Articulo producto de la investigacin

Mtodo de superficie de respuesta para optimizar

las condiciones de produccin de cido lctico
a partir de subproductos lcteos: SLC

Alexandra Plata1, Sandra Ramrez2, Campo Elas Riao Luna 3

1, 2.
Escuela de Ciencias Bsicas Tecnologa e Ingeniera, Universidad Nacional
Abierta y a Distancia. Bogot, Colombia.
3
Docente asistente de la Escuela de Ciencias Bsicas Tecnologa e Ingeniera,
Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Bogot, D.C. Colombia.

Recibido: 09/08/2012 Aceptado: 14/09/2012

Correspondencia: campo.riano@unad.edu.co

Resumen
Mediante un diseo experimental 2kcombinado con un diseo compuesto central y un anlisis de su-
perficie de respuesta se optimizo la produccin de cido lctico (AL) a partir de suero de leche de capri-
no (SLC) como sustrato principal y se determin la combinacin de los efectos de la concentracin de
tres nutrimentos: riboflavina, extracto de levadura y sulfato de amonio. Segn el experimento realizado
(confiabilidad; 95%) existe evidencia que tanto la temperatura y la concentracin del complemento
como la interaccin de ambos inciden en la produccin de cido lctico (AL), que se obtiene al fermen-
tar suero de leche de caprino. Las mayores producciones de cido lctico-23,68 g/litro y crecimiento
bacteriano se obtuvieron con mayores concentraciones de los nutrimentos a una temperatura de 42C.

Palabras clave:cido lctico, diseo experimental compuesto central, Lactobacillus helveticus

LH 0-091, optimizacin, suero de leche de caprino, superficies de respuesta.

Response surface method for the optimization of lactic acid production

conditions from dairy sub products: SLC

Abstract
In the study the production of lactic acid from whey goats as main substrate (SLC) was optimized, fo-
llowing 2k experimental design combined with a central composite design and response surface analy-
sis. It was also determined the combined effects of the concentration of three nutrient level (Ribo-
flavin, yeast extract, ammonium sulfate): X1 and temperature (0C): X2 in lactic acid concentration.
According with the results there is enough statistical evidence (95% confidence) that showed that the
temperature and the concentration of complement and their interaction influence the production of
lactic acid obtained by fermenting goat whey. The greatest lactic acid production (23, 68 g / liter) and
bacterial growth were gotten with higher concentrations of nutrients and temperature of 42 C.
Keywords: Central composite experimental design, goat whey, lactic acid, Lactobacillus helveti-
cus LH 0-091, optimization, response surface.
Nova - Publicacin Cientfica en Ciencias Biomdicas - Issn: 1794-2470 - Vol. 10 No. 18 Julio - Diciembre de 2012: 135 - 250
Introduccin
La preocupacin pblica por el control de la polu-
cin ambiental con efluentes lcteos ha estimulado
la bsqueda de soluciones de aprovechamiento de
los subproductos de la industria lctea, antes de ser
desechados (1). Los procesos de bioconversin por
fermentacin han sido propuestos como alternati-
vas viables para el aprovechamiento de este dese-
cho como sustrato para el crecimiento de microor-
ganismos capaces de producir sustancias como el
cido lctico, ampliamente usado en la industria
alimenticia, textil, farmacutica y cosmtica (2).
La fermentacin lctica es el proceso celular don-
de se utiliza glucosa para obtener energa y donde
el producto de desecho es el cido lctico (AL) (3).
El AL es de amplio uso en la industria, debido a
sus caractersticas benficas, se utiliza en la indus-
tria alimentaria; en bebidas y como conservante,
en farmacia, medicina, textileria, en la industria
del cuero y para la produccin de plsticos bio
degradables (3). El AL es producido por sntesis
qumica o por fermentacin microbiana de dife-
rentes carbohidratos (4,5).
En la actualidad se prefiere la va fermentativa,
debido a la necesidad de obtener cido lctico p-
ticamente puro (6,7). Su produccin fermentati-
va tiene las ventajas de utilizar fuentes renovables
como sustrato y producir cido L- D-lctico p-
ticamente puro, dependiendo de la cepa seleccio-
nada (8).
La produccin de cido lctico por va fermentati-
va es limitada por el crecimiento del microrganis-
mo y el cido mismo (9). El sustrato y los costos
operacionales representan el 68% y 80% respecti-
vamente de los costos totales de produccin bio-
tecnologica del AL (10), cobrando importancia la
bsqueda de materias primas baratas y la optimi-
zacin del proceso para la obtencin de AL (11).
La utilizacin de lactosuero de leche de caprino
(SLC) - (DBO) de 40000 a 60000 ppm y (DQO)
de 50000 a 80000 ppm se ha propuesto en esta in-
vestigacin como fuente de carbono y de nitrgeno
158
para la obtencin de cido lctico por fermenta-
cin (12). Alternativa interesante a estudiar para
determinar el costo de produccin de este produc-
to qumico y, a la vez, dar valor agregado a un
desecho industrial-LSLC, que contiene un alto
contenido de carbohidratos fermentables (13,14).
Los mayores productores de cido lctico son los
organismos pertenecientes a las familias Strep-
tococcaceae (gneros; Streptococcus, Lactococcus,
Leuconostoc, Pediococcus, Aerobacter y Gemella) y
Lactobacillaceae (gneros; Lactobacillus), (4). Los
del gnero Lactobacillus (L. bulgaricus, L. helve-
ticus, L. delbruekii, etc.), son anaerobias faculta-
tivas; con crecimiento superficial o escaso, tienen
metabolismo fermentativo, cerca del 50% de su
producto final es cido lctico, su temperatura
optima de crecimiento est entre 30-40C, en un
rango aceptable entre 26 y 46C, a un pH de 4.5-
7.2 y es un microorganismo no patgeno (9). En
sustratos serinos con LH se reportan producciones
de AL del orden de 10,97 kg/m3 (17) y de 76,24
g/L en 93 horas de proceso continuo (15).
Tango & Ghaley (16) describen la utilizacin de
suero de queso para la produccin de cido lc-
tico por Lactobacillus helveticus en condiciones
intermitentes con un control continuo de tempe-
ratura y pH para lograr mejores rendimientos de
biomasa y de cido lctico. Sin embargo, a pesar
de la importancia del proceso para generar AL to-
dava existen pocas formulaciones de medios de
cultivo para su produccin y los estudios de creci-
miento deLH durante el proceso biotecnolgico
(10,17).Igualmente, la inhibicin por producto es
el principal obstculo en la fermentacin lctica,
ya que limita el rendimiento que se puede lograr
durante el proceso (17-26).
De esta forma y teniendo como base los factores
que fueron significativos para Ramrez, Plata &
Riao (12), y que dos variables controlables influ-
yen en el proceso y concentracin de los suplemen-
tos el presente trabajo de investigacin tuvo como
objetivo optimizar la produccin de AL utilizando
 Mtodo de superficie de respuesta para optimizar las condiciones de produccin de cido lctico
a partir de subproductos lcteos: SLC
LH cultivado en sistema discontinuo, aplicando
un diseo central compuesto (DCC) 24+* con 2
rplicas del punto central. Esta tcnica estadstica
permite establecer la influencia de los factores ms
relevantes as como tambin las posibles interac-
ciones que influyen en la seal, usando un reduci-
do nmero de ensayos (18).
Materiales y mtodos
Materiales: LSLC caracterizado bromatolgica-
mente utilizando protocolos estndar para hume-
dad (AOAC925.10), cenizas (AOAC923.03), pro-
tenas (AOAC978.02), fibra cruda (AOAC962.09),
grasas (mtodo de Goldfish) y carbohidratos (por
diferencia) y pre-tratado proveniente de la elabora-
cin de queso.
Microorganismo y preparacin del cultivo bacteria-
no. Lactobacillus helveticus LH 0-0.91, cepa liofi-
lizada, producida por la Technical Sheet, activada
en tubos de vidrio con 10 ml de leche UHT a
una temperatura de 42C durante 48 horas en
un medio microaeroflico-recipiente cerrado sin
oxgeno presente.
Preparacin del medio de cultivo. Los medios de
cultivo para los ensayos batch estuvieron compues-
tos de LSLC como fuente principal de carbono y
extracto de levadura como fuente compleja de ni-
trgeno, sulfato de amonio y vitamina B.
Fermentaciones y toma de muestras. Preparados los
sustratos; suero puro y suero con complementos,
se envasaron en erlenmeyers de 500 mililitros-bio-
rreactores intermitentes, con un volumen de tra-
bajo de 250 mililitros y se esterilizaron por 10 min
a 121C. Sistema descrito en la figura 1.
===
Figura 1. Diagrama del sistema de fermentacin bsico utilizado
para produccin de cido lctico por lote repetido.
Los sustratos se llevaron a una temperatura de
30C, se inocularon con 10ml de la cepa de Lac-
tobacillus helveticus, la cual antes de la inoculacin
se haba adaptado a los diferentes sustratos por tres
generaciones; en todos los casos se utiliz 10% de
inculo con respecto al volumen de trabajo (19).
Durante la fermentacin el pH se registr y la
temperatura se regul a 42C. Cada dos horas se
tomaron 10ml de muestra del medio de fermen-
tacin con el fin de determinar la concentracin
de cido lctico producido en el medio de cultivo.
Las biofermentaciones se llevaron a cabo mediante
un proceso por lote, figura 1, finalizando cada ci-
ntica cuando la fermentacin lctica alcanzaba la
fase estacionaria y se evacuaba el caldo fermentado.
El criterio para determinar los mejores valores de
concentracin de los complementos y temperatura
de trabajo fue la productividad de AL (20).
Diseo experimental. Se sigui un diseo central
compuesto, metodologa planteada por Box, Hun-
ter & Hunter (21); y la metodologa de superficie
de respuesta (MSR), esta es una tcnica que per-
mite al investigador inspeccionar una respuesta,
que se puede mostrar como una superficie, cuan-
do los experimentos investigan el efecto que tiene
el variar factores cuantitativos en los valores que
toma una variable dependiente o de respuesta (18).
En estas tcnicas cada factor (k-valor) X i (i = 1; 2)
puede tener dos valores-mximo y mnimo (1, -1),
se les conoce como valores codificados, tabla 1. Se
consider como objetivo alcanzar los mximos si-
multneos para las dos variables.
Los diseos experimentales usados y los anlisis
estadsticos realizados fueron generados, ejecuta-
dos y analizados mediante el software estadstico
Statgraphics Plus (versin 5.1, Statistics Graphical
Corporation, USA).
Se utilizaron como variables de respuesta la con-
centracin de AL y la produccin de biomasa en
la fase acuosa.
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Tabla 1. Caractersticas de los factores de control X.
Factor Niveles de complemento
Concentracin
Alto con Sin
de nutrientes
suplementos (+) suplementos (-)
% - X1
Temperatura
C- X 2
42 (+) 37 (-)
Fuente: Autores del proyecto.
De esta forma, el medio de cultivo que en su for-
mulacin contena los porcentajes ms altos de ex-
tracto de levadura, sulfato de amonio y riboflavina
y adems operaba a 42C fue el mayor generador
de cido lctico, razn por la cual se decidi que
la regin de exploracin estuviera entre los 35 y los
52C. Para simplificar los clculos las variables in-
dependientes se codificaron en un intervalo (-1,1).
Las variables codificadas fueron:
X1 =(x1-35) / 5yX 2= (x2-52) / 5
La influencia de los factores y sus interacciones so-
bre el modelo de regresin obtenido del tratamiento
estadstico, fue evaluada por medio de un anlisis
de varianza y mostrada a travs de diagramas de
Pareto.
Variables de respuesta
Concentracin en cido lctico (AL) y pH. La deter-
minacin de los azcares reductores totales (ART)
se hizo siguiendo el mtodo de Lane-Eynon
(AOAC). El cido lctico (AL) se determin por
colorimetra (AOAC), para lo cual se utiliz un
espectrofotmetro marca Spectronic 20 Genesys.
Variables controlables. Temperatura, concentracin
del nutrimento y tiempo del proceso.
Anlisis estadstico
A los resultados de los anlisis qumicos se les apli-
c el anlisis de varianza (ANOVA) de una va y
anlisis de comparacin mltiple (Test de Tukey).
160
La productividad de AL se determin en la fase es-
tacionaria-cuando los valores evaluados (concentra-
cin de AL y pH) no se modificaron significativa-
mente al realizar dos determinaciones consecutivas.
Resultados
El suero de leche de cabra entero y descremado se
caracteriz bromatolgicamente (19).
Cultivo discontinuo
Los ensayos de cultivo batch se llevaron a cabo
con el objetivo de evaluar las condiciones pti-
mas de cultivo y a la vez optimizar la composicin
del medio de cultivo para facilitar el aislamiento
y purificacin del cido lctico, esto se consigui
utilizando tres concentraciones del sustrato-inter-
medio, alto (13.2) y bajo (13.1). Los parmetros
determinados se muestran en la tabla 1.
Los resultados muestran que en los cultivos hubo
una conversin completa del sustrato pero con di-
ferente velocidad de conversin, figuras 2 y 3.
La mejor productividad de cido lctico en la fase ex-
ponencial de crecimiento se consigui en el cultivo in-
termedio. La mejor productividad de biomasa se ob-
serv en el cultivo intermedio. El mejor rendimiento
en cido lctico por sustrato consumido (90 y 93%)
y biomasa (18,5%) se observ en los cultivos interme-
dio y alto respectivamente. La mayor velocidad espe-
cfica de crecimiento en la fase exponencial (=
0.2 h-1), se observ en los cultivos intermedio y alto.
En el crecimiento del microorganismo la fase de
adaptacin tiene una duracin promedio de 11 ho-
ras, la fase exponencial termina aproximadamente
entre las 37 y 40 horas, seguida por la fase de la-
tencia la cual se debe al agotamiento de nutrientes
y a la acidificacin del medio. Durante las 50 ho-
ras de fermentacin el microorganismo no alcanz
la fase de latencia, esto debido a que el medio en
ese momento an contena lactosa.
El consumo de lactosa es inversamente pro-
porcional a la produccin de cido lctico, por
 Mtodo de superficie de respuesta para optimizar las condiciones de produccin de cido lctico
a partir de subproductos lcteos: SLC
consiguiente, a medida que aumenta la concentra-
cin de cido lctico disminuye el pH del medio,
l pH inicial de los medios de cultivo fue de 5.44
y el pH final se situ entre 3.49 y 3.29, figura 4.
La concentracin de lactosa tuvo una reduccin en
promedio de 52% en los ensayos 13.1-nivel bajo y
en los ensayos 13.2-nivel alto la reduccin fue del
61.5% en promedio.
Figura 2. Comportamiento cintico del pH en la fermentacin
controlada. Concentracin de nutrientes.
Figura 3. Comportamiento cintico de la fermentacin controla-
da. Acido lactico-concentracin de nutrientes.
Figura 4. Comportamiento cintico de la produccin de acido
lactico-lactosa.
Figura 5. Comportamiento cintico de la produccin de acido
lactico-tiempo proceso.
De todos los ensayos realizados, con el cultivo 13.1
se obtuvieron los mejores resultados; una mayor
productividad de cido lctico (5,4 g/L/h) unido
a un alto rendimiento en biomasa y cido lctico
(13,2 y 86,1%) y una conversin completa de la
lactosa, figuras 4 y 5.
Este mismo comportamiento con respecto a la
biomasa se observ en todas las fermentaciones lo
que se explicara por el efecto inhibitorio del AL
sobre el crecimiento celular, figuras 4 y 5, situa-
cin reportada en la literatura (9, 10).
Superficies de respuesta y grficas de contorno para
la produccin de cido lctico. La superficie de
respuesta y la grfica de contorno, figuras 6 y
7, se aprecian la produccin de AL cundo se
mantienen constantes la concentracin del su-
plemento y la temperatura respectivamente
indicando la existencia de un punto mximo-
curvatura y un mnimo.
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Tabla 2. Anlisis de Varianza para el AL

Suma de
Fuente Liber Cuadrado Medio F-Razon P-Valor
cuadrados
0,0349
A: Factor_A 18,1656 1 18,1656 8,25
0,0001
B: Factor_B 357,745 1 357,745 162,49
0,0134
AA 30,8376 1 30,8376 14,01
0,0377
AB 17,3472 1 17,3472 7,88**
0,0014
BB 89,2031 1 89,2031 40,52

Total error 11,0085 5 2,2017

Discusin
Se produjo AL a partir de SLC como sustrato
principal y se determin la combinacin de los
efectos de la concentracin de los complementos
al mximo nivel (12).
Puesto que el valor del estadstico R 2 es 0,666969 se
puede concluir que el modelo explica casi un 67%
la variabilidad de la concentracin de cido lctico.
Los resultados obtenidos muestran que la tempera-
tura y la composicin del suplemento presentan una
influencia estadsticamente significativa (p<0.05)
sobre la concentracin de cido lctico cuando la
fuente se aplica en el nivel superior, tabla 2.
El LSLC es un subproducto de muy bajo valor eco-
nmico, concebido en general en Colombia como un
desecho agroindustrial con alto impacto ambiental
negativo. Los resultados presentados documentan la
factibilidad tcnica de produccin de AL- producto
de alto valor agregado a partir de SLLC.
El mtodo del diseo experimental es una herra-
mienta til para la optimizacin, ya que se pueden
analizar los efectos de cada componente, as como,
las interacciones entre ellos.
El anlisis estadstico, basado en el diseo Box-
Behnken, permiti hallar las concentraciones que
maximizaban la respuesta.
Este proceso conducido en forma discontinua
present rendimientos y concentraciones finales
de AL comparables a otros procesos discontinuos
reportados en la literatura con otros microorga-
nismos y otros sustratos. Los rendimientos y pro-
ductividades obtenidos en este estudio, podran
ser mejorados optimizando otros parmetros de
operacin como la agitacin.
En este sentido, se pudo constatar que mediante el
diseo factorial y el DCC propuesto, la direccin
de la optimizacin es hacia un incremento de las
cantidades de suplementos en el SLC para favore-
cer la produccin de AL.
Las superficies de respuesta y las grficas de
contorno permitieron analizar los efectos de la
concentracin de suplementos y la temperatu-
ra de la fermentacin, y en consecuencia tomar
decisiones para lograr los valores deseados de
las respuestas.
En general, para todas las variables evaluadas,
se encontr que el ANAVA report significancia
estadstica, pues los F-calculados fueron mayo-
res en comparacin con el F de la tabla, tanto
al 0,05 como al 0,01, lo que quiere decir que
el modelo refleja bien el comportamiento de las
variables evaluadas.

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 Mtodo de superficie de respuesta para optimizar las condiciones de produccin de cido lctico
a partir de subproductos lcteos: SLC
Figura 6. Grfico de superficie de respuesta entre las variables
temperatura y suplemento. El mximo efecto se da cuando la con-
centracin del suplemento est en el nivel medio y la temperatura
en el superior. Confianza 95%.
Figura 7. Grfico de contorno de la superficie de respuesta entre
las variables temperatura y suplemento. El mximo efecto se da
cuando la concentracin del suplemento est en el nivel medio y
la temperatura en el superior. Confianza 95%.
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