Filtragem

VALIDACIN DE LA RETENCIN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE
ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TCNICA DE

FILTRACIN POR MEMBRANA PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
NORMA ISABEL GALEANO ROJAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT D.C.
JULIO DE 2007
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al titulo de
MICROBILOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT D.C.
JULIO DE 2007
2
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia.
3
APROBADO
______________________________ ____________________________
Viviana Pea Paez, Cindy Fernndez,
Microbiloga Industrial Microbiloga Industrial
DIRECTOR ASESOR
______________________________ ____________________________
Gineth Fajardo, Jeinny Romero,
Microbiloga Industrial Microbiloga Industrial
JURADO JURADO
4
APROBADO
______________________________ ______________________________
Angela Umaa Muoz. M. Phil. David Gmez Mendez M. Sc.
DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA
5
A Dios y
A mis padres por su apoyo y amor incondicional.
6
AGRADECIMIENTOS
A Viviana Pea, directora del trabajo por su tiempo, colaboracin, apoyo y

compromiso durante la ejecucin del proyecto, al igual que por su amistad.
A Cindy Fernndez por su compromiso, responsabilidad, y aportes realizados para

la elaboracin de ste trabajo de grado
A la Doctora Blanca Cecilia Surez, gerente de AQM Ltda., por el prstamo de las
instalaciones y recursos necesarios para llevar a cabo este trabajo.
A AQM Ltda., especialmente al rea de microbiologa por su colaboracin y apoyo.
7
TABLA DE CONTENIDO
PG
1. INTRODUCCIN 1
2. MARCO TEORICO 2
2.1. VALIDACIN 2
2.1.1. Protocolo de validacin 4
2.1.2. TIPOS DE VALIDACIN 5
2.1.2.1. Validacin prospectiva 5
2.1.2.2. Validacin concurrente 5
2.1.2.3. Validacin retrospectiva 5
2.1.2.4. Revalidacin 6
2.1.3. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACION DE 6
METODOLOGIAS
2.1.3.1. Precisin 6
2.1.3.2. Especificidad 7
2.1.3.3. Selectividad 7
2.1.3.4. Exactitud 7
2.1.3.5. Lmite de deteccin 7
2.1.3.6. Lmite de cuantificacin 7
2.1.3.7. Linealidad 8
2.1.3.8. Robustez 8
2.1.4. CALIFICACIN 8
2.1.4.1. Tipos de calificacin 8
2.1.4.1.1. Calificacin de las instalaciones - IQ 8
2.1.4.1.2. Calificacin de desempeo - PQ 9
2.1.4.1.3. Calificacin operacional - OQ 9
viii
2.2. FILTROS DE MEMBRANA 10
2.2.1. Tipos de filtros de membrana 11
2.2.1.1. Filtros de profundidad 11
2.2.1.2. Filtros de superficie o de membrana 12
2.2.1.2.1. Membrana nitrato de celulosa 13
2.2.1.2.2. Membrana de acetato de celulosa 14
2.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD 16

2.3.1. MEDIOS DE CULTIVO 16
2.3.1.1. Medio Fluido de Tioglicolato 16
2.3.1.2. Medio de Digerido Casena-Soja 18
2.3.1.3. Lquidos de dilucin y lavado para la filtracin por membrana 19
2.3.2. PRUEBAS DE APTITUD 20
2.3.2.1. Esterilidad de los medios de cultivo 20
2.3.2.2. Prueba de promocin del crecimiento de organismos aerobios, 20
anaerobios y hongos
2.3.3. MTODOS PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD 22
2.3.3.1. Filtracin por membrana 22
2.3.3.2. Inoculacin directa 24
2.3.4. Interpretacin de resultados 25
2.3.5. Condiciones del rea estril de trabajo 28
2.4. ESPECTROFOTOMETRA 31
2.4.1. Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorcin: Ley de Beer- 31
Bouguer-Lambert
2.4.2. Tratamientos de los datos espectrofotomtricos 32
2.4.2.1. Curvas espectrales 32
2.4.2.2. Curvas de calibrado 32
3. JUSTIFICACIN 33
ix
4. OBJETIVOS 35
4.1. Objetivo general 35
4.2. Objetivos especficos 35
5. MATERIALES Y MTODOS 36
5.1. DISEO DE LA INVESTIGACIN 36
5.1.1. Poblacin de estudio y muestra 36
5.1.2. Materiales utilizados durante la validacin 37
5.1.2.1. Pruebas preliminares 37
5.1.2.1.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 37
5.1.2.1.2. Prueba de promocin de crecimiento 38
5.1.2.2. Tcnica de filtracin por membrana 38
5.1.2.2.1. Controles para el proceso 38
5.1.2.2.2. Control negativo 38
5.1.2.2.3. Filtracin por membrana 39
5.2. METODOLOGA DE VALIDACIN 40
5.2.1. Recopilacin de la informacin 40
5.2.2. Calibracin y mantenimiento de los equipos 41
5.3. Pruebas preliminares 41
5.3.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 42
5.3.2. Prueba de promocin de crecimiento 42
5.4. TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA UTILIZADA EN LA 45
PRUEBA DE ESTERILIDAD
6. RESULTADOS 50
6.1. Calibracin y mantenimiento de equipos 50
6.2. Pruebas preliminares 51
6.2.1. Prueba organolptica 51
6.2.2. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 52
6.2.3. Prueba de promocin de crecimiento 52
6.2.3.1. Mtodo turbidimtrico 56
6.3. Tcnica de filtracin por membrana utilizada en la prueba de esterilidad 80
x
6.3.1. Controles para el proceso 80
6.3.1.1. Control ambiental y de personal 80
6.3.1.2. Control negativo de la prueba 81
6.3.2. Tcnica de filtracin por membrana 81
6.3.3. Lquido filtrado 84
7. DISCUSIN DE RESULTADOS 87
8. CONCLUSIONES 94
9. RECOMENDACIONES 96
10. BIBLIOGRAFA 97
11. ANEXOS 101
xi
LISTA DE TABLAS
PG
Tabla N 1. Composicin del medio Fluido de Tioglicolato 17
Tabla N 2. Composicin del medio de Digerido Casena-Soja 18
Tabla N 3. Cepas de microorganismos de prueba adecuados para la 20
prueba de promocin de crecimiento
Tabla N 4. Comparacin de los sistemas abierto y cerrado para tcnica de 23
filtracin por membrana
Tabla N 5. Clasificacin de ambientes controlados para la industria 30
farmacutica
Tabla N 6. Lmites microbiolgicos para el rea asptica manejados por 30
AQM Ltda.
Tabla N 7. Lmites microbiolgicos para el control de personal. 30
Tabla N 8. Programa de calibracin y mantenimiento de los equipos 50
utilizados en la validacin
Tabla N 9. Anlisis organolptico de los medios de cultivo 51
Tabla N 10. Resultados de la Prueba de esterilidad de los medios de 52
cultivo lquidos
Tabla N 11. Recuentos obtenidos en la Prueba de promocin de 52
crecimiento
Tabla 12. Resultados obtenidos en la Prueba de promocin de crecimiento 55
para medios de cultivo lquidos en los tres ensayos realizados
Tabla N 13. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium 56
sporogenes en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante
espectrofotometra
Tabla N 14. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium 58
sporogenes en medio Digerido Casena-Soja observados mediante
espectrofotometra
Tabla N 15. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus 60
aureus en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante
espectrofotometra
xii
Tabla N 16. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus 62
aureus en medio Digerido Casena-Soja observados mediante
espectrofotometra
Tabla N 17. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas 64
aeruginosa en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante
espectrofotometra
Tabla N 18. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas 66
aeruginosa en medio Digerido Casena-Soja observados mediante
espectrofotometra
Tabla N 19. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en 68
medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometra
Tabla N 20. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en 70
medio Digerido Casena-Soja observados mediante espectrofotometra
Tabla N 21. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans 72
en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometra
Tabla N 22. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans 74
en medio Digerido Casena-Soja observados mediante espectrofotometra
Tabla N 23. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en 76
medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometra
Tabla N 24. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en 78
medio Digerido Casena-Soja observados mediante espectrofotometra
Tabla N 25. Resultados del control ambiental durante la prueba de 80
esterilidad
Tabla N 26. Resultados del control de personal durante la prueba de 80
esterilidad
Tabla N 27. Resultados obtenidos para el control negativo de la tcnica de 81
filtracin de membrana durante los 5 montajes realizados.
Tabla N 28. Resultados obtenidos en la tcnica de filtracin por membrana 81
durante el Montaje 1, abril 14 de 2007
xiii
durante el Montaje 4, mayo 12 de 2007
durante el Montaje 5, mayo 19 de 2007
Tabla N 33. Resultados obtenidos despus del tiempo de incubacin del 84
lquido filtrado del montaje 1
xiv
LISTA DE FIGURAS
PG
Figura N 1. Filtro de profundidad 12
Figura N 2. Filtro de superficie o de membrana 12
Figura N 3. Filtros de nitrato de celulosa 13
Figura N 4. Filtro de acetato de celulosa 15
Figura N 5. Medio Fluido de Tioglicolato 17
Figura N 6. Medio Digerido Casena-Soja 18
Figura N 7. Equipo de filtracin 23
Figura N 8. Interpretacin del ensayo de esterilidad. 27
Figura N 9. Validacin de procedimientos. 40
Figura N 10. Pruebas preliminares 41
Figura N 11. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo 42
Figura N 12. Diagrama de las diluciones empleadas en la prueba de 43
promocin de crecimiento.
Figura N 13. Prueba de promocin de crecimiento. 45
Figura N 14. Controles para el proceso en la tcnica de filtracin por 48
membrana.
Figura N 15. Control negativo de la tcnica de filtracin por membrana. 48
Figura N 16. Tcnica de Filtracin por membrana. 49
Figura N 17. Bacillus subtilis en agar Casoy 53
Figura N 18. Clostridium sporogenes en agar Casoy 53
Figura N 19. Staphylococcus aureus en agar Casoy 54
Figura N 20. Pseudomas aeruginosa en agar Casoy 54
Figura N 21. Candida albicans en agar HC 54
Figura N 22. Aspergillus niger en agar HC 55
Figura N 23. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio 57
Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de promocin de
crecimiento
Figura N 24. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio 59
Digerido Casena-Soja, observada en la prueba de promocin de
crecimiento
xv
Figura N 25. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio 61
crecimiento
Figura N 26. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio 63
crecimiento
Figura N 27. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio 65
crecimiento
Figura. N 28. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio 67
crecimiento
Figura N 29. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Fluido de 69
Tioglicolato, observada en la prueba de promocin de crecimiento
Figura N 30. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Digerido 71
Casena-Soja, observada en la prueba de promocin de crecimiento
Figura N 31. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Fluido de 73
Figura N 32. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Digerido 75
Figura N 33. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Fluido de 77
Figura N 34. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Digerido 79
xvi
RESUMEN
La validacin de la retencin microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa

en la tcnica de filtracin por membrana para la prueba de esterilidad tuvo como
propsito la eficacia de los filtros de membrana para optimizar esta tcnica en el
laboratorio de Anlisis Qumico y Microbiolgico AQM Ltda., siguiendo los
parmetros establecidos por la USP 29 y basndose en la necesidad de realizar un
montaje que garantice resultados confiables y la disminucin de los riesgos de
repeticin que aumentan el tiempo de anlisis y los costos.
Al inicio de la validacin se verific la calibracin y mantenimiento de los equipos

para as garantizar los procedimientos realizados y los resultados obtenidos.
Luego se realizaron las pruebas preliminares en las cuales se evalu la calidad de
los medios de cultivo Fluido de tioglicolato, Digerido casena-soja, agar Casoy y
agar HC. Se verific en los medios de cultivo lquidos que contienen los nutrientes
necesarios para el crecimiento de los microorganismos mediante la prueba de
promocin de crecimiento inoculados con cepas ATCC de Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Bacillus
subtilis y Aspergillus niger; estos resultados se complementarn por
espectrofotometra determinando para cada microorganismo su curva de
crecimiento en un tiempo de 100 horas.
Despus de obtener resultados satisfactorios en las pruebas preliminares que
indican la ausencia de resultados falsos negativos o positivos, se realiz la
metodologa de filtracin por membrana en la cual se determin la retencin de los
microorganismos contaminantes en los filtros de acetato y nitrato de celulosa con un
tamao de poro de 0,45 m.
Con los resultados obtenidos se ajust el procedimiento de la prueba de esterilidad

mediante la tcnica de filtracin por membrana para el laboratorio AQM Ltda., como
fundamento para obtener resultados confiables, oportunos y con calidad que logren
la satisfaccin del cliente.
xvii
ABSTRACT
The validation of the microbial retention in the cellulose acetate filters and cellulose
nitrate filters in the filtration technique used in sterility testing had the purpose to
verified the effectiveness of membrane filters to optimize this technique in the
laboratory Anlisis Qumico y Microbiolgico AQM Ltda., following the established
parameters by the USP 29 and based on the necessity to do a test with guarantee of
reliable results, and the diminution of repetition risk which increases the analysis
time and the cost.
At the beginning of the validation the machine calibration and maintenance was
verified to guarantee the process and results.
Later the preliminaries tests was done to evaluate the quality of media, Fluid
Thioglycolate medium, Soybean-casein digest medium, Casoy agar and HC agar.
For the liquid media it was observed they had the necessary nutrients for the growth
of microorganism by the growth promotion test inoculating microorganisms ATCC of
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes,
Candida albicans, Bacillus subtilis y Aspergillus niger. Furthermore this test
complemented by spectrofotometric method determining for each microorganism its
growth curve in a time of 100 hours.
After obtaining satisfactory results in the preliminary test that indicated the lack of
false negative or false positive results, the membrane filtration methodology was
done which determined the satisfactory retention of microorganism in cellulose
nitrate filters and cellulose acetate filters with a pore size of 0,45 m.
With the results was fitted the process of sterility testing by membrane for the
laboratory AQM Ltda., like fundament to obtain reliable results with quality to obtain
the client satisfaction.
xviii
1. INTRODUCCIN
El control de calidad de productos farmacuticos garantiza la seguridad y eficacia de

cada uno, certificando que estos cumplen con los parmetros y normas reguladas
por organizaciones nacionales e internacionales. Estas especificaciones constituyen
un elemento importante para asegurar la calidad de los productos y sirven de base
para el anlisis de stos en el laboratorio.
Este control de calidad se debe realizar desde el inicio, durante y al final de la

elaboracin del producto para asegurar que el proceso se ha realizado bajo estrictas
normas y controles. Al final del proceso de produccin se deben realizar pruebas
microbiolgicas de acuerdo a la naturaleza y finalidad del producto, dentro de estas
se encuentra la prueba de esterilidad, la cual demuestra la calidad de un producto
referido a la ausencia de contaminantes microbianos, permitiendo su uso para
humanos y animales sin ningn riesgo de infeccin.
Dada la necesidad de optimizar la tcnica para desarrollar la prueba de esterilidad,

obtener resultados confiables, realizar un buen montaje que garantice los
resultados, la disminucin de los riesgos de repeticin que aumentan el tiempo de
anlisis y la reduccin de costos, este proyecto que tiene como finalidad validar la
retencin microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en la
tcnica de filtracin por membrana para la prueba de esterilidad, y as asegurar que
la efectividad de la filtracin como principal proceso de esta tcnica en el laboratorio
de Anlisis Qumico y Microbiolgico AQM Ltda., logre obtener resultados
confiables, oportunos y con calidad para la satisfaccin del cliente.
1
2. MARCO TEORICO
2.1. VALIDACIN
Validacin es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia

documentada que un proceso especfico producir de forma consistente y
permanente productos que reunirn las caractersticas de calidad predefinidas.
(CORTES, A. et al. 2003) Mediante el proceso de validacin se demuestra que el
mtodo es lo suficientemente fiable para producir el resultado; proporcionando
confianza y seguridad del proceso productivo o del mtodo analtico, as como
tambin en la calidad de los resultados. (GARCIA, et al. 2005)
La validacin de un mtodo analtico es el proceso que establece, mediante

estudios de laboratorio, que las caractersticas de desempeo del mtodo cumplen
los requisitos para las aplicaciones analticas previstas (USP 29, 2006); teniendo
como objetivo confirmar y documentar que los resultados producidos son confiables.
(CORTES, A. et al. 2003)
El principal objetivo de una validacin analtica es asegurar que el procedimiento
analtico seleccionado va a dar resultados reproducibles y confiables que son
adecuados para el propsito deseado. De esta manera es necesario definir
apropiadamente las condiciones en las cuales va a ser realizado el procedimiento y
su objetivo. Estos objetivos aplican a todos los procedimientos descritos o no en una
Farmacopea los cuales son usados en una compaa manufacturera. (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 1997)
Igualmente establece las caractersticas de desempeo y las limitaciones de un

mtodo, la identificacin de variables que influyen y pueden cambiar estas
caractersticas determinado hasta que punto pueden ser cambiadas. (FDA, 2005)
Para llevar a cabo una validacin se debe tener clara la metodologa analtica, la
cual va de lo general a lo particular, se inicia con la valoracin de la tcnica, que es
el principio cientfico que puede ser til para suministrar informacin sobre la
composicin de una muestra; seguida del mtodo que es la adaptacin de la tcnica
2
para un propsito especfico, que para ser utilizado correctamente debe ir descrito
en un procedimiento y finalmente a partir de la informacin recopilada se obtiene el
protocolo en donde se suministran una serie de direcciones precisas y definitivas
que deben seguirse si se quiere que los resultados analticos se acepten, este es la
evidencia objetiva de la validacin. (BARRAGN y GARCA, 2001)
Dentro de un proceso de validacin se deben validar:

- Mtodo analtico en el cual se evalan y analizan parmetros como
sensibilidad, exactitud, linealidad, selectividad, etc.
- Sistema analtico incluye instrumentos, ordenador y mtodo, con este se
concluye que el conjunto funciona como se espera.
- Anlisis de la muestra donde se evidencia por medio de la documentacin la
comprobacin de los datos primarios. (USP 29, 2006)
La importancia de la validacin radica en la obtencin de mtodos estndar los

cuales son parte integral del sistema de calidad de un laboratorio. Los mtodos
estndar son usados siempre que sea posible a menos que se especifique su no
uso. (FDA, 2005)
Adems tiene ventajas como la optimizacin y estandarizacin de los procesos, el
incremento de la productividad, la reduccin de costos, la reduccin de la
probabilidad de fallas en el proceso y as la reduccin de repeticiones y rechazos.
Para realizar validaciones en microbiologa es importante:

- Conocer los mtodos compatibles con los requerimientos, la compatibilidad
de los mtodos es revisada y confirmada por comparacin con
requerimientos tpicos para realizar la prueba.
- Incluir un medio control sin inocular para evaluar la contaminacin a partir del
laboratorio y no de la prueba. Este control es considerado un blanco y no
muestra crecimiento.
3
- Preparar y analizar visualmente controles positivos y negativos. Un control
negativo no presenta crecimiento y el control positivo muestra crecimiento
microbiano.
- Evaluar interferencias. Esto asegura la selectividad y la especificidad del
mtodo.
- Realizar documentacin de la validacin. (FDA, 2005)
De esta forma despus de la validacin se demuestra que el laboratorio es capaz de

repetir con un nivel aceptable de ejecucin el mtodo estndar. Esto en condiciones
especficas establecidas por el mtodo, adems de la demostracin de exactitud y
precisin o de otros parmetros dependiendo el tipo de mtodo. (FDA, 2003)
2.1.1. Protocolo de validacin
Los protocolos de validacin incluyen la definicin clara del sistema a validar, la

identificacin de las variables operativas y los probables parmetros de control. En
ellos se describe el proceso a validar, los objetivos de la validacin, los mtodos y el
personal responsable de la validacin, adems de indicar el nmero de rplicas que
se consideran adecuadas para la evaluacin de un determinado parmetro para que
los resultados sean estadsticamente confiables. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
Dentro de un protocolo de validacin tambin se encuentra el procedimiento

operativo estndar (POE) del sistema validado, donde se describe el procedimiento
de cmo deben realizarse determinados mtodos analticos, cmo deben manejarse
los instrumentos o realizarse otras actividades de laboratorio cuyo seguimiento
puntual es de obligatorio cumplimiento. (MEDINA y QUINTANA, 2002)
Los laboratorios documentan sus protocolos, las caractersticas y medidas de
ejecucin y los lmites aceptables para la validacin de sus mtodos. La magnitud
de la validacin depende de las limitaciones que se imponen como lo son el tiempo,
el costo, la cantidad de muestras o estndares, el uso posterior del mtodo o el tipo
de informacin (cuantitativa, cualitativa).
4
De esta forma la buena documentacin es una parte esencial del sistema de
garanta de calidad y por lo tanto es importante en un proceso de validacin.
2.1.2. TIPOS DE VALIDACIN
2.1.2.1. Validacin prospectiva
Se basa en la informacin obtenida antes de implantar el proceso de validacin.

Utiliza informacin generada durante todas las etapas de desarrollo del proceso y se
puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que
proporciona un alto grado de seguridad que un proceso especfico producir
consistentemente una forma farmacutica que lleva las especificaciones
predeterminadas y los atributos de calidad y que se basa en el anlisis de los datos
obtenidos a travs del diseo y desarrollo de un protocolo de validacin.
(HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
2.1.2.2. Validacin concurrente
La informacin se obtiene durante la implementacin del proceso, se debe tener en

cuenta el monitoreo en proceso de las variables crticas que demuestre que el
proceso est bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en
estado productivo. (CORTES, A. et al. 2003)
Se puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que
proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso especfico producir
predeterminadas y atributos de calidad y que se sustentan en datos o informacin
obtenidos a partir de un proceso que se encuentra en marcha o en el cual se haya
introducido alguna variacin. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
2.1.2.3. Validacin retrospectiva
Es aquella donde se trabaja con los antecedentes histricos, obtenidos a partir de

registros del proceso y control de calidad. Con esta recopilacin de datos histricos
5
se obtiene documentacin til para la determinacin de la reproducibilidad de dicho
proceso. Por esto, para la obtencin de informacin no es necesario aplicar ensayos
analticos o supervisin del proceso en forma explcita. (GONZALES, 2005)
Se puede definir como el establecimiento de un programa documentado, que
proporciona un alto grado de seguridad de que un proceso especfico producir
predeterminadas, atributos de calidad y que se sustenta en el anlisis de datos de
lotes que han sido elaborados con anterioridad. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
2.1.2.4. Revalidacin
Este tipo de estudio se utiliza cuando se ha introducido alguna variable en algn

procedimiento o metodologa ya validado anteriormente, por lo que se alteran las
caractersticas finales. (GONZALES, 2005)
2.1.3. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACION DE METODOLOGIAS
No todas las caractersticas analticas son aplicables a todos los procedimientos o a

todos los materiales; depende del objetivo requerido.
2.1.3.1. Precisin
Es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando
se aplica el mtodo repetidamente a muestras separadas e idnticas, obtenidas del
mismo lote de material homogneo. (USP 29, 2006) El parmetro estadstico que
caracteriza a este estudio es la desviacin estndar o preferiblemente el coeficiente
de variacin (desviacin estndar relativa). Este parmetro permite evaluar la
incertidumbre en la estimacin de la media, es decir, el error aleatorio que
corresponde con la dispersin de los datos alrededor de la media. (CASTILLO Y
GONZLES, 1996)
Puede ser una medida del grado de reproducibilidad o de repetibilidad del mtodo
analtico en condiciones normales de operacin. (USP 29, 2006)
6
Reproducibilidad es la medida de la precisin de los resultados de ensayos
realizados sobre la misma muestra homognea, pero ejecutados por diferentes
analistas, en das diferentes y con diferentes instrumentos.
Repetibilidad: refleja la precisin de un mtodo, cuando se desarrolla bajo las
mismas condiciones, utilizando la misma muestra, analizada por el mismo analista,
en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante una misma
sesin de trabajo en un perodo corto. (CASTILLO Y GONZLES, 1996)
2.1.3.2. Especificidad
Es la capacidad de evaluar de manera inequvoca el compuesto de inters en
presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, como
impurezas, productos de degradacin y componentes de la matriz. (USP 29, 2006)
2.1.3.3. Selectividad
Un mtodo selectivo aporta resultados para todos los analitos de inters, mientras
que uno especfico produce resultados exactos para un analito, al tiempo que los
otros analitos de inters se pueden interferir los unos con los otros. (CORTES, A. et
al. 2003)
2.1.3.4. Exactitud
Indica la capacidad del mtodo analtico para obtener resultados lo ms prximos
posibles al valor verdadero. A diferencia de la precisin, que refleja el error aleatorio,
la exactitud refleja el error sistemtico o la tendencia a l. (CASTILLO Y
GONZLES, 1996)
2.1.3.5. Lmite de deteccin

Es la cantidad mnima de analito en una muestra que puede detectarse, aunque no
necesariamente detectarse, en las condiciones experimentales indicadas.
2.1.3.6. Lmite de cuantificacin

Es una caracterstica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se
encuentran en baja concentracin en la matriz de una muestra. Es la mnima
7
cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisin y
exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. (USP 29, 2006)
2.1.3.7. Linealidad
Es la capacidad del mtodo analtico para obtener resultados directamente
proporcionales a la concentracin o cantidad del analito en un intervalo definido. Se
determina mediante el tratamiento matemtico de los resultados obtenidos en el
anlisis del analito a diferentes cantidades o concentraciones. (CASTILLO Y
GONZLES, 1996)
2.1.3.8. Robustez
Es la medida de la capacidad del mtodo para no resultar afectado por pequeas
pero deliberadas variaciones en los parmetros del mtodo y proporciona una
indicacin de su confiabilidad durante su uso normal. (USP 29, 2006)
2.1.4. CALIFICACIN
Consiste en la realizacin de pruebas que determine si un componente de un

proceso de fabricacin posee los atributos requeridos para obtener un producto con
una calidad determinada. (JAIME, 2002)
2.1.4.1. Tipos de calificacin
2.1.4.1.1. Calificacin de las instalaciones - IQ

Verificacin documentada de que todos los aspectos claves de la instalacin estn
de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y corresponden a las
especificaciones aprobadas en el diseo. (CORTES, A. et al. 2003)
Se incluyen todos los equipos, instrumentos y aparatos que son utilizados en
proceso productivo y en los mtodos de anlisis. Adems es necesario considerar
que stos se encuentran localizados en instalaciones fsicas que deben ser
evaluadas. Otros aspectos son la calibracin de equipos y el mantenimiento
preventivo de los equipos.
8
Calibracin de equipos: La calibracin es la comparacin de un estndar de medida
o instrumento de exactitud conocida con otro estndar o instrumento, sirve para
detectar, correlacionar y/o reportar por ajuste cualquier variacin en la exactitud del
instrumento que est siendo comparado. (JAIME, 2002)
2.1.4.1.2. Calificacin de desempeo - PQ

Demostrar la efectividad y reproducibilidad del proceso, bajo condiciones normales
de operacin y bajo condiciones lmite de operacin. (JAIME, 2002)
2.1.4.1.3. Calificacin operacional - OQ

Verificacin de que los equipos funcionan en la forma esperada y son capaces de
operar satisfactoriamente los parmetros operacionales para los que han sido
diseados. (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002)
9
2.2. FILTROS DE MEMBRANA
Los filtros de membrana son un avance consecuente de los desarrollados por el

premio Nbel Richard Zsigmondy en 1925. La primera produccin comercial en el
mundo se llev a cabo en Gttingen en 1927, el uso de los filtros de membrana se
conoce desde los aos cuarenta, cuando fueron utilizados para el control de agua
potable. (AVENDANO y MOYANO, 1997)
Existen distintos tipos de filtros: de asbesto-celulosa, de vidrio, de cermica y de

steres de celulosa. Las membranas estn compuestas por steres de celulosa
biolgicamente inertes. Los poros varan desde 0.025 m a 25 m de dimetro,
siendo los de 0.22 m los ms utilizados ya que son lo suficientemente pequeos
para retener a todas las bacterias. Dado que las membranas son inertes,
proporcionan un buen medio para retener microorganismos, por ejemplo para
cultivar bacterias que se encuentran en bajas concentraciones en un gran volumen
de lquido.
El mecanismo de accin es bastante simple: retienen todas las partculas que
posean un tamao mayor que los poros. Estos poros quedan formados por los
espacios que resultan de la superposicin de las fibras de las distintas capas que
forman la membrana. As, algunas partculas de menor tamao son retenidas por
otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por la suma de partculas
retenidas previamente. (PEARCE, 2007)
Los filtros de membrana son utilizados para el control microbiolgico de diversos

productos, por ello requieren un control de calidad que se obtiene con una excelente
uniformidad de un lote a otro manteniendo una tcnica de produccin
cuidadosamente elaborada y por controles rgidos como:
a) El examen de la materia prima con cromatgrafo de gas.
b) Control durante el proceso de produccin.
c) Control de calidad:
- Comportamiento de autoclavado.
- Punto de burbuja.
d) Control ptico de los rollos de membrana.
10
e) Control microbiolgico (Prueba de desafo). (AVENDANO y MOYANO, 1997)
Para realizar la prueba de esterilidad es necesario usar filtros de membrana con un

tamao nominal de poro no mayor de 0,45 m y un dimetro de aproximadamente
50mm.
Se utilizan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo
contenido alcohlico y filtros de acetato de celulosa para soluciones con alto
contenido alcohlico. (USP 29, 2006)
Los filtros de membrana con este tamao de poro han sido reconocidos como un
estndar para el crecimiento de microorganismos. Este tamao de poro es usado
para recuperar bacterias y otros microorganismos de muchas muestras y ambientes.
(MILLPORE, 2000)
2.2.1. Tipos de filtros de membrana

Hay varios tipos de filtros, entre ellos los que ms se usan son los filtros de
profundidad y los filtros de superficie o filtros de membrana.
2.2.1.1. Filtros de profundidad
Estos filtros estn elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de
vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean
vas tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayora de los contaminantes
presentes.
Entre sus ventajas se encuentran su alta capacidad de retencin de partculas sobre
su superficie y a travs de toda su estructura y que permiten filtrar grandes
volmenes. Sin embargo, tienen como desventajas que no presentan un tamao de
poro uniforme y existe la posibilidad de liberacin, hacia el material filtrado, de
partculas y microorganismos que hayan crecido dentro del filtro.
Dadas sus caractersticas los filtros de profundidad se usan principalmente como
prefiltros, ya que permiten eliminar las partculas grandes pero no la eliminacin total
de los microorganismos.
http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
11
Figura N 1. Filtro de profundidad.
2.2.1.2. Filtros de superficie o de membrana
Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y

contienen poros de tamao uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que al
conocer exactamente el tamao de poro que presentan, se pueden seleccionar
filtros capaces de retener la totalidad de los microorganismos presentes en una
solucin. Sin embargo, se saturan rpidamente y la velocidad de filtracin a travs
de ellos es lenta. Para la filtracin esterilizante se pueden usar combinaciones de un
filtro de profundidad con un filtro de superficie que tenga un tamao de poro de
0.22m. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en
autoclave y luego se manipulan aspticamente al ensamblar el equipo.
http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
Figura N 2. Filtro de superficie o de membrana
12
2.2.1.1. Membrana de nitrato de celulosa
La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricacin de

filtros de membrana.
Estas membranas son de naturaleza hidroflica, con una microestructura muy
uniforme lo que permite excelentes niveles de retencin de partculas y un
comportamiento perfecto en pruebas microbiolgicas. En esos casos pueden ser de
utilidad membranas cuadriculadas con el fondo de color verde o negro, as mediante
contraste, mejorar la visualizacin y el conteo de colonias.
Otra caracterstica importante de estas membranas es su elevada adsorcin. Por
ello, y en combinacin con papeles de cromatografa FILTERLAB serie PC estn
especialmente indicados en procedimientos de identificacin de los componentes en
muestras de cidos nucleicos y protenas mediante tcnicas de transferencia.
http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf
Tienen una estructura de poro muy uniforme, lo que asegura una excelente
retencin y un ptimo crecimiento microbiolgico en muestras de agua, bebidas,
frmacos. (PEARCE, 2007)
Figura N 3. Filtros de nitrato de celulosa

Fuente: www.whatman.com
13
Aplicaciones de los filtros de nitrato de celulosa
Filtracin de aguas.
Anlisis microbiolgico.
Anlisis gravimtricos.
Anlisis cualitativos de partculas.
Esterilizacin de muestras.
Determinacin de protenas.
Identificacin de cidos nucleicos.
Prefiltracin de muestras.
Clarificacin de muestras.
2.2.1.2. Membrana de acetato de celulosa
Los filtros de membrana de celulosa son de naturaleza hidroflica. Presentan una

excelente estabilidad trmica y una bajo nivel de adsorcin, por lo que son
especialmente indicados para la esterilizacin de soluciones biolgicas., adems
estas membranas permiten gran capacidad de carga y altas velocidades de flujo,
por lo que resultan apropiados para la esterilizacin y clarificacin de soluciones
acuosas, alcohlicas y aceites.
Es un material muy fiable como filtro membrana por su excelente estabilidad

qumica frente a soluciones acuosas con pH entre 4 y 8, la mayora de los alcoholes,
hidrocarburos y aceites. El tamao de poro en la superficie de la mayora de las
membranas es altamente uniforme, existen de 0.20, 0.45, 0.65 y 0.80m, en color
blanco, con superficie lisa y no estril. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf
Las partculas ms grandes que el tamao del poro son rechazadas por la superficie
de la membrana y el remanente permanece o se concentra all. El volumen del fluido
y otras partculas finas de menor tamao del poro pueden pasar a travs de la
membrana al sitio de filtrado. (PEARCE, 2007)
14
Figura N 4. Filtro de acetato de celulosa
Fuente: Levy R. y Jornitz M., 2006.
Aplicaciones
Filtracin de muestras de aguas.
Esterilizacin de muestras de protenas.
Esterilizacin de fluidos biolgicos.
Filtracin de alcoholes.
Filtracin de aceites.
15
2.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD
Se puede definir esterilidad como la total ausencia de toda vida viable. A partir de
1940 la definicin de esterilidad aplicada a las industrias farmacuticas fue
incapacidad de un producto de generar turbidez al ser adicionado a un medio de
crecimiento estril. (ALLISON, 1999)
La prueba de esterilidad es bsicamente una prueba en la cual se evala si un
producto mdico o farmacutico esterilizado est libre de microorganismos
contaminantes, mediante la incubacin de todo o parte del producto con un medio
nutritivo. (HUGO y RUSSEL 1998) En esencia, se aade una muestra del material a
analizar a un medio de cultivo, se incuba y se comprueba la existencia de signos de
crecimiento. Si existe crecimiento, se supondr que la contaminacin procede de la
muestra que, por tanto, no pasar la prueba. (HUGO y RUSSEL, 1998)
El fundamento de la prueba de esterilidad consiste en establecer un procedimiento

para valorar la ausencia/presencia de microorganismos aerobios y anaerobios
viables (bacterias, hongos y levaduras) (HERNANDEZ y VASQUEZ, 2002); en
sustancias, preparaciones y objetos que segn la farmacopea deben ser estriles.
Las Farmacopeas y las autoridades reguladoras exigen que el nivel de garanta de

esterilidad para los productos esterilizados acabados sea de 10-6 o superior. Esto
significa que la probabilidad de que un producto seleccionado al azar a partir de un
lote no sea estril debe ser inferior a 1 en 1 milln. (HUGO y RUSSEL 1998)
2.3.1. MEDIOS DE CULTIVO
Segn la USP 29, 2006 los siguientes medios de cultivo son adecuados para la
prueba de esterilidad.
2.3.1.1. Medio Fluido de Tioglicolato

Se utiliza principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo
tambin detecta bacterias aerobias.
16
Tabla N 1. Composicin del medio Fluido de Tioglicolato
L-cisteina 0.5 g
Cloruro de sodio 2.5 g
Dextrosa 5.5 g
Extracto de levadura (soluble en agua) 5.0 g
Digerido pancretico de Casena 15.0 g
Tioglicolato de sodio o cido tiogliclico 0.3 mL
Rezarsurina sdica 1.0 mL
Agua purificada 1000 mL
Fuente: USP 29, 2006
Despus de la esterilizacin, el pH del medio debe ser de 7,1 +/- 0,2. El Medio
Fluido de Tioglicolato debe incubarse a 32,5 +/- 2,5 .
Figura N 5. Medio Fluido Tioglicolato.

Fuente: ZIMBRO M. y POWER D., 2003.
Las sustancias reductoras, tioglicolato y cisteina, los cuales proporcionan una

anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes. La elevada viscosidad
del medio de cultivo tioglicolato impide la penetracin rpida de oxgeno. El eventual
aumento del contenido en oxgeno se pone de manifiesto por un viraje a rojo del
indicador redox Resarzurina sdica. (MERCK, 1998)
La dextrosa, peptona, L-cisteina, y el extracto de levadura proveen los factores de
crecimiento necesarios para la replicacin de los microorganismos. El cloruro de
sodio da iones esenciales. El tioglicolato de sodio es un agente reductor que
previene la acumulacin de perxidos que son letales para los microorganismos.
17
Despus de incubacin, el crecimiento es evidente por la presencia de turbidez
comparada al control sin inocular. Los aerobios estrictos tienden a crecer en la
superficie del medio, los anaerobios obligados pueden crecer solamente en la
porcin del medio por debajo de la parte oxidada. (ZIMBRO y POWER, 2003)
2.3.1.2. Medio de Digerido Casena-Soja
Este medio es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias

aerobias. Es un medio de cultivo verstil y altamente nutritivo que se recomienda
para el crecimiento de hongos y levaduras.
Tabla N 2. Composicin del medio de Digerido Casena-Soja

Digerido Pancretico de Casena 17.0 g
Digerido Papanico de Harina de Soja 3.0 g
Dextrosa 2.5 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Fosfato Dibsico de Potasio 2.5 g
Agua purificada 1000 mL
Despus de la esterilizacin, el pH debe ser de 7,3 +/- 0,2. El Medio de Digerido

Casena-Soja debe incubarse a 22,5 +/- 2,5 .
Figura N 6. Medio Digerido Casena-Soja

Fuente: ZIMBRO M. y POWER D., 2003.
18
El digerido pancretico de casena y el digerido papanico de harina de soja proveen
aminocidos y otras sustancias nitrogenadas. La dextrosa es una fuente de energa.
El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmtico, y el fosfato dibsico de potasio
acta como buffer para controlar el pH. (ZIMBRO y POWER, 2003)
2.3.1.3. Lquidos de dilucin y lavado para filtracin por membrana
Estas soluciones son empleadas para disolver y acondicionar la muestra a evaluar e

inhibir sustancias bacteriostticas y fungistticas que puedan contener la muestra.
(USP 29, 2006)
Los lquidos contienen digerido pptico de tejido animal, que provee una fuente de
nitrgeno para los microorganismos. (ZIMBRO y POWER, 2003)
Liquido A
Contiene digerido pptico de tejido animal en una concentracin de 1g/L y un pH de
7,1 +/- 0,2. Se utiliza para sustancias lquidas miscibles en agua. (USP 29, 2006)
Es un diluyente general o solucin de lavado utilizado para evaluar antibiticos y
sustancias que contienen preservativos. (MILLPORE, 2005)
Lquido D
Contiene digerido pptico de tejido animal y tween 80 en una concentracin de
1ml/L y un pH de 7,1 +/- 0,2 se usa este lquido para artculos que contengan
lecitina o aceite. (USP 29, 2006)
Los lquidos A y D ayudan en el completo enjuague de los filtros de membrana y no
son txicos para los microorganismos. Adems el tween 80 acta como un
surfactante para romper la lecitina o aceites presentes. (ZIMBRO y POWER, 2003)
Lquido K
Contiene digerido pptico de tejido animal, extracto de carne bovina y tween 80, con
un pH de 6,9 +/- 0,2. (USP 29, 2006)
Es generalmente utilizado como solucin de lavado cuando se evalan sustancias
que contienen petrolato. (MILLPORE, 2005)
19
2.3.2. PRUEBAS DE APTITUD
2.3.2.1. Esterilidad de los medios de cultivo

Se confirma la esterilidad del medio para cada partida de esterilizacin, incubando
una porcin del medio a la temperatura de incubacin especifica, durante 14 das.
No se debe producir crecimiento de ningn organismo. (USP 29, 2006). Estos
medios sirven como controles negativos durante la realizacin de la prueba de
esterilidad.
2.3.2.2. Prueba de promocin del crecimiento de organismos aerobios,

anaerobios y hongos
Se evala cada lote de medio preparado o cada lote de medio deshidratado, para
garantizar que el medio de cultivo contiene los nutrientes necesarios para promover
el crecimiento de microorganismos presentes en el producto y para demostrar que
este medio puede sostener el crecimiento de los contaminantes habituales para los
que est diseado. (HUGO y RUSSEL, 1998)
Para realizar esta prueba se debe inocular cada medio con un nmero pequeo (no
ms de 100 UFC) de los microorganismos viables (ver tabla N 6) e incubarlos
durante no ms de 3 das en el caso de bacterias y durante no ms de 5 das en el
caso de hongos. Los medios son adecuados (prueba satisfactoria) si se produce un
crecimiento claramente visible de los microorganismos. (USP 29, 2006)
Tabla N 3. Cepas de microorganismos de prueba adecuados para la prueba de

promocin de crecimiento. Fuente: USP 29, 2006
Medio de cultivo Microorganismo Cepa Temperatura
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Fluido de Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 32,5 +/- 2,5 C
Tioglicolato Clostridium sporogenes ATCC19404
Candida albicans ATCC 10231
Digerido de Bacillus subtilis ATCC 6633 22,5 +/- 2,5 C
Casena-Soja Aspergillus niger ATCC 16404
20
Para realizar la prueba de promocin de crecimiento se puede emplear el patrn de
McFarland, este patrn es utilizado como estndar de turbidez en la preparacin de
suspensiones de microorganismos. Los estndares de turbidez son preparados por
la mezcla de qumicos que precipitan para formar una solucin de turbidez
reproducible. Son realizados adicionando cido sulfrico a una solucin acuosa de
cloruro de bario, del cual resulta la formacin de un precipitado de sulfato de bario.
(ZIMBRO y POWER, 2003)
Esta escala de turbidez es elaborada con una mezcla de BaCl2 de 0.048 M y H2SO4
0.6M, la turbidez la da el cloruro de bario, el cual va en cantidad creciente mientras
el cido sulfrico va disminuyendo la proporcin.
Cada uno de los tubos del patrn de acuerdo con la turbidez, representa un nmero
de bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido determinado por
recuento de colonias. De esta forma al comparar una emulsin de bacterias con el
tubo del patrn de McFarland que ms se asemeje se puede saber
aproximadamente el nmero de bacterias en la emulsin. (ESCOBAR, 2002)
Igualmente es importante tener en cuenta la recuperacin microbiana, ya que esto

va a determinar la cantidad de microorganismos que van a crecer durante la prueba
de promocin de crecimiento y si es o no satisfactoria esta prueba. Las pruebas
microbianas no utilizan clulas individuales, se recolectan poblaciones de clulas
para su estudio. Los datos generados en estos estudios son menos variables si las
poblaciones de clulas son homogneas. Los cultivos lquidos o los cultivos
confluentes en medios slidos son ms adecuados para la preparacin de cultivos
reproducibles.
Las condiciones de recuperacin microbiana estn dentro de las ms cruciales para
calcular con exactitud el nmero de microorganismos presentes en la solucin de
prueba. Se debe considerar el medio de recuperacin que permita el crecimiento,
las condiciones de incubacin, las condiciones ptimas de crecimiento para as
asegurar el crecimiento completo y resultados reproducibles. (USP 29, 2006)
La prueba de esterilidad es no vlida si las pruebas de aptitud no son satisfactorias.
21
2.3.3. MTODOS PARA LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
2.3.3.1. Filtracin por membrana
Esta tcnica es recomendada por la mayora de las Farmacopeas y envuelve la

filtracin de fluidos a travs de un filtro de membrana estril, cualquier
microorganismo presente es retenido en la superficie del filtro. Tambin se pueden
analizar slidos solubles en agua, los cuales pueden ser disueltos en un diluyente
apropiado y procesados por medio de esta tcnica. (HUGO y RUSSEL, 1998)
La tcnica de filtracin por membrana se basa en hacer pasar la muestra a travs

de una membrana porosa delgada, elaborada con plstico de celulosa inerte, los
poros son de tamao uniforme lo suficientemente pequeos para retener los
microorganismos. (AVENDANO y MOYANO, 1997)
Esta tcnica involucra la filtracin a travs de una membrana la cual se coloca en el
equipo de filtracin, donde los microorganismos son atrapados en la superficie del
filtro. Despus de lavar el filtro de membrana con el fin de eliminar los residuos de
las sustancias antimicrobianas del producto que puedan inhibir el crecimiento de los
posibles contaminantes, la membrana se transfiere a los correspondientes medios
de cultivo los cuales son incubados a 32,5 +/- 2,5C para bacterias en el medio
Fluido de Tioglicolato y para hongos en el medio Digerido Casena-Soja a 22,5 +/-
2,5C, durante el tiempo apropiado. (HUGO y RUSSEL 1998)
Se debe transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla
aspticamente en dos partes iguales y transferir una mitad a cada uno de los
medios de cultivo e incubar los medios durante no menos de 14 das.
Cuando se obtengan evidencias de contaminacin microbiana en algn artculo el
resultado es concluyente para determinar que el artculo no cumple con los
requisitos de la prueba de esterilidad. (USP 29, 2006)
La membrana debe sostenerse firmemente en una unidad de la filtracin que

consiste en una base de apoyo para la membrana, un vaso para el fluido que va a
ser evaluado, un depsito colectivo para el fluido filtrado, y los tubos necesarios o
conexiones. El aparato se disea de forma que la solucin a ser filtrada se puede
22
introducir y filtrarse bajo las condiciones aspticas. Adems permite retirar
aspticamente la membrana para transferirla al medio de cultivo o es adecuado para
llevar a cabo la incubacin dentro del aparato mismo despus de agregar el medio.
(AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)
Figura N 7. Equipo de filtracin por membrana.

Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/esterilfilt.pdf
Existen dos tipos de sistemas de filtracin por membrana: el sistema abierto y el

sistema cerrado.
Tabla N 4. Comparacin de los sistemas abierto y cerrado para la tcnica de

filtracin por membrana.
SISTEMA ABIERTO SISTEMA CERRADO
Preparacin del material: se debe Preparacin del material: si el equipo
esterilizar el equipo junto con los es reutilizable se debe esterilizar el
portafiltros y la membrana. manifold junto con los portafiltros y la
membrana.
Sitio de trabajo: se debe llevar a cabo Sitio de trabajo: se debe llevar a cabo
en un rea estril en cabina de flujo en un rea estril en cabina de flujo
laminar clase 100. laminar clase 100.
23
Filtracin del producto: se debe abrir Filtracin del producto: no hay
el sistema para adicionar la muestra. manipulacin de la muestra.
(Momento en que puede presentarse
contaminacin de la muestra).
Adicin de la membrana al medio de Adicin de la membrana al medio de
cultivo: se debe desmontar el equipo y cultivo: no hay contacto en ningn
cortar la membrana por mitad para momento con la membrana ni
adicionarla a los medios de cultivo. manipulacin, se adiciona el producto y
el medio de cultivo, para su posterior
incubacin.
Fuente: Catalogo Sartorius. Sterility Testing System.
2.3.3.2. Inoculacin directa
En condiciones aspticas se transfiere directamente en los medio de cultivo (Fluido

de Tioglicolato y Digerido Casena-Soja) la cantidad apropiada de producto a
examinar, de modo que el volumen del producto no sea mayor de 10% del volumen
del medio, a menos que se indique algo diferente.
Se incuban los medios por no menos de 14 das a la temperatura adecuada,
32,5 +/- 2,5C para el medio Fluido de Tioglicolato y para el medio Digerido
Casena-Soja a 22,5 +/- 2,5C. Se observan los medios de cultivo peridicamente
durante el periodo de incubacin para determinar la ausencia o presencia de
microorganismos. (USP 29, 2006)
Este mtodo es de eleccin para dispositivos mdicos debido a que estos

dispositivos estn en contacto directo con los medios de cultivo durante el periodo
de incubacin. De esta forma los microorganismos viables que se pueden encontrar
en un producto despus de una inadecuada o defectuosa esterilizacin tienen un
ambiente ideal donde pueden crecer y proliferar. (RICHTER, 2006)
24
2.3.4. Interpretacin de resultados
A intervalos durante el perodo de incubacin y al momento de su finalizacin,

examinar los medios en busca de evidencias macroscpicas de crecimiento
microbiano. (USP 29, 2006)
Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado

cumple con la prueba de esterilidad.
Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, los microorganismos deben aislarse
e identificarse y el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a
menos que pueda demostrarse claramente que la prueba result invlida por causas
no relacionadas con el producto examinado. (RICHTER, 2006)
El crecimiento es determinado mediante la observacin del medio, el cual es

generalmente claro y transparente, la turbidez en el medio indica el crecimiento
microbiano. Una vez la turbidez es detectada se debe confirmar que es causada por
el crecimiento de microorganismos y no por la desintegracin de la muestra.
Algunas muestras producen turbidez cuando son vertidas en los medios o producen
reacciones qumicas con los medios de cultivo.
La prueba puede considerarse invlida si se cumple una o ms de las siguientes

condiciones:
- los datos de monitoreo microbiolgico de las instalaciones para la prueba de
esterilidad demuestran una falla.
- Una revisin del procedimiento analtico usado durante la prueba revela una
falla.
- Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
- Despus de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la
prueba, el crecimiento de esta especie puede atribuirse de manera
inequvoca a fallas con respecto al material o a la tcnica usados al realizar
el procedimiento de la prueba de esterilidad.
Si la prueba se declara invlida, se repetir con el mismo nmero de unidades de la
prueba original. Si no se hallan pruebas de crecimiento microbiano en la prueba
25
repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan
pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no
cumple con la prueba de esterilidad. (USP 29, 2006) (Ver Figura N 8.)
26
Ausencia de turbiedad despus de incubacin Conclusin: producto estril
Primer ensayo, realizado
en n muestras Identificacin A
Turbiedad despus de incubacin
Repeticin del ensayo
Ausencia de turbiedad
despus de incubacin Conclusin: producto estril
Segundo ensayo,
realizado en n muestras
Turbiedad despus
Conclusin: producto no estril
de incubacin
Figura N 8. Interpretacin del ensayo de esterilidad.
Fuente: PRADEAU, 1997.
27
2.3.5. Condiciones del rea estril de trabajo
Las reas limpias para la manufactura y anlisis de productos estriles son

clasificadas de acuerdo a las caractersticas ambientales requeridas. Cada
operacin requiere un nivel de limpieza ambiental apropiado para minimizar los
riesgos de contaminacin microbiana en el producto.
Un rea limpia o cuarto limpio es un espacio definido en el cual la concentracin de
microorganismos en el aire, en superficies y en el personal, se encuentra entre
lmites o niveles especficos a una clase.
Para la fabricacin normal de productos estriles pueden distinguirse cuatro

calidades de cuartos limpios:
- Grado A: es la zona para operaciones de alto riesgo, tales condiciones son
proporcionadas por un trabajo bajo cmara de flujo laminar.
- Grado B: es el ambiente de los alrededores de la zona A.
- Grado C y D: reas limpias donde se realizan las fases menos crticas, pero
igualmente importantes, en la fabricacin de productos estriles.
Esto es un punto importante que se debe tener en cuenta para que la preparacin
de los productos estriles se lleve de una forma controlada, evitando riesgos de
contaminacin y garantizando la calidad de estos productos para su
comercializacin. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002)
Para lograr las condiciones aspticas en la prueba de esterilidad, el entorno de la

prueba tendr que adaptarse a la manera en que se realice. Se deben tomar
precauciones para evitar la contaminacin de modo que no afecte a ningn
microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones aspticas
para la ejecucin de la prueba deben ser usadas en una cabina de flujo laminar
(cuarto limpio clase A) localizado en un cuarto limpio clase B. (Ver tabla N 5)
(EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0., 2005)
Las condiciones de trabajo en las que se efectan las pruebas se controlan
regularmente mediante un muestreo adecuado del rea de trabajo y la realizacin
28
de controles adecuados para verificar que estas condiciones sean apropiadas.
(EUROPEAN PHARMACOPOEIA 5.0., 2005) El control microbiolgico de las reas
estriles se puede realizar por diferentes mtodos como el mtodo de
sedimentacin, el mtodo de impactacin utilizando un equipo muestreador de aire y
tambin por muestreo de superficies. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002)
Al realizar los anlisis de esterilidad en estas condiciones y con los debidos
controles se reduce la incidencia de resultados falsos positivos debido a
contaminaciones extraas introducidas durante la realizacin del anlisis. (HUGO y
RUSSEL, 1998)
Las condiciones de trabajo donde se realiz la evaluacin prctica, laboratorio de

microbiologa de AQM Ltda., presenta especificaciones ambientales establecidas
mediante estudios previos y resultados histricos. (Ver tabla N 6)
Debido a que las pruebas de esterilidad constituyen un procedimiento cuya asepsia

debe garantizarse para lograr una interpretacin correcta de los resultados, es
importante que el personal est debidamente entrenado y calificado. (USP 29, 2006)
Es importante que los materiales en los que se va a analizar la esterilidad no sufran
contaminaciones procedentes de los operadores o del ambiente durante la
realizacin del anlisis. (HUGO y RUSSEL 1998)
Por ello, estas pruebas deben llevarse a cabo en laboratorios adecuados y por
personal competente y experto usando tcnicas y equipo, lo cual minimiza los
riesgos de contaminacin microbiana accidental en las pruebas y en el muestreo
ambiental. (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)
El personal que ocupa el rea asptica durante la prueba de esterilidad debe llevar
vestimenta estril. (Ver tabla N 7) Igualmente todo el material, equipo y dems
objetos que pueden entran en contacto durante el curso de la prueba deben ser
esterilizados antes de su uso. (AUSTRALIAN GOVERNMENT, 2006)
En conclusin el ensayo de esterilidad debe realizarse en condiciones muy estrictas,

respetando las exigencias en cuanto a los procedimientos establecidos por la
Farmacopea.
29
Tabla N 5. Clasificacin de ambientes controlados para la industria farmacutica.
rea Denominacin N mximo de N mximo de
grado US partculas/m3 microorganismos viables/m3
A 100 3530 <1
B 1000 35300 5
C 10000 350000 100
D 100000 3530000 500
Fuente: USP 29, 2006.
Tabla N 6. Lmites microbiolgicos para el rea asptica manejados por AQM Ltda.
Ambiente del rea asptica N mximo de microorganismos
viables/placa
Cabina Clase 1001 <1
Mesa 5
Sobre cabina 5
Puerta 8
1
Segn USP 29, 2006.
Tabla N 7. Lmites microbiolgicos para el control de personal.

rea N mximo de microorganismos
viables/guante
Clase 100 3
Clase 10000 10
Fuente: USP 29, 2006.
30
2.4. ESPECTROFOTOMETRA
Se denomina espectrofotometra a la medicin de la cantidad de energa radiante

que absorbe un sistema en funcin de la longitud de onda de la radiacin, y a las
mediciones a una determinada longitud de onda.
La teora ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de
cuantos de energa llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda est
asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad definida de
energa. (FISHER, 1970)
Se puede realizar lecturas espectrofotomtricas de diversas sustancias para

determinar parmetros como la absorbancia o la tramitancia, lo mismo que puede
hacerse con una emulsin de microorganismos para determinar as su
concentracin.
Un cultivo bacteriano acta como una suspensin coloidal, porque absorbe o
transmite la luz que pasa a travs de l. Dentro de ciertos lmites, la luz que pasa
por una suspensin bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de
clulas que hay en el cultivo. Por lo tanto al aplicar la medida de la transmisin de
los rayos de luz, o la medida del porcentaje de absorcin de luz a una suspensin
bacteriana, se puede calcular el nmero de clulas presentes. (ESCOBAR, 2002)
Para estas determinaciones se utiliza el espectrofotmetro, instrumento que posee
una fuente de luz monocromtica. Esta luz pasa a travs de un cultivo bacteriano y
la cantidad de luz reflejada o transmitida es medida.
2.4.1. Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorcin: Ley de Beer-

Bouguer-Lambert
La ley de Beer-Bouguer-Lambert rige las determinaciones espectrofotomtricas, en

las cuales al incidir un rayo de luz monocromtica sobre un medio absorbente de
luz, la absorbancia por el medio ser directamente proporcional a la concentracin
de la sustancia responsable de la absorcin, al mantenerse constante la intensidad
31
del rayo incidente, la distancia recorrida por el rayo dentro de la sustancia y la
longitud de onda de sta.
Al incidir un rayo de intensidad, la intensidad que sale del medio se denomina
intensidad transmitida. La relacin entre estas dos variables se denomina tramtancia
(T). El logaritmo de la tramitancia multiplicado por menos uno es igual a la
absorbancia (A). (ESCOBAR, 2002)
La forma matemtica de la ley de Beer-Bouguer-Lambert, log T = A, muestra que

log T y A son funciones lineales de la concentracin. La representacin de log T
frente a la concentracin es una lnea recta de pendiente negativa, y la
representacin de A frente a la concentracin es una lnea recta de pendiente
positiva. (FISHER, 1970)
2.4.2. Tratamientos de los datos espectrofotomtricos
2.4.2.1. Curvas espectrales

Los datos obtenidos mediante espectrofotometra pueden representarse mediante
una grfica de tramitancia o absorbancia frente a longitudes de onda. Algunas
sustancias exhiben una mayor o menor absorcin en una regin espectral amplia,
otras pueden mostrar una absorcin especfica a una longitud de onda
caracterstica. (FISHER, 1970)
2.4.2.2. Curvas de calibrado

Despus de determinar la longitud de onda a la cual deben de realizarse las
medidas, se calibra el mtodo midiendo una serie de patrones del constituyente
evaluado. Las medidas de tramitancia (o absorbancia) se realizan comnmente
ajustando la escala de medida del instrumento a 100% de tramitancia (absorbancia
0) cuando el rayo luminoso pasa a travs de un blanco, que debe ser idntico a la
muestra en todo, excepto que no debe contener el constituyente que se ha de
determinar. (FISHER, 1970)
32
3. JUSTIFICACIN
La calidad debe ser garantizada en la produccin de medicamentos en la industria

farmacutica, por lo cual la evaluacin de estos productos es de gran importancia
para asegurar su calidad y su uso sin ningn riesgo.
Esta calidad se relaciona con el cumplimiento de las especificaciones, las cuales
comprenden una serie de normas seleccionadas junto con los mtodos de anlisis
correspondientes, utilizadas para determinar la integridad de los productos y las
materias primas. (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1997)
Es evidente que los puntos de calidad son caractersticas importantes en la

manufactura de los medicamentos, no solamente para el producto sino tambin en
el hecho que un error puede ser perjudicial para la salud y la vida. Todo esto ha
causado que la industria farmacutica sea fuertemente regulada sobre la calidad de
los productos a comercializar. As se dio inicio al concepto de validacin como una
medida para asegurar la calidad el producto final. (ALEEM, et al. 2003)
El componente ms importante de la garanta de la calidad microbiolgica aplicada

tradicionalmente a los productos estriles es el anlisis de esterilidad, que asegura
que un producto farmacutico estril se encuentra libre de microorganismos
contaminantes. (HUGO y RUSSEL 1998) Para esto se aade una muestra del
material a analizar a un medio de cultivo, se incuba y se comprueba la existencia de
signos de crecimiento. (HUGO y RUSSEL 1998). Al ser esta una prueba que
necesita un largo tiempo de anlisis, los laboratorios de anlisis microbiolgicos
enfocados hacia la industria farmacutica, necesitan establecer un procedimiento
estndar que produzca de forma constante las mismas caractersticas y resultados
satisfactorios.
Por lo tanto, la prueba de esterilidad es uno de los pasos ms importantes en el

control de un producto farmacutico estril, evitando falsos positivos, falsos
33
negativos, fallas en el equipo y errores humanos que pueden costar tiempo, dinero y
fundamentalmente producto. (MILLPORE, 2005)
Las tcnicas analticas de un producto farmacutico o de ingredientes especficos

sin producto, son necesarias para garantizar la seguridad y eficacia de stos
durante toda su vida til, incluyendo su almacenamiento, distribucin y uso; esta
evaluacin debe ser llevada en concordancia con especificaciones elaboradas y
validadas durante el desarrollo del producto y su anlisis. (WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1997)
En este trabajo se valid la retencin microbiana en los filtros de acetato y nitrato de

celulosa empleados en la tcnica de filtracin por membrana, esta evaluacin se
realiz sin ningn producto especfico para que en adelante esta tcnica sirva de
soporte para la prueba de esterilidad con diferentes productos farmacuticos,
controlando las condiciones establecidas por la validacin.
El Laboratorio de anlisis qumico y microbiolgico AQM Ltda., diariamente realiza

pruebas de esterilidad donde analiza diversos productos farmacuticos, por lo tanto
se hace necesario obtener una tcnica reproducible y con ptimos resultados. Al
optimizar esta prueba el laboratorio va a obtener resultados precisos y confiables,
disminuyendo el riesgo de equivocacin y la repeticin de anlisis con lo cual
disminuye costos, incrementa la productividad y mejora la calidad del servicio al
cliente.
34
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Validar la retencin microbiana en los filtros de membrana de acetato y nitrato de

celulosa con un tamao de poro de 0,45m empleados en la tcnica de filtracin por
membrana para la prueba de esterilidad.
4.2. Objetivos especficos
Comprobar la retencin de microorganismos contaminantes en los filtros de

membrana de 0,45 m mediante la turbidez de los medios de cultivo lquidos.
Determinar la retencin y la recuperacin de los microorganismos

contaminantes en los filtros de membrana de acetato y nitrato de celulosa
empleados en la tcnica de filtracin por membrana.
Confirmar las condiciones del montaje de la tcnica de filtracin por

membrana siguiendo los parmetros de la USP 29.
Verificar en los medios de cultivo, Fluido de Tioglicolato y Digerido de

Casena-Soja la prueba de promocin de crecimiento.
Determinar el tiempo de crecimiento de los microorganismos utilizados en la

prueba de promocin de crecimiento mediante turbidimetra, en los medios
de cultivo lquidos Fluido de Tioglicolato y Digerido de Casena-Soja.
Ajustar el procedimiento POSM0017 P002 PROCEDIMIENTO PARA LA

REALIZACIN DE PRUEBAS DE ESTERILIDAD para optimizar el proceso
de la tcnica de filtracin por membrana para la prueba de esterilidad en el
Laboratorio AQM Ltda.
35
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1. DISEO DE LA INVESTIGACIN
Se realiz un estudio experimental donde la validacin fue de tipo concurrente ya

que la informacin se obtuvo durante el proceso, realizando monitoreo de todo el
proceso para verificar que esta bajo control.
Igualmente en la validacin se evaluaron parmetros como la linealidad, la precisin
y la especificidad.
5.1.1. Poblacin de estudio y muestra
Se analizaron 6 microorganismos estos son:

Staphylococcus aureus ATCC 6538
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Candida albicans ATCC 10231
Bacillus subtilis ATCC 6633
Aspergillus niger ATCC 16404
Con estos microorganismos se realiz el montaje de la tcnica de filtracin por

membrana con 5 rplicas para cada microorganismo, realizando cada rplica en 5
das diferentes.
Igualmente se utilizaron dos tipos de membranas de 0,45 m, los cuales son filtros
de nitrato de celulosa y filtros de acetato de celulosa.
Para la prueba de promocin de crecimiento se utilizaron los 6 microorganismos
mencionados anteriormente y se realizaron 3 rplicas en 3 das diferentes.
La prueba de esterilidad de los medios de cultivo se realiz 5 veces en das
diferentes, sin ningn microorganismo.
Las cepas de los microorganismos utilizados se encontraban liofilizadas para luego
ser conservadas en cultivos de mantenimiento, sin embargo los microorganismos
viables empleados para la prueba no deban tener ms de cinco transferencias
desde el lote original.
36
5.1.2. Materiales utilizados durante la validacin
5.1.2.1. Pruebas preliminares

5.1.2.1.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
- Medio Fluido de Tioglicolato

- Medio Digerido Casena-Soja
- Frascos Schott de 250 mL
- Incubadora de 22,5 +/- 2,5C
5.1.2.1.2. Prueba de promocin de crecimiento
- Agar Casoy
- Agar HC
- Solucin salina
- Cajas de Petri desechables
- Asa curva
- Tubos de ensayo de 13 X100
- Tubo 0,5 del patrn de Mc Farland
- Pipetas de 2mL
- Anaerogen
- Indicador de anaerobiosis
- Cmara de anaerobiosis
- Lminas
- Colorantes de Gram
- Staphylococcus aureus ATCC 6538
37
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- Clostridium sporogenes ATCC 19404
- Candida albicans ATCC 10231
- Bacillus subtilis ATCC 6633
- Aspergillus niger ATCC 16404
5.1.2.2. Tcnica de filtracin por membrana
5.1.2.2.1. Controles para el proceso
- Agar Casoy
- Agar HC
- Alcohol al 72 %
- Cajas de Petri desechables
- Muestreador de aire MAS-100
- Cabina de flujo laminar con filtro HEPA.
5.1.2.2.2. Control negativo
- Diluyente D estril
- Filtro de membrana de acetato de celulosa Sartorious
- Filtro de membrana de nitrato de celulosa Durapore - Millipore
- Tijeras estriles
- Pinzas estriles
- Manifold
- Mangueras
- Erlenmeyer con tabuladora lateral
- Vasos de filtracin
38
- Tapn
- Bomba de vaco de 420 mmHg.
- Autoclave
5.1.2.2.3. Filtracin por membrana
- Diluyente D
- Solucin salina
- Filtro de membrana de acetato de celulosa Sartorious
- Filtro de membrana de nitrato de celulosa Durapore - Millipore
- Tubos de ensayo de 13 X 100
- Tijeras estriles
- Pinzas estriles
- Lminas
- Colorantes de Gram
- Manifold
- Mangueras
- Erlenmeyer con tabuladota lateral
- Vasos de filtracin
- Tapn
- Bomba de vaco de 420 mmHg.
- Autoclave
- Staphylococcus aureus ATCC 6538
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
- Clostridium sporogenes ATCC 19404
- Candida albicans ATCC 10231
39
- Bacillus subtilis ATCC 6633
- Aspergillus niger ATCC 16404
5.2. METODOLOGA DE VALIDACIN
VALIDACIN DE PROCEDIMIENTOS
Recopilacin de informacin
Calibracin y mantenimiento de equipos
Revisin bibliogrfica de la prueba en USP 29
Realizacin de pruebas preliminares
Realizacin de la prueba de esterilidad
Reporte de resultados
Optimizacin de procedimientos POEs
Figura N 9. Validacin de procedimientos.
Fuente: CORTES, A. et al. 2003
5.2.1. Recopilacin de la informacin

Se realiz una revisin de los factores que influyen en la validez de la prueba como
lo son tcnicas, personal, equipos e instalaciones, controles ambientales, de
personal y sanitizacin de equipos e instalaciones del rea asptica, reactivos y
medios de cultivo utilizados para la prueba de esterilidad y procedimientos
operativos del laboratorio para el rea de microbiologa.
40
5.2.2. Calibracin y mantenimiento de los equipos
Se verific que los equipos utilizados en la validacin se encontraban funcionando
de la forma esperada dentro de los rangos operacionales para los cuales fueron
diseados.
Dentro de los equipos utilizados se encuentran:
- Cabina de flujo laminar horizontal del rea asptica
- Bomba de vaco del rea asptica
- Balanza Ohaus
- Autoclave Sterilof
- Incubadoras de 22,55C y 32,5C.
- Muestreador de aire MAS 100
- Microscopio
- Termmetro de cada incubadora
- Espectrofotmetro
5.3. Pruebas preliminares
PRUEBAS PRELIMINARES
Prueba organolptica
Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
Prueba de promocin de crecimiento
Reportar resultados en formatos respectivos
Reporte de resultados
Figura N 10. Pruebas preliminares

Se realiz a cada lote de medio de cultivo preparado una prueba organolptica
donde se evalu el color, la textura y aspecto frente a las especificaciones de la
USP 29.
41
5.3.1. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
Esta prueba se realiz a cada lote de medio de cultivo lquido preparado y utilizado
durante la metodologa. Este ensayo se realiz 5 veces en das diferentes para
determinar as la esterilidad de los medios de cultivo durante el estudio de
validacin.
ESTERILIDAD
Se incubaron los medios de cultivo lquidos, Medio Fluido de Tioglicolato a 32,5 +/-
2,5C y Medio de Digerido Casena-Soja a 22,5 +/- 2,5C durante 14 das.
No crecimiento Crecimiento
Prueba satisfactoria Prueba no satisfactoria
Realizar coloracin de Gram
Figura N 11. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo.

5.3.2. Prueba de promocin de crecimiento

Se realizaron 3 repeticiones en 3 das diferentes para garantizar que los medios de
cultivo utilizados durante el estudio contenan los nutrientes necesarios para
promover el crecimiento de los microorganismos evaluados y verificar as la
efectividad de estos medios.
Para realizar esta prueba fue necesario obtener las cepas de los 6 microorganismos
evaluados, los cuales se encontraban en medio de mantenimiento, por lo cual se
realiz una siembra por agotamiento en los medios de cultivo slidos agar Casoy y
agar HC. Con las cepas obtenidas anteriormente se realiz una suspensin de cada
microorganismo en 10 mL de solucin salina segn el tubo 0,5 del patrn de Mc
42
Farland el cual corresponde a una concentracin de 1X108 UFC/mL. A partir de
cada suspensin se realizaron diluciones hasta 10-6 inoculando 0.1 mL en 9,9 mL de
solucin salina obteniendo as una concentracin final de 1X102 UFC/ml. (Ver figura
N 12)
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL
Suspensin del 9,9 mL solucin 9,9 mL solucin 9,9 mL solucin

microorganismo salina salina salina
segn tubo 0,5
-2 -4 -6
patrn Mc Farland 10 10 10
8 6 4 2
1X10 UFC/mL 1X10 UFC/mL 1X10 UFC/mL 1X10 UFC/mL
Figura N 12. Diagrama de las diluciones empleadas en la prueba de promocin de

crecimiento.
Despus de realizar las diluciones se sembr 0.1mL de la ltima dilucin 10-6 en los
medios de cultivo lquidos (Fluido de Tioglicolato, Digerido Casena Soja) y slidos
(Agar Casoy, Agar HC) y stos se incubaron durante el tiempo adecuado como se
muestra en la figura N 13.
En el ensayo 3 de esta prueba se inocul 0,1mL de la dilucin 10-6 de cada

microorganismo en los medios de cultivo lquidos (Fluido de Tioglicolato y Digerido
Casena- Soja) y se incubaron durante 100 horas para observar su crecimiento
mediante un mtodo turbidimtrico utilizando el espectrofotmetro con una longitud
de onda de 540 nm y haciendo una lectura de porcentaje de Tramitancia. Los
tiempos evaluados fueron 2, 4, 6, 8, 24, 28, 32, 48, 52, 56, 72, 78, 96 y 100 horas.
43
Los datos de crecimiento obtenidos corresponden al parmetro de linealidad y
fueron analizados mediante el software Validation Manager, versin 2.20L.
PROMOCIN DE CRECIMIENTO
A partir de un cultivo en medio de mantenimiento (Procedimiento para el manejo del

cepario POSM002-P002) se obtuvieron las cepas de los diferentes microorganismos
(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida
albicans, Bacillus subtilis, Aspergillus niger) realizando una siembra por agotamiento en
agar Casoy para bacterias y agar HC para hongos, incubndolos 24 horas a 32,5 +/-
1
2,5C para bacterias y 3 das a 22,5 +/-2,5C para hongos.
Se realiz una suspensin de cada microorganismo repicado en un tubo con 10 mL de

Solucin Salina segn el tubo 0,5 del patrn de Mc Farland correspondiente a una
8
concentracin de 1X10 UFC/mL.
Se realizaron diluciones hasta 10-6 en tubos con 9.9 mL de solucin salina inoculando
0,1 mL de cada suspensin en cada una de las diluciones.
Se sembr 0,1 mL de la ltima dilucin 10-6 (100UFC/mL) en los medios de cultivo
Fluido de Tioglicolato Digerido Casena-Soja
Staphylococcus aureus Candida albicans

Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis
Clostridium sporogenes Aspergillus niger
Se incub durante 2 das a 32,5 +/- Se incub durante 5 das a 22,5 +/-
2,5C 2,5C
Se evalu el crecimiento de los microorganismos por turbidimetra durante 100 horas

mediante espectrofotmetro con una longitud de onda de 540 nm.
44
-6
Se sembr en profundidad por duplicado 1 mL de la dilucin 10 en los medios de cultivo
slido, agar HC para hongos y agar Casoy para bacterias.
Candida albicans Staphylococcus aureus

Aspergillus niger Pseudomonas aeruginosa
Bacillus subtilis
1
Clostridium sporogenes
Se incub por 5 das a 22,5 +/- 2,5C Se incub por 2 das a 32,5 +/- 2,5C
Se observaron los resultados en los medios lquidos y slidos
Crecimiento No crecimiento
Prueba satisfactoria Prueba no satisfactoria
Se realiz conteo de UFC/mL en medios slidos el

cual era aproximadamente de 100 UFC/mL.
Se realiz coloracin de Gram

1
Clostridium sporogenes se incub en condiciones de anaerobiosis.
Figura N 13. Prueba de promocin de crecimiento.

5.4. TCNICA DE FILTRACIN POR MEMBRANA UTILIZADA EN LA PRUEBA

DE ESTERILIDAD
Cada montaje incluy esterilidad en los dos tipos de membrana de 0,45 m, filtros
de nitrato de celulosa y acetato de celulosa, por cada microorganismo para un total
de 12 esterilidades, teniendo en cuenta los 6 microorganismos y realizados en 5
45
das diferentes, para un total de 60 pruebas de esterilidad, utilizando el lquido D
como diluyente.
Antes de los montajes de esta prueba se coloc una membrana de 0,45 m en cada
vaso de filtracin, para que stos y los dems materiales que se utilizaron fueran
esterilizados, previamente al ensayo, en el autoclave a 121C y 15 lb psi durante 35
minutos.
En cada montaje se evaluaron inicialmente los controles para el proceso en donde

se realiz el control ambiental del rea estril por el mtodo de sedimentacin, en
agar Casoy y agar HC, en ambientes como la cabina de flujo laminar, sobre la
cabina, la mesa auxiliar y la puerta, igualmente se realiz el control ambiental inicial
en la cabina de flujo laminar con el muestreador de aire MAS-100 durante 2 minutos
equivalentes a 200 L.
Adems se realiz el control de personal al inicio y final de cada montaje mediante
la impresin de guantes en agar Casoy y agar HC.
Despus de los controles ambientales y de personal se sanitizaron los materiales
con alcohol al 72% y stos se ubicaron dentro de la cabina de flujo laminar para
armar el equipo de filtracin y as proceder a las filtraciones. (Ver figura N 14.)
Primero se realiz la filtracin del control negativo del montaje o blanco del equipo
en donde se filtr 250 mL de diluyente D estril, se cort por mitad el filtro de
membrana y cada parte de la membrana se adicion a los medio de cultivo lquidos
(Fluido de Tioglicolato y Digerido Casena-Soja), los cuales fueron incubados
durante 14 das a la temperatura adecuada como se indica en la figura N 15. Si
despus del tiempo de incubacin se observa turbidez (crecimiento microbiano) del
medio de cultivo la prueba era no satisfactoria y se realizaba coloracin de Gram, al
contrario si no se presentaba turbidez o crecimiento microbiano la prueba era
satisfactoria.
Para realizar las filtraciones por membrana se contamin el diluyente D con 0,1 mL
de la dilucin 10-6 de cada uno de los 6 microorganismos evaluados en la prueba de
promocin de crecimiento. El diluyente contaminado fue filtrado, la membrana fue
46
cortada por mitad y cada parte fue adicionada a los medios de cultivo Fluido de
Tioglicolato y Digerido Casena-Soja, stos medios se incubaron durante 14 das a
la temperatura adecuada. Al cabo del tiempo de incubacin se realiz la lectura si
se observa crecimiento microbiano se considera una prueba satisfactoria, si no se
observa crecimiento la prueba es no satisfactoria. (Ver figura N 16)
Despus de filtrar cada diluyente contaminado se agreg a cada medio de cultivo
lquido 10 mL del lquido filtrado, para asegurar la retencin de los microorganismos
contaminantes en los filtros de membrana y el no crecimiento de stos en el lquido
filtrado. Los medios de cultivo fueron incubados durante 14 das, si despus del
tiempo de incubacin se observa turbidez (crecimiento microbiano) del medio de
cultivo la prueba se considera no satisfactoria, al contrario si no se presenta turbidez
o crecimiento microbiano la prueba es satisfactoria. (Ver figura N 16). Esta
evaluacin del lquido filtrado se realiz en los montajes 1, 3 y 5 de la tcnica de
filtracin por membrana.
Para realizar los controles para el proceso se utiliz por cada da:
- 5 cajas de Petri con agar Casoy para el control ambiental.
- 5 cajas de Petri con agar HC para el control ambiental.
- 2 cajas de Petri con agar Casoy para el control de personal al inicio y final de
la prueba.
- 2 cajas de Petri con agar HC para el control de personal al inicio y final de la
prueba.
Para realizar el control negativo de la prueba se utiliz por cada da:
- Un frasco con medio Fluido de Tioglicolato para el diluyente estril.
- Un frasco con medio Digerido Casena-Soja para el diluyente estril.
Para realizar la filtracin por membrana se utiliz por cada montaje:
- Dos frascos con medio Fluido de Tioglicolato para cada microorganismo a
evaluar.
- Dos frascos con medio Digerido Casena-Soja para cada microorganismo a
evaluar.
- Dos frascos con medio Fluido de Tioglicolato para agregar el lquido filtrado.
- Dos frascos con medio Digerido Casena-Soja para agregar el lquido
filtrado.
47
Se utilizaron frascos Schott de 250 mL que contenan 80 mL de medio preparado.
CONTROLES PARA EL PROCESO
Se realiz el control ambiental en la cabina de flujo laminar, sobre la cabina, mesa

auxiliar y puerta con agar Casoy y agar HC mediante el mtodo de sedimentacin
durante el tiempo de la prueba. Igualmente se realiz el control ambiental de la cabina, al
inicio de la prueba, con el equipo MAS-100 durante 2 minuto equivalente a 200L.
Se realiz el control de personal al inicio y final de la prueba mediante la impresin de

guantes en agar Casoy y agar HC.
Se sanitizaron los materiales a utilizar en la cabina de flujo laminar con alcohol al 72%
Se ubic el material y se arm el equipo Manifold dentro de la cabina de flujo
Figura N 14. Controles para el proceso en la tcnica de filtracin por membrana.
CONTROL NEGATIVO
Se filtr 250 mL de diluyente
Se cort la membrana por mitad con tijeras y pinzas estriles
Se adicion cada parte de la membrana a los medios lquidos
Se incubaron los medios por 14 das observndose peridicamente. Medio Fluido de

Tioglicolato a 32,5 +/- 2,5C y Digerido Casena-Soja a 22,5 +/-2,5C
Prueba no Prueba
satisfactoria satisfactoria
Coloracin de Gram
Figura N 15. Control negativo de la tcnica de filtracin por membrana.
48
FILTRACIN POR MEMBRANA
Se contamin 250 mL de diluyente D

-3
con 0,1 mL de la dilucin 10 de
cada microorganismo evaluado en la
Se agreg 10 mL del filtrado a los prueba de promocin de crecimiento
medios de cultivo lquidos y stos se
incubaron durante 14 das.
Se filtr el diluyente contaminado
Crecimiento No crecimiento Se cort la membrana por mitad con

tijeras y pinzas estriles, se adicion
Prueba no Prueba cada parte a los medios lquidos
Se incubaron los medios durante 14

Coloracin de Gram das observndose peridicamente.
Medio Fluido de Tioglicolato a 32,5
+/- 2,5C y Digerido Casena-Soja a
22,5 +/-2,5C
Prueba Prueba no
Coloracin de Gram
Figura N 16. Tcnica de Filtracin por membrana.
49
6. RESULTADOS
6.1. Calibracin y mantenimiento de equipos
Tabla N 8. Programa de calibracin y mantenimiento de los equipos utilizados en

la validacin.
EQUIPO MARCA / LTIMA PRXIMA PROVEEDOR
MODELO VERIFICACIN VERIFICACIN
Incubadora N 2 BINDER / M: febrero M: octubre 2007 Servibalanzas
M1711509900312 2007
Incubadora N 6 BINDER / M: febrero M: octubre 2007 Servibalanzas
M1711509900312 2007
Termmetro digital FISHER / C: julio 2006 C: julio 2007 Metrocal
15-078G
Cabina de flujo PAF / CF: julio 2006 CF: julio 2007 Tcnica
laminar PAMAS 2448
Bomba de vaco MILLIPORE / M: julio 2006 M: julio 2007 Impresin y
5KH33DN16X plsticos
Muestreador MERCK / M y C: octubre M y C: octubre Merck
MAS 100 65792 2006 2006
Balanza OHAUS OHAUS / M: enero 2007 M: julio 2007 Vansolix
2610
Microscopio OLYMPUS / M: abril 2007 M: abril 2008 Servibalanzas
CHK 4E
Autoclave Sterilof STERILOF / CF: enero 2007 CF: enero 2008 BPM Andina
144-1PGrPr M: mayo 2007 M: noviembre Equitcnicos
2007
Espectrofotmetro UNICAM / M y C: abril 2007 M y C: abril 2007 Innovatec
UV2-100
M: Mantenimiento
C: Calibracin
CF: Calificacin
50
6.2. Pruebas preliminares
6.2.1. Prueba organolptica
Tabla N 9. Anlisis organolptico de los medios de cultivo.

MEDIO ESPECIFICACIN RESULTADO
Fluido de Medio lquido transparente de color Satisfactorio
Tioglicolato amarillo claro, translcido, con anillo de
rezarsurina en la parte superior.
Digerido Casena- Medio lquido transparente de color Satisfactorio

Soja amarillo, translcido.
Agar Casoy Medio slido de color claro. Satisfactorio
Agar HC Medio slido de color mbar con tonos Satisfactorio

amarillos, ligeramente turbio y sin
precipitado significante.
51
6.2.2. Prueba de esterilidad de los medios de cultivo
Tabla N 10. Resultados de la Prueba de esterilidad de los medios de cultivo

lquidos.
MEDIO Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Ensayo 4 Ensayo 5
dE 14-04-07 21-04-07 28-04-07 12-05-07 19-05-07
CULTIVO
Fluido de Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Tioglicolato
Digerido
Casena- Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
Soja
Satisfactorio se refiere a la ausencia de crecimiento microbiano.
6.2.3. Prueba de promocin de crecimiento
Tabla N 11. Recuentos obtenidos en la Prueba de promocin de crecimiento.

MEDIO Microorganismo Recuento 1 Recuento 2 Recuento 3
UFC / ML UFC / ML UFC / ML
de
14-04-07 28-04-07 19-05-07
cultivo
Bacillus subtilis ATCC 6633 216 69 20
237 52 21
Promedio 226 60 20
Clostridium sporogenes 23 24 71
AGAR ATCC 19404 30 29 31
CASOY Promedio 26 26 51
52
Staphylococcus aureus 177 90 97
ATCC 6538 205 118 89
Promedio 191 104 93
AGAR Pseudomonas aeruginosa 173 91 103
CASOY ATCC 9027 197 104 96
Promedio 185 97 99
Candida albicans 96 78 65
ATCC 10231 101 73 48
Promedio 98 76 56
AGAR Aspergillus niger 20 24 92
HC ATCC 16404 23 22 60
Promedio 22 23 76
Figura N 17. Bacillus subtilis en agar Casoy.
53
Figura N 18. Clostridium sporogenes en agar Casoy.
Figura N 19. Staphylococcus aureus en agar Casoy.
Figura N 20. Pseudomas aeruginosa en agar Casoy.
54
Figura N 21. Candida albicans en agar HC.
Figura N 22. Aspergillus niger en agar HC.
Tabla 12. Resultados obtenidos en la Prueba de promocin de crecimiento para

medios de cultivo lquidos en los tres ensayos realizados.
MEDIO de MICROORGANISMO RESULTADO MORFOLOGIA
cultivo
Clostridium sporogenes Satisfactorio Bacilos Gram
ATCC 19404 positivos
Fluido de Staphylococcus aureus Satisfactorio Cocos Gram
Tioglicolato ATCC 6538 positivos
55
Pseudomonas aeruginosa Satisfactorio Bacilos Gram
ATCC 9027 negativos
Bacillus subtilis Satisfactorio Bacilos Gram
ATCC 6633 positivos
Digerido Candida albicans Satisfactorio Levaduras
Casena-Soja ATCC 10231
Hifas hialinas,
conidios globosos y
Aspergillus niger Satisfactorio
cabezas conidiales
ATCC 16404
radiales.
Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano.
56
6.2.3.1. Mtodo turbidimtrico
Los datos de % de tramitancia obtenidos durante el tiempo de incubacin (100
horas) de los medios inoculados se observan en las tablas N 12 a la N 23.
Tabla N 13. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium sporogenes en

medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometra.
TIEMPO (horas) % TRAMITANCIA
2 94,159
2 94,714
Promedio 94,437
4 90,196
4 90,024
Promedio 90,110
6 89,603
6 88,497
Promedio 89,050
8 82,024
8 82,024
Promedio 82,024
24 77,967
24 76,984
Promedio 77,476
28 69,471
28 67,429
Promedio 68,450
32 59,556
32 59,821
Promedio 59,689
48 50,619
48 49,867
Promedio 50,243
52 45,736
52 41,830
Promedio 43,783
56 34,202
56 34,148
Promedio 34,175
72 17,470
72 17,459
Promedio 17,465
78 12,102
78 12,207
Promedio 12,155
96 4,552
96 4,496
Promedio 4,524
100 2,955
100 2,947
Promedio 2,951
57
Figura N 23. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba
de promocin de crecimiento.
0,5
Tiempo (Horas)
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,5
Log A
-1,0
y = 0.0164x - 1.3427
-1,5
-2,0
Coeficiente de correlacin R2 = 0.990293
Fase de adaptacin durante las primeras 24 horas despus de la inoculacin.

Fase exponencial a partir de la hora 56.
58
Tabla N 14. Datos de % tramitancia del crecimiento de Clostridium sporogenes en
medio Digerido Casena-Soja observados mediante espectrofotometra.
2 99,786
2 99,935
Promedio 99,861
4 99,622
4 99,605
Promedio 99,613
6 99,682
6 99,668
Promedio 99,675
8 100,091
8 98,612
Promedio 99,351
24 99,363
24 99,405
Promedio 99,384
28 98,212
28 98,184
Promedio 98,198
32 97,239
32 97,240
Promedio 97,240
48 98,544
48 98,286
Promedio 98,415
52 98,228
52 97,901
Promedio 98,065
56 97,457
56 97,499
Promedio 97,478
72 95,734
72 95,840
Promedio 95,787
78 94,983
78 95,085
Promedio 95,034
96 94,740
96 94,699
Promedio 94,720
59
100 94,818
100 94,719
Promedio 94,769
60
Figura N 24. Curva de crecimiento de Clostridium sporogenes en medio Digerido Casena-Soja, observada en la prueba
Tiempo (Horas)
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,5
-1,0
-1,5
lo g A
-2,0
-2,5
y = 0,0136x - 2,7897
-3,0
-3,5
No se observ crecimiento de Clostridium sporogenes en medio Digerido Casena-Soja ya que no se evidencian

diferencias significativas entre los valores de tramitancia durante las 100 horas evaluadas.
61
Tabla N 15. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus aureus en
medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometra.
2 92,443
2 92,380
Promedio 92,412
4 90,638
4 89,473
Promedio 90,056
6 87,130
6 87,077
Promedio 87,104
8 81,850
8 81,974
Promedio 81,912
24 70,702
24 71,697
Promedio 71,200
28 65,708
28 65,663
Promedio 65,686
32 60,215
32 60,442
Promedio 60,329
48 51,022
48 53,612
Promedio 52,317
52 42,057
52 42,652
Promedio 42,355
56 39,414
56 40,194
Promedio 39,804
72 28,676
72 28,667
Promedio 28,672
78 21,478
78 21,498
Promedio 21,488
96 16,336
96 17,312
Promedio 16,824
62
100 12,255
100 12,238
Promedio 12,247
63
Figura N 25. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba
0,2 Tiempo (Horas)
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,2
-0,4
-0,6
Log A
-0,8
-1,0
-1,2 y = 0.0133x - 1.238
-1,4
-1,6
Coeficiente de correlacin R2= 0.983401

64
Tabla N 16. Datos de % tramitancia del crecimiento de Staphylococcus aureus en
medio Digerido Casena-Soja observados mediante espectrofotometra.
2 95,015
2 95,002
Promedio 95,009
4 92,537
4 93,573
Promedio 93,055
6 90,666
6 90,545
Promedio 90,606
8 88,498
8 88,576
Promedio 88,537
24 81,491
24 81,485
Promedio 81,488
28 77,521
28 76,424
Promedio 76,973
32 72,766
32 70,407
Promedio 71,587
48 64,442
48 63,400
Promedio 63,921
52 58,249
52 58,039
Promedio 58,144
56 46,727
56 46,169
Promedio 46,448
72 25,725
72 25,719
Promedio 25,722
78 16,457
78 16,499
Promedio 16,478
96 5,887
96 5,857
Promedio 5,872
65
100 2,923
100 2,897
Promedio 2,910
66
Figura N 26. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus en medio Digerido Casena-Soja, observada en la prueba
0,5 Tiempo (Horas)
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,5
Log A
-1,0
y = 0.0173x - 1.4996
-1,5
-2,0
67
Tabla N 17. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa
en medio Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometra.
2 90,093
2 90,052
Promedio 90,073
4 86,592
4 86,165
Promedio 86,379
6 84,804
6 84,931
Promedio 84,868
8 78,415
8 78,280
Promedio 78,348
24 62,947
24 62,838
Promedio 62,893
28 60,675
28 60,484
Promedio 60,580
32 51,168
32 52,736
Promedio 51,952
48 50,601
48 50,951
Promedio 50,776
52 40,176
52 39,396
Promedio 39,786
56 41,084
56 40,906
Promedio 40,995
72 11,517
72 11,547
Promedio 11,532
78 6,678
78 6,686
Promedio 6,682
96 3,430
96 3,363
Promedio 3,397
68
100 0,294
100 0,296
Promedio 0,295
69
Figura N 27. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio Fluido de Tioglicolato, observada en la
prueba de promocin de crecimiento.
0,6
Tiempo (Horas)
0,4
0,2
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,2
-0,4
Log A
-0,6
-0,8
-1,0
y = 0.0155x - 1.1933
-1,2
-1,4
-1,6
Fase de adaptacin durante las 8 primeras horas despus de la inoculacin.

Fase exponencial a partir de las 60 horas.
70
Tabla N 18. Datos de % tramitancia del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa
en medio Digerido Casena-Soja observados mediante espectrofotometra.
2 98,081
2 98,070
Promedio 98,076
4 96,982
4 96,896
Promedio 96,939
6 94,207
6 94,176
Promedio 94,192
8 89,919
8 89,046
Promedio 89,483
24 79,545
24 80,648
Promedio 80,097
28 80,763
28 80,624
Promedio 80,694
32 75,993
32 73,185
Promedio 74,589
48 53,269
48 52,434
Promedio 52,852
52 42,054
52 44,894
Promedio 43,474
56 48,317
56 47,754
Promedio 48,036
72 20,253
72 23,023
Promedio 21,638
78 13,307
78 13,231
Promedio 13,269
96 1,732
96 1,675
Promedio 1,704
71
100 1,877
100 1,797
Promedio 1,837
72
Figura. N 28. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa en medio Digerido Casena-Soja, observada en la
prueba de promocin de crecimiento.
1,0
Tiempo (Horas)
0,5
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,5
Log A
-1,0
-1,5 y = 0.0213x - 1.7083
-2,0
-2,5
73
Tabla N 19. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en medio
Fluido de Tioglicolato observados mediante espectrofotometra.
2 71,105
2 71,864
Promedio 71,485
4 65,071
4 67,557
Promedio 66,314
6 60,677
6 60,301
Promedio 60,489
8 51,784
8 52,156
Promedio 51,970
24 35,820
24 36,209
Promedio 36,015
28 31,648
28 32,052
Promedio 31,850
32 26,018
32 27,802
Promedio 26,910
48 15,871
48 15,782
Promedio 15,827
52 12,392
52 12,367
Promedio 12,380
56 10,635
56 10,663
Promedio 10,649
72 7,439
72 6,445
Promedio 6,942
78 6,681
78 6,174
Promedio 6,428
96 2,043
96 2,954
Promedio 2,499
74
100 0,659
100 0,664
Promedio 0,662
75
Figura N 29. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de
0,6 Tiempo (Horas)
0,4
0,2
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,2
Log A
-0,4
-0,6 y = 0.0103x - 0.6752
-0,8
-1,0
Fase exponencial a partir de las 24 horas
76
Tabla N 20. Datos de % tramitancia del crecimiento de Bacillus subtilis en medio
Digerido Casena-Soja observados mediante espectrofotometra.
2 96,826
2 97,185
Promedio 97,006
4 96,493
4 96,877
Promedio 96,685
6 95,000
6 95,276
Promedio 95,138
8 95,695
8 94,988
Promedio 95,342
24 94,199
24 96,324
Promedio 95,262
28 90,122
28 89,231
Promedio 89,677
32 91,534
32 94,418
Promedio 92,976
48 88,956
48 89,650
Promedio 89,303
52 71,600
52 72,552
Promedio 72,076
56 80,827
56 80,565
Promedio 80,696
72 56,888
72 56,481
Promedio 56,685
78 48,836
78 48,461
Promedio 48,649
96 23,053
96 24,130
Promedio 23,592
77
100 28,232
100 27,732
Promedio 27,982
78
Figura N 30. Curva de crecimiento de Bacillus subtilis en medio Digerido Casena-Soja, observada en la prueba de
Tiempo (Horas)
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
-1,0
Log A
-1,2
-1,4
y = 0.0175x - 1.9094
-1,6
-1,8
-2,0
79
Tabla N 21. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans en medio
2 91,473
2 91,478
Promedio 91,476
4 90,439
4 90,346
Promedio 90,393
6 87,901
6 88,050
Promedio 87,976
8 79,224
8 78,753
Promedio 78,989
24 62,556
24 62,482
Promedio 62,519
28 57,607
28 58,667
Promedio 58,137
32 49,059
32 49,360
Promedio 49,210
48 39,299
48 39,488
Promedio 39,394
52 34,070
52 31,671
Promedio 32,871
56 36,184
56 36,110
Promedio 36,147
72 20,938
72 20,931
Promedio 20,935
78 8,127
78 8,155
Promedio 8,141
96 3,216
96 3,232
Promedio 3,224
80
100 0,447
100 0,448
Promedio 0,448
81
Figura N 31. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de
0,6
Tiempo (Horas)
0,4
0,2
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,2
-0,4
Log A
-0,6
-0,8
-1,0
y = 0.0161x - 1.2312
-1,2
-1,4
-1,6

82
Tabla N 22. Datos de % tramitancia del crecimiento de Candida albicans en medio
2 90,447
2 90,493
Promedio 90,470
4 90,576
4 90,559
Promedio 90,568
6 90,072
6 90,151
Promedio 90,112
8 83,141
8 83,127
Promedio 83,134
24 76,325
24 76,333
Promedio 76,329
28 76,911
28 76,965
Promedio 76,938
32 65,474
32 62,229
Promedio 63,852
48 43,391
48 43,037
Promedio 43,214
52 52,901
52 52,629
Promedio 52,765
56 47,268
56 47,010
Promedio 47,139
72 12,263
72 12,237
Promedio 12,250
78 12,228
78 12,111
Promedio 12,170
96 2,859
96 2,823
Promedio 2,841
83
100 0,853
100 0,843
Promedio 0,848
84
Figura N 32. Curva de crecimiento de Candida albicans en medio Digerido Casena-Soja, observada en la prueba de
0,6 Tiempo (Horas)
0,4
0,2
0,0
-0,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,4
Log A
-0,6
-0,8
-1,0 y = 0.0169x - 1.3594
-1,2
-1,4
-1,6

85
Tabla N 23. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en medio
2 93,918
2 92,766
Promedio 93,342
4 90,380
4 90,425
Promedio 90,403
6 84,581
6 84,592
Promedio 84,587
8 77,329
8 77,265
Promedio 77,297
24 66,302
24 66,284
Promedio 66,293
28 57,064
28 57,171
Promedio 57,118
32 57,814
32 55,475
Promedio 56,645
48 55,346
48 53,579
Promedio 54,463
52 49,761
52 47,644
Promedio 48,703
56 34,886
56 34,647
Promedio 34,767
72 6,730
72 6,707
Promedio 6,719
78 2,417
78 2,403
Promedio 2,410
96 1,249
96 1,244
Promedio 1,247
86
100 0,448
100 0,444
Promedio 0,446
87
Figura N 33. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Fluido de Tioglicolato, observada en la prueba de
1,0
Tiempo (Horas)
0,5
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,5
Log A
-1,0
y = 0.0172x - 1.2764
-1,5
-2,0

88
Tabla N 24. Datos de % tramitancia del crecimiento de Aspergillus niger en medio
2 96,278
2 95,265
Promedio 95,772
4 94,722
4 94,728
Promedio 94,725
6 90,282
6 91,186
Promedio 90,734
8 88,492
8 88,503
Promedio 88,498
24 82,205
24 83,124
Promedio 82,665
28 85,370
28 85,427
Promedio 85,399
32 85,924
32 82,856
Promedio 84,390
48 70,321
48 70,228
Promedio 70,275
52 70,917
52 70,686
Promedio 70,802
56 65,514
56 64,777
Promedio 65,146
72 18,240
72 18,087
Promedio 18,164
78 14,531
78 14,506
Promedio 14,519
96 0,559
96 0,562
Promedio 0,561
89
100 0,973
100 0,966
Promedio 0,970
90
Figura N 34. Curva de crecimiento de Aspergillus niger en medio Digerido Casena-Soja, observada en la prueba de
0,5 Tiempo (Horas)
0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100
-0,5
Log A
-1,0
y = 0.0196x - 1.6558
-1,5
-2,0
91
6.3. Tcnica de filtracin por membrana utilizada en la prueba de esterilidad
6.3.1. Controles para el proceso

6.3.1.1. Control ambiental y de personal
Tabla N 25. Resultados del control ambiental durante la prueba de esterilidad.

Ambiente Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3 Montaje 4 Montaje 5 eSPECIFICACI
14-04-07 21-04-07 28-04-07 12-05-07 19-05-07 N
MEDIO DE Casoy H Casoy HC Casoy H Casoy HC Casoy H ufc/ PLACA
CULTIVO C C C (VIABLES
TOTALES)
Cabina con
equipo
MAS-100 0
UFC/m3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Cabina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
UFC/placa
Sobre 0 0 2 1 0 0 1 0 3 0 5
cabina H
UFC/placa
1L
Mesa 1 0 4 0 0 0 1 0 3 0 5
UFC/placa
Puerta 1 0 4 1 0 0 2 1 2 0 8
UFC/placa H H
H: Hongos; L: Levaduras
Los resultados obtenidos para el control microbiolgico de ambientes CUMPLEN
con las especificaciones establecidas en el Laboratorio AQM Ltda.
Tabla N 26. Resultados del control de personal durante la prueba de esterilidad.

Montaje 1 Montaje 2 Montaje 3 Montaje 4 Montaje 5 eSPECIFICACIN
14-04-07 21-04-07 28-04-07 12-05-07 19-05-07 ufc/GUANTE
MEDIO Casoy HC Casoy HC Casoy HC Casoy HC Casoy HC
DE
CULTIVO UFC/guante UFC/guante UFC/guante UFC/guante UFC/guante
Guantes 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3
inicial
Guantes 0 0 1 2L 0 1H 2 0 0 0 3
final
H: Hongos; L: Levaduras
92
Los resultados obtenidos para el control microbiolgico de personal CUMPLEN con
las especificaciones establecidas en el Laboratorio AQM Ltda.
6.3.1.2. Control negativo de la prueba
Tabla N 27. Resultados obtenidos para el control negativo de la tcnica de filtracin

de membrana durante los 5 montajes realizados.
membrana acetato de celulosa nitrato de celulosa
Medio de Fluido de Digerido Fluido de Digerido
Tioglicolato Casena-Soja Tioglicolato Casena-Soja
cultivo
CONTROL Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
NEGATIVO
Satisfactorio se refiere a la ausencia de crecimiento microbiano
6.3.2. Tcnica de filtracin por membrana
Tabla N 28. Resultados obtenidos en la tcnica de filtracin por membrana

durante el Montaje 1, abril 14 de 2007.
MEMBRANA Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa MORFOLOGIA
MEDIO Fluido de Digerido Fluido de Digerido

Microorganismo
Bacilos
Bacillus Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Gram
subtilis ATCC positivo
6633 s
Candida
Levaduras
albicans Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
ATCC 10231
Aspergillus Hifas
niger Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio hialinas,
conidios
ATCC 16404 globosos
Clostridium No No Bacilos
sporogenes Satisfactorio satisfactorio Satisfactorio satisfactorio Gram
ATCC 19404 positivo
s
Staphylococcus Cocos
aureus
93
ATCC 6538 Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Gram
positivo
s
Pseudomonas Bacilos
aeruginosa Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Gram
ATCC 9027 negativo
Satisfactorio se refiere a la presencia de crecimiento microbiano
Tabla N 29. Resultados obtenidos en la tcnica de filtracin por membrana durante

el Montaje 2, abril 21 de 2007.

Microorganismo
Bacilos
6633 s
Candida
Levaduras
ATCC 10231
Aspergillus Hifas
conidios
ATCC 16404 globosos
sporogenes Satisfactorio satisfactorio
Satisfactorio satisfactorio
Gram
1
ATCC 19404 positivo
s
aureus Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Gram
ATCC 6538 positivo
s
Pseudomonas Bacilos
ATCC 9027 negativo
1
Se sembr Clostridium sporogenes en medio slido despus de 14 das de
incubacin del medio lquido.
94
el Montaje 3, abril 28 de 2007.

Microorganismo
Bacilos
6633 s
Candida
Levaduras
ATCC 10231
Aspergillus Hifas
conidios
ATCC 16404 globosos
sporogenes Satisfactorio satisfactorio
Satisfactorio satisfactorio
Gram
ATCC 19404 positivo
s
ATCC 6538 positivo
s
Pseudomonas Bacilos
ATCC 9027 negativo

el Montaje 4, mayo 12 de 2007.

Microorganismo
Bacilos
95
6633 s
Candida
Levaduras
ATCC 10231
Aspergillus Hifas
conidios
ATCC 16404 globosos
sporogenes Satisfactorio satisfactorio Satisfactorio satisfactorio
Gram
ATCC 19404 positivo
s
ATCC 6538 positivo
s
Pseudomonas Bacilos
ATCC 9027 negativo

el Montaje 5, mayo 19 de 2007.

Microorganismo
Bacilos
6633 s
Candida
Levaduras
ATCC 10231
Aspergillus Hifas
conidios
ATCC 16404 globosos
sporogenes Satisfactorio satisfactorio Satisfactorio satisfactorio Gram
96
ATCC 19404 positivo
s
ATCC 6538 positivo
s
Pseudomonas Bacilos
ATCC 9027 negativo
6.3.3. Lquido filtrado

Los das de montaje 2 y 4 que corresponden a las fechas 21-04-07 y 12-05-07, no
se realiz la inoculacin del lquido filtrado en los medio de cultivo.
Tabla N 33. Resultados obtenidos despus del tiempo de incubacin del lquido
filtrado del montaje 1, abril 14 de 2007.
MEMBRANA Acetato de celulosa Nitrato de Celulosa
MEDIO Fludo de Digerido Fludo de Digerido

Microorganismo
Bacillus subtilis Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
ATCC 6633
Candida albicans Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
ATCC 10231
Aspergillus niger Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
ATCC 16404
Clostridium
sporogenes Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
ATCC 19404
Staphylococcus
aureus Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
97
ATCC 6538
Pseudomonas
aeruginosa Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio Satisfactorio
ATCC 9027
filtrado del montaje 3, abril 28 de 2007.

Microorganismo
ATCC 6633
ATCC 10231
ATCC 16404
Clostridium
ATCC 19404
Staphylococcus
ATCC 6538
Pseudomonas
ATCC 9027
98
filtrado del montaje 5, mayo 19 de 2007.

Microorganismo
ATCC 6633
ATCC 10231
ATCC 16404
Clostridium
ATCC 19404
Staphylococcus
ATCC 6538
Pseudomonas
ATCC 9027
7. DISCUSIN DE RESULTADOS
Los resultados y la informacin obtenida demostraron un monitoreo de las variables

crticas para un proceso bajo control, lo cual proporciona un alto grado de seguridad
99
a la validacin realizada donde se producirn constantemente las mismas
caractersticas obteniendo resultados confiables y reproducibles.
Los resultados demuestran que la tcnica de filtracin por membrana para evaluar
los filtros de acetato y nitrocelulosa evaluada es precisa, reproducible al tener en
cuenta que se realiz diferentes das y es repetible ya que se realiz por el mismo
analista y con el mismo equipo.
Se identificaron los factores que influyen en la validez de la prueba y los pasos a

seguir para el buen desarrollo de la validacin con la recopilacin de la informacin
que se realiz.
La calibracin y el mantenimiento de los equipos es un paso importante dentro de la
metodologa de validacin; los equipos utilizados durante las diferentes pruebas
realizadas se encontraban funcionando correctamente y dentro de los rangos
esperados, por lo tanto se debe contar con un cronograma de mantenimiento
preventivo vigente. (Ver Tabla N 8)
Los resultados de la prueba organolptica mostraron que los medios de cultivo

cumplen con las especificaciones de color, textura y aspecto segn las casas
comerciales y la USP 29, indicando su calidad para la obtencin de resultados en la
metodologa realizada. (Ver Tabla N 9)
La prueba de promocin de crecimiento demostr que los medios de cultivo Fluido

de Tioglicolato y Digerido Casena-Soja contienen los nutrientes necesarios para el
desarrollo y crecimiento de los microorganismos evaluados. (Ver tabla N 10)
El crecimiento de los microorganismos contaminantes en los medios de cultivo
lquidos en los 3 ensayos realizados se evalu en un tiempo de 2 y 5 das de
incubacin, en los medios de cultivo lquidos se observ turbidez en menor tiempo
de lo esperado, por lo cual se determin para cada microorganismo su curva de
crecimiento en ambos medios, los resultados se obtuvieron por medo del mtodo
espectrofotomtrico.
100
Despus de evaluar los medios de cultivo inoculados mediante espectrofotometra
se evidenci el crecimiento de los microorganismos contaminantes mediante
turbidez evidenciada por la disminucin del porcentaje de tramitancia durante el
tiempo evaluado.
Los microorganismos crecieron en ambos medios de cultivo debido a que estos no
contienen sustancias inhibitorias y poseen sustancias nutritivas que ayudan al
crecimiento de bacterias, hongos y levaduras.
El medio Fluido de Tioglicolato es utilizado principalmente para microorganismos

anaerobios, como Clostridium sporogenes, por su contenido de sustancias
reductoras y su alta viscosidad, tambin crecen microorganismos aerobios y
microaeroflicos al poseer componentes como dextrosa, peptona de casena y
extracto de levadura, los cuales proveen los factores de crecimiento necesarios para
la replicacin. (ZIMBRO y POWER, 2003) Por lo cual para el trabajo realizado los
resultados de tramitancia obtenidos reflejan una disminucin aproximada del 25%
30% a las 24 horas de inoculacin. Sin embargo, Clostridium sporogenes fue el
microorganismo que present mayor porcentaje de tramitancia en este tiempo (ver
Tabla N 13) es decir su crecimiento fue menor.
Esto se atribuye a que en cada tiempo evaluado al tomar la muestra se pudo
introducir oxgeno atmosfrico o aument el oxgeno por alguna agitacin del frasco
y ste es un microorganismo anaerobio que necesita total ausencia de oxgeno.
En el medio Digerido Casena-Soja se present crecimiento de bacterias aerobias,

hongos y levaduras, debido a que este medio de cultivo es altamente nutritivo por la
combinacin de peptonas de casena y soya y se encuentra exento de sustancias
inhibidoras lo cual soporta el crecimiento de gran variedad de microorganismos
exigentes y no exigentes. (ZIMBRO y POWER, 2003)
A las 24 horas de evaluacin de los microorganismos en el medio Digerido Casena-

Soja se obtuvo una disminucin entre el 13% y 18% de tramitancia comparado con
el medio Fluido de Tioglicolato para Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa,
Aspergillus niger y Staphylococcus aureus. (Ver Tablas N 16, 18, 22 y 24). Bacillus
subtilis present menor crecimiento a las 24 horas pero durante todo el tiempo
101
evaluado se observ mayor crecimiento y por lo tanto disminucin del porcentaje de
tramitancia. (Ver Tabla N 20)
Durante las 100 horas evaluadas se encontr que Clostridium sporogenes no creci
en el medio Digerido Casena-Soja debido a que este microorganismo es anaerobio
y el medio no posee las condiciones ni sustancias reductoras apropiadas para su
crecimiento. La falta de crecimiento se determin al obtener por espectrofotometra
valores altos de % de tramitancia y valores cercanos al valor de tramitancia del
tiempo inicial (ver Tabla N 14), esto demuestra que no se present turbidez en el
medio de cultivo, a diferencia de los otros microorganismos evaluados en el mismo
medio.
El tiempo requerido para el crecimiento evidenciado por turbidez puede ser

considerado como la suma de dos etapas, una fase donde los microorganismos se
preparan para crecer, y el tiempo de generacin requerido para un bajo nivel de
crecimiento donde stos son visibles a la visin humana, la concentracin de los
microorganismos es aproximadamente 107 UFC/mL. (MOLDENHAUER y SUTTON,
2004)
Los resultados mostraron que en las primeras horas despus de la inoculacin de
los microorganismos en los dos medios de cultivo los valores del porcentaje de
tramitancia disminuyeron en menor proporcin con relacin a las dems horas
evaluadas. Esto determina que los microorganismos tuvieron una fase de
adaptacin durante las primeras seis horas aproximadamente, donde los
microorganismos empezaron a tomar los nutrientes del medio para su posterior
replicacin. Para luego presentarse un crecimiento determinado por valores de %
tramitancia muy bajos y la presencia de turbidez.
La linealidad fue determinada mediante el software Validation Manager, evaluando

los datos de % de tramitancia obtenidos para cada microorganismo contaminante en
los medios de cultivo lquidos durante 100 horas evaluadas.
Para cada microorganismo inoculado en los medios de cultivo se determin la
regresin lineal y el coeficiente de correlacin, observndose que hay una relacin
directa entre las dos variables, en este caso a medida que aumenta el tiempo el
102
microorganismo produce biomasa presentandose turbidez lo que provoca la
disminucin del porcentaje de tramitancia del medio de cultivo.
A partir de cada regresin lineal calculada se obtuvo la ecuacin de la recta la cual
puede ser utilizada para estimar porcentajes de tramitancia en valores de tiempo no
evaluados, demostrndose as una relacin directamente proporcional entre las dos
variables estimadas.
El coeficiente de correlacin calculado para cada curva evaluada fue superior a 0.9
valor que para crecimiento y cuantificacin microbiano es ptimo, siendo los
menores valores 0,92 y 0,93 obtenidos para Bacillus subtilis en los medios Fluido de
tioglicolato y Digerido casena-soja respectivamente (ver figuras N 29 y 30). Estos
coeficientes demuestran resultados para la regresin lineal donde existe un alto
grado de asociacin y una relacin directa entre las dos variables (tiempo vs.
crecimiento microbiano), obteniendo as un modelo lineal.
Para verificar que el recuento de los microorganismos no fuera mayor a 100

UFC/mL se sembraron en los medios slidos agar Casoy y agar HC segn lo indica
la USP 29. Esto se evidenci en los tres das de ensayo para la prueba de
promocin de crecimiento en los resultados obtenidos para Candida albicans,
Aspergillus niger y Clostridium sporogenes los cuales tuvieron recuentos entre 20 y
100 UFC/mL, y para los recuentos de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa en el segundo y tercer ensayo. (Ver Tabla N 11)
Los resultados obtenidos en los recuentos de Staphylococcus aureus y

Pseudomonas aeruginosa se relacionan con la disminucin del porcentaje de
tramitancia durante el tiempo evaluado, especialmente durante las primeras 24
horas en el medio Fluido de Tioglicolato.
Por otro lado la prueba de esterilidad de los medios de cultivo se realiz a cada lote
de esterilizacin y se incubaron los medios durante 14 das, tiempo durante el cual
se evidenciaron resultados satisfactorios ya que no existi crecimiento de ningn
microorganismo contaminante en los medios de cultivo utilizados en la tcnica de
filtracin por membrana, estos medios de cultivo se dejaron como controles
negativos de la prueba de esterilidad.
103
Gracias a los resultados derivados de las pruebas preliminares se continu con los
ensayos de la tcnica de filtracin por membrana para la prueba de esterilidad, ya
que de haber observado resultados no satisfactorios la prueba sera no vlida. (USP
29, 2006)
Los resultados obtenidos a partir de los cinco das de montaje de la tcnica de

filtracin por membrana fueron satisfactorios ya que en los ensayos realizados con
los filtros de acetato y nitrato de celulosa evaluados se observ crecimiento de los
microorganismos inoculados en los diluyentes, los cuales fueron filtrados y la
membrana sembrada en los medios Fluido Tioglicolato y Digerido Casena Soja,
verificando de esta forma la retencin microbiana en los filtros por la presencia de
crecimiento microbiano en los medio de cultivo.
Los seis microorganismos utilizados en la prueba crecieron satisfactoriamente en los

medios lquidos (ver Tablas N 27, 28, 29, 30 y 31), es decir fueron retenidos en los
filtros de acetato y nitrato de celulosa y utilizaron los nutrientes de los medios de
cultivo para promover su crecimiento. En el montaje 2 correspondiente al 21 de abril
de 2007 se observ menor turbidez en los medios Fluido de Tioglicolato que
posean los filtros de membrana contaminados con Clostridium sporogenes. El
medio que contena la membrana de nitrato de celulosa se sembr en agar Casoy
despus de los 14 das de incubacin, en ste medio de cultivo slido se evidenci
crecimiento al cual se le realiz coloracin de Gram observando la presencia de
bacilos Gram positivos.
En todos los ensayos realizados por la tcnica filtracin por membrana los medios
Digerido Casena-Soja adicionados con los filtros de acetato y nitrato de celulosa
contaminados con Clostridium sporogenes no presentaron turbidez, esto se debe a
que ste medio de cultivo es adecuado para el crecimiento de hongos, levaduras y
bacterias aerobias (ZIMBRO y POWER, 2003), y no para bacterias anaerobias
como es el caso de Clostridium sporogenes.
Estos resultados se relacionan con la prueba de promocin de crecimiento apoyada
por espectrofotometra, donde el medio Digerido Casena-Soja inoculado con
104
Clostridium sporogenes no present disminucin del % de tramitancia, esto quiere
decir que el microorganismo no creci.
Al comparar los dos filtros de membrana acetato y nitrato de celulosa con un tamao
de poro de 0,45m se observ que stos retienen microorganismos contaminantes,
de esta forma se puede asegurar su uso en las pruebas de esterilidad con
resultados ptimos y confiables.
A partir de cada filtracin se adicion el fluido filtrado en los medios de cultivo

obteniendo resultados satisfactorios (ver Tablas N 32, 33 y 34) al no presentarse
turbidez durante los 14 das de incubacin. Esto demuestra que el diluyente
despus de ser filtrado no contiene microorganismos contaminantes debido a que
stos quedaron retenidos en los filtros de acetato y nitrato de celulosa empleados en
la prueba de esterilidad dejando as el lquido filtrado estril.
Para evitar falsos positivos y posibles repeticiones es importante tener en cuenta el

buen manejo del equipo de filtracin ya que al desarrollarse la prueba de esterilidad
en un sistema abierto existe mayor riesgo de contaminacin cruzada, por esto es
crucial el ajuste del equipo, la ubicacin del filtro de membrana dentro del embudo y
la mnima manipulacin, que pueden generar falsos positivos y posibles
repeticiones.
En el estudio realizado se evalu el control negativo de cada montaje de la tcnica

de filtracin por membrana donde solamente se filtr el diluyente estril y se
incubaron los medios de cultivo con los filtros de membrana. Estos resultados fueron
satisfactorios al no presentar turbidez en los medios, lo que demuestra que no se
presentaron falsos positivos que afecten la validez de la prueba.
Durante el tiempo empleado en cada ensayo de la tcnica de filtracin de
membrana se realiz el control ambiental y de personal, los resultados obtenidos
cumplen (ver Tablas N 25 y 26) segn los lmites microbianos manejados por AQM
Ltda. (Ver Tablas N 6 y 7) Estos resultados aseguran que las condiciones de
trabajo para la prueba de esterilidad fueron controladas, obteniendo resultados
satisfactorios durante todos los ensayos de la tcnica evaluada.
105
Al realizar las pruebas bajo condiciones ambientales controladas se reducen falsos
positivos por contaminacin microbiana cruzada y se garantiza la asepsia del rea
donde se realiza la prueba de esterilidad. El proceso de limpieza y desinfeccin del
rea de trabajo, en este caso del rea estril, fueron primordiales para obtener
buenos resultados durante la validacin y a futuro para el anlisis diario de la prueba
de esterilidad para la tcnica de filtracin por membrana.
Las pruebas realizadas mostraron resultados satisfactorios gracias al correcto

procedimiento empleado durante la validacin, el personal capacitado con las
habilidades para el manejo de equipos y materiales, y el uso de equipos calificados
y validados que funcionan de la forma esperada.
8. CONCLUSIONES
Se realiz la validacin de la retencin microbiana en los filtros de acetato y

nitrato de celulosa con un tamao de poro de 0,45m empleados en la
106
tcnica de filtracin por membrana para la prueba de esterilidad,
obtenindose resultados satisfactorios y reproducibles.
Se comprob que en los filtros de acetato y nitrato de celulosa con un

tamao de poro de 0,45m utilizados en la tcnica de filtracin por
membrana retienen y recuperan satisfactoriamente los microorganismos
contaminantes, esto se observa por la turbidez presentada en los medios de
cultivo lquidos, los resultados se confirmaron por coloracin de Gram.
La retencin y recuperacin de los microorganismos en los filtros de acetato

y nitrato de celulosa se determin con el lquido filtrado que se inocul en los
medios de cultivo; los resultados obtenidos no presentaron turbidez es decir
no hubo crecimiento microbiano.
Se confirmaron las condiciones de montaje de la tcnica de filtracin por

membrana siguiendo los parmetros de la USP 29 mediante la obtencin de
resultados que optimizan la tcnica reduciendo repeticiones y minimizando
riesgos en las pruebas.
Se verific mediante la prueba de promocin de crecimiento que los medios

de cultivo Fluido de Tioglicolato y Digerido de Casena-Soja utilizados en la
prueba de esterilidad poseen los nutrientes necesarios para favorecer el
crecimiento de microorganismos contaminantes.
El crecimiento de los microorganismos utilizados en la prueba de promocin

de crecimiento se verific mediante espectrofotometra observndose
disminucin del % de tramitancia que indica el crecimiento de los
microorganismos en los medios de cultivo, este crecimiento fue determinado
en menos de 24 horas.
El crecimiento de los microorganismos presenta un modelo lineal

demostrando as una relacin directamente proporcional entre las variables,
tiempo y crecimiento microbiano.
107
De acuerdo a los resultados obtenidos se actualiz el procedimiento
operativo estndar POSM0017 P002 PROCEDIMIENTO PARA LA
REALIZACIN DE PRUEBAS DE ESTERILIDAD para la ejecucin de la
tcnica de filtracin por membrana empleada en el anlisis de esterilidad en
el laboratorio de Anlisis Microbiolgico y Qumico AQM Ltda.
La capacitacin oportuna de los analistas minimiza posibles errores, los

riesgos de contaminacin y asegura resultados confiables durante la
validacin y el transcurso habitual de las pruebas realizadas en el
laboratorio.
El funcionamiento y el mantenimiento preventivo de los equipos garantizan

que los procedimientos realizados y los resultados obtenidos son confiables
para el estudio realizado.
La calidad de los medios de cultivo trabajados presentaron una caracterstica

importante para la recuperacin de los microorganismos y la interpretacin
de resultados confiables, evitando falsos positivos.
108
9. RECOMENDACIONES
Es importante el buen manejo del equipo de filtracin durante el anlisis de

productos estriles, mediante la tcnica de filtracin por membrana en un
sistema abierto, por lo que se recomienda tener en cuenta el ajuste del
equipo y los embudos, la ubicacin del filtro de membrana dentro del
embudo y la mnima manipulacin del equipo para evitar cualquier
contaminacin cruzada.
Teniendo en cuenta los tiempos de crecimiento y recuperacin de los

microorganismos se sugiere un monitoreo visual frecuente de los medios de
cultivo, Fluido de Tioglicolato y Digerido de Casena-Soja, para una rpida
deteccin de microorganismos contaminantes en productos evaluados.
Al monitorear el medio de cultivo Fluido de Tioglicolato se debe evitar la

agitacin para mantener las condiciones de anaerobiosis y as poder
recuperar microorganismos anaerobios contaminantes como Clostridium
sporogenes.
La actualizacin y revisin peridica de acuerdo a la normatividad es

importante para el xito de la pruebas y para obtener resultados ptimos y
confiables.
Es fundamental el empleo de los microorganismos establecidos por la USP

para la evaluacin de controles positivos y as verificar la efectividad de la
tcnica de filtracin.
109
10. BIBLIOGRAFA
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113
11. ANEXOS
SOPORTE ESTADSTICO DE LAS CURVAS DE CRECIMIENTO OBTENIDAS EN

LA PRUEBA DE PROMOCIN DE CRECIMIENTO REALIZADO POR EL
SOFTWARE VALIDATION MANAGER
Anexo 1. Clostridium sporogenes en el medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados
El modelo usado es: Y = a + bX

El test de linealidad del mtodo di los siguientes resultados:
Nmero de valores 33
Nmero de repeticiones 3
Curva crecimiento
# Tiempo %T Residuales
1 2 94.159 3.276
2 2 94.714 3.831
3 2 94.437 3.554
4 4 90.196 1.168
5 4 90.024 0.996
6 4 90.110 1.082
7 6 89.603 2.430
8 6 88.497 1.324
9 6 89.050 1.877
114
Curva crecimiento
10 8 82.024 -3.294
11 8 82.024 -3.294
12 8 82.024 -3.294
13 28 69.471 2.703
14 28 67.429 0.661
15 28 68.450 1.682
16 32 59.556 -3.502
17 32 59.821 -3.237
18 32 59.689 -3.369
19 48 50.619 2.401
20 48 49.867 1.649
21 48 50.243 2.025
22 52 45.736 1.228
23 52 41.830 -2.678
24 52 43.783 -0.725
25 56 34.202 -6.596
26 56 34.148 -6.650
27 56 34.175 -6.623
28 96 4.552 0.855
29 96 4.496 0.799
30 96 4.524 0.827
31 100 2.955 2.968
32 100 2.947 2.960
33 100 2.951 2.964
115
1.1 Curva de calibracin
Nivel de confianza para la curva de calibracin: 97.50
1.2. Cuadro de residuales
Nivel de confianza para los residuales: 97.50
116
1.3. Anlisis de la varianza de la linealidad
Nivel de confianza 97.5
t- Student 2.021
Intercepto Y 9.27380e+001
- Varianza 7.24286e-001
- Intervalo de confianza 1.71997e+000
Pendiente -9.27505e-001
- Varianza 2.72028e-004
- Intervalo de confianza 3.33329e-002
Coeficiente de correlacin r 0.995134
Coeficiente de determinacin r 0.990293
Varianza de la regresin SI 3.18011e+004
Varianza residual SR 1.00559e+001
Suma residual de cuadrados 3.11734e+002
Varianza del error experimental SE 4.91575e-001
Varianza del error de la regresin SL 3.34355e+001
1.4. Test para la existencia de una pendiente significativa (F1)

Grados de libertad (1,2) 1 , 31
F tabulado 4.080
F calculado 3162.419
El test F de Fisher es satisfactorio.
1.5. Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0

Nivel de confianza (1-alpha/2) 97.50
Grados de libertad 31
t tabulado 2.021
t calculado 108.969
El intercepto-Y es diferente de cero.
117
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Anlisis de la varianza de la linealidad
InterceptoY : 9.27380e+001
Pendiente : -9.27505e-001
Coeficiente de determinacin r : 0.990293
Anexo 2. Clostridium sporogenes en el medio Digerido Casena-soja.
1. Resultados

Nmero de datos 30
Curva crecimiento
1 2 99.786 -0.155
2 2 99.935 -0.006
3 2 99.861 -0.080
4 4 99.622 -0.208
5 4 99.605 -0.225
6 4 99.613 -0.217
7 6 99.682 -0.036
118
Curva crecimiento
8 6 99.668 -0.050
9 6 99.675 -0.043
10 24 99.363 0.650
11 24 99.405 0.692
12 24 99.384 0.671
13 28 98.212 -0.278
14 28 98.184 -0.306
15 28 98.198 -0.292
16 56 97.457 0.530
17 56 97.499 0.572
18 56 97.478 0.551
19 72 95.734 -0.300
20 72 95.840 -0.194
21 72 95.787 -0.247
22 78 94.983 -0.716
23 78 95.085 -0.614
24 78 95.034 -0.665
25 96 94.740 0.046
26 96 94.699 0.005
27 96 94.720 0.026
28 100 94.818 0.347
29 100 94.719 0.248
30 100 94.769 0.298
119
1.1. Curva de calibracin
120
t- Student 2.048
- Varianza 1.40563e-002
- Varianza 4.01194e-006
Varianza residual SR 1.60322e-001
Varianza del error de la regresin SL 5.57370e-001

F tabulado 5.610
F calculado 776.620

t tabulado 2.048
t calculado 843.909
121
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Intercepto Y : 1.00053e+002
Pendiente: -5.58190e-002
Anexo 3. Staphylococcus aureus en medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados

Nmero de datos 42
Linealidad
# Tiempo (horas) %T Residuales
1 2 92.443 3.967
2 2 92.380 3.904
3 2 92.412 3.936
4 4 90.638 3.810
5 4 89.473 2.645
6 4 90.056 3.228
7 6 87.130 1.950
122
Linealidad
8 6 87.077 1.897
9 6 87.104 1.924
10 8 81.850 -1.682
11 8 81.974 -1.558
12 8 81.972 -1.560
13 24 70.702 0.353
14 24 71.697 1.348
15 24 71.200 0.851
16 28 65.708 -1.345
17 28 65.663 -1.390
18 28 65.686 -1.367
19 32 60.215 -3.543
20 32 60.442 -3.316
21 32 60.329 -3.429
22 48 51.022 0.448
23 48 53.612 3.038
24 48 52.317 1.743
25 52 42.057 -5.222
26 52 42.652 -4.627
27 52 42.355 -4.924
28 56 39.414 -4.569
29 56 40.194 -3.789
30 56 39.804 -4.179
31 72 28.676 -2.124
32 72 28.667 -2.133
33 72 28.672 -2.128
34 78 21.478 -4.378
35 78 21.498 -4.358
36 78 21.488 -4.368
123
Linealidad
37 96 16.336 5.311
38 96 17.312 6.287
39 96 16.824 5.799
40 100 12.255 4.526
41 100 12.238 4.509
42 100 12.247 4.518
124

t-Student 2.021
- Varianza 8.41670e-001
- Varianza 2.86477e-004
125
Varianza de error experimental SE 1.97351e-001
1.4. Test para la existencia de una pendiente significatica (F1)

F tabulado 4.080

t tabulado 2.021
t calculado 98.236
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
126
Anexo 4. Staphylococcus aureus en medio Digerido Casena-soja.
1. Resultados

El test de linealidad di los siguientes resultados:
Nmero de datos 39
Linealidad
# Tiempo (horas) %Tramitancia Residuales
1 2 95.015 -1.085
2 2 95.002 -1.098
3 2 95.009 -1.091
4 4 92.537 -1.653
5 4 93.573 -0.617
6 4 93.055 -1.135
7 6 90.666 -1.615
8 6 90.545 -1.736
9 6 90.606 -1.675
10 8 88.498 -1.873
11 8 88.576 -1.795
12 8 88.537 -1.834
13 12 81.495 -5.057
14 12 81.485 -5.067
15 12 81.488 -5.064
16 28 77.521 6.245
17 28 76.424 5.148
18 28 76.973 5.697
127
Linealidad
# Tiempo (horas) %Tramitancia Residuales
19 32 72.766 5.309
20 32 70.407 2.950
21 32 71.587 4.130
22 52 58.249 9.887
23 52 58.039 9.677
24 52 58.144 9.782
25 56 46.727 2.184
26 56 46.169 1.626
27 56 46.448 1.905
28 72 25.725 -3.542
29 72 25.719 -3.548
30 72 25.722 -3.545
31 78 16.457 -7.082
32 78 16.499 -7.040
33 78 16.478 -7.061
34 96 5.887 -0.467
35 96 5.857 -0.497
36 96 5.872 -0.482
37 100 2.923 0.388
38 100 2.897 0.362
39 100 2.910 0.375
128
129
T Student 2.021
- Varianza 1.27636e+000
- Varianza 4.32147e-004

F tabulado 4.080

t tabulado 2.021
t calculado 86.752
130
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Pendiente: -9.54747e-001
Anexo 5. Pseudomonas aeruginosa en medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados

Nmero de datos 36
Curva de crecimiento
1 2 90.093 3.103
2 2 90.052 3.062
3 2 90.073 3.083
4 4 86.592 1.477
5 4 86.165 1.050
6 4 86.379 1.264
7 6 84.804 1.565
8 6 84.931 1.692
9 6 84.868 1.629
131
Curva de crecimiento
10 8 78.415 -2.948
11 8 78.280 -3.083
12 8 78.348 -3.015
13 24 62.947 -3.410
14 24 62.838 -3.519
15 24 62.893 -3.464
16 28 60.675 -1.930
17 28 60.484 -2.121
18 28 60.580 -2.025
19 48 50.601 6.754
20 48 50.951 7.104
21 48 50.776 6.929
22 56 41.084 4.740
23 56 40.906 4.562
24 56 40.995 4.651
25 72 11.517 -9.821
26 72 11.547 -9.791
27 72 11.532 -9.806
28 78 6.678 -9.033
29 78 6.686 -9.025
30 78 6.682 -9.029
31 96 3.430 4.601
32 96 3.363 4.534
33 96 3.397 4.568
34 100 0.294 5.217
35 100 0.296 5.219
36 100 0.295 5.218
132
133
T Student 2.021
- Varianza 2.08604e+000
- Varianza 6.69247e-004

F tabulado 4.080

t tabulado 2.021
t calculado 61.528
134
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Anexo 6. Pseudomonas aeruginosa en medio Digerido Casena-soja.
1. Resultados

Nmero de datos 42
Linealidad
1 2 98.081 -2.152
2 2 98.070 -2.163
3 2 98.076 -2.157
4 4 96.982 -1.153
5 4 96.896 -1.239
6 4 96.939 -1.196
7 6 94.207 -1.830
135
Linealidad
8 6 94.176 -1.861
9 6 94.192 -1.845
10 8 89.919 -4.020
11 8 89.046 -4.893
12 8 89.483 -4.456
13 24 79.575 2.422
14 24 80.648 3.495
15 24 80.097 2.944
16 28 80.763 7.806
17 28 80.624 7.667
18 28 80.694 7.737
19 32 75.993 7.233
20 32 73.185 4.425
21 32 74.589 5.829
22 48 53.269 1.294
23 48 52.434 0.459
24 48 52.852 0.877
25 52 42.054 -5.724
26 52 44.894 -2.884
27 52 43.474 -4.304
28 56 48.317 4.735
29 56 47.754 4.172
30 56 48.036 4.454
31 72 20.253 -6.544
32 72 23.023 -3.774
33 72 21.638 -5.159
34 78 13.307 -7.195
35 78 13.231 -7.271
36 78 13.269 -7.233
136
Linealidad
37 96 1.732 0.114
38 96 1.675 0.057
39 96 1.704 0.086
40 100 1.877 4.455
41 100 1.797 4.375
42 100 1.837 4.415
137

t Student 2.021
InterceptoY 1.02331e+002
- Varianza 1.35009e+000
Pendiente -1.04909e+000
- Varianza 4.59527e-004
138

F tabulado 4.080

t tabulado 2.021
t calculado 88.070
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Intercepto Y: 1.02331e+002
Pendiente : -1.04909e+000
139
Anexo 7. Bacillus subtilis en medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados

Nmero de datos 27
Curva crecimiento
1 6 60.677 11.020
2 6 60.301 10.644
3 6 60.489 10.832
4 8 51.784 3.276
5 8 52.156 3.648
6 8 51.970 3.462
7 24 35.820 -3.497
8 24 36.209 -3.108
9 24 36.015 -3.302
10 28 31.648 -5.371
11 28 32.052 -4.967
12 28 31.850 -5.169
13 32 26.018 -8.703
14 32 27.802 -6.919
15 32 26.910 -7.811
16 72 7.439 -4.304
17 72 6.445 -5.298
18 72 6.942 -4.801
19 76 6.681 -2.764
20 76 6.445 -3.000
140
Curva crecimiento
21 76 6.942 -2.503
22 96 2.043 4.087
23 96 2.954 4.998
24 96 2.499 4.543
25 100 0.659 5.001
26 100 0.664 5.006
27 100 0.662 5.004
Nivel de confianza para la curva: 97.50
141

t Student 2.06
- Varianza 4.04528e+000
- Varianza 1.11474e-003
142

F tabulado 4.240
F calculado 296.029

t tabulado 2.060
t calculado 26.403
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Anlisis de la vaianza de la linealidad
InterceptoY: 5.31037e+001
143
Anexo 8. Bacillus subtilis en medio Digerido Casena-soja.
1. Resultados

Nmero de datos 30
1 2 96.826 -5.816
2 2 97.185 -5.457
3 2 97.006 -5.636
4 4 96.493 -4.590
5 4 96.877 -4.206
6 4 96.685 -4.398
7 6 95.000 -4.524
8 6 95.276 -4.248
9 6 95.138 -4.386
10 8 95.695 -2.270
11 8 94.988 -2.977
12 8 95.342 -2.623
13 24 94.199 8.707
14 24 96.324 10.832
15 24 95.262 9.770
16 32 91.534 12.279
17 32 94.418 15.163
18 32 92.976 13.721
19 72 56.888 8.816
20 72 56.481 8.409
144
21 72 56.685 8.613
22 76 34.111 -10.842
23 76 33.676 -11.277
24 76 33.894 -11.059
25 96 23.053 -6.309
26 96 24.130 -5.232
27 96 23.592 -5.770
28 100 28.323 2.080
29 100 27.732 1.489
30 100 27.982 1.739
145

t Student 2.048
- Varianza 4.76619e+000
- Varianza 1.49429e-003
146

F tabulado 4.200
F calculado 406.714

t tabulado 2.048
t calculado 47.730
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
147
Anexo 9. Candida albicans en medio Fluido de Tioglicolato.
1. Resultados

El test de la linealidad del mtodo do los siguientes resultados:
Nmero de datos 36
Curva Crecimiento
1 2 91.473 4.220
2 2 91.478 4.225
3 2 91.476 4.223
4 4 90.439 5.082
5 4 90.346 4.989
6 4 90.393 5.036
7 6 87.901 4.439
8 6 88.050 4.588
9 6 87.976 4.514
10 8 79.224 -2.342
11 8 78.753 -2.813
12 8 78.989 -2.577
13 24 62.556 -3.846
14 24 62.482 -3.920
15 24 62.519 -3.883
16 28 57.607 -5.004
148
Curva Crecimiento
17 28 58.667 -3.944
18 28 58.137 -4.474
19 52 34.070 -5.794
20 52 31.671 -8.193
21 52 32.871 -6.993
22 56 36.184 0.111
23 56 36.110 0.037
24 56 36.147 0.074
25 72 20.938 0.029
26 72 20.931 0.022
27 72 20.935 0.026
28 78 8.127 -7.096
29 78 8.155 -7.068
30 78 8.141 -7.082
31 96 3.216 5.053
32 96 3.232 5.069
33 96 3.224 5.061
34 100 0.447 6.075
35 100 0.448 6.076
36 100 0.448 6.076
149
150
t Student 2.021
- Varianza 1.68437e+000
- Varianza 5.34665e-004

F tabulado 4.080
The Fisher F test is satisfactory.

t tabulado 2.021
t calculado 68.690
151
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Intercepto Y: 8.91481e+001
Anexo 10. Candida albicans en medio Digerido Casena-soja
1. Resultados

Nmero de datos 33
Curva Crecimiento
1 2 90.447 -3.845
2 2 90.493 -3.799
3 2 90.470 -3.822
4 4 90.576 -1.799
5 4 90.559 -1.816
6 4 90.568 -1.807
7 6 90.072 -0.387
152
Curva Crecimiento
8 6 90.151 -0.308
9 6 90.112 -0.347
10 8 83.141 -5.402
11 8 83.127 -5.416
12 8 83.134 -5.409
13 24 76.325 3.111
14 24 76.333 3.119
15 24 76.329 3.115
16 28 76.911 7.530
17 28 76.965 7.584
18 28 76.938 7.557
19 52 52.901 6.514
20 52 52.629 6.242
21 52 52.765 6.378
22 56 47.268 4.713
23 56 47.010 4.455
24 56 47.139 4.584
25 78 12.228 -9.249
26 78 12.111 -9.366
27 78 12.170 -9.307
28 96 2.859 -1.372
29 96 2.823 -1.408
30 96 2.841 -1.390
31 100 0.853 0.454
32 100 0.843 0.444
33 100 0.848 0.449
153
154
t Student 2.021
- Varianza 1.82289e+000
- Varianza 6.14709e-004

F tabulado 4.080

t tabulado 2.021
t calculado 71.257
155
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Anexo 11. Aspergillus niger en medio Fluido de Tioglicolato.
1.1 Resultados

Nmero de datos 36
Curva Crecimiento
1 2 93.918 5.891
2 2 92.766 4.739
3 2 93.342 5.315
4 4 90.380 4.163
5 4 90.425 4.208
6 4 90.403 4.186
7 6 84.581 0.175
8 6 84.592 0.186
9 6 84.587 0.181
10 8 77.329 -5.267
156
Curva Crecimiento
11 8 77.265 -5.331
12 8 77.297 -5.299
13 24 66.302 -1.812
14 24 66.284 -1.830
15 24 66.293 -1.821
16 28 57.064 -7.430
17 28 57.171 -7.323
18 28 57.118 -7.376
19 32 57.814 -3.059
20 32 55.475 -5.398
21 32 56.645 -4.228
22 48 55.346 8.955
23 48 53.579 7.188
24 48 54.463 8.072
25 52 49.761 6.990
26 52 47.644 4.873
27 52 48.703 5.932
28 56 34.886 -4.264
29 56 34.647 -4.503
30 56 34.767 -4.383
31 96 1.249 -1.696
32 96 1.244 -1.701
33 96 1.247 -1.698
34 100 0.448 1.123
35 100 0.444 1.119
36 100 0.446 1.121
157
158
t Student 2.021
- Varianza 1.60917e+000
- Varianza 6.46600e-004

F tabulado 4.080
1.5 Compatibilidad del intercepto-Y con el valor 0

t tabulado 2.021
t calculado 70.820
159
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Anexo 12. Aspergillus niger en medio Digerido Casena-soja
1. Resultados

Nmero de datos 33
Curva Crecimiento
1 2 96.278 -7.052
2 2 95.265 -8.065
3 2 95.772 -7.558
4 4 94.722 -6.478
5 4 94.728 -6.472
6 4 94.725 -6.475
7 6 90.282 -8.788
8 6 91.186 -7.884
9 6 90.734 -8.336
160
Curva Crecimiento
10 24 82.205 2.307
11 24 83.124 3.226
12 24 82.665 2.767
13 28 85.370 9.732
14 28 85.427 9.789
15 28 85.399 9.761
16 32 85.924 14.546
17 32 82.856 11.478
18 32 84.390 13.012
19 48 70.321 15.985
20 48 70.228 15.892
21 48 70.275 15.939
22 72 18.240 -10.534
23 72 18.087 -10.687
24 72 18.164 -10.610
25 78 14.531 -7.852
26 78 14.506 -7.877
27 78 14.519 -7.864
28 96 0.559 -2.653
29 96 0.562 -2.650
30 96 0.561 -2.651
31 100 0.973 2.021
32 100 0.966 2.014
33 100 0.970 2.018
161
Nivel de confianza de la curva de calibracin: 97.50
Nivel de confianza de los residuales: 97.50
162

t Student 2.021
- Varianza 6.80245e+000
Pendiente -1.06509e+000
- Varianza 2.12408e-003

F tabulado 4.080
F calculado 534.075

t tabulado 2.021
t calculado 40.435
El intecepto-Y es diferente de cero.
163
2. Conclusiones
Linealidad
RESUMEN
Pendiente : -1.06509e+000
164

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VALIDACIN DE LA RETENCIN MICROBIANA EN LOS FILTROS DE

ACETATO Y NITRATO DE CELULOSA EMPLEADOS DE LA TCNICA DE

NORMA ISABEL GALEANO ROJAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

NORMA ISABEL GALEANO ROJAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

NORMA ISABEL GALEANO ROJAS

NORMA ISABEL GALEANO ROJAS

A Viviana Pea, directora del trabajo por su tiempo, colaboracin, apoyo y

A Cindy Fernndez por su compromiso, responsabilidad, y aportes realizados para

A AQM Ltda., especialmente al rea de microbiologa por su colaboracin y apoyo.

2.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD 16

11. ANEXOS 101

La validacin de la retencin microbiana en los filtros de acetato y nitrato de celulosa

Al inicio de la validacin se verific la calibracin y mantenimiento de los equipos

Con los resultados obtenidos se ajust el procedimiento de la prueba de esterilidad

El control de calidad de productos farmacuticos garantiza la seguridad y eficacia de

Este control de calidad se debe realizar desde el inicio, durante y al final de la

Dada la necesidad de optimizar la tcnica para desarrollar la prueba de esterilidad,

Validacin es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia

La validacin de un mtodo analtico es el proceso que establece, mediante

Igualmente establece las caractersticas de desempeo y las limitaciones de un

Dentro de un proceso de validacin se deben validar:

La importancia de la validacin radica en la obtencin de mtodos estndar los

Para realizar validaciones en microbiologa es importante:

De esta forma despus de la validacin se demuestra que el laboratorio es capaz de

2.1.1. Protocolo de validacin

Los protocolos de validacin incluyen la definicin clara del sistema a validar, la

Dentro de un protocolo de validacin tambin se encuentra el procedimiento

2.1.2. TIPOS DE VALIDACIN

2.1.2.1. Validacin prospectiva

Se basa en la informacin obtenida antes de implantar el proceso de validacin.

2.1.2.2. Validacin concurrente

La informacin se obtiene durante la implementacin del proceso, se debe tener en

2.1.2.3. Validacin retrospectiva

Es aquella donde se trabaja con los antecedentes histricos, obtenidos a partir de

Este tipo de estudio se utiliza cuando se ha introducido alguna variable en algn

2.1.3. PARAMETROS A EVALUAR PARA LA VALIDACION DE METODOLOGIAS

No todas las caractersticas analticas son aplicables a todos los procedimientos o a

2.1.3.5. Lmite de deteccin

2.1.3.6. Lmite de cuantificacin

Consiste en la realizacin de pruebas que determine si un componente de un

2.1.4.1. Tipos de calificacin

2.1.4.1.1. Calificacin de las instalaciones - IQ

2.1.4.1.2. Calificacin de desempeo - PQ

2.1.4.1.3. Calificacin operacional - OQ

Los filtros de membrana son un avance consecuente de los desarrollados por el

Existen distintos tipos de filtros: de asbesto-celulosa, de vidrio, de cermica y de

Los filtros de membrana son utilizados para el control microbiolgico de diversos

Para realizar la prueba de esterilidad es necesario usar filtros de membrana con un

2.2.1. Tipos de filtros de membrana

2.2.1.1. Filtros de profundidad

2.2.1.2. Filtros de superficie o de membrana

Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y

Figura N 2. Filtro de superficie o de membrana

La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricacin de

Figura N 3. Filtros de nitrato de celulosa

2.2.1.2. Membrana de acetato de celulosa

Los filtros de membrana de celulosa son de naturaleza hidroflica. Presentan una

Es un material muy fiable como filtro membrana por su excelente estabilidad

El fundamento de la prueba de esterilidad consiste en establecer un procedimiento