaco supere las diferentes membranas
biolgicas y alcance su lugar de accin debe presentar un balance adecuado en-
tre hidrofilia y lipofilia, que se expresa habitualmente por el coeficiente de re-
parto octanol-agua (P) o ms fcilmente por log P. Este parmetro es un buen
predictor de la permeabilidad de muchos frmacos y puede ser correlacionado
con diversos parmetros farmacocinticos. Ello no es posible cuando se trata
de pptidos y protenas, debido a que en su estructura estn presentes numero-
sas funciones polares que forman puentes hidrgeno con los grupos hidroxilo
de la fase acuosa. Los pptidos presentan, en consecuencia, coeficientes de re-
parto ms altos, que no se corresponden con la permeabilidad. No obstante,
pueden obtenerse buenas correlaciones cuando se determina el nmero de
puentes de hidrgeno potenciales que pueden establecerse con el agua. Los co-
eficientes de reparto heptano-etilenglicol o la diferencia entre los coeficientes
de reparto octanol-agua y ciclohexano-agua (logP) permiten estimar los puen-
tes hidrgeno o la desolvatacin potencial de las molculas peptdicas que son
buenos predictores de la permeabilidad. De esta forma es posible anticipar el
efecto de las modificaciones estructurales en la absorcin oral de pptidos de
inters teraputico, lo que es de gran utilidad en el desarrollo de nuevas mol-
culas. La desolvatacin potencial que presentan diferentes pptidos ha podido
ser relacionada con parmetros farmacocinticos que describen el proceso de
absorcin como Cmax y AUC.
Factores fisiolgicos como el tiempo de trnsito gastrointestinal, la dilu-
cin y las interacciones con componentes de los alimentos reducen la fraccin
de dosis disponible para la absorcin de pptidos y protenas. Finalmente, el
efecto del "primer-paso" y las "bombas de eflujo" tambin son responsables de
la escasa biodisponibilidad oral que presentan los productos obtenidos por bio-
tecnologa.
La Figura 3 muestra algunos de los factores ms importantes que reducen
161
la biodisponibilidad oral de molculas proteicas.
Pese a esta situa-

cin, sabemos que al-
gunos medicamentos
con estructura peptdi-
ca como antibiticos
-lactmicos, inhibi-
dores de la ECA o la
ciclosporina presentan
valores de biodisponi-
bilidad que permiten
su administracin por
Figura 3. Efecto del va oral y tienen acreditado su valor teraputico. Asimismo, peque-
metabolismo y del os pptidos procedentes de la digestin de las protenas de la dieta
contratransporte por o incluso algunos antgenos naturales solubles se absorben intactos.
gliclop-P en la
A diferencia de otros frmacos algunas protenas recombinantes
biodisponibilidad oral de
presentan una actividad intrnseca muy elevada, hasta el punto de po-
protenas.
der admitir que una biodisponibilidad del 10% podra ser suficiente
para alcanzar los objetivos teraputicos cuando se administran por va oral.
La Figura 4 recoge algunas de las alternativas en desarrollo para mejorar
la biodisponibilidad oral de pptidos y protenas.
Figura 4. Protenas por va oral: es posible?

- Modificaciones estructurales:
Emisphere Technologies y Nobex Corporation (insulina, hormona del
crecimiento y paratohormona).
Generes Biotechnology Corp: Oral-lyn (oral insulin spray*).
- Sistemas endgenos de transporte celular:
Inhibidores de la P-glicoprotena, G-CSF-transferrina.
- Partculas como sistemas de transporte:
Liposomas recubiertos con mucoadhesivos, hidrogeles.
- Nanosistemas (<500 nm):
Nanopartculas vectorizadas (1 Integrinas, lectinas).
162 Vacunas orales.
*primera formulacin oral de insulina comercializada
ADMINISTRACIN PARENTERAL
Debido a las limitaciones de la va oral, los pptidos y protenas se admi-

nistran habitualmente por va parenteral, preferentemente endovenosa. La ma-
yora de estas molculas presentan un rpido aclaramiento, lo que conduce a
valores bajos en la semi-vida de eliminacin
Los problemas que surgen con la administracin parenteral de macromol-
culas que presentan un rpido aclaramiento ha estimulado el desarrollo de dife-
rentes actuaciones dirigidas, en principio, a modificar el perfil farmacocintico
y, en consecuencia, facilitar su administracin. Ello se ha conseguido mediante
cambios estructurales, por conjugacin con diversos polmeros, por hiperglico-
silacin de las protenas y con el desarrollo de formulaciones parenterales de
liberacin controlada9-11.
Entre las modificaciones estructurales pueden citarse las derivadas de la
insulina de accin ultralarga como el (Fmoc)2-insulina, un profrmaco cuya
transformacin en insulina presenta un t1/2 = 12 1 das en ratas. No se han
publicado an los resultados de los estudios en humanos.
La conjugacin de pptidos y protenas con diversos polmeros constituye
actualmente un rea de gran inters especialmente en la teraputica oncolgica
a la que se han incorporado protenas antitumorales, enzimas, citoquinas, etc.
La conjugacin con polmeros produce cambios significativos en el perfil far-
macocintico de las macromolculas, permitiendo superar algunas de las limi-
taciones que presentaban para su utilizacin clnica. El principal cambio es un
incremento en la semi-vida de eliminacin con un aumento de la captacin ce-
lular por endocitosis. Una vez en sangre se produce la liberacin del conjugado
a los compartimentos endosmicos y lisosmicos de la clula con descenso del
pH (5,5-6,0). Una vez alcanzado el lisosoma se produce la degradacin meta-
blica por accin de las hidrolasas intracelulares, como se puede observar en la
Figura 5.
La pegilacin de protenas con una o varias cadenas de polietilenglicoles
(PEG) es, posiblemente, el mecanismo de conjugacin ms desarrollado. Los
PEG son polmeros lineales o ramificados constituidos por unidades de xido
de etileno (-CH2-O-CH2-) que presentan dos grupos hidroxilo terminales, los
cuales pueden ser activados qumicamente 12. La reaccin de pegilacin ms 163
frecuente implica al grupo -amino de la lisina o grupos amino terminales de
las protenas. Las bio-

molculas conjugadas
presentan propiedades
fsico-qumicas dife-
rentes de las protenas
originales, como cam-
bios conformacionales,
impedimento estrico,
capacidad de unin
electrosttica, valores
de pK locales de la li-
sina, hidrofobicidad
punto isoelctrico, etc.
Estos cambios pueden
quedar reflejados, en
principio, por cambios
Figura 5. Captacin en la actividad detectada mediante ensayos in vitro y en la eficacia,
celular de un polmero establecida utilizando ensayos in vivo. La fijacin a receptores se re-
por endocitosis.
duce progresivamente al aumentar la masa molecular del polmero,
lo que produce un descenso de la actividad cuando se utilizan ensa-
yos in vitro con tiempos de incubacin cortos. Sin embargo, la eficacia de la
protena se incrementa como consecuencia de los siguientes mecanismos:
a) Retraso en el aclaramiento renal de la protena que produce un incre-
mento en la semi-vida de eliminacin y en el valor del rea bajo la curva de
niveles sricos. Este ltimo parmetro refleja el "periodo de exposicin" y se
relaciona, en ocasiones, con la eficacia en modelos pK-pD.
b) Mayor estabilidad frente a los enzimas responsables de la degradacin
de peptidos y protenas frecuentemente como consecuencia del impedimento
estrico.
c) Menores efectos adversos debido a que el PEG reduce significativa-
mente la inmunogenicidad y antigenicidad de las protenas.
La pegilacin de interferones tambin produce cambios significativos en el
perfil farmacocintico-farmacodinmico que pueden suponer un progreso en el
tratamiento de la hepatitis C y otras indicaciones. La Figura 6 muestra el efecto
164 provocado en las concentraciones sricas del interfern--2a como consecuen-
cia de su conjugacin con el PEG. El efecto depende del tamao del polmero
y se ha considerado
que dos cadenas rami-
ficadas de 20 kDa pro-
porcionaban un perfil
farmacolgico idneo
para el desarrollo cl-
nico13.
Durante los pasa-
dos 20 aos han sido
estudiados numerosos
conjugados de prote-
nas con PEG (citotxi-
cos, antioxidantes, enzimas, trombolticos, citoquinas y factores de Figura 6. Farmacocintica
de interfern y dos
crecimiento hematopoytico, etc.) aunque slo algunos se encuentran
derivados pegilados.
en fase de desarrollo clnico. La conjugacin con PEG ha sido apli-
cada tambin a oligonucletidos y lpidos para aumentar su solubili-
dad, estabilizar las molculas, incrementar la permeabilidad o dismi-
nuir el aclaramiento14.
Los glicoconjugados son aquellos compuestos resultantes de la unin co-
valente de una fraccin glucdica con otro compuesto que puede ser protdico o
lipdico. La eritropoyetina recombinante es una glicoportena utilizada desde
hace ms de 10 aos en el tratamiento de la anemia renal. Su excrecin renal
es mnima, pero es ampliamente metabolizada en el hgado va receptores de la
galactosa. Los residuos de cido sialico eliminados en el proceso de biotrans-
formacin aseguran la estabilidad de la hormona y su actividad biolgica. El
metabolito desprovisto de cido sialico es rpidamente eliminado, siendo la se-
mi-vida de eliminacin de la eritropoyetina de 4-8 horas.
Diversos estudios experimentales han demostrado que hay una relacin
directa entre el contenido de cido sialico y la semi-vida de eliminacin de
las glicoprotenas, lo que ha sido un estmulo para la bsqueda de nuevas
molculas.
La darbepoetina alfa es un anlogo hiperglicosilado de eritropoyetina que
presenta distintas propiedades fsico-qumicas y biolgicas. La Figura 7 recoge
la estructura de ambas molculas estimulantes de la eritropoyesis as como la
evolucin de los niveles sricos obtenidos tras su administracin por va intra- 165
venosa. La principal consecuencia del cambio producido en el perfil farmacoci-
ntico ser de modifi-

cacin del intervalo
posolgico, que pasar
de 3 a 4 das con la
eritropoyetina a 7-14
das con NESP15.
En los ltimos
aos se han desarrolla-
Figura 7. Estructura y
do numerosas matrices polimricas biodegradables y biocompatibles
farmacocintica de
eritropoyetina y NESP.
que se han incorporado a microcpsulas, microesferas, nanoesferas e
implantes para conseguir una liberacin prolongada de pequeas mo-
lculas. Actualmente, algunos de estos polmeros se utilizan en el di-
seo de formulaciones parenterales de medicamentos obtenidos por biotecnolo-
ga16. Entre ellos destacan los poli (-hidroxicidos) como el ac.polilctico y el
ac.polihidroxibutrico y co-polmeros, especialmente el ac.lctico-ac.gliclico.
Estos productos no son inmunognicos y permiten, por sus propiedades fsico-
qumicas controlar la velocidad de liberacin de pptidos y protenas. El diseo
y fabricacin de estas formulaciones difiere de los habitualmente utilizados con
frmacos de bajo peso molecular que presentan, en general, una mayor estabili-
dad durante los procesos de separacin de fases, evaporacin de disolventes,
emulsin, atomizacin, etc. Estos procesos exigen temperaturas elevadas, con-
centraciones altas de tensoactivos, mezcla de disolventes, etc. que provocan, en
muchos casos, una degradacin acelerada de protenas. Para evitar la prdida
de actividad asociada a la degradacin qumica debe recurrirse a la liofilizacin
de las protenas, homogeneizacin de la suspensin protena-polmero, secado
por atomizacin en nitrgeno liquido, eliminacin del disolvente del polmero
con etanol y filtracin y secado bajo vaco17. Estas tcnicas han sido utilizadas
en el desarrollo de microesferas de liberacin controlada de protenas recombi-
nantes, como la hormona de crecimiento interfern-, interleuquina-2, calcito-
nina, hormona liberadora de tirotropina, etc.
La liberacin de las proteinas microencapsuladas en el organismo es un
proceso complejo e incluye habitualmente la hidratacin de las partculas, diso-
lucin del frmaco con difusin a travs de los poros de la matriz polimrica y
biodegradacin del polmero. La duracin del proceso de liberacin est condi-
166 cionada por diversos factores como la composicin del polmero, la presencia
de modificadores de la liberacin, etc.
La posibilidad de modular el proceso de liberacin ha permitido el diseo

de vacunas para administracin en dosis nicas. Las micropartculas (1-200
mm) del copolmero lctico-gliclico estn siendo utilizadas como portadores
de antgenos para la inmunizacin frente a bacterias, virus y parsitos. Sin em-
bargo, el progreso es lento debido a que no existe un consenso sobre la cintica
ptima de liberacin y por las dificultades para mantener la estabilidad fsica y
qumica de los antgenos.
La mayor complejidad de estas formulaciones en relacin con las de libe-
racin inmediata obliga a adoptar precauciones especiales en la optimizacin
de su produccin industrial. Los principales puntos crticos son la integridad de
la protena y el valor del Cmax en ratas, utilizado como parmetro farmacocin-
tico que refleja la eficacia del proceso de encapsulacin.
DISTRIBUCIN TISULAR Y CELULAR
La incorporacin de los frmacos a rganos y tejidos corporales es un pro-

ceso cintico complejo con una gran repercusin en la respuesta teraputica. La
velocidad de distribucin puede estar limitada por la perfusin sangunea o por
la permeabilidad lo que condiciona el acceso y permanencia en su lugar de ac-
cin. La fraccin de la dosis de un frmaco que alcanza finalmente los tejidos,
o incluso los espacios intracelulares, depende de numerosos factores, muchos
de ellos dependientes de sus propiedades fsico-qumicas. Por ello, las peque-
as molculas con un ptimo coeficiente de reparto acceden con facilidad a los
compartimentos perifricos y presentan valores elevados del volumen aparente
de distribucin, a diferencia de los pptidos y protenas que presentan valores
relativamente pequeos. El elevado peso molecular que presentan algunas bio-
molculas constituye un factor limitante de la distribucin tisular. Sin embargo,
en algunos casos es posible alcanzar el lugar de accin en concentracin sufi-
ciente para producir una respuesta teraputica adecuada.
La especificidad en la localizacin del lugar de accin de muchos frma-
cos obtenidos por Biotecnologa obliga a mayores exigencias en su perfil de
distribucin. El desarrollo de los factores de crecimiento y genes recombinates
para promover la angiognesis en el infarto de miocardio es un buen ejemplo
de la importancia de esta caracterstica farmacocintica18. La administracin 167
endovenosa del factor de crecimiento de fibroblastos (FCF) no produce res-
puesta angiognica en modelos experimentales de isquemia miocrdica. Por

ello ha sido necesario recurrir a la administracin directa en el miocardio, en el
saco pericrdico o en el espacio perivascular, para alcanzar la respuesta tera-
putica deseada. La eficacia de estas alternativas fue confirmada y evaluada
por medida del flujo y funcin miocrdica, aunque se hace preciso an aplicar
nuevas tcnicas, como la tomografa de emisin de positrones o la resonancia
magntica, para establecer, de forma ms precisa, la extensin de la respuesta
angiognica.
Una situacin ms problemtica se plantea cuando se precisa el acceso in-
tracelular de genes y oligonucletidos antisentido, cuya diana est localizada en
el compartimento citosol/ncleo19. Se han propuestos diferentes mecanismos pa-
ra explicar la internalizacin de estas molculas como la endocitosis en fase
fluida y la endocitosis mediada por receptores, ya que no hay evidencia de paso
por difusin pasiva, ni siquiera recurriendo a biomolculas neutras. En el mo-
mento actual la escasa capacidad de internalizacin y la inadecuada comparti-
mentalizacin intracelular constituyen un problema bsico en el progreso de la
teraputica antisentido. Recientemente se han desarrollado diferentes mtodos
fsicos (microinyeccin, permeabilizacin, electroporizacin, etc.), que mejoran
la captacin celular de los oligonucletidos en relacin a los mtodos conven-
cionales de conjugacin o aqullos que recurren a transportadores (liposomas,
lipoplexes, policationes, etc.). Tambin puede recurrirse a la administracin de
estos medicamentos en el tejido diana, como el fomivirsen administrado por in-
yeccin intravtrea directa en el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus.
La selectividad en la distribucin permite mejorar la relacin beneficio-
riesgo de numerosos medicamentos, lo que puede incrementar su potencial te-
raputico. Esta ltima consideracin ha vuelto a poner de actualidad el concep-
to de "bala mgica", idealizacin introducida por Paul Erlich hace casi un siglo
y que gracias a la Biotecnologa puede convertirse en una realidad20.
Los sistemas de transporte coloidal como liposomas, nanopartculas, mi-
crosferas, etc. han sido utilizados para prolongar el tiempo de circulacin de
numerosas molculas, protegerlas de la degradacin y dirigirlas a tejidos diana.
Estos sistemas tienen dificultades para acceder a los tejidos sanos, debido, en-
tre otros factores, a su tamao, especialmente si supera 20 nm, considerado el
tamao crtico para la mayora de los tejidos.
168 Los liposomas son opsomizados por las protenas plasmticas en la circu-
lacin sistmica y reconocidos por el sistema reticuloendotelial (SRE) acumu-
lndose preferentemente en el hgado. Los liposomas son vehculos adecuados

para el transporte de pptidos y protenas inmoduladoras debido a su absorcin
linftica y a la captacin y metabolismo por los macrfagos. Ello ha impulsado
el desarrollo de liposomas conteniendo interleuquina-2, factores de crecimiento
eritropoytico e interferones. Adems, los liposomas, como algunas macromo-
lculas, pueden acumularse tambin en los tumores debido a la falta de drenaje
linftico normal y a la lenta velocidad de difusin.
Para evitar o reducir la captacin por el SRE, se ha optado preferentemen-
te por incrementar la hidrofilidad superficial mediante sialoconjugados sintti-
cos y ms recientemente con PEG. Estos liposomas de lento aclaramiento han
sido utilizados para la vectorizacin activa y pasiva de medios diagnsticos y
teraputicos.
Las mayores dificultades se plantean para dirigir los liposomas a aqullos
tejidos donde normalmente no se acumulan. Ello ha obligado al desarrollo de
diferentes tipos de vectores como oligosacridos, oligonucletidos, pptidos,
protenas, vitaminas, anticuerpos monoclonales y receptores.
En principio sera posible dirigir los liposomas a todo tipo de clulas,
siempre que los vectores sean adecuados, aunque algunos problemas como el
acceso a los tejidos y el rpido aclaramiento pueden disminuir las posibilidades
teraputicas.
El desarrollo de los anticuerpos monoclonales representa una de las tcnicas
ms poderosas para dirigir frmacos, txicos, isotopos y enzimas a su lugar de
accin. El gemtuzumab es un anticuerpo recombinante humanizado dirigido fren-
te al antgeno CD33 y unido a la calicheamicina, un potente antibitico tumoral.
Se trata del primer frmaco vectorizado introducido en quimioterapia y ha sido
aprobado por la FDA a finales del ao 2000 en el tratamiento de la leucemia
mieloide aguda en casos de recidivas. Gemtuzumab se une al antgeno CD33, ex-
presado en el 80-90% de los pacientes con leucemia mieloide aguda, penetrando
en la clula y liberando el agente citotxico que provoca la muerte celular.
El potencial teraputico de estos agentes se ha incrementado desde la in-
troduccin de la tecnologa del hibridoma en los aos 70 y actualmente se dis-
pone de frmacos inhibidores de la reactividad aloninmune y autoinmune, anti-
tumorales, antiplaquetarios antivirales, etc. En Espaa se han introducido
recientemente transtuzumab, infliximab y rituzimab, aunque otros muchos se
encuentran en diferentes fases de desarrollo, alcanzando casi un 25% de todos
169
los productos obtenidos por Biotecnologa21.
A pesar de las ventajas potenciales que presentan al fijarse selectivamente

a las clulas diana, su incorporacin a la teraputica present mayores dificul-
tades de las inicialmente previstas. Entre ellas figuran la capacidad limitada de
penetracin tisular que depende, entre otros factores, de las dimensiones del
anticuerpo. Los anticuerpos convencionales son protenas de elevado peso mo-
lecular que presentan una baja capacidad de acceso a tejidos, especialmente
aqullos que tienen escasa vascularizacin. En teraputica oncolgica con anti-
cuerpos monoclonales, la relacin de concentraciones entre el tumor y la circu-
lacin sistmica se incrementa lentamente durante varios das debido a la eli-
minacin del anticuerpo y, en menor grado, a la captacin tumoral22.
METABOLISMO Y EXCRECIN
Los pptidos y protenas se eliminan del organismo por metabolismo y ex-

crecin renal. El metabolismo se produce principalmente por proteolisis en di-
ferentes localizaciones del organismo como consecuencia de la amplia disper-
sin que presentan los enzimas proteoliticos. La velocidad y extensin de la
degradacin metablica es muy variada y depende de la estructura qumica, va
de administracin etc.
El tracto gastrointestinal constituye el ambiente ms hostil para las prote-
nas debido a los numerosos enzimas proteolticos que se encuentran, a elevadas
concentraciones, a lo largo del tubo digestivo. La encapsulacin con materiales
entricos no es suficiente para proteger su integridad qumica durante el perio-
do de tiempo que transcurre entre la liberacin y la incorporacin a la circula-
cin sistmica. En el pasado se trat de superar este inconveniente asociando a
las protenas inhibidores enzimticos (p.e. aprotinina), pero actualmente su uso
est desaconsejado. Sin embargo, se han obtenido resultados esperanzadores in-
corporando las protenas en partculas biodegradables mucoadhesivas, que con-
tienen inhibidores metablicos unidos de forma covalente con diferentes pol-
meros23.
Una de las principales limitaciones de los agentes antisentido es la degra-
dacin enzimtica por las nucleasas que se produce en sangre y en el interior
de las clulas. La semi-vida de degradacin de los oligonucletidos que contie-
170 nen uniones fosfodiester es prxima a 5 minutos lo que impide su utilizacin
en clnica.
Ello ha impulsado el desarrollo de nuevos oligonucletidos ms estables

frente a las nucleasas y que mantengan su capacidad para fijarse al lugar de ac-
cin. Para mejorar la estabilidad metablica se han modificado las uniones fos-
fodiester, los azcares y las bases heterocclicas. Los derivados mejor conoci-
dos son los fosforotionatos en los que los tomos de oxgeno del fosfato han
sido sustituidos por azufre. Sin embargo, an estos derivados son metaboliza-
dos en animales experimentales en mayor extensin que las previsiones apoya-
das en los resultados de estudios en cultivos celulares. Por ello, se hace preciso
introducir mejoras en el perfil farmacocintico de los agentes antisentido, in-
crementando su estabilidad metablica24.
La excrecin renal se produce por los mismos mecanismos que afectan a
los frmacos de bajo peso molecular. Las macromolculas menores de 68
kDa podran experimentar una filtracin glomerular, aunque la capacidad de
filtracin depende tambin de la carga y rigidez de la molcula. La influen-
cia de la carga se pone especialmente de manifiesto con molculas cuyo ra-
dio es superior a 2 nm. Despus de la filtracin, los pptidos complejos y las
protenas son reabsorbidos en los tbulos proximales por endocitosis e hidro-
lizados a fragmentos peptdicos o aminocidos que retornan a la circulacin
sistmica. En consecuencia, slo cantidades mnimas de las protenas intac-
tas son detectadas en la orina. Los pptidos y protenas pueden tambin ex-
perimentar una secrecin tubular desde los capilares postglomerulares, acom-
paada tambin de una degradacin metablica. Esta va de eliminacin es
utilizada por diversas hormonas como calcitonina, insulina, vasopresina, an-
giotensina II, etc.
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172
Aplicaciones de la Biotecnologa Recombinante Vegetal a la teraputica humana
APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGA
RECOMBINANTE VEGETAL A LA TERAPUTICA
HUMANA
Fernando Ponz. Departamento de Biotecnologa. INIA, Madrid
DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGA VEGETAL
Aproximadamente, durante las dos ltimas dcadas se han producido, en

el conjunto de las actividades ligadas a la investigacin gentica en plantas,
una serie de innovaciones y cambios tecnolgicos que se han englobado bajo la
denominacin de biotecnologa vegetal, y que constituyen una verdadera revo-
lucin, ya no slo de la investigacin y el desarrollo agrario, sino de toda una
concepcin de la agricultura tradicional y de la utilizacin econmica de las
plantas. Sin duda, la capacidad de generar plantas transgnicas constituye una
de estas nuevas tecnologas sobre las que pivota el cambio global que se est
produciendo. Hoy da, prcticamente ya no hay ninguna especie vegetal culti-
vada importante para la que no se disponga de la capacidad de transgnesis.
Transgnesis vegetal mediante Agrobacterium tumefaciens
La transgnesis vegetal no se realiza en la actualidad de un modo nico.

173
Los primeros desarrollos, todava ampliamente utilizados, se basaron en la ca-
pacidad natural de la bacteria Agrobacterium tumefaciens y relacionados para

integrar de forma estable parte de su material gentico en el genoma de sus
plantas husped. La manipulacin subsiguiente del genoma de Agrobacterium
permiti disponer, en breve plazo, de vectores desarmados (exentos de la capa-
cidad de inducir enfermedad que poseen los aislados naturales de la bacteria)
para llevar a cabo integraciones estables de genes forneos. El clonaje de estos
genes en los vectores de Agrobacterium permite que la bacteria los integre en
el genoma de las futuras plantas transgnicas. En general, el proceso de trans-
formacin se complementa con un conjunto de tecnologas de cultivo in vitro
de tejidos vegetales, que permiten regenerar plantas enteras frtiles a partir de
determinados tejidos transformados cultivados. Como queda dicho, esta tecno-
loga de generacin de plantas transgnicas se utiliza todava ampliamente. Sin
embargo, ms recientemente se han desarrollado otras formas de transforma-
cin de plantas, lo cual a su vez ha permitido ampliar el abanico de especies
transformables.
Otros mtodos de transformacin de plantas
De entre todos los desarrollos habidos desde las primeras transformaciones

de discos de hojas de tabaco con Agrobacterium, merecen destacarse dos por la
simplicidad que han aadido al proceso. En primer lugar la biolstica, que im-
plica el disparo de microproyectiles de oro, wolframio, etc., recubiertos del
ADN que se desea integrar en el genoma de la planta. Esta tcnica permite evi-
tar el uso de la bacteria en el proceso de transformacin y es especialmente in-
teresante en los casos de especies vegetales que no son huspedes naturales de
la bacteria, como es el caso de los cereales (en general de las plantas monoco-
tiledneas). El otro desarrollo reciente es el que permite en algunas especies,
sobre todo experimentales, llevar a cabo la transformacin con la bacteria di-
rectamente sobre las flores, lo que posibilita la obtencin directa de semillas de
plantas transgnicas sin necesidad de recurrir al cultivo in vitro.
Genmica y protemica vegetales
Disponer de plantas transgnicas constituye un hito importante en el de-

174 sarrollo de la Biotecnologa Vegetal, pero no es el nico. En efecto, la capaci-
dad para el anlisis pormenorizado de los genomas vegetales, tanto en su ver-
tiente estructural como funcional, se ha desarrollado en paralelo con la trans-

gnesis y est empezando a permitir la racionalizacin de muchos de los pro-
cesos clsicos de la mejora gentica y, tambin de la propia transgnesis. La
nuevas disciplinas de la genmica y la protemica, cuyas aplicaciones al estu-
dio del genoma humano estn provocando toda una nueva forma de buscar y
disear frmacos, estn tambin teniendo un fuerte impacto en la Biotecnolo-
ga Vegetal. La conjuncin de ambas tecnologas supone un potencial enorme
de incidencia en procesos de desarrollo controlado de las plantas, as como de
su utilizacin para otras reas biotecnolgicas, como por ejemplo la farmacia.
Como en tantas otras ocasiones anteriores, el desarrollo tecnolgico ha permi-
tido poner de manifiesto conceptos de ndole ms fundamental, en un proceso
de alimentacin mutuo muy caracterstico de todas las actividades de I+D. As
por ejemplo, fenmenos como la cosupresin y el silenciamiento gnico me-
diado por ARN se han descubierto y estudiado por primera vez en plantas,
gracias al propio desarrollo tecnolgico de la Biotecnologa Vegetal. Tras su
descubrimiento en plantas, se ha demostrado en los ltimos 2-3 aos la exis-
tencia de fenmenos similares en animales, incluido el hombre, incluyendo to-
do un nuevo sistema de regulacin de la expresin gnica basado en micro-
ARNs. Las implicaciones de este descubrimiento en las aproximaciones
teraputicas a enfermedades, tanto genticas como infecciosas, se estn reve-
lando en la actualidad como de una enorme importancia.
GENERACIONES DE PRODUCTOS VEGETALES

BIOTECNOLGICOS
Primera generacin de plantas y productos vegetales

transgnicos
Las primeras variedades transgnicas de algunas plantas de gran cultivo

mundial como, por ejemplo, el maz, la soja, la colza o el algodn, ya han lle-
gado al mercado y tanto ellas como sus productos derivados estn en estos mo-
mentos en el centro de una fuerte polmica social que se est desarrollando en
varios frentes a diferentes niveles. Los ejemplos citados forman parte de lo que
se ha dado en llamar la primera generacin de plantas y productos transgni-
175
cos. La principal caracterstica de esta primera generacin de productos vegeta-
les transgnicos es que las modificaciones genticas que se les han introducido
van dirigidas a mejorar caractersticas de las plantas que son de inters funda-
mentalmente para sus productores, o sea, para los agricultores. As, plantas que
expresan constitutivamente un gen de una toxina para insectos procedente de
una bacteria, que sobreexpresan una enzima que inactiva la accin de un herbi-
cida o que son resistentes a una virosis gracias a la resistencia conferida por la
produccin en planta de fragmentos del propio virus, son plantas de un inters
obvio e inmediato para el productor primario. La OCDE, que ha venido estu-
diando intensamente el fenmeno de la Biotecnologa desde muchos ngulos
en los ltimos aos, ha definido esta primera generacin de cultivos transgni-
cos como que "se ha centrado en caractersticas agronmicas para conferir ma-
yores rendimientos en las cosechas mediante la reduccin de prdidas y espa-
ciamientos menores entre hileras, y para reducir costes de insumos mediante la
disminucin del uso de plaguicidas y herbicidas". Otras dos caractersticas de
los productos de la primera generacin son su irrelevancia para el consumidor
final, as como que no suponen un cambio de mercado. Se trata, en definitiva,
de plantas cuyos productos van dirigidos a los mismos mercados que sus pa-
rientes no transgnicas y que no suponen cambios sustanciales para el consu-
midor, excepto quiz su menor precio, consecuencia de unos menores costes de
produccin.
Segunda generacin de plantas y productos vegetales

transgnicos
Existen ya una segunda y una tercera generacin de plantas transgnicas,

cuya llegada al mercado se est produciendo an con timidez, pero de las que
se espera mucho mayor impacto comercial en los prximos aos. De nuevo se-
gn la OCDE, la segunda generacin de plantas transgnicas "se centra en una
serie de caracteres relacionados con la calidad, que mejorarn su uso en los sis-
temas de produccin de alimentos, as como sus caractersticas de uso finales.
Cosechas con modificaciones en las grasas, aceites y almidones para mejorar el
procesamiento y la digestibilidad, tales como sojas de alto contenido en cido
oleico, colzas de alto estearato o cido lurico (cultivndose ya en los Estados
Unidos), maz de bajo fitato o cido ftico. Desde un punto de vista industrial
176 se pueden esperar, por ejemplo, plantas de algodn coloreado que eviten o dis-
minuyan la necesidad de tintes qumicos (algunas ya disponibles)". Se aprecian
en esta segunda generacin algunos cambios sustanciales en relacin con la

primera. En primer lugar hay un cambio de mercado final. Las modificaciones
genticas ya no se hacen pensando fundamentalmente en el productor, sino en
el consumidor del producto final al cual se le proporciona un producto de ma-
yor calidad. Por supuesto, es posible combinar caractersticas tpicas de esta se-
gunda generacin con otras de la primera, si se desea o el mercado lo deman-
da. As por ejemplo, es posible producir patatas con unas caractersticas de
almidn ms adecuadas para su congelacin y fritura directa en freidora, que
adems sean resistentes al escarabajo de la patata mediante la expresin de la
toxina bacteriana. La otra caracterstica de algunos de los productos de la se-
gunda generacin es que presentan un aspecto de interfase con cuestiones ms
clsicamente relacionadas con problemas de salud humana que con considera-
ciones meramente agroalimentarias. Por ejemplo, la produccin de aceite de
soja con un mayor contenido en cido oleico se har teniendo muy en cuenta
factores de salud relacionados con enfermedades cardiovasculares, adems de
otros factores de produccin agraria. O algunas de las modificaciones en los
metabolismos de hidratos de carbono de plantas, como la patata o algunos ce-
reales, considerarn el tamao creciente de mercado que suponen los consumi-
dores diabticos.
Tercera generacin de plantas y productos vegetales

transgnicos
Si la segunda generacin de productos biotecnolgicos vegetales supone un

grado de sofisticacin considerable en relacin con los de la primera, ser as
ms an con los productos de la tercera generacin. La OCDE predice que estas
plantas "producirn ms factores de calidad de cara a un producto final tales co-
mo productos de nutricutica o 'alimentos funcionales', que son cosechas modi-
ficadas para producir medicinas o suplementos alimentarios en la planta. Estas
plantas podran inducir inmunidad a enfermedades o mejorar caractersticas sa-
nitarias de los alimentos tradicionales, por ejemplo colza con -carotenos o
arroz suplementado con vitamina A. Tambin se prevn plantas que fijen nitr-
geno con mayor eficacia, disminuyendo por tanto la necesidad de abonos o
plantas resistentes a la sequa, las inundaciones y las temperaturas extremas, as
como plantas que se puedan utilizar en procesos de biorremediacin de suelos y
177
aguas. Tambin se ha sugerido la posibilidad de producir plantas de algodn in-
combustible o que no se arrugue, o plantas de colza que produzcan plsticos

biodegradables (esto ya se ha conseguido)". Es, en estos productos de tercera
generacin, donde se producir el verdadero cambio que aporta la Biotecnologa
a la produccin vegetal. Los mercados a los que se dirigen estos productos pue-
den ser tradicionales del producto agrario, pero sern bsicamente mercados
nuevos. La interfase entre la produccin vegetal e industrias que son en estos
momentos ajenas a la agricultura, o utilizan productos agrarios de manera muy
minoritaria, se ver fuertemente incrementada cuando estos productos alcancen
masivamente el mercado. De entre todas estas industrias es quiz la industria
farmacutica la que se prev que se afecte antes en sus estructuras de produc-
cin de determinados productos por el impacto de la Biotecnologa Vegetal. Se
prevn dos niveles de impacto entre productos biotecnolgicos vegetales y la
produccin de medicamentos. El primero es el de utilizar las plantas como bio-
factoras de produccin de medicinas o productos de inters farmacutico. Esta
actividad constituye el factor ms importante de lo que se ha venido a llamar
"agricultura molecular" (molecular pharming) y se describe con algo ms de de-
talle en el siguiente apartado. La otra constituye una verdadera sntesis entre la
agricultura, la alimentacin y la farmacia y es la base de una nueva disciplina
cientfica emergente, la "nutricutica", como parte de un concepto ms general,
que es el del "alimento funcional". Conferir una funcionalidad sanitaria al hecho
de alimentarse supone profundizar en una tendencia creciente en las sociedades
avanzadas, como es la de la "comida sana", confiriendo al hecho de alimentarse
una vertiente curativa, o ms bien, y en mayor medida, preventiva. Quedan
mencionadas anteriormente las posibilidades de plantas con suplementos vitam-
nicos, pero quiz el paradigma de lo que puede ser esta nueva actividad farma-
cutica lo constituyan las llamadas "vacunas comestibles". Esta idea intenta ex-
plotar la inmunidad mucosal de las personas y los animales (tambin
aplicaciones veterinarias) mediante la presentacin de antgenos con potencial
vacunal a travs de alimentos procedentes de plantas transgnicas que expresen
dichos antgenos. Algunas de las primeras pruebas hechas en animales de expe-
rimentacin han resultado muy prometedoras y las pruebas clnicas ya han em-
pezado en algn caso. Adems de la posible implantacin de este tipo de vacuna
alimenticia en las poblaciones infantiles de pases desarrollados, lo cual resulta
algo cuestionable desde el punto de vista de la rentabilidad y ventajas econmi-
178 cas y de gestin, esta aproximacin presenta una vertiente social de indudable
valor, como es el poder alcanzar segmentos de poblacin que en estos momen-
tos no estn sometidos a programas de vacunacin, fundamentalmente por moti-

vos econmicos, especialmente en pases no desarrollados. Ello podra incluir
enfermedades infecciosas tropicales de baja incidencia en pases desarrollados,
como el clera, la malaria o la fiebre amarilla, para las que se podran plantear
vacunaciones fundamentadas en vacunas comestibles basadas en productos de
alto consumo (yucas, bananas, etc.).
PRODUCCIN DE FRMACOS EN PLANTAS
Produccin en plantas transgnicas
La agricultura molecular ha comenzado su andadura fundamentalmente

orientada a la produccin de frmacos en plantas y, de entre ellas, los primeros
productos que han despertado el mayor inters entre los biotecnlogos vegeta-
les han sido las protenas teraputicas. Existen ya en la literatura cientfica nu-
merosos ejemplos de plantas transgnicas productoras de protenas humanas
con valor teraputico. Los resultados obtenidos hasta el momento permiten ser
muy optimista con respecto a la evolucin creciente de esta tecnologa, pero al
tiempo ilustran con claridad la complejidad de situaciones que se pueden pro-
ducir al generar las plantas productoras. Algunos de los puntos que se estn re-
velando claves para el xito o el fracaso de esta aproximacin global son tan
variados como, por ejemplo, las enormes diferencias de expresin del transgn
que se encuentran en los distintos casos, la problemtica de extraccin de las
protenas producidas, el grado de similitud en el procesamiento post-traduccio-
nal de las protenas, etc. Cada uno de estos puntos va a requerir un esfuerzo de
afinamiento de las condiciones de produccin que necesitar soluciones par-
cialmente distintas para cada caso, por lo que es difcil, en estos momentos, ir
mucho ms all en las generalizaciones. En la actualidad no hay todava ningu-
na protena teraputica humana producida en plantas que se encuentre en el
mercado, pero ya hay algunas en las fases de pruebas clnicas. Quiz la ms
avanzada sea un anticuerpo producido en tabaco que se pretende utilizar, a tra-
vs de chicles de mascar, en el tratamiento y prevencin de las caries y enfer-
medades infecciosas de las encas. Los costes menores de produccin de gran-
des volmenes de un anticuerpo de estas caractersticas en plantas de tabaco
179
posiblemente permitan lanzar al mercado ese tipo de producto sin disparar el
precio para el consumidor final. Al margen de los problemas nuevos que se va-
yan poniendo de manifiesto en la produccin de frmacos en plantas segn se
vayan desarrollando los procesos, esta estrategia de produccin presenta algu-
nas ventajas inherentes respecto de los mtodos tradicionales de extraccin de
tejidos humanos y animales o de procesos de fermentacin. Queda ya mencio-
nado el probable menor coste, pero hay ms. Por ejemplo, el de la seguridad
sanitaria del frmaco. La reciente crisis de las encefalopatas espongiformes
bovinas, y su probable relacin con algunas enfermedades humanas del tejido
nervioso, ha puesto claramente de manifiesto el riesgo de arrastrar, desde teji-
dos animales en los procesos de extraccin, patgenos de difcil deteccin o
eliminacin. Este riesgo se elimina totalmente en las plantas, ya que stas no
permiten la multiplicacin de estos patgenos (priones, virus del SIDA, virus
de las diferentes hepatitis, etc.). Adems, las plantas pueden constituir el nico
sistema capaz de producir eficientemente ciertas protenas humanas, tales como
reguladores del crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que tendran un im-
pacto negativo en los animales transgnicos o en las clulas animales cultiva-
das en las que se expresaran. Otra consideracin es la de capacidad de produc-
cin del frmaco, la cual puede llegar a ser limitante en algunos casos. Un caso
citado con frecuencia de esta ltima situacin es el del potencial tratamiento
del cncer mediante inmunoterapia. Clculos efectuados en los Estados Unidos
predicen que cada paciente puede llegar a necesitar 10-200 mg de anticuerpo
recombinante antitumoral, lo cual, dado el ritmo de diagnstico de nuevos ca-
sos al ao (650.000 de cnceres de mama, pulmn y colon slo en los Estados
Unidos), puede llegar a crear una demanda de unos 130 kg por ao en ese pas.
Prcticamente, slo la produccin en plantas puede asegurar ese nivel de pro-
duccin a un precio razonable.
Produccin mediada por virus vegetales
El punto de la produccin de grandes cantidades del frmaco que se de-

sea producir ha puesto de manifiesto un problema al que se enfrentan las plan-
tas transgnicas como va de produccin. Como se ha mencionado previamen-
te, con la tecnologa disponible en la actualidad es prcticamente imposible
predecir los niveles de expresin del gen forneo que se alcanzarn en una l-
180 nea transgnica determinada y, de todas formas, parece razonable pensar que
la expresin a partir de un promotor tiene que presentar lmites cuantitativos
difciles de sobrepasar. Por otra parte, establecer un lnea transgnica producti-

va y genticamente estable puede llevar muchos meses, incluso aos. Situa-
ciones como la de los anticuerpos antitumorales, mencionada anteriormente,
son claramente incompatibles con estas limitaciones, pues se trata de frmacos
personalizados de los que se necesitan grandes cantidades en perodos breves
de tiempo (semanas a unos pocos meses). Este tipo de consideraciones, junto
con algunas otras de carcter ms cercano a la estrategia comercial, han hecho
que bastantes investigadores y empresas de Biotecnologa se hayan fijado en
los virus vegetales como vehculos de expresin de los genes forneos. Los
virus vegetales suelen ser agentes infecciosos muy simples genticamente, por
lo que su manipulacin gentica no resulta excesivamente compleja. General-
mente se multiplican hasta alcanzar niveles de acumulacin de viriones bas-
tante elevados, lo cual se encuentra tambin para algunos de sus productos g-
nicos individuales y, por extrapolacin, para protenas producidas a partir de
genes forneos introducidos en ellos. Adems, desde el punto de vista de la
rapidez de produccin, resulta mucho ms rpido generar un virus transgnico
que una planta transgnica. Estas caractersticas hacen de los virus vehculos
de expresin muy interesantes y que se estn desarrollando rpidamente en la
actualidad. Una consideracin adicional para algunas aplicaciones es que es
factible combinar ambas estrategias (plantas transgnicas y vectores virales),
lo cual permitira elegir lo mejor de ambas.
La estructura de la empresa biotecnolgica farmacutica

vegetal
El rpido desarrollo de la Biotecnologa Vegetal est contribuyendo tam-

bin, junto con otros desarrollos biotecnolgicos, a la profunda transformacin
que se est experimentando en la actualidad en la estructura empresarial de va-
rios sectores industriales ligados a las ciencias de la vida. Hay caractersticas
muy llamativas de la nueva situacin. Por un lado, surgen constantemente (sobre
todo en los Estados Unidos) nuevas pequeas empresas con un alto contenido
tecnolgico que contribuyen de manera muy significativa al rpido desarrollo de
la Biotecnologa. Muchas de estas empresas fracasan en su proyecto empresarial
o son finalmente absorbidas por otras empresas mayores. Por otro lado, este
proceso de absorcin empresarial se da tambin entre grandes empresas multina-
181
cionales, lo cual est generando una situacin de concentracin empresarial sin
precedentes. Otra caracterstica nueva es la de la creacin de un sector industrial

completamente nuevo, que se ha venido a denominar de empresas de ciencias
de la vida. Este tipo de empresas se diferencian de las clsicas empresas farma-
cuticas o de productos agrarios o alimentarios en que integran en su seno am-
bos mundos, reflejo de la interfase creciente entre ambas actividades, que se ha
comentado varias veces a lo largo de este artculo. En lo referente al futuro es
razonable pensar que ambas tendencias (nuevas pequeas empresas tecnolgicas
y grandes grupos empresariales) seguirn desarrollndose, creando una estructu-
ra de produccin farmacutica nueva. Sin embargo, el fenmeno es todava muy
reciente y habr que estar atento a su evolucin.
BIBLIOGRAFA
El nmero de trabajos que abordan de manera pblica los temas referidos a la produc-
cin de frmacos en plantas mediante Biotecnologa es an limitado, dada su relativa
novedad. Adems, bastantes de estos trabajos se publican en revistas especializadas de
investigacin en plantas de menor difusin en los ambientes mdicos o farmacuticos.
Sin embargo, en los ltimos aos se han publicado un nmero importante de buenos ar-
tculos de revisin sobre este tema, que proporcionan un visin general y un buen nivel
de informacin al lector interesado. Se presenta a continuacin, como orientacin, una
lista de algunas de estas revisiones.
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Innovacin tecnolgica y nuevas terapias
INNOVACIN TECNOLGICA Y
NUEVAS TERAPIAS. OBTENCIN
DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
TOTALMENTE HUMANOS:
PANITUMUMAB
Jos Luis Motelln. Amgen S.A.
La innovacin en la produccin de anticuerpos ha permitido

la produccin de anticuerpos totalmente humanizados. Un
claro ejemplo es el panitumumab. A lo largo de este captulo
se presentan las aportaciones y diferencias de este tipo de
anticuerpos sobre los tradicionales, y en concreto, las
ventajas clnicas del panitumumab en su uso en Oncologa.
INTRODUCCIN
Las terapias dirigidas se han convertido en la punta de lanza de la in-

novacin en nuevas tratamientos. Dentro de ellas, los anticuerpos son el
ejemplo ms claro y quizs ms revolucionario. Los anticuerpos monoclo-
nales estn cada vez ms instaurados en la farmacopea. Hoy en da, esta-
mos asistiendo a un nuevo paradigma en la produccin y utilizacin clni-
ca de estas terapias, con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales
totalmente humanos. Esta tecnologa presenta claras ventajas en su utiliza-
cin clnica sobre los anticuerpos monoclonales no totalmente humanos.
Entre ellos, el panitumumab representa el mejor ejemplo dentro del rea 185
de la Oncologa.
DESARROLLO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES TOTALMENTE

HUMANOS
Los anticuerpos son biomolculas de naturaleza proteica que se caracteri-

zan por poseer la capacidad de reconocer y unirse especficamente a un antge-
no. En el ao 1975, Kholer y Milstein describieron que si se fusionaban clulas
plasmticas productoras de anticuerpos con una clula de un tumor llamado
mieloma, se conseguan clulas, las llamadas hibridomas, que tenan las pro-
piedades de los dos tipos celulares iniciales, esto es: eran clulas productoras
de anticuerpos, como las clulas plasmticas y que podan mantenerse de ma-
nera indefinida en cultivo (como las clulas mielomatosas). La posterior selec-
cin de la mejor de dichas clulas y su expansin, dando lugar a un clon, per-
mita producir anticuerpos procedentes de un nico clon y, por lo tanto,
homogneos (anticuerpo monoclonales, AcM) en cantidades ilimitadas1. Ini-
cialmente, la inmunizacin con el antgeno para obtener las clulas plasmticas
se haca sobre roedores (habitualmente ratones), por lo que los AcM obtenidos
eran de ratn. Esto limitaba su utilizacin en la clnica, ya que su inyeccin en
humanos generaba una respuesta inmunolgica frente al propio AcM, la deno-
minada HAMA (siglas en ingls de Human anti-murine antibody) que neutrali-
zaba la posterior utilizacin del anticuerpo y limitaba su uso, en muchos casos,
a una nica administracin2,3. Por consiguiente, la investigacin en la utiliza-
cin teraputica de los AcM ha ido, en buena medida, dirigida a disminuir di-
cha capacidad inmunognica (3)
El primer intento ha consistido en producir AcM quimricos en los que la
regin variable del anticuerpo, que es la que se une al antgeno (aproximada-
mente un 34% de la protena), sigue siendo de origen murino, mientras que el
resto del anticuerpo es de origen humano4-6. Entre los AcM quimricos aproba-
dos para ser utilizados en la clnica estn, por ejemplo, rituximab (Rituxan),
cetuximab (Exbitux) e infliximab (Remicade). Si bien la utilizacin de es-
tos AcM quimricos ha reducido significativamente la inmunigenicidad de los
AcM, el desarrollo de anticuerpos humanos frente a la quimera (o respuesta
HACA, human anti-chimeric antibody) sigue siendo un problema potencial-
mente importante, que requiere monitorizacin de los pacientes a los que se les
186 administra, as como, en algunos casos, el tratamiento concomitante con corti-
costeroides3.
Otro avance en la minimizacin de la inmunogenicidad producida por

los AcM lo constituye la produccin de AcM 'humanizados', proceso inicial-
mente llamado reshaping con los que se consigue que los AcM contengan s-
lo un 5 a 10% de protena murina4. Esta tcnica consiste en utilizar tecnolo-
ga de DNA recombinante para insertar las regiones determinantes de la
complementariedad (CDRs- complementary determining regions) de origen
murino en un anticuerpo humano7. Con ello se esperaba poder eliminar prc-
ticamente la inmunogenicidad, aunque en realidad todava se sigue observan-
do respuesta inmunognica frente a dichos AcM humanizados, la llamada
HAHA (human anti-human antibody)3. Por otra parte, el proceso de humani-
zacin no es simple, ya que en ocasiones se compromete la afinidad por el
antgeno3,7. Bevacizumab (Avastin) y trastuzumab (Herceptin) son anti-
cuerpos humanizados.
La generacin de AcM totalmente humanos es un paso adelante en la con-
secucin de AcM todava ms seguros y eficaces3. Entre las tcnicas que se
han utilizado para producir AcM totalmente humanos, est la creacin de rato-
nes transgnicos (XenoMouse)4,8,9. La Figura 1 ilustra los pasos implicados
en la creacin del XenoMouse. En primer lugar, se toman clulas embriona-
rias de ratn, y mediante tcnicas de delecin de genes diana, se
inactivan los loci de los genes que codifican para la inmunoglobuli-
nas (Ig) endgenas de ratn. La descendencia consiste en ratones ho-
mocigticos incapaces de producir inmunoglobulinas murinas. A
continuacin se toman grandes fragmentos de DNA correspondientes Fig. 1. Tecnologa de la
produccin de
a la cadena pesada y la cadena ligera de las Ig humanas se clonan y
XenoMouse
se introducen tambin en
clulas embrionarias de
ratn. Finalmente, estas
dos cepas de ratones
(una incapaz de producir
Ig y otra que produce
tanto Ig humanas como
de ratn) se cruzan entre
s, para producir el Xe-
noMouse, que es capaz
de expresar Ig totalmen- 187
te humanas e incapaz de
producir las Ig murinas. Estas cepas de ratn se pueden utilizar para producir
hibridomas, con la diferencia de que los AcM producidos sern humanos y no
murinos (4).
PANITUMUMAB
Panitumumab es el primero de estos AcM totalmente humanos producidos

por tecnologa XenoMouse10 en incorporarse al arsenal teraputico, puesto
que el pasado 27 de septiembre de 2006, Amgen anunci la aprobacin por
parte de la FDA de panitumumab (con el nombre comercial de Vectibix) pa-
ra el tratamiento de pacientes con cncer colorrectal metastsico11. Por lo que
respecta a Europa, el pasado 28 de abril de 2006 fue presentada la solicitud de
autorizacin de comercializacin de panitumumab en la EMEA.
Panitumumab es un anticuerpo monoclonal IgG2 totalmente humano que se
une con alta afinidad al receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFr),
que se encuentra sobreexpresado en el 25-77% de los cnceres colorrectales12,13.
El bloqueo de la va de sealizacin del EGFr en las clulas cancerosas por pani-
tumumab determina no slo la inhibicin de la tirosina quinasa del receptor y la
proliferacin celular, sino tambin otros efectos que son crticos para la supervi-
vencia tumoral, crecimiento y metstasis10. A continuacin se resumen los datos
de los ensayos clnicos de panitumumab en cncer colorrectal.
Farmacocintica de panitumumab, bases para la dosificacin
Un estudio de fase 1 llevado a cabo por Weiner et al. en pacientes con

cncer colorrectal, de pulmn no microctico, renal, de prstata, pncreas o
esfago, evalu los datos farmacocinticos de panitumumab administrado a do-
sis de 0,01 mg/kg a 5 mg/kg una vez por semana, 6 m/kg/cada dos semanas y
9mg/kg/cada tres semanas. La dosis de 2,5 mg/kg/semana fue escogida como
dosis ptima sobre la base de la incidencia de exantema, saturacin del aclara-
miento no linear de panitumumab y consecucin de los niveles sricos asocia-
dos con la regresin tumoral en modelos. El modelado farmacocintico utiliza-
do en este estudio predijo que la dosis de 6 mg/kg/cada dos semanas y 9
188 mg/kg/cada tres semanas conseguiran concentraciones mnimas similares a 2,5
mg/kg/semana (aproximadamente 50 mcg/mL). Los resultados farmacocinti-
cos de los pacientes de este estudio confirmaron esto, y en consecuencia la do-

sis de 6 mg/kg/cada dos semanas se escogi para los ensayos de fase 314.
Eficacia teraputica en cncer colorrectal (CCRm)
Estudio pivotal de fase 3
Peeters et al. llevaron a cabo un estudio multicntrico, abierto, aleatorizado y

controlado de panitumumab administrado a dosis de 6 mg/kg/cada dos semanas
junto con el mejor tratamiento de soporte frente al mejor tratamiento de soporte
solo en pacientes con CCRm con progresin documentada radiolgicamente (du-
rante o en los seis meses tras la quimioterapia ms reciente consistente en fluoro-
pirimidinas, irinotecan y oxaliplatino), los pacientes tenan un estado funcional
ECOG de 0-2 y al menos un 1% de la membrana de las clulas tumorales presen-
taban tincin de EGFr por tcnica de inmunohistoqumica (evaluada centralmen-
te). A los pacientes en el brazo del tratamiento de soporte que progresaban se les
permita que se cruzasen a recibir panitumumab en un protocolo aparte. Las res-
puestas tumorales por RECIST modificado se analizaron mediante un proceso cie-
go de valoracin y revisin centralizada en las semanas 8, 12, 16, 24, 32, 40, 48,
y cada 12 semanas a partir de entonces hasta progresin. La valoracin principal
del estudio era determinar si panitumumab mejoraba la supervivencia libre de pro-
gresin frente al tratamiento de soporte. Otros objetivos eran seguridad, supervi-
vencia global, tasa de respuesta objetiva y duracin de la respuesta. Un total de
463 pacientes fueron aleatorizados (231 en el brazo de panitumumab ms trata-
miento de soporte y 232 en el brazo de tratamiento de soporte solo) con caracte-
rsticas basales bien equilibradas entre los dos grupos. Considerando todos los pa-
cientes, 67 (14%) tenan una puntuacin ECOG de 2, 172 (37%) haban recibido
al menos 3 lneas previas de quimioterapia (el 100% haba recibido al menos 2 l-
neas), y la mediana de edad era de 63 aos15.
Se observ una mejora significativa de la supervivencia libre de progre-
sin en el brazo panitumumab (p<0,0001) con una disminucin en la tasa de
progresin relativa del 46% en los pacientes que recibieron panitumumab fren-
te a los que recibieron tratamiento de soporte (HR= 0,54, IC 95%: 0,44, 0,66).
Ya en la primera valoracin programada para la semana 8, un mayor porcentaje
de pacientes estaban vivos sin progresin en el grupo panitumumab que en el
189
grupo control (49% vs 30%, respectivamente); con una diferencia que conti-
Tabla 1. Mejor respuesta objetiva de panitumumab ms mejor tratamiento de

soporte frente a tratamiento de soporte solo15
Panitumumab ms
Anlisis primario, tratamiento de soporte Tratamiento de soporte
Revisin centralizadaa (n= 231) solo (n= 232)
Respuesta parcial
- n (%) 19 (8) 0 (0)
Enfermedad estable -
n (%) 64 (28) 24 (10)
Control de la enfermedad
(RP ms EE) - n (%) 83 (36) 24 (10)
Tiempo hasta respuesta-
semanas
Mediana (min, mx) 8 (97, 15) n/a
Duracin de la respuesta-
semanas
Mediana (min, mx) 17 (4, 40) n/a
a PorRECIST modificado, las tasas de respuesta se confirmaron al menos 4 semanas tras la
consecucin del primer criterio de respuesta.
nuaba hasta las semana 40 (Figura 2). Un anlisis de subgrupos demostr un

efecto coherente de panitumumab en funcin del estatus del ECOG, regmenes
de quimioterapia previa, estatus del EGFr o la edad. Debido probablemente al
diseo cruzado, un anlisis interino de la supervivencia global mostr que no
Figura 2. Estimado
de Kaplan-Meiera
de supervivencia
libre de progresin
de panitumumab
ms tratamiento de
soporte frente a
190
a Anlisis
tratamiento de
primario, conjunto de todos los anlisis aleatorizados, radiologa
central. soporte solo15.
Tabla 2. La mejor respuesta objetiva de panitumumab ms tratamiento de

soporte en el Estudio Cruzado15
Revisin local Pacientes
Pacientes que recibieron
panitumumab 174
Respuesta completa - n (%) 1 (1)
Respuesta parcial- n (%) 16 (9)
Enfermedad estable - n (%) 55 (32)
Control de la enfermedad
(RP ms EE) - n (%) 72 (42)
haba diferencias entre los dos grupos con un hazard ratio de 0,93 (IC 95%:
0,73, 1,19). Las mejores respuestas objetivas vistas en este estudio y en el estu-
dio cruzado se resumen en las Tablas 1 y 215.
Ms pacientes en el grupo de panitumumab con tratamiento de soporte
frente al tratamiento de soporte slo presentaron toxicidades cutneas (91% vs
15% con exantema grado 3 /4 en el 14% y 0% respectivamente). Tambin se
observaron: fatiga (24% vs 15%), dolor abdominal (23% vs 17%), nusea
(22% vs 15%), y diarrea (21% vs 11%) respectivamente. Doce pacientes (5%)
presentaron potenciales reacciones a la infusin (ninguna fue de grado 3 /4); 1
paciente interrumpi panitumumab debido a una reaccin de hipersensibilidad
de grado 215.
Estudio de fase 2
Este estudio llevado a cabo por Malik et al. era multicntrico, abierto, de
un nico brazo para evaluar la seguridad y la eficacia de panitumumab en mo-
noterapia en pacientes con CCRm que haban fracasado al tratamiento con 5-
Fu con o sin leucovorin e irinotecn u oxaliplatino o ambos. La cohorte A in-
cluy pacientes con tincin de EGFr por inmunohistoqumica de 2+ 3+ en al
menos el 10% de las clulas tumorales y la cohorte B incluy pacientes con
suma de las tinciones de EGFr de 1+, 2+ y 3+ en al menos el 10% de las clu-
las tumorales, pero con suma de 2+ y 3+ en menos del 10% de las clulas tu-
morales. Panitumumab se administr como infusin IV a 2,5 mg/kg/semana
durante 8 ciclos hasta progresin de la enfermedad, toxicidad inaceptable o
191
muerte. Un total de 148 pacientes recibieron al menos una dosis de panitumu-
Tabla 3. Resultados de Eficacia para el estudio de fase 2 en monoterapia de

panitumumab en CCRm16
Parmetro de Cohorte A Cohorte B Total
eficacia (n= 105) (n= 43) (N= 148)
Respuesta global,
n (%) 7 (7%) 6 (14%) 13 (9%)
Enfermedad estable,
n (%) 36 (34%) 7 (16%) 43 (29%)
Enfermedad
progresiva, n (%) 35 (33%) 24 (56%) 59 (40%)
Medianaa (IC 95%)
Duracin de la
enfermedad estable
(Revisin
centralizada) 18,3 (16,7, 26,4) 26,1 (16,3, 35,9) 24,7 (17,0, 26,4)
Medianaa (IC 95%)
Supervivencia sin
progresin, semanas 16,0 (9,6, 16,4) 8,3 (8,0, 16,3) 13,6 (8,3, 16,1)
Medianaa (IC 95%)
Supervivencia
global, semanas 39,9 (23,3, 44,7) 37,5 (24,1, 47,7) 37,6 (25,6, 42,4)
aMediana de Kaplan-Meier
mab con una media de edad de 59 aos (21-88 aos), 111 (75%) con un estado
funcional ECOG de 1, y 65 (44%) haban recibido 3 agentes quimioterpicos
previos. Se observ control de la enfermedad en 43 (41%) de los pacientes en
la cohorte A y 13 (30%) de los pacientes en la cohorte B. La duracin mediana
de la enfermedad estable fue 18,3 semanas (IC 95% 16,7-26,4) para los pacien-
tes en la cohorte A y 26,1 semanas (IC 95% 16,3 - 35,9) para los pacientes en
la cohorte B. Los resultados de eficacia se muestran en la Tabla 316.
Los cuatro acontecimientos adversos grado 3/ 4 relacionados con el trata-
miento notificados con mayor frecuencia fueron exantema 5 (3%), fatiga 4
(3%), vmitos 2 (1%) y nusea 1 (1%). Acontecimientos adversos relacionados
con toxicidad cutnea fueron notificados por 141 pacientes (95%) y 5% eran
grado 3 y ninguno grado 4. Una reaccin relacionada con la infusin se obser-
192 v en un paciente que no requiri modificaciones de la dosis. No se observaron
anticuerpos anti-humanos en ninguno de los 145 pacientes testados16.
Estudios clnicos en primera lnea en CCRm
En un estudio de fase 2, de dos partes, brazo nico, llevado a cabo

en pacientes con CCRm, los pacientes fueron tratados con panitumumab
2,5 mg/kg/una vez por semana y IFL (parte 1) o FOLFIRI (parte 2; en-
mienda al protocolo debido a la toxicidad del esquema IFL). Los criterios
clave de eligibilidad incluyeron estatus ECOG de 0 1, no tratamiento
previo con quimioterapia, expresin de EGFr en al menos el 10% de las
clulas tumorales. La valoracin principal fue la incidencia de diarrea
grado 3 /4. Diecinueve pacientes se incluyeron en la parte 1 y 24 pa-
cientes en la parte 2, 14 (73%) y 19 (79%), respectivamente, de los pa-
cientes presentaron control de la enfermedad (incluye respuestas comple-
tas, respuestas parciales y enfermedad estable). La mediana de
supervivencia sin progresin fue de 5,6 meses y 10,9 meses, y la supervi-
vencia mediana global fue de 16,8 meses y no estimable (23 de los 24
pacientes seguan vivos en el momento del anlisis). La incidencia de
diarrea grado 3 /4 fue 11 (58%) y 6 (25%) para la parte 1 y la parte 2,
respectivamente. Todos los pacientes (de ambas partes) presentaron toxi-
cidad cutnea, de los cuales 3 (16%) y 4 (17%) eran de grado 3 /4 para
la parte 1 y parte 2, respectivamente. No se observaron reacciones a la
infusin graves o formacin de anticuerpos anti-humanos inducidos por
panitumumab 17.
CONCLUSIN
La innovacin tecnolgica en el desarrollo de AcM ha ido en la lnea de

disminuir cada vez ms el componente exgeno, generalmente murino, de los
mismos para minimizar su inmunogenicidad, lo que se espera que se asocie
con una mejora en su perfil de eficacia y seguridad. Panitumumab es el primer
AcM totalmente humano aprobado para ser utilizado en la clnica. En concreto,
la FDA lo ha aprobado para el tratamiento de pacientes con cncer colorrectal
metastsico con sobreexpresin de EGFr en progresin durante o despus del
tratamiento con esquemas de quimioterapia que contengan fluoropirimidinas,
irinotecan y oxaliplatino18. Actualmente, panitumumab est en fase de registro 193
por la EMEA.
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194 15. Peeters M, Van Cutsem E, Siena S, et al. A phase 3, multicenter, randomized con-
trolled trial (RCT) of panitumumab plus best supportive care (BSC) vs BSC alone
in patients (pts) with metastatic colorectal cancer (mCRC). 97th AACR Annual Mee-
ting April 1-5, 2006: Washington, DC. 2006;Abstract CP-1 y Presentacin (Presen-
tacin disponible en la pgina web del congreso a travs del siguiente enlace:
http://www.aacr.org/page5911.aspx# (Fecha de acceso: 3 de abril de 2006).
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col. 2005;Abstract 3520 y Pster.
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rouracil, leucorvorin, and irinotecan (IFL) or folfiri for first-line treatment of metas-
titic colorectal cancer (MCRC). Proc Am Soc Clin Oncol: Gastrointestinal Can
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wwwext.amgen.com/medpro/vectibix_pi.html. (Fecha de acceso, 28 de Noviembre
de 2006).
195
Evaluacin de medicamentos biotecnolgicos en la EMEA
EVALUACIN DE MEDICAMENTOS
BIOTECNOLGICOS EN LA AGENCIA EUROPEA
DE MEDICAMENTOS (EMEA)
BWP (GRUPO DE BIOLGICOS) Y CHMP
(COMIT DE MEDICAMENTOS DE USO HUMANO)
Sol Ruiz y Gonzalo Calvo
Agencia Espaola de Medicamentos y Productos Sanitarios
ABREVIATURAS
BWP Biologics Working Party (previamente Biotechnology Working

Party)
CHMP Committee for Human Medicinal products (previamente CPMP)
COMP Committee for Orphan Medicinal Products
CPMP Committee for Proprietary Medicinal Products (actualmente
CHMP)
CVMP Committee for Veterinary Medicinal Products
EM Estado(s) Miembro(s)
EMEA European Medicines Agency 197
HMCP Committee for Herbal Medicinal Products
ICH International Conference for Harmonization of Technical Requi-

rements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
OMS Organizacin Mundial de la Salud
PhEur Farmacopea Europea
RMS Reference Member State
UE Unin Europea
INTRODUCCIN
Durante la dcada de los 80, los avances en ingeniera gentica y en el

establecimiento y cultivo de lneas celulares han permitido la obtencin de
multitud de protenas teraputicas (ej. eritropoyetina, hormona de crecimien-
to, interfern) que nunca hubiese sido posible obtener en cantidad suficiente
de sus fuentes naturales. Adems, el desarrollo de las tcnicas de ingeniera
de protenas ha permitido disponer de protenas modificadas respecto a sus
equivalentes naturales que presentan una mejor eficacia clnica, un mejor
perfil de seguridad o una nueva aplicacin teraputica. As, se encuentran
disponibles anlogos de insulina o eritropoyetina, (ej. insulina lispro, darbe-
poetin alfa), protenas de fusin que combinan caractersticas de dos prote-
nas diferentes (ej. etanercept), protenas conjugadas a polietilnglicol (ej.
peginterferon, pegfilgrastim) o anticuerpos monoclonales "humanizados" (ej.
alemtuzumab).
Desde la creacin de la agencia europea de medicamentos (EMEA) en
1995, la evaluacin de estos medicamentos obtenidos mediante tecnologa
del ADN recombinante se realiza, por requerimiento legal, mediante un pro-
cedimiento de tipo centralizado, es decir, efectuado en todos los pases de la
Unin Europea a la vez y coordinado por la EMEA. Hasta la fecha se han
autorizado ms de 70 productos biotecnolgicos y se espera que este nmero
siga aumentando durante los prximos aos. Adems, la investigacin en
nuevos sistemas de expresin permitirn obtener medicamentos biotecnolgi-
cos de fuentes "menos convencionales" como por ej. animales transgnicos o
plantas. As, la EMEA autoriz en junio de 2006 el primer medicamento bio-
tecnolgico (antitrombina III humama recombinante) producido en la leche
198 de cabras transgnicas. Otros productos obtenidos en conejos transgnicos,
tales como C1 inhibidor, lactoferrina y fibringeno humanos, se encuentran
en fase de desarrollo clnico o preclnico. Otros medicamentos considerados

de alta tecnologa incluyen las denominadas "terapias avanzadas" que inclu-
yen terapia gnica, terapia celular somtica e ingeniera de tejidos. Las solici-
tudes de comercializacin para estos productos se evalan tambin mediante
el procedimiento centralizado (solamente la autorizacin de ensayos clnicos
es responsabilidad nacional).
La legislacin comunitaria actual permite la autorizacin de medica-
mentos biosimilares, es decir, medicamentos biotecnolgicos equivalentes a
otros ya autorizados y cuya patente ha expirado. Su autorizacin es tambin
mediante el procedimiento centralizado coordinado por la EMEA. Hasta
ahora se han autorizado dos medicamentos (ambos son preparaciones de
hormona de crecimiento humana recombinante) siguiendo esta nueva va de
autorizacin.
Marco legal y bases para la creacin de una agencia europea de

evaluacin de medicamentos
Los fundamentos de la Unin Europea (UE) se recogen en el Tratado de

Roma, ratificado inicialmente por seis pases en 1957. Aunque el tratado com-
prometa a sus signatarios a establecer un amplio rango de medidas de armoni-
zacin, dejaba la organizacin de la sanidad y los sistemas de seguridad social
a la decisin de cada pas. Cada estado miembro (EM), por tanto, desarroll su
propia regulacin farmacutica.
Desde 1965 (fecha de adopcin de la primera directiva de la UE), la legis-
lacin farmacutica comunitaria ha buscado dos objetivos fundamentales: la
proteccin de la salud pblica y la creacin de un mercado comn que permita
la libre circulacin de medicamentos.
La Comisin Europea (en adelante referida como Comisin) comenz
en 1965 a promulgar Directivas (del ingls, Directives), es decir, leyes o
disposiciones comunitarias de carcter obligatorio, relacionadas con la re-
gulacin farmacutica. La Directiva 65/65/EEC del Consejo de 26 de ene-
ro de 1965 estableci el principio de concesin de autorizaciones de comer-
cializacin de especialidades farmacuticas en todos los EM sobre criterios
cientficos de calidad, seguridad y eficacia, sin tener en cuenta considera-
ciones de tipo socioeconmico. Diez aos ms tarde, los EM consolidaron
199
la experiencia adquirida y se pusieron de acuerdo sobre principios comunes
para la autorizacin y control de medicamentos de uso humano (Directivas

75/318/CEE y 75/319/CEE del Consejo de 20 de mayo de 1975). No obs-
tante, cada EM mantena la responsabilidad de conceder o denegar la auto-
rizacin para comercializar cada medicamento en particular. Actualmente,
tanto las directivas citadas anteriormente como otras relacionadas con me-
dicamentos humanos han sido derogadas y sustituidas por la Directiva
2001/83/EC del 6 de noviembre, posteriormente modificada y ampliada por
la Directiva 2003/63/EC del 25 junio. Estas dos directivas constituyen ac-
tualmente la legislacin bsica que regula los medicamentos para uso hu-
mano. Otra directiva posterior, 2004/27/EC, y la Regulacin (EC) No.
726/2004 modifican y delimitan tambin el mbito de aplicacin de la di-
rectiva 2001/83/EC.
En 1977, el denominado Comit de Especialidades Farmacuticas o
CPMP (Committee for Proprietary Medicinal Products), formado por repre-
sentantes de todos los EM y de la Comisin, a solicitud de un EM o de la Co-
misin, poda emitir un dictamen consultivo sobre temas relacionados con la
autorizacin de medicamentos y sobre el control de reacciones adversas de los
mismos (farmacovigilancia).
En 1981, se adoptaron provisiones similares para medicamentos de uso
veterinario (Directivas 81/51/CEE y 81/52/CEE del Consejo de 28 de septiem-
bre de 1981), incluyendo la creacin del Comit de Medicamentos Veterina-
rios o CVMP (Committee for Veterinary Medicinal Products). Al igual que pa-
ra medicamentos humanos, estas directivas han sido sustituidas por otra ms
reciente, la Directiva 2001/82/EC.
La creacin de estos comits supuso tambin el inicio de un procedimien-
to coordinado de evaluacin, con dictamen no vinculante, que marc un paso
importante en la cooperacin entre EM. Aparte de los procedimientos de regis-
tro nacionales, las compaas farmacuticas podan utilizar dos tipos de proce-
dimiento de registro comunitario: el "procedimiento multi-estado" (amplia-
cin de la autorizacin existente en un EM a dos o ms de los restantes EM) o
el "procedimiento de concertacin" (evaluacin coordinada de la solicitud de
autorizacin en todos los EM; ningn EM poda tomar una decisin individual
sobre una autorizacin de comercializacin antes de su discusin previa y dic-
tamen por el CPMP). Este ltimo procedimiento estaba reservado a los medica-
200 mentos obtenidos por procesos biotecnolgicos y para otros medicamentos de
alta tecnologa.
Con el objeto de colaborar con el CPMP en determinados aspectos de la

evaluacin de medicamentos, se crearon grupos de trabajo sobre calidad, se-
guridad y eficacia con objeto de aproximar la forma en que cada EM pona en
prctica las obligaciones derivadas de las directivas comunitarias. Estos gru-
pos de trabajo han tenido su continuacin en grupos equivalentes en el seno
de la EMEA.
Primeros pasos en la creacin del Grupo de Biotecnologa
En 1985 se cre el denominado Ad Hoc Working Group on Biotechno-

logy/Pharmacy (precedente del grupo de Biotecnologa de la EMEA) con dos
objetivos fundamentales: asesorar al CPMP sobre solicitudes de autorizacin de
productos biotecnolgicos y establecer recomendaciones especficas sobre la
produccin y control de calidad y seguridad de estos productos.
Esta segunda finalidad se llev a cabo mediante la elaboracin de di-
rectrices o "guidelines" (i.e. disposiciones de carcter no obligatorio basa-
das en los conocimientos cientficos del momento sobre un aspecto concre-
to). Se ha preferido la utilizacin de directrices, que no obligan
jurdicamente, en vez de un instrumento jurdico formal, como una directiva,
con el fin de mantener la flexibilidad y no poner obstculos legales al pro-
greso cientfico. Se admite que en algunos casos, como resultado de los
avances cientficos, pueda ser adecuado otro enfoque. Sin embargo, cuando
un solicitante decida no seguir una determinada directriz debe explicar y
justificar dicha decisin en los informes que presente la compaa en apoyo
de su solicitud.
El Ad Hoc Working Group on Biotechnology/Pharmacy estaba formado
por expertos (alrededor de 20) procedentes de diferentes reas relacionadas
con la Biomedicina, desde autoridades reguladoras, laboratorios nacionales
de control o investigadores, y un representante (observador) de la Farmaco-
pea Europea (PhEur). En esta etapa inicial se completaron y/o iniciaron va-
rias directrices sobre citoquinas, anticuerpos monoclonales y reduccin del
riesgo de transmisin de encefalopatas espongiformes a travs de medica-
mentos. Este grupo ha tenido continuacin como el Biotechnology Working
Party (BWP) dentro de la estructura de la EMEA. Recientemente este grupo
ha pasado a denominarse Biologics Working Party (BWP), aunque sus funcio-
201
nes no han variado.
LA AGENCIA EUROPEA DE MEDICAMENTOS. PROCEDIMIENTOS

DE AUTORIZACIN
A finales de 1990 se publicaron varias propuestas relacionadas con la cre-

acin de la agencia y el nuevo sistema comunitario para autorizacin de medi-
camentos. En 1993 se decidi fijar la sede de la EMEA en Londres y comenz
a funcionar como tal en febrero de 1995. La funcin principal de la EMEA es
coordinar y organizar el sistema de autorizacin de medicamentos en Europa.
Este sistema evala cualquier solicitud de comercializacin bien mediante el
denominado "procedimiento centralizado" (autorizacin de comercializacin
en todos los pases de la UE a la vez; decisin unnime o por mayora) o "des-
centralizado" (tambin conocido como "reconocimiento mutuo", equivalente
al anterior procedimiento "multi-estado" (extensin de la autorizacin existente
en un EM a otros). El procedimiento centralizado de autorizacin est regla-
mentado por la Regulacin (EC) No. 726/2004. Este procedimiento es obliga-
torio para los medicamentos que se describen a continuacin:
medicamentos obtenidos a partir de tecnologa del ADN recombinante, o
de la expresin controlada de genes que codifican protenas biolgica-
mente activas en procariotas o eucariotas, incluyendo las clulas de ma-
mfero transformadas, u obtenidos a partir de hibridomas o que emplean
anticuerpos monoclonales durante su produccin
medicamentos veterinarios empleados como potenciadores para aumen-
tar el crecimiento o rendimiento de los animales tratados
medicamentos humanos para el tratamiento del sndrome de inmunodefi-
ciencia adquirida, cncer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas.
A partir de 2008 tambin ser aplicable a enfermedades autoinmunes u
otras alteraciones inmunitarias y para enfermedades virales.
Medicamentos hurfanos (segn la Regulacin (EC) No 141/2000).
Existen actualmente cuatro comits cientficos dentro de la EMEA:
CHMP (comit de medicamentos humanos; previamente CPMP), CVMP (co-
mit de medicamentos veterinarios), COMP (Committee for Orphan Medicinal
Products; encargado de la concesin este tipo de clasificacin a un medica-
mento) y HMPC (Committee for Herbal Medicinal Products; encargado de
202 plantas medicinales). Cada uno de estos comits est formado por un represen-
tante de cada uno de los EM. La EMEA acta como el eje central del sistema
europeo, organizando y coordinando el trabajo de evaluacin que es llevado a

cabo por expertos nacionales de cada una de las agencias reguladoras.
EVALUACIN DE MEDICAMENTOS DE USO HUMANO Y

VETERINARIO: EL CHMP Y CVMP
Desde la creacin de la EMEA, ambos comits de medicamentos humanos y

veterinarios, CHMP y CVMP, respectivamente, continan su labor mediante reu-
niones mensuales de varios das de duracin. Una gran parte de la agenda consiste
en la discusin y emisin de dictmenes respecto a nuevas solicitudes de comer-
cializacin, bien por el procedimiento centralizado o por el descentralizado. En el
procedimiento centralizado, dos miembros del comit (representantes de pases
distintos) son designados como ponentes (rapporteur y co-rapporteur) para coor-
dinar la evaluacin de cada solicitud. Tras la evaluacin en el mbito nacional, los
informes de cada uno de los ponentes son discutidos en las reuniones del comit
cientfico correspondiente (CHMP o CVMP), y se emite un informe final vincu-
lante sobre dicho producto. La decisin final se transmite a la Comisin, que con-
vertir dicha opinin en una nica autorizacin de comercializacin para toda la
UE. Solamente quedan a decisin nacional los aspectos relacionados con el precio
del medicamento y su posible financiacin por el sistema nacional de salud.
El procedimiento descentralizado est basado en el principio de reconoci-
miento mutuo de autorizaciones nacionales. Permite la extensin de una autori-
zacin de comercializacin dada por un EM (denominado EM de referencia o
RMS) a otro(s) EM identificados por el solicitante. Cuando no sea posible lle-
gar a un acuerdo porque algn EM no acepte la autorizacin nacional original
concedida por el RMS, los puntos de desacuerdo sern discutidos en el recien-
temente creado Grupo de Coordinacin. Si el desacuerdo permanece, la deci-
sin del comit correspondiente (CHMP o CVMP) es siempre vinculante.
Independientemente del procedimiento seguido, la decisin final es toma-
da por la Comisin Europea o, en caso de desacuerdo importante entre EM,
por el Consejo de la UE.
Aquellos productos que vayan a comercializarse nicamente en un EM
pueden continuar utilizando la va de autorizacin nacional (como se ha descri-
to anteriormente, los productos biotecnolgicos nunca podran utilizar esta va
203
de autorizacin).
Grupos de trabajo del CHMP
Con objeto de emitir una opinin sobre cualquier cuestin planteada a la

EMEA relacionada con medicamentos, el CHMP cuenta con el apoyo de gru-
pos de trabajo que le asesoran en aspectos especficos relacionados con la cali-
dad, eficacia y seguridad de medicamentos y que participan en las actividades
de armonizacin internacionales (ICH).
Actualmente existen diferentes grupos de trabajo del CHMP y uno conjun-
to del CHMP/CVMP:
Grupo de Biolgicos (Biologics Working Party o BWP - previamente
Biotechnology Working Party): asesora al CHMP y COMP sobre aspec-
tos relacionados con la produccin y control de productos biolgicos y
biotecnolgicos.
Grupo de Eficacia (Efficacy Working Party o EWP), responsable de
elaborar recomendaciones metodolgicas en reas teraputicas estableci-
das y documentos de opinin sobre aspectos de eficacia de medicamen-
tos en reas en desarrollo clnico.
Grupo de Seguridad (Safety Working Party, SWP), discusin y reco-
mendaciones sobre aspectos de seguridad preclnicos.
Grupo de Farmacovigilancia (Pharmacovigilance Working Party,
PhWP), grupo de discusin y evaluacin de aspectos relacionados con la
seguridad o cambios en la relacin riesgo/beneficio de medicamentos
autorizados.
Grupo de Hemoderivados (Blood Products Working Group, BPWG),
encargado de aspectos de seguridad y evaluacin clnica de productos
derivados de sangre o plasma humanos.
Grupo de Vacunas (Vaccine Working Party, VWP), evaluacin y discusin
de aspectos relacionados con la calidad, eficacia y seguridad de vacunas;
Grupo de Terapia Gnica (Gene Therapy Working Party, GTWP), gru-
po asesor en temas de terapia gnica.
Grupo de Terapia Celular e Ingeniera de Tejidos (Working Party on
Cell-based Products, CTWP); grupo asesor en temas de terapia celular e
ingeniera de tejidos.
204 Grupo de Biosimilares (Similar Biological (Biosimilar) Medicinal Pro-
ducts, BMWP), grupo encargado de aspectos de seguridad y evaluacin
clnica de medicamentos biolgicos o biotecnolgicos que se presentan

como equivalentes a otro ya autorizado.
Grupo de Farmacogentica (Pharmacogenetics Working Party, PgWP),
grupo asesor del CHMP en materias relacionadas con farmacogentica.
Grupo de Calidad (Quality Working Party, QWP), grupo conjunto del
CHMP y CVMP para armonizar y asesorar sobre aspectos de calidad de
medicamentos humanos y veterinarios.
El grupo de Biolgicos (BWP)
Desde 1995 hasta ahora el BWP viene celebrando unas 10-12 reuniones
anuales, de varios das de duracin, en la sede de la EMEA. Este grupo est
formado por un representante de cada uno de los EM de la UE, un representan-
te de la Comisin, un representante de la Farmacopea Europea, personal tcni-
co de la EMEA y, desde febrero de 2000, un representante de Noruega y otro
de Islandia se han incorporado como miembros de pleno derecho (presentes
desde 1999 en calidad de observadores).
El BWP es responsable de proporcionar asistencia tcnica al CHMP sobre
aspectos relacionados con la fabricacin y control de medicamentos biotecno-
lgicos y de origen biolgico, incluyendo aquellos derivados de sangre o plas-
ma y productos inmunolgicos. El BWP es tambin el grupo asesor del COMP
para productos de origen biolgico o biotecnolgico y de la OMS en aquellos
casos en que este organismo lo solicite.
Las actividades principales del BWP se describen a continuacin:
Elaboracin de informes sobre los procesos de produccin y control de
las solicitudes de comercializacin de medicamentos humanos de origen
biolgico y biotecnolgico. Los aspectos relacionados con la calidad de
este grupo de medicamentos se discuten en la reunin correspondiente
del BWP y se emite un informe para su consideracin por el CHMP
que, tras la discusin de los aspectos toxicolgicos y clnicos del medi-
camento en cuestin, emitir un dictamen final sobre la aprobacin o re-
chazo de la solicitud correspondiente.
Elaboracin de directrices o recomendaciones europeas e internacio-
nales sobre temas especficos relacionados con productos biolgicos
y biotecnolgicos. Al igual que el resto de grupos de trabajo, una de 205
las tareas fundamentales del BWP es la elaboracin de directrices o
recomendaciones, que sern despus aprobadas por el CHMP, sobre

temas especficos relacionados con productos biolgicos y biotecno-
lgicos. Con este fin, se suelen crear subgrupos dentro del BWP que
elaboran un documento inicial sobre un tema especifico que es discu-
tido posteriormente en las sesiones plenarias del BWP. En general,
las directrices elaboradas por el BWP son objeto de evaluacin conti-
nua a medida que se producen avances cientficos en temas especfi-
cos. Expertos del BWP participan tambin en grupos de trabajo inter-
nacionales para armonizar criterios y recomendaciones entre la UE,
Norteamrica y Japn (actividades ICH) sobre este grupo particular
de medicamentos.
El BWP tambin proporciona asesoramiento al CHMP en forma de docu-
mentos de opinin o recomendaciones puntuales (Points to Consider) sobre as-
pectos concretos relacionados con un grupo particular de medicamentos (p. ej.
aspectos relacionados con la evaluacin de posibles vacunas de gripe atenua-
das), introduccin de nuevos requerimientos de control (p. ej. test de PCR para
la deteccin del virus de la hepatitis C en volmenes de plasma para la obten-
cin de hemoderivados), etc.
Asesoramiento cientfico. Las compaas farmacuticas tienen la posibi-
lidad de solicitar asesoramiento cientfico en cualquier momento durante
el desarrollo de un medicamento previo a la presentacin de una solici-
tud de autorizacin de comercializacin o antes de introducir determina-
dos cambios en la fabricacin de un medicamento ya autorizado. El ase-
soramiento en aspectos de produccin y control de medicamentos
biotecnolgicos lo realiza el BWP.
Organizacin de "workshops" y reuniones sobre temas relacionados con
medicamentos biolgicos y biotecnolgicos. El BWP organiza reuniones
con expertos europeos e internacionales con objeto de discutir los lti-
mos avances cientficos en determinadas reas que permitan la elabora-
cin de recomendaciones especificas, p. ej. productos de terapia gnica,
ensayos para la deteccin de marcadores de encefalopatas espongifor-
mes y su posible aplicacin a medicamentos, etc. El BWP tambin lleva
a cabo reuniones con representantes de la industria farmacutica impli-
cados en temas concretos con objeto de evaluar las implicaciones o con-
206 secuencias de la introduccin de determinadas medidas de control o de
discutir la aplicacin de las mismas de forma coordinada, p. ej. con re-
presentantes de fabricantes de gelatinas y derivados de grasas animales

empleados en la fabricacin de medicamentos.
Reuniones con otros grupos de trabajo de la EMEA y de la PhEur.
Miembros del BWP participan tambin en reuniones conjuntas con
miembros de otros grupos de trabajo con objeto de coordinar y facilitar
la adopcin de recomendaciones concretas, p. ej. la discusin sobre as-
pectos de seguridad del tiomersal (empleado en la fabricacin de deter-
minadas vacunas) se llev a cabo junto con los Grupos de Seguridad
(SWP) y el de Farmacovigilancia (PhWP). Miembros del BWP tambin
forman parte de grupos de trabajo de la PhEur para coordinar activida-
des y recomendaciones en temas relacionados con el control de calidad
de productos biolgicos y biotecnolgicos en general.
WEBLIOGRAFA
www.emea.europa.eu Informacin adicional sobre el BWP y actividades de la EMEA
en general (incluyendo los documentos elaborados por los gru-
pos de trabajo)
pharmacos.eudra.org Regulacin relacionada con la autorizacin de medicamentos
en la Unin Europea
207
Impact of pharmacogenetics on drug use
IMPACT OF PHARMACOGENETICS ON DRUG USE IN

INDIVIDUALLY OPTIMISED PHARMACOTHERAPY
Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl MPharm. Department of Hospital Pharmacy.
Erasmus University Medical Centre Rotterdam. The Netherlands
Traditional pharmacotherapy is rather inefficient; on

average only 40% of patients will benefit from a particular
drug as compared with placebo. Interindividual variability in
drug disposition and effect can be partly explained by
genetic variants. In the science of pharmacogenetics the
influences of genetic differences on patients' drug response
are studied. The major causes of inefficient drug treatment
(like lack of effectiveness or the occurrence of side effects
or toxicity) are heterogeneity of the disease, variations in
drug disposition (pharmacokinetics) and drug response
(pharmacodynamics).
Genetic variants can be detected by amplification of DNA
using the Polymerase Chain Reaction (PCR) followed by
sequence analysis. Other techniques, like micro-arrays,
enable us to screen the whole genome.
The influence of pharmacogenetics becomes more and more
important in clinical practice and on drug development. In
this review we will discuss the principles of
pharmacogenetics and the practical implications, illustrated
with examples taken from clinical practice.
Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!
INTRODUCTION
When looking at the demographic evolution one can observe that there
has been an impressive increase in life expectancy of the population in the 209
developed world during the last century. Currently, it is not expected that, on
average, we can add many more years to the general population. The formi-
dable increase in life expectancy was caused by a general increase in stan-
dard of living, including better hygiene standards such as the availability of
clean (and thus safe) drinking water and a reliable sewage system in crowded
areas. Although difficult to quantify, improved medical care may have contri-
buted as well. With a traditional medical approach, we are able to cure infec-
tious diseases and postpone deleterious effects of systemic diseases like dia-
betes, hypertension, COPD, etc. However, we may have reached a plateau
with this rather crude and population-based approach. When treating risk fac-
tors (e.g. hypertension) medically, we are grossly overtreating the general po-
pulation; only a minority will actually benefit from these treatments. A good
measure to evaluate treatment effect is the Numbers Needed to Treat (NNT):
the total number of people that are exposed to treatment to prevent one inci-
dent. For example >1000 patients younger than 60 years with hypertension
should be treated to prevent one death. From this perspective, traditional
drug treatment is rather inefficient and causes a serious morbidity problem
(due to inherent side effects).
The reason for this inefficiency is that we cannot point out beforehand
which patients will benefit from the treatment. For many drugs, the exact dose-
response relationship is uncertain. So, on top of inefficiency, there is also a cer-
tain degree of inaccuracy. Patients do not only show a considerable variation in
disease-development but also in drug disposition (pharmacokinetics) and drug
effects (pharmacodynamics) (Evans et al; 2003). As a result, some experts state
that only some 40% or less of all used drugs benefit individual patients (i.e.
60% or more of all drugs do not clearly benefit our patients).
The mapping of the human genome is slowly changing this scene. Based
on genetic analysis drugs can be produced tailor-made for specific patients,
based on their genetic constitution. Many applications can be envisaged. Ge-
netic predisposition can be spelled out: which patients carry a serious disease
risk and should be treated with priority? Which patients will benefit most
from certain types of drugs? It may become possible to repair genetically de-
termined risk factors, or to repair genetic defects (gene therapy). Gene therapy
can also be employed to change the biochemical repertoire of a cell in such a
way that the body is producing its own drugs. But also in the use of traditio-
210 nal drugs, the scene will change. Factors like absorption and metabolism are
genetically determined by the structure of so-called P-glycoprotein pumps in
the cell membrane and polymorphism of the cytochrome P450 family of drug
metabolising enzymes in the liver. In addition, it may become feasible to as-
sess the sensitivity of target-tissues or even become possible to change it in a
desirable fashion.
GENETIC VARIATION
The whole DNA sequence is called the human genome. The arsenal of
proteins is the proteome. 99.9% of the genome of two unrelated persons is
identical, but still there is genetic variability in 0,1% of 3.3 billion base pairs
(on average one variant per 1000 bases).
The most common type of variant is a single nucleotide polymorphism
(SNP), a single-base difference in the DNA sequence that can be observed be-
tween individuals in the population. A polymorphism has been defined as the
minor allele occurring in more than 1% of the population, whereas mutations
are rare. Many mutations have been discovered in coding sequences of genes
causing rare inherited diseases.
The specific set of alleles observed on a single chromosome is called a ha-
plotype. Haplotypes are formed by recombination when the paternal and mater-
nal chromosomes exchange corresponding segments of DNA. The coinheritan-
ce of SNPs on these haplotypes leads to associations between these alleles
(linkage disequilibrium). Not a single SNP but the haplotype is associated with
the disease. This advantage leads to optimal genotyping: carefully chosen SNPs
in a specific region will provide enough information to predict much of the in-
formation about the remaining SNPs in that region. These SNPs are called
'tagSNPs' and are used to screen the whole genome (Burton et al; 2005).
The human genome is diploid (one paternal and one maternal allele). A
SNP can be present on 0, 1 or 2 alleles. If an individual has no polymorphism
on both alleles, this individual is called homozygous wildtype. One speaks of
homozygous mutant if both alleles are affected. An individual with one wildtype
and one variant allele is heterozygous. A SNP could lead to no functional enzy-
me activity or decreased enzyme activity. To simplify different combinations
the term semiquantitative gene dose (SGD) is introduced. Functional alleles ha-
ve a SGD of 1, completely dysfunctional alleles 0 (e.g. CYP2D6*4) and 0,5 211
for variant alleles with decreased enzyme activity (Steimer et al; 2004).
SOURCES OF VARIATION
The major causes of ineffi-

cient drug treatment are heteroge-
neity in disease, variations in drug
disposition (pharmacokinetics)
and drug response (pharmacody-
namics). The figure shows the re-
lationships in relation with the
drugs response / therapy outcome
and the targets we can use to opti-
mise pharmacotherapy. In the fo-
llowing sections we will present
some illustrative examples of ge-
netic variability with practical
consequences for the quality of
Figure 1. Variability in
drug response scheme. pharmacotherapy.
Heterogeneity in disease
One of the interesting examples of diseases showing the importance of ge-

netic heterogeneity is Alzheimer-disease. Currently, we know that at least 3 ge-
ne-mutations are involved. In addition, there are polymorphisms in susceptibi-
lity genes. Such genes may not cause the disease themselves but may make an
individual more sensitive to acquire the disease if conditions make this permi-
ssive.
The E4 variant of APOE (apolipoprotein E) is associated with an increa-
sed risk of Alzheimer disease. Homozygosity of the E4 allele increases the risk
of Alzheimer by a factor 33 in Japaneses, 15 in Caucausians and 6 in African
Americans. Although this increased risk is known for 12 years, its identifica-
tion did not help to develop effective medicines or prevention strategies.
Alzheimer is also an illustrative example to show heterogeneity in drug
response. When the cholinesterase-inhibiting drug tacrine was investigated in
clinical trials, the overall efficacy was disappointing: only about 1/3 of the pa-
212 tients benefited from the drug, in 1/3 there was no apparent effect and the drug
had to be discontinued in another 1/3 due to side effects. Only later (when the
drug was already dead) is was found that patients with a ApoE 2/3 genotype
showed a 80% response while the ApoE 4 genotype predisposed for no effect /
worsening of the disease and suffering from side effects. This example shows
the potential promise of genome technology. Some drugs are very efficacious
in some patients, but not in others. But how can we learn this beforehand? That
means that we have to study the origins of variability in drug response in more
detail, and these may have to do with disease state, pharmacokinetics and phar-
macodynamics.
On the other hand success stories are also know. The drug trastuzumab has
a high affinity for the HER2 transmembrane protein. HER2 (human epidermal
growth factor) is a member of the epidermal growth factor receptor (EGFR) fa-
mily of tyrosine kinases and is involved in regulation of cell proliferation. In pa-
tients with overexpression of HER2 or an amplification of the gene, breastcan-
cer is more aggressive: enhanced growth and proliferation, increased invasive
and metastatic capability and stimulation of angiogenesis. In these patients treat-
ment with trastuzumab leads to a response rate of 34%. In combination with cy-
totoxic agents the response rate is further increased (Hortobagyi et al; 2005).
Heterogeneity in Pharmacokinetics
Absorption / P-glycoprotein and Multi-Drug Resistance (MDR) Genes
The P-glycoprotein efflux pump, which is encoded for by the MDR1 gene,
plays an important role in the export of substances from the inside of cells and
from membranes to the outside. PGP (P-glycoprotein) protects cells from toxic
substances and many drugs by permitting or inhibiting transportation through
the intestine and other epithelial barriers. To date at least 105 variants of the
MDR1 gene have been discovered. Not all these SNPs lead to an effect on
PGP; most of them are intronic or non-coding. Of the 15 most common variants
the C3435T mutation at exon 26 is well known. This silent mutation leads to an
alteration in the effect of PGP. The TT genotype (homozygous variant allele) is
associated with a twofold lower MDR-1 expression level in the duodenum
compared with the CC genotype (wildtype) and resulted for instance in a hig-
her digoxine plasma concentration (Kerb; 2006).
HIV-protease inhibitors are known substrates of PGP resulting in a low
213
bioavailability and a limited penetration in targets. Patients who were ho-
mozygous for the 3435TT genotype had low plasma concentrations of nelfi-
navir and efavirenz, but for not fully understood reasons, they had a better
antiviral response and CD4+ immune recovery than patients with the CC- or
CT genotype (Fellay et al; 2002). This can be explained by low PGP levels
in the membrane of (infected) cells and therefore enhanced concentration
build-up of anti-retroviral drugs in these cells. The frequency of the TT ge-
notype is very low in Africans comparing to Caucasians (25%), which ex-
plains the difference in response between Caucasians and black Africans to
these drugs.
Metabolism / polymorphism in drug metabolising enzymes
Many drugs are metabolised by the oxidative cytochrome P450-enzyme

complex. One member of this family, CYP2D6, is extremely polymorphic,
with more than 75 allelic variants. CYP2D6*4 is the most common variant
(21% allele frequency in Caucasians), which leads to a non-functional allele.
Subjects homozygous for a non-functional variant allele lack enzyme activity
and are defined as 'poor metabolisers' (PMs). The CYP2D6 PM phe-
Figure 2. Schematic notype results in an increased plasma concentration of drugs predo-
presentation of the minantly metabolised by CYP2D6 e.g. tricyclic antidepressants, co-
relationship between the
deine, tramadol. In case of a narrow therapeutic window this will
debrisoquine metabolic
lead to toxicity.
ratio and CYP2D6 genotype
in caucasians (Dahl et al;
CYP2D6 gene duplication/multiplication occurs relatively infrequent
2002). among northern Europeans (1-2% of the Swedish population), but increa-
ses in southern direction: 7-
10% of Spaniards and Sout-
hern Italians, and as high as
29% of Ethiopians. Such
subjects can have an inade-
quate response to standard
doses of drugs metabolised
by CYP2D6 and are called
'ultrarapid metabolisers'
(UMs) (Dahl et al; 2002).
214 These polymorphisms
are illustrated in Figure 2.
The following case is a nice example showing the influence of CYP2D6

polymorphisms in daily practice (Gasch et al; 2004).
A 62-year-old man with a history of chronic lymphocytic leukaemia had com-
plaints of fever, fatigue, dyspnea and a cough. Therapy with ceftriaxone, clari-
thromycine and voriconazol was initiated for pneumonia infected by yeast. The
patient received a modest dose of codeine (25 mg 3 times daily) to relieve the
cough. After 4 days, the patient's level of consciousness deteriorated. His neurolo-
gical status (a score of 6 on the Glasgow Coma Scale) was poor. After the admi-
nistration of naloxone, the patient recovered rapidly. Extremly high plasma levels
of codeine and morphine were found despite of the modest dose of codeine. After
analysis of the patients CYP2D6 genotype, the patient seemed to be an ultrarapid
metaboliser. Along with the CYP2D6 gene duplication, a drug interaction may ha-
ve contributed to the observed toxic effects. Voriconazole and clarithromycine both
inhibit CYP3A4, thereby decreasing the amount of the metabolite norcodeine (and
increasing codeine concentration). At last due to renal failure the excretion of the
morphine metabolites was reduced, leading to the observed respiratory problems.
A similar example demonstrating the impact of the CYP2D6 genotype on
codeine toxicity was published in the Lancet (Koren et al; 2006). A full term
baby boy died due to an increased morphine concentration (70 mg/ml instead
of 0-2,2 ng/ml). The mother, who was breast-feeding her child, was prescribed
codeine in a standard dose. After genotyping for CYP2D6, the mother seemed
to be an ultrarapid metaboliser (gene duplication). This genotype leads to in-
creased formation of morphine from codeine, which she passed on to her boy.
Genetic variations do not only determine drug response and toxicity but
also side effects. A polymorphism (C677T) in 5,10-methylenetetrahydrofolate
(MTHFR) polymorphism for example, can determine MTX toxicity. MTHFR
is a folate-metabolizing enzyme that is inhibited by MTX metabolites. The ac-
tivity of the enzyme is reduced in the TT and CT genotypes to 30% and 60%
respectively. Patients with these genotypes often experience MTX toxicity as a
result of low folate levels. As the prevalence of MTHFR variant allele is very
high, (TT 10-12% and CT 40%) genotyping with subsequent adaptation in the-
rapy will reduce the risk of MTX toxicity (Ulrich et al; 2001).
Unless proven evidence that genotyping contributes to better drug respon-
se, genotyping is hardly performed in clinical practice to predict drug response.
It is mostly carried out afterwards to explain clinical symptoms as seen in the
215
cases mentioned above.
Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) genotyping comprises an excep-

tion: it is clinically used to prevent life-threatening myelosuppression in pa-
tients with acute lymphoblastic leukemia, treated with mercaptopurine (Puri-
Nethol) or azathioprine (Imuran).
The immunosuppressant thiopurine drugs mercaptopurine and azathioprine
are metabolised by thiopurine S-methyltransferase (TMPT) and xanthine oxidase
(XO). Variation in TPMT is of much greater impact than XO. Three important
SNPs are found in the TPMT gene: TPMT*3A, *3B and *3C. The presence of
one of these mutations leads to reduced enzyme activity. Subjects homozygous
for the variant allele TPMT*3A (0,3% of the Caucasians) are of increased risk of
myelosuppression, a known side effect of thiopurine drugs. *3C is the most co-
mmon variant allele in Asian subjects, while *3B is very rare (Wang et al; 2006).
Phenotypic assays for TPMT, performed on red blood cells, have also
been developed. However, the phenotypic assay is labor-intensive, requires
qualified knowledge and expensive instruments.
Some authors have doubts about the benefit of genotyping, since TPMT
polymorphism fails to explain all cases of myelosuppression. However, cer-
tainty is rare in clinical medicine. TPMT genotyping predicts myelosuppression
and is proven to be cost-effective (van den Akker et al; 2006).
Heterogeneity in Pharmacodynamics
Pharmacodynamics of a drug is regulated by the whole genome. We know

for example that drug response depends on the presence of sufficient numbers and
sensitivity of receptors. Receptors are proteins that are encoded for by genes. This
means that the gene expression level determines the amount of receptors and is
thus closely associated with drug response. Gene expression itself however, is de-
termined by several transcriptional, translational and post-translational regulatory
effects of other genes. In this way the whole genome is involved in drug response.
Small genetic variations, such as variability in receptors, can have a large
impact on the pharmacodynamics of a drug. It is no surprise that the list of
drugs that are subject to such an effect is increasing almost daily.
In some cases a SNP or a point mutation can modify drug response. Gene-
tic variability in receptors is either inherited or acquired. Resistence to imatinib
216 is for example associated with mutations in the kinase domain of BCR-ABL
that interfere with drug binding. Acquired mutation in a theronine residue of
the ABL kinase is the cause of resistance to imatinib in about 67% of the cases
(Gorre et al;2001). Increased expression of BCR-ABL from genomic amplifi-
cation could also be a mechanism for resistance.
One of the first well documented examples that in literature relates to the
efficacy of cholesterolsynthesis-inhibitors of the statin-type. Carriers of so ca-
lled B1-alleles on the receptor benefit more from statin-therapy than indivi-
duals that have just one allele (Kuivenhoven et al;1998).
Another example relates to the tachyphylaxis of beta-2-agonists, a well
known effect from drugs like salbutamol. The 2-receptor has three main poly-
morphisms and two of them (Arg16Gly and Gln27Glu) are found in the gene-
ral population. The two SNPs are in strong linkage disequillibrium and can be
considered together in haplotypes. It is demonstrated that homozygous carriers
of Gly16/Gly16 desensitise faster than Arg16/Arg16 carriers. Arg16Gly and
Gln27Glu are associated with a decreased effect of 2-agonists.
Patients with variant alleles of the promoter gene of ALOX5 (5-lipoxyge-
nase) have a diminished gene transcription, and therefore a decreased receptor
activity, which leads to a decreased response to treatment with leukotriene an-
tagonists (like montelukast) (Drazen et al;1999).
DETECTING GENETIC VARIATION
One of the most frequently used techniques in identifying genetic variability

is the Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR is a simple method by which a
part of DNA or a transcript (RT-PCR) is amplified. Subsequent sequence analysis
on the PCR product will reveal the presence of mutations or polymorphism. PCR
is not only used to detect sequential variability but also variability in gene ex-
pression. By applying real-time PCR, we are able to measure gene expression
precisely. In this way single nucleotide polymorphism can be detected in genes
encoding drug metabolising enzymes, transporters and receptors.
Micro-arrays have been developed to detect many SNPs in a short time
period. The Amplichip CYP450 GeneChip is an oligonucleotide microarray
hybridization method for genotyping CYP2D6 and CYP2C19. This test distin-
guishes 29 polymorphisms in the CYP2D6 gene including gene deletion (*5)
and gene duplication. In this way the phenotype of a patient (PM, IM, EM or 217
UM) can be predicted. For CYP2C19 the test discriminates between PM and
EM by determining 2 common polymorphisms in CYP2C19 (*2 and *3). The

main disadvantage of the test is its price (600 euro per patient). It is expected
that these costs will decrease due to a higher demand and mass production.
For detecting disease related genes 'whole genome screening' can be used.
Commercially available kits based on hybridisation technology (Illumina, Affy-
metrix) contain more than 550 000 tagSNP's evenly distributed across the geno-
me (1 tagSNP every 5.5 Kb). None of these arrays covers all variation in the hu-
man genome, but come close by using haplotype tagging SNP's.
A different technique to detect chromosomal aberrations is spectral karyoty-
ping (SKY). SKY is based on the hybridisation of certain molecules (probe) to
chromosomes, creating colour in exposure to light. As a result, each chromosome
has a specific and distinguished colour. Parts of chromosome can be translocated,
or swapped between one chromosome and another. Other chromosomes can be
deleted or duplicated either in whole or in part.
SKY is routinely used to identify birth defects and genetic abnormalities behind
certain cancers, like leukaemia. Based on chromosomal aberrations in leukaemia di-
fferent therapeutic approaches are undertaken. For example, patients with a transloca-
tion between chromosome 15 and 17 t(15;17), are successfully treated with all-trans
retinoic acid (ATRA). Targeted therapy in these patients leads to an enhanced event-
free survival (80-90% at 3 years). Without such targeted therapy the overall survival
is relatively poor, ranging from 6-20%. Recently, many clinical studies are going on
with Imatinib, a signal transduction inhibitor with effect against tyrosine kinase acti-
vity. Imatinib is developed especially for leukemic patients with a translocation be-
tween chromosome 9 and 22. The so-called t(9;22) or Philadelphia positive leukae-
mia generates high amounts of an abnormal tyrosine kinase protein and is associated
with a very poor prognosis. It seems however that Imatinib is changing the prospects
of Philadelphia positive leukemic patients. Ongoing trials indicate that after some
time resistance occurs frequently (see before). Research is aimed at new kinase
inhibitors or combination of compounds to overcome this resistance (Tallman; 2002).
INFLUENCE ON DRUG DISCOVERY
Pharmacogenomics can enhance drug discovery in two ways:

218 Identification of new drug targets.
Subpopulation-specific drug development.
Pharmaceutical companies are interested in carrying out smaller, less ex-

pensive trials using pharmacogenetics. Identification of a genetic variant asso-
ciated with drug response can lead to smaller phase III studies involving only
those individuals who are more likely to respond that lead to improved effi-
cacy, decreased toxicity and less side effects.
Many genetic variants vary in frequency among ethnic populations. If a
marker for drug response has a low prevalence in a certain population, that po-
pulation might be excluded from research or treatment.
An example is the drug BiDil, a combination of isosorbide dinitrate and
hydralazine. This drug was not sufficiently effective in treating heart failure in
two large ethnically mixed clinical trials. But in a subpopulation of African
Americans BiDil decreased the risk of death by 43%. The FDA approved this
drug for a single racial group (Service; 2005).
CONCLUSION
Pharmacogenetics constitutes a rapidly evolving research field. Thousands

of studies are published annually with great promise. However, incorporation
of these discoveries in medical practice has been slower than expected.
Promising prospects are complicated by several factors. Diagnostics have
to be changed in such a way that genotyping of relevant PK/PD systems is in-
cluded. Who will translate this kind of sophisticated information to a prescri-
bing physician? By now, proper dosing and avoiding drug interactions is alrea-
dy a formidable task. The number of disease-targets will become almost
incomprehensible for the average physician. That means that an incredible in-
formation dissemination barrier has to be solved. As a result, a new speciality
will develop: genetic information specialist. Not aimed at diagnosing inherited
diseases but at inherited risk factors and drug-treatment success-factors. And
last but not least: the costs of these developments -both for diagnosis and for
more individualised drug preparations- will be impressive. There will be no
way to deny patients the results of these new developments because they may
prove highly efficacious and possibly also cost-effective (although very costly
on an individual basis).
Hospital pharmacists and other healthcare professionals should be aware 219
of the upcoming developments and should prepare both for a proper informa-
tion structure and sufficient expertise to advise doctors in the rapidly approa-
ching era of genetically based medicine (pharmacogenetics). And of course of
the formidable resources needed to pay for this.
Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!
ACKNOWLEDGEMENT
We wish to thank Dr. A. Vermes, hospital pharmacist, for critically reading

the manuscript.
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221
Notas
NOTAS
222
Notas
223
Notas
224
CURSO DE
BIOTECNOLOGA
APLICADA
7 Edicin
DIRECCIN DEL CURSO

DR. JUAN BUEREN Y DR. JOS LUIS MOTELLN
7 Curso de BIOTECNOLOGA APLICADA

Fundacin
Centro Nacional de
Investigaciones
Cardiovasculares
Carlos III
Este curso es posible gracias a una aportacin educacional de
Madrid, 13-16 de febrero de 2007

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7 Curso de BIOTECNOLOGA APLICADA

Este curso es posible gracias a una aportacin educacional de

Madrid, 13-16 de febrero de 2007

Reservados todo los derechos. Ninguna parte de esta

Sanidad y Ediciones, S.L.

Tcnicas de anlisis masivo de la expresin de genes ......................... 5

Inmunoterapia humoral .......................................................... 31

Introduccin a la inmunoterapia celular .......................................... 41

Clulas embrionarias pluripotentes ............................................. 57

Trasplante celular y terapia regenerativa con clulas madre .................. 65

Avances en terapia regenerativa ................................................. 89

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Vectores de transferencia en terapia gnica .................................... 119 1

Terapia gnica en enfermedades monognicas y cncer ...................... 137

Farmacocintica de los medicamentos obtenidos por Biotecnologa . . . . . . . . . 157

Aplicaciones de la Biotecnologa Recombinante Vegetal a la teraputica

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Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised

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