PLoS Pathog. 2010 Nov; 6(11): e1001199.

Published online 2010 Nov 18. doi: 10.1371/journal.ppat.1001199

LAS QUIMIOCINAS CXC INDUCIBLES POR INTERFERN CONTRIBUYEN

DIRECTAMENTE A LA DEFENSA DEL HUSPED CONTRA EL NTRAX
INHALATORIO EN UN MODELO MURINO DE INFECCIN

Matthew A. Crawford,1 Marie D. Burdick,2 Ian J. Glomski,3 Anne E. Boyer,4 John R.

Barr,4 Borna Mehrad,2 Robert M. Strieter,2 y Molly A. Hughes1,*

Abstracto
Se ha encontrado que las quimioquinas ejercen una actividad antimicrobiana
directa similar a la defensina in vitro, lo que sugiere que, adems de orquestar la
acumulacin celular y la activacin, las quimiocinas pueden contribuir
directamente a la respuesta innata del husped frente a la infeccin. No se han
hecho observaciones, sin embargo, que demuestren la promocin directa mediada
por quimiocina de la defensa del husped in vivo. Aqu, mostramos que las
quimiocinas CXC inducibles por interfern murino CXCL9, CXCL10 y CXCL11
ejercen efectos antimicrobianos directos in vitro contra esporas y bacilos de estirpe
de Bacillus anthracis Sterne, incluyendo interrupciones en la germinacin de
esporas y reducciones marcadas en la viabilidad de esporas y bacilos, evaluada
usando CFU Y un ensayo fluoromtrico de la actividad metablica. Tambin se
observ actividad antimicrobiana mediada por quimiocina similar frente a esporas
de cepas de Ames completamente virulentas y bacilos encapsulados. Adems, se
encontr que la neutralizacin mediada por anticuerpo de estas quimiocinas CXC
in vivo aumentaba significativamente la susceptibilidad del husped a la infeccin
pulmonar de B. anthracis en un modelo murino de ntrax por inhalacin con una
progresin de la enfermedad caracterizada por diseminacin bacteriana sistmica,
toxemia y muerte del husped. No se encontr que la neutralizacin del receptor
de quimioquinas compartido CXCR3, responsable de mediar el reclutamiento
celular en respuesta a CXCL9, CXCL10 y CXCL11, aumentara la susceptibilidad
del husped al ntrax por inhalacin. Tomados en conjunto, nuestros datos
demuestran una novela, independiente de los receptores papel antimicrobiano
para el interfern inducible CXC quimiocinas en la inmunidad innata pulmonar in
vivo. Estos datos tambin apoyan un enfoque inmunomodulador para tratar y / o
prevenir eficazmente la infeccin pulmonar por B. anthracis, as como infecciones
causadas por bacterias patgenas y potencialmente resistentes a mltiples
frmacos que incluyen otros organismos que forman esporas
Resumen del autor
La inmunidad innata es crtica para la defensa del husped y juega un papel
central en la proteccin de los pulmones de los patgenos respiratorios. Entre los
mediadores importantes en la respuesta del husped innata a la infeccin
pulmonar estn las quimioquinas, protenas originalmente descritas por su
capacidad para regular el trfico de clulas inmunes durante una respuesta
inflamatoria. Ms recientemente, se ha encontrado que las quimiocinas ejercen
una actividad antimicrobiana directa contra una amplia gama de bacterias y
hongos in vitro. Aunque estas observaciones sugieren que las quimiocinas pueden
contribuir a la defensa del husped al matar microorganismos en sitios locales de
infeccin a travs de actividades no asociadas con receptores de quimiocinas
celulares, no se ha establecido la relevancia biolgica de la actividad
antimicrobiana mediada por quimiocina directa in vivo. Aqu mostramos que las
quimiocinas murinas CXCL9, CXCL10 y CXCL11 ejercen efectos antimicrobianos
directos contra B. anthracis in vitro y que la neutralizacin de estas quimiocinas
CXC, pero no su receptor compartido CXCR3, aumenta la susceptibilidad del
husped a la infeccin pulmonar por B. anthracis in vivo. Estos datos proporcionan
una visin nica de los mediadores del husped importante en la interaccin
husped-patgeno y la patognesis de la enfermedad y apoyan el concepto
emergente de que las quimiocinas husped mediar eficientes, pleiotrpico
funciones que incluyen independiente del receptor promocin de la defensa del
anfitrin in vivo.

Introduccin
Las vas respiratorias pulmonares representan un importante sitio de interaccin
entre el husped mamfero y los patgenos microbianos. La infeccin resultante
de la exposicin del tracto respiratorio a una variedad de microorganismos se
opone a la inmunidad innata pulmonar, una respuesta compleja del husped que
protege contra la infeccin mediando directamente la defensa inicial del husped
en el espacio areo mientras ayuda a dar forma a la activacin de la inmunidad
adaptativa [1] , [2]. Entre los componentes primarios de la inmunidad innata se
secretan mediadores incluyendo quimiocinas, pequeas protenas producidas
principalmente por clulas epiteliales y fagocticas en respuesta a la participacin
de receptor de reconocimiento de patrn y citoquinas pro-inflamatorias [3]. Las
quimiocinas se reconocieron originalmente por su capacidad para inducir la
migracin dirigida de leucocitos y facilitar la acumulacin celular controlada y la
activacin durante una respuesta inflamatoria a travs de interacciones receptor-
dependientes entre las quimiocinas y sus receptores especficos acoplados a
protenas G expresados por clulas sensibles [4] .

Adems de su papel en el reclutamiento celular, se ha encontrado que una serie

de quimiocinas median efectos antimicrobianos directos contra una amplia gama
de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas in vitro [5] - [8]. Aunque los detalles
mecnicos de estos efectos siguen siendo indefinidos, se cree que la actividad
antimicrobiana es el resultado de las interacciones entre las regiones cargadas
positivamente presentes en el C-terminal de la quimioquina y los restos cargados
negativamente en la superficie de las clulas microbianas, resultando en la lisis
celular. Aunque las quimioquinas han demostrado ser componentes centrales de la
respuesta del husped a la infeccin pulmonar [9], estas molculas se han visto
principalmente en el contexto de las interacciones receptor / ligando, sin tener en
cuenta la actividad antimicrobiana mediada por ligando directo. Como tal, la
relevancia biolgica de la actividad antimicrobiana mediada por quimiocina
independiente del receptor en la defensa del hospedador in vivo queda por
establecer.

La enfermedad del ntrax es causada por la bacteria Gram-positiva, formadora de

esporas Bacillus anthracis. La espora infecciosa de B. anthracis consta de
distintas capas concntricas que encierran el material genmico de la espora y
proporcionan proteccin contra mltiples tensiones, incluyendo alta temperatura y
digestin ltica [10], [11]. Dependiendo de la ruta de entrada de la espora, B.
anthracis causa tres tipos distintos de enfermedad: inhalacin, gastrointestinal y
ntrax cutneo. El ntrax inhalatorio resulta como consecuencia de la deposicin
de esporas dentro del espacio areo del husped. En este caso, las esporas
encuentran efectores de la inmunidad innata del husped y son absorbidos por
fagocitos incluyendo macrfagos [12] y clulas dendrticas [13]. Se piensa que la
germinacin de las esporas, la reanudacin de la actividad metablica y la
proliferacin como clula vegetativa, comienza despus de la fagocitosis en estos
sitios localizados de infeccin [14], [15] y que la gran mayora de los organismos
germinantes mueren [16]. Sin embargo, durante el trnsito por clulas fagocticas
a los ganglios linfticos regionales, se cree que un pequeo subconjunto de
bacilos supervivientes median eventos disruptivos de membrana que permiten
escapar de las vesculas fagocticas y, posteriormente, de la clula fagoctica [17].
Los bacilos extracelulares evaden las respuestas inmunitarias del husped
mediante la produccin de dos factores de virulencia codificados por plsmidos:
una toxina tripartita codificada por pXO1 y responsable de suprimir ampliamente la
respuesta inmune del husped [18], y una cpsula de cido poli-D-glutmico
codificada por pXO2 , Que protege contra la matanza fagoctica [19]. Estos y otros
factores bacterianos permiten que B. anthracis se multiplique rpidamente, dando
como resultado la diseminacin sistmica, la toxemia y la muerte del husped
infectado [20].

CXCL9, CXCL10 y CXCL11 son homlogos, miembros inducibles por interfern de

la familia de quimioquinas CXC que carecen del motivo de estructura / funcin
tripeptdico Glu-Leu-Arg (ELR) importante en la quimioatraccin de neutrfilos [9].
Como tal, estas citoquinas ELR-CXC inducibles por interfern se comunican a
travs de un receptor comn, CXCR3, para facilitar el reclutamiento selectivo de
leucocitos mononucleares, clulas asesinas naturales y clulas dendrticas
plasmacitides a sitios de inflamacin [9], [21]. [22] y otros [5], [8] han informado
previamente de la capacidad de humanos CXCL9, CXCL10 y CXCL11 para ejercer
una actividad antimicrobiana directa contra B. anthracis, as como Escherichia coli,
Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus. Adems, hemos observado que
la induccin de quimioquinas CXC en los pulmones de ratones C57BL / 6
desafiados intranasalmente con esporas de B. anthracis Sterne se asocia con
reducciones significativas en la germinacin de esporas y la posterior progresin
de la enfermedad [22]. Sobre la base de estas observaciones, la hiptesis de que
murino CXCL9, CXCL10 y CXCL11 ejercen efectos antimicrobianos directos
contra B. anthracis y por lo tanto mediar un receptor independiente de la
contribucin a la defensa del husped contra la infeccin pulmonar B. anthracis.

En el presente estudio, demostramos que las citoquinas ELR-CXC inducibles por

interfern murino CXCL9, CXCL10 y / o CXCL11 ejercen

Resultados
Los CXCL9, CXCL10 y CXCL11 murinos ejercen efectos antimicrobianos directos
contra B. anthracis Esporas y bacilos de estirpe Sterne

Dado que la induccin de las quimiocinas ELR-CXC inducibles por interfern

dentro de los pulmones de ratones estimulados por esporas se asocia con
resistencia al ntrax por inhalacin, se busc determinar si los CXCL9 murinos,
CXCL10 y CXCL11 ejercen actividad antimicrobiana contra B. anthracis Esterlina.
Se incluyeron en estos estudios dos quimiocinas de CC de control, CCL2 y CCL5,
cuyos pesos moleculares y puntos isoelctricos bsicos son similares a las
quimiocinas CXC examinadas [5]. Las interrupciones en la germinacin de
esporas y la viabilidad celular bacteriana se evaluaron mediante la determinacin
de unidades formadoras de colonias (UFC), realizadas en presencia o ausencia de
tratamiento trmico para diferenciar entre esporas resistentes al calor y bacilos
sensibles al calor.

A las 6 h despus del tratamiento, las esporas tratadas con CCL2 y CCL5 no
tratadas experimentaron una germinacin y un crecimiento vegetativo
considerables como se evidenci por una prdida de CFU resistente al calor
(germinacin) y un aumento en CFU sensible al calor (crecimiento vegetativo) en
comparacin con El inculo inicial (Figura 1A). El tratamiento de esporas de B.
anthracis con CXCL9 dio como resultado una reduccin aproximada de 1.000
veces en organismos viables en comparacin con el control no tratado. Se
observ que la retencin de la latencia de esporas era significativamente mayor en
presencia de CXCL9, aunque las esporas viables representaban menos del 10%
del inculo inicial; Curiosamente, esta reduccin en las esporas viables no
coincidi con una aparicin de organismos sensibles al calor y germinados. Estos
efectos fueron dependientes de la concentracin (EC50 = 5,00 1,10 g / ml,
Figura S1A, B) y sugieren que CXCL9 inhibe la germinacin de esporas y perturba
el mantenimiento de la viabilidad de las esporas. En apoyo de esta nocin, las
esporas tratadas con CXCL9 demostraron una falta de crecimiento primario como
se determin mediante la visualizacin microscpica (Figura 1B) y la reanudacin
del metabolismo (una caracterstica de la germinacin de esporas) estaba ausente
en muestras de esporas tratadas con CXCL9 6 h post- Tratamiento medido por un
ensayo de metabolismo basado en Alamar Blue (Figura 1C). El tratamiento de
esporas de B. anthracis con CXCL10 o CXCL11 dio como resultado niveles
significativamente disminuidos de organismos resistentes al calor y una reduccin
aproximada de 10 veces en el crecimiento vegetativo en comparacin con el
control no tratado (Figura 1A). Aunque posiblemente ejerciendo un efecto
esporicida, no se encontr que CXCL10 o CXCL11 bloquearan la germinacin de
esporas (Figura 1A, C). Tambin se observ una actividad antimicrobiana mediada
por quimiocina frente a B. anthracis Tambin se observaron bacilos de la cepa
estereoscpica, con las tres quimiocinas ELR-CXC inducibles por interfern
capaces de mediar disminuciones significativas en la viabilidad celular vegetativa
como se determina tanto por el anlisis de CFU (Figura 1D) como por la reduccin
de Alamar Blue Figura 1E). La CXCL9 demostr una actividad bactericida
considerable, mediando la muerte completa del inculo inicial de bacilos de una
manera dependiente de la concentracin (EC50 = 3,96 \ pm 0,75 \ mu g / ml,
Figura S1C, D). Cabe destacar que la jerarqua antimicrobiana de las quimiocinas
CXC murinas presentadas aqu (CXCL9 >> CXCL10 CXCL11) es distinta de la
jerarqua previamente observada para las quimiocinas CXC humanas (CXCL10
CXCL9 >> CXCL11) [22].

Efectos antimicrobianos de las quimiocinas ELR-CXC inducibles por interfern

contra esporas de cepas de B. anthracis Ames y bacilos encapsulados

En contraste con los organismos de cepa de B. anthracis Sterne, los bacilos

vegetativos de la cepa Ames llevan el opern biosinttico de la cpsula codificado
por pXO2 y son capaces de generar una cpsula protectora de cido poli-D-
glutmico. Mientras que el aumento de la virulencia de los organismos
encapsulados se ha atribuido principalmente a la evasin bacteriana mejorada de
clulas mediada por las respuestas del husped [19], la cpsula puede actuar
como una barrera contra los mediadores inmunes solubles. Por lo tanto, el
potencial antimicrobiano de CXCL9 murino frente a organismos de cepa de B.
anthracis Ames completamente virulentos se examin usando la determinacin de
CFU. Adems, como se desconoce la capacidad de las quimiocinas CXC
inducibles por ELR-interfern humano de mediar los efectos antimicrobianos
contra cepa de B. anthracis Ames, se busc determinar la capacidad de la
CXCL10 humana para dirigir directamente esporas virulentas y bacilos
encapsulados relevantes para la enfermedad humana; CXCL10 humano se ha
demostrado anteriormente para ejercer efectos antimicrobianos contra B. anthracis
organismos de la cepa Sterne similares a los informados aqu para CXCL9 murina
[22].

El tratamiento de esporas de cepa de Ames con CXCL9 murino o CXCL10

humano result en niveles significativamente reducidos de germinacin de
esporas y crecimiento primario en comparacin con el control no tratado (Figura
2A), apoyando la falta de un papel para los componentes codificados con pXO2 en
susceptibilidad a esporas A estas quimioquinas. A continuacin examinamos la
capacidad de CXCL9 murino y CXCL10 humano para ejercer un efecto bactericida
directo contra bacilos toxignicos encapsulados. El tratamiento de bacilos de cepa
Ames encapsulados con CXCL9 murino dio como resultado una reduccin
aproximada de 100 veces en la viabilidad bacteriana en comparacin con el
control no tratado 6 h despus del tratamiento (Figura 2B). De forma similar, se
encontr que CXCL10 humano mostr actividad antimicrobiana contra bacterias
encapsuladas, mediando una reduccin de cinco log en clulas vegetativas
viables. Los bacilos de cepa de Ames se visualizaron en preparaciones de tinta de
la India, confirmando que el inculo de bacilos inicial consista en clulas
bacterianas encapsuladas y que la cpsula no se perda en condiciones
experimentales (Figura 2C). Que el CXCL9 murino y el CXCL10 humano ejercen
efectos antimicrobianos directos contra esporas de cepa Ames y bacilos
encapsulados y que estos efectos son similares a los observados para organismos
de cepa Sterne, indican que B.

Las quimiocinas ELR-CXC inducibles por interfern contribuyen directamente a la

defensa del husped contra la infeccin pulmonar por B. anthracis

Con el fin de determinar la relevancia biolgica de la actividad antimicrobiana

mediada por quimiocina directa durante la infeccin pulmonar por B. anthracis, se
utiliz un modelo murino de ntrax inhalatorio en el que se neutralizaron
selectivamente CXCL9, CXCL10 y / o CXCL11 endgeno, o su receptor celular
compartido CXCR3 . La neutralizacin mediada por anticuerpos se realiz en
ratones C57BL / 6 (relativamente resistente a la infeccin inhalatoria por cepa de
B. anthracis Sterne) y se logr mediante la administracin intraperitoneal (ip) de
anti-sueros contra las quimiocinas ELR-CXC inducibles con interfern individual o
el NH2 Terminal de CXCR3 [23], [24]. Estos anticuerpos se demostr previamente
que son especficos sin reactividad cruzada a un panel de citocinas y otros
ligandos quimiocinas [23].

Se encontr que la neutralizacin de la CXCL9 endgena en animales estimulados

con esporas de B. anthracis aumentaba significativamente la susceptibilidad del
husped a la infeccin pulmonar (p = 0,012), resultando en una mortalidad de
aproximadamente 30% en comparacin con los animales con suero control
controlados con esporas, 3); La administracin de suero neutralizante de CXCL9
en ausencia de infeccin no se encontr que causara la muerte, con 12/12 ratones
sobreviviendo ms de 20 das. La neutralizacin de CXCL10 en animales con
esporas result en una menor supervivencia del husped (20% de mortalidad) que
se aproxim a significacin estadstica (p = 0,064) en comparacin con animales
infectados que recibieron suero de control; Se observ una mortalidad similar en
ratones CXCL10 - / - tras la estimulacin con esporas (datos no mostrados). No se
encontr que la neutralizacin de CXCL11 aumentara la susceptibilidad del
husped al ntrax por inhalacin. La neutralizacin combinatoria de CXCL9 junto
con CXCL10 o CXCL10 / CXCL11 durante la infeccin pulmonar de B. anthracis
aument significativamente la susceptibilidad del husped al ntrax, con la
neutralizacin de las tres quimiocinas CXC, resultando en una mortalidad del 50%
(p = 0,0003).
Es importante destacar que la neutralizacin mediada por anticuerpos de CXCR3
(Figura S2) no dio como resultado una susceptibilidad incrementada a la infeccin
pulmonar de B. anthracis (Figura 3), y la supervivencia entre los animales con
CXCR3- / mostrado). Estos datos sugieren que los efectos directos mediados por
ligandos no asociados con CXCR3 contribuyen a limitar la progresin de la
enfermedad en este modelo de infeccin pulmonar. De hecho, la induccin post-
desafo de endgeno CXCL9, CXCL10, y CXCL11 previamente asociado con la
resistencia a inhalacin B. anthracis infeccin [22] se mantuvo en los animales que
reciben CXCR3 neutralizar el suero (Figura S3). Adicionalmente, las poblaciones
de clulas inflamatorias del husped en los pulmones de animales que
presentaban esporas que reciban suero neutralizante CXCL9 / CXCL10 / CXCL11
o CXCR3 eran sorprendentemente similares despus del desafo (Figura S4); La
ausencia de diferencias significativas en las poblaciones de clulas husped
indican que CXCR3 dependiente, los efectos mediados por clulas no son
responsables de las distintas diferencias en la progresin de la enfermedad entre
estos grupos. Tomados en conjunto, los datos anteriores demuestran un nuevo
papel antimicrobiano para las quimiocinas ELR-CXC inducibles por interfern
durante la infeccin pulmonar de B. anthracis que es independiente del
reclutamiento celular mediado por CXCR3 a sitios de infeccin.
La neutralizacin de quimiocinas ELR-CXC inducible por interfern se asocia con
la diseminacin y toxemia de B. anthracis

Para conocer mejor la progresin de la enfermedad asociada a la neutralizacin

de CXCL9, CXCL10 y CXCL11, y para confirmar que la muerte del husped
result como consecuencia de la infeccin por B. anthracis, se investigaron dos
caractersticas destacadas del ntrax: la diseminacin bacteriana y la toxemia. La
capacidad de B. anthracis para diseminar a partir de los sitios iniciales de infeccin
se examin midiendo la CFU de B. anthracis en los pulmones, los riones, el bazo
y el hgado de ratones moribundos que reciban sueros neutralizantes CXCL9 /
CXCL10 / CXCL11, comparados con los medidos de pares , Animales estimulados
con esporas que reciben suero de control.

En concordancia con los informes publicados anteriormente que miden la

diseminacin bacteriana durante la infeccin pulmonar por B. anthracis [25], [26],
la UFC de B. anthracis en los pulmones de animales con esporas fue
aproximadamente equivalente entre los grupos de tratamiento. Sin embargo, a
diferencia de los animales de control, que mostraron poca evidencia de
diseminacin extrapulmonar, los tejidos recolectados de animales que recibieron
sueros neutralizantes CXCL9 / CXCL10 / CXCL11 demostraron diseminacin
bacteriana generalizada con CFU considerable detectada en los riones, el bazo y
el hgado (Figura 4). Esta difusin observada es coherente con la diseminacin
bacteriana previamente inform de cepas de ratones altamente susceptibles a la
infeccin de cepa Sterne [20]. La capacidad de las quimiocinas CXC para
participar en la limitacin de la progresin de la enfermedad antes de la invasin
sistmica tambin se observ utilizando imgenes in vivo. Los ratones C57BL / 6
fueron desafiados con una cepa bioluminiscente de B. anthracis (7702 lux) cuyas
clulas vegetativas son constitutivamente luminiscentes y permiten la visualizacin
de la diseminacin bacteriana [27]. Como anteriormente, slo despus de la
neutralizacin de CXCL9, CXCL10, y CXCL11 fue la enfermedad sistmica
observada como evidenciado por la deteccin de la luminiscencia en los tejidos
distantes de las vas respiratorias del anfitrin (Figura 5A, B). Adems, la
diseminacin extrapulmonar se observ despus del establecimiento de la
infeccin en el trax (Figura C, D) en consonancia con el deterioro de la defensa
del husped en los sitios locales de la infeccin.
La toxemia es caracterstica del ntrax sistmico y resulta de la secrecin de una
toxina tripartita que consiste en el antgeno protector (PA) del componente de
unin al receptor y dos componentes catalticamente activos, el factor letal de
metaloproteasa (LF) y el factor de edema de la adenilato ciclasa [ 18]. Varios
estudios de animales que examinan la produccin de PA y LF durante la infeccin
han encontrado PA para ser detectable en la sangre de los animales infectados
slo durante las etapas terminales de la enfermedad [28], una observacin
pensada para reflejar la rpida unin de la PA por las clulas husped [29] . Por el
contrario, se ha demostrado que la LF se acumula ms temprano en la infeccin,
en consonancia con la internalizacin tarda (la entrada celular de la LF depende
de la fijacin, activacin y heptamerizacin previa de PA), proporcionando una
buena medida de la toxemia durante la progresin de la enfermedad. Como un
ndice de toxemia, se utiliz un mtodo establecido espectrometra de masas [30]
para detectar y medir los niveles de biolgicamente activos LF en el suero
recogidos de esporas desafiados ratones. Mientras que los animales de control
infectados mostraron niveles bajos o indetectables de LF, se encontr que el suero
recogido de animales que recibieron suero neutralizante CXCL9 / CXCL10 /
CXCL11 contena concentraciones de LF activa que oscilaban entre 25 y 400 ng /
ml (Figura 6), niveles proporcionales Con concentraciones medidas a partir de los
sueros de primates no humanos que han sucumbido al ntrax por inhalacin [30].
Estos datos indican que las quimiocinas ELR-CXC inducibles por interfern
ayudan a proteger contra la infeccin pulmonar de B. anthracis en un modelo
murino de infeccin y que la interrupcin de los papeles innatos mediados por
ligandos en la defensa del husped aumenta la susceptibilidad a enfermedades
invasivas y toxemia.

Discusin
La exposicin de los pulmones del husped a microorganismos potencialmente
patgenos representa un desafo inmunolgico significativo para la defensa del
husped. Los encuentros iniciales entre los microbios inhalados y los
componentes de la inmunidad innata pulmonar inician un conjunto dinmico de
interacciones que finalmente determina si la enfermedad se producir [31]. La
respuesta del husped a la infeccin se coordina, en parte, a travs de la
produccin de quimiocinas que permiten la acumulacin celular controlada y la
activacin durante una respuesta inmune [32]. Algunos ligandos de quimioquinas
muestran actividad antimicrobiana directa in vitro [33] planteando la posibilidad de
un papel multifuncional para las quimiocinas en la defensa del husped que
incluye la matanza microbiana en sitios locales de interaccin husped-patgeno.
Aqu, se investig la capacidad de los interfern inducible ELR-CXC quimiocinas
para contribuir directamente a la defensa del husped contra la infeccin pulmonar
B. anthracis. Se encontr que CXCL9, CXCL10 y CXCL11 ejercen efectos
antimicrobianos directos contra B. anthracis in vitro y que la neutralizacin de
CXCL9 endgeno, individualmente o junto con CXCL10 o CXCL10 / CXCL11, pero
no CXCR3, aumenta significativamente la susceptibilidad del husped al ntrax
inhalatorio en un Modelo murino de infeccin. Nuestros datos apoyan una novela,
independiente de CXCR3 papel para el interfern inducible ELR-CXC quimiocinas
en la respuesta del husped innata contra la infeccin pulmonar B. anthracis que
es coherente con la actividad antimicrobiana mediada por quimiocina directa en
los sitios locales de la infeccin.

Se encontr que cada quimioquina CXC murina examinada in vitro para

determinar la actividad antimicrobiana ejerca efectos antimicrobianos directos
contra esporas y bacilos de B. anthracis Sterne. El anlisis in vitro tambin
demostr la capacidad de CXCL9 murino y CXCL10 humano para ejercer efectos
antimicrobianos directos contra esporas de cepa de B. anthracis Ames
completamente virulentas y bacilos encapsulados. Curiosamente, mientras que las
esporas de cepa Ames se encontr que son totalmente susceptibles a CXCL9
murino, matanza directa de los bacilos encapsulados por CXCL9 murina se redujo
en comparacin con organismos no encapsulados. Como CXCL9 contiene una
regin C-terminal relativamente extendida [5], la reduccin relativa de la actividad
antimicrobiana puede resultar de una mayor exclusin de CXCL9 por la cpsula de
cido poli-D-glutmico, impidiendo as que la quimioquina llegue al (los) sitio (es)
de accin En la superficie bacteriana. Aunque esta diferencia puede afectar el
papel defensivo de CXCL9 durante la infeccin con B. anthracis completamente
virulento, los datos in vitro presentados aqu demuestran que la actividad
antimicrobiana mediada por quimioquinas es aplicable a ambas cepas de B.
anthracis examinadas. Dado que la actividad de muchas quimiocinas
antimicrobianas y pptidos husped es interrumpida por la presencia de suero y /
o fisiolgicas concentraciones de iones, incluyendo Na +, K + y Mg2 + [33], [34],
es importante sealar que el antimicrobiano in vitro De CXCL9, CXCL10 y CXCL11
frente a B. anthracis en medio de cultivo que contiene concentraciones
fisiolgicamente relevantes de protenas e iones de suero. Adems, estas
concentraciones de iones son similares a los encontrados en el fluido de la
superficie de las vas respiratorias [35], apoyando el potencial de las quimiocinas
ELR-CXC inducibles por interfern para mediar la actividad antimicrobiana en las
vas respiratorias del husped. Trabajos previos realizados por nuestro laboratorio
han demostrado que la induccin de las quimiocinas ELR-CXC inducibles por
interfern dentro de los pulmones tras el desafo de esporas de B. anthracis se
asocia con reducciones significativas en la germinacin de esporas y resistencia a
la infeccin pulmonar [22]. En el presente estudio, investigamos las consecuencias
de la neutralizacin selectiva de CXCL9, CXCL10 y / o CXCL11 durante la
infeccin pulmonar de B. anthracis y si las posibles contribuciones mediadas por el
ligando a la defensa del husped eran independientes de las interacciones con
CXCR3. Consistente con su potente actividad antimicrobiana in vitro y su
induccin sostenida dentro de los pulmones despus de la estimulacin de
esporas in vivo (Figura S3; [22]), la neutralizacin de CXCL9 endgeno se tradujo
en un aumento significativo de la susceptibilidad del husped al ntrax por
inhalacin. Aunque no se encontr que la neutralizacin individual de CXCL10 o
CXCL11 diera como resultado un aumento significativo de la mortalidad entre
animales con esporas, la neutralizacin combinada de CXCL9 junto con CXCL10 o
CXCL10 / CXCL11 indic efectos aditivos potenciales en la promocin de la
defensa del hospedador contra la infeccin pulmonar por B. anthracis, De los tres
ligandos CXC resultando en diseminacin bacteriana generalizada, toxemia y la
mayor mortalidad de cualquier grupo con esporas examinado en este estudio. Es
importante destacar que la neutralizacin de CXCR3, que interrumpe el
reclutamiento celular mediado por receptor en respuesta a estas quimioquinas
CXC, no se encontr que aumentara la susceptibilidad del husped al ntrax
inhalatorio. Estos resultados demuestran la capacidad de las quimiocinas ELR-
CXC inducibles por interfern, en particular CXCL9, para contribuir directamente a
la defensa del husped mediante actividades no asociadas con CXCR3. Adems,
estas observaciones apoyan el potencial de un papel multifuncional eficiente para
las quimiocinas husped que puede representar un mecanismo ms generalizado
de la respuesta innata del husped contra la infeccin.

Aunque los datos presentados aqu son consistentes con la actividad

antimicrobiana mediada por quimiocina directa in vivo, las concentraciones de
ligandos de quimioquinas medidas a partir de homogeneizados de pulmn de
animales estimulados con esporas no son tan altas como las requeridas para
conseguir efectos antimicrobianos in vitro. De hecho, con pocas excepciones, la
mayora de las quimiocinas antimicrobianas conocidas y los pptidos husped,
incluyendo muchas defensinas, ejercen efectos bactericidas directos in vitro a
concentraciones relativamente altas; Concentraciones inhibitorias mnimas
tpicamente en el rango de 0,1-100 g / ml [36]. Numerosos estudios, sin
embargo, han identificado los papeles de pptidos antimicrobianos husped en
defensa pulmonar contra la infeccin bacteriana lo que sugiere biolgicamente
relevantes concentraciones se producen durante la infeccin [37]. La capacidad de
las quimiocinas ELR-CXC inducibles por interfern para mediar la actividad
antimicrobiana directa in vivo es muy probable que sea relevante en los sitios
locales de interaccin husped-patgeno. En estos focos inflamatorios, se puede
esperar que la elaboracin de la produccin de quimioquinas por las clulas
husped resulte en concentraciones substanciales de quimioquinas capaces de
mediar las contribuciones directas a la defensa del husped [1]. Esta nocin est
respaldada por la capacidad de clulas epiteliales [38], [39] y mononucleares [5]
para producir cantidades significativas de CXCL9, CXCL10 y / o CXCL11 en
respuesta a estmulos inflamatorios, con concentraciones de CXCL9 y CXCL10
llegar a varios cientos Nanogramos por mililitro [39]. Adems, el lquido amigdalino
recogido de pacientes con faringitis por Streptococcus pyogenes contiene
concentraciones de CXCL9 que superan las necesarias para matar a S. pyogenes
in vitro, y la inhibicin de la expresin de CXCL9 reduce la actividad
antimicrobiana contra este organismo en la superficie de las clulas farngeas
inflamadas. CXCL9 puede ser de particular importancia en la promocin de la
defensa del husped contra la infeccin bacteriana, ya que es fuertemente
inducida en varios modelos murinos de infeccin pulmonar, incluyendo Klebsiella
pneumoniae y Mycobacterium tuberculosis [9], [40]. Del mismo modo, y con
especial relevancia para el presente estudio, los adultos expuestos a esporas de
B. anthracis (basados en cultivos de hisopo nasofarngeos positivos) en el edificio
del Capitolio de los Estados Unidos durante los ataques de ntrax de 2001
demostraron niveles elevados de varios mediadores inflamatorios incluyendo
CXCL9. La capacidad de CXCL9 de mediar un papel multifuncional en la defensa
del husped es apoyada por observaciones de que S. pyogenes y el patgeno
oportunista Finegoldia magna liberan cada uno factores de virulencia especficos
que se cree promueven la evasin inmune interrumpiendo la integridad o
disponibilidad de la regin C-terminal de CXCL9 , Lo que reduce o suprime la
actividad antimicrobiana directa [38], [42]. Curiosamente, mientras estos factores
limitan la actividad antimicrobiana mediada por CXCL9, la capacidad de CXCL9 de
seal a travs de CXCR3 se mantiene en gran medida, demostrando separadas y
distintas funciones mediadas por quimiocina independientemente alteradas por
patgenos. El hecho de que otras quimiocinas antimicrobianas estn orientadas
de forma similar [43] indica adems que las quimiocinas husped producidas
endgenamente median papeles multifuncionales en la defensa del husped que
probablemente representan un mecanismo ms generalizado de la respuesta
innata del husped a la infeccin. De hecho, recientemente se encontr que el
CCL6 murino y sus homlogos humanos estaban altamente expresados en la
mucosa intestinal y eran capaces de mediar los efectos antimicrobianos contra un
subconjunto de bacterias intestinales ex vivo [44]. Adems, se ha encontrado que
la quimiocina antimicrobiana CCL28 est constitutivamente expresada y altamente
concentrada en las secreciones mucosas [6], y CXCL9 del plasma seminal posee
actividad antimicrobiana contra el patgeno urogenital Neisseria gonorrhoeae [45].
Estas observaciones son cada uno coherente con la directa chemokine mediada
por papeles en la defensa del husped y apoyar la nocin de quimioquinas
husped como efectores multifuncionales de la inmunidad innata.

Queda por determinar en qu punto de la infeccin pulmonar por B. anthracis las

quimiocinas ELR-CXC inducibles por interfern median su contribucin a la
defensa del husped. CXCL9 y CXCL10 son inducidos a niveles relativamente
altos dentro de los pulmones despus de la estimulacin de esporas sugiriendo
que la actividad antimicrobiana puede actuar tempranamente en la infeccin
contra la forma de esporas del organismo. La actividad antimicrobiana contra las
esporas de B. anthracis durante la infeccin es consistente con la asociacin
previamente informada entre la induccin de CXCL9, CXCL10 y CXCL11 y la
disminucin de la germinacin de esporas in vivo [22], as como las observaciones
de que la reduccin de la carga de esporas en los macrfagos residentes es
importante en Previniendo el crecimiento vegetativo intracelular y posterior
progresin de la enfermedad [46]. Spore desafo con toxignica, no encapsulado
B. anthracis resultados en la germinacin de esporas y el establecimiento de la
infeccin en sitios locales dentro de las vas respiratorias de acogida [14], [15]. La
infeccin est contenida aqu inicialmente proporcionando una oportunidad para la
actividad antimicrobiana mediada por quimioquinas contra bacilos vegetativos
antes de la diseminacin extrapulmonar [20]. Aunque las observaciones aqu
presentadas son consistentes con los efectos antimicrobianos directos similares a
los encontrados in vitro, no excluyen la actividad inmunomoduladora mediada por
el ligando; Recientemente se ha informado que CXCL9 induce la transcripcin de
genes y la produccin de quimioquinas en clulas mononucleares de sangre
perifrica, independientemente de las interacciones con CXCR3 [47]. Dado que el
ntrax por inhalacin es una enfermedad aguda capaz de abrogar las respuestas
inmunitarias del husped, sugiere que las quimiocinas del hospedador median
papeles importantes en la respuesta innata del husped de los huspedes
inocentes y ayudan a limitar la infeccin temprana en la progresin de la
enfermedad.

La emergencia continua de la resistencia a los antibiticos [48] y el potencial de la

resistencia de ingeniera en el armamento de agentes biolgicos [49] representan
graves reas de preocupacin. La capacidad de los pptidos de defensa del
hospedador para ejercer efectos antimicrobianos directos y promover la inmunidad
protectora se ha sugerido como una plantilla para el desarrollo de nuevas
estrategias teraputicas capaces de abordar estos retos [50]. Algunas quimiocinas
(incluyendo CXCL9, CXCL10 y CXCL11) comparten muchas relaciones
estructurales y funcionales con los pptidos de defensa del husped, lo que
sugiere que estos mediadores tienen papeles superpuestos en la defensa del
husped y potencial teraputico similar [51]. La capacidad de interferones de tipo 1
(IFN- / ) y tipo 2 (IFN-) para inducir fuertemente la produccin de quimioquinas
ELR-CXC apoya la administracin de interfern exgeno como una estrategia
teraputica para tratar la infeccin pulmonar por B. anthracis. De hecho, tanto IFN-
/ y IFN- se han encontrado para promover la proteccin contra B. anthracis
desafo in vitro [52] e in vivo [53]. Aunque ninguno de estos estudios examin
quimiocinas CXC, cada uno apoya la aplicacin teraputica potencial de la
induccin exgena de quimiocinas en la profilaxis post exposicin o el tratamiento
del ntrax. Adems, la induccin exgena de quimiocinas husped capaces de
activar la inmunidad celular, de promover la produccin de mediadores inmunes y
de matar directamente patgenos puede aplicarse ms ampliamente al desarrollo
de vas teraputicas innovadoras para el tratamiento de infecciones bacterianas
patgenas y potencialmente multirresistentes. En resumen, nuestros hallazgos
aportan una fuerte evidencia de un importante papel independiente de CXCR3
para las quimiocinas ELR-CXC inducibles por interfern en la respuesta del
husped innata contra la infeccin pulmonar por B. anthracis e indican que
CXCL9, en particular, puede funcionar como una de las Componentes
antimicrobianos principales de la va area del husped inflamada. Se encontr
que la neutralizacin de los ligandos de quimioquinas CXC, pero no su receptor
celular compartido, perturba la capacidad del husped para limitar la progresin de
la enfermedad y contiene B. anthracis en los sitios iniciales de infeccin,
resultando en una susceptibilidad incrementada al ntrax inhalatorio caracterizado
por diseminacin sistmica, Y la muerte. Aunque se requieren estudios adicionales
para definir las contribuciones biolgicamente relevantes de las quimiocinas ELR-
CXC inducibles por interfern para la defensa del husped, la capacidad de una
respuesta de quimiocina husped intacta para promover directamente la respuesta
innata del husped contra el ntrax inhalatorio es consistente con la actividad
antimicrobiana directa observada Para estas quimiocinas in vitro. La actividad
antimicrobiana mediada por quimiocina directa en la interfase de interaccin
husped-patgeno puede representar un mecanismo importante en la defensa del
husped, y apoya la consideracin de quimiocinas husped en el desarrollo de
nuevas estrategias teraputicas inmunomoduladoras.

Cepas y condiciones de cultivo bacteriano

B. anthracis Las esporas 7702 de estirpe Sterne se prepararon usando un mtodo

de cultivo lquido [54] con modificacin. En resumen, se inocul Difco Sporulation
Medium [55] con B. anthracis 7702, y los cultivos se incubaron 4-5 d a 37 C con
agitacin. Despus de la esporulacin, los cultivos se lavaron en dH2O fro y
estril y se trataron trmicamente a 65 C para eliminar cualquier clula
vegetativa restante. Las esporas se purificaron sobre un gradiente de Percoll (GE
Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.), se lavaron y se enumeraron. Se
prepararon bacilos de B. anthracis en caldo de infusin de corazn cerebral (BHI)
(Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) y se subcultivaron
antes de su uso. Luminescentes B. anthracis 7702 lux fue amablemente
proporcionado por el Dr. T. Merkel (Food and Drug Administration, Bethesda, MD)
y se describe en detalle en otra parte [27]. Todos los trabajos relacionados con la
cepa 7702 de B. anthracis Sterne se realizaron usando precauciones BSL-2
apropiadas. B. anthracis Ames se obtuvo a travs de la NIH Biodefense y las
infecciones emergentes Research Resources Repository, NIAID, NIH: Bacillus
anthracis, Strain Ames (A0462), NR-411. El stock original se cultiv en placas de
agar de capsulacin (CAP) (0,3% de extracto de levadura, 0,8% de caldo
nutriente, 1,5% de agar, 5% de suero de caballo y 0,8% de bicarbonato de sodio)
durante una noche a 37C, CO2 al 5% Aislar los organismos fenotpicamente
encapsulados. Las esporas de cepa de Ames se prepararon sobre agarres de agar
como se describi previamente [14], y se prepararon bacilos frescos de placas de
agar CAP. Todos los experimentos con la cepa B. anthracis Ames se realizaron
bajo las precauciones BLS-3 en un laboratorio aprobado por Select Agents
siguiendo las directrices establecidas por los Centros para el Control y Prevencin
de Enfermedades, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y el
Comit Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Virginia.

Ensayos antimicrobianos

Para la determinacin de CFU y el anlisis de Alamar Blue, se aadieron esporas

(0,4 - 1 106 total) o bacilos (0,4 - 3 105 total) al medio esencial modificado de
Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal
al 10% (Hyclone, Logan, UT, USA) y que contena 48 g / ml de CXCL9, CXCL10,
CXCL11, CCL2, o CCL5 recombinante murino o humano (Peprotech, Rocky Hill,
NJ, EE.UU.) estabilizado con albmina de suero humano al 0,3% (ZLB Bioplasma
AG, Berna, Suiza), o un volumen igual de albmina sola (control sin tratar); Se
usaron quimiocinas murinas recombinantes a menos que se especifique lo
contrario. Los anlisis de punto final se realizaron 6 h post-tratamiento (despus
de la germinacin de esporas y / o crecimiento vegetativo, pero antes de
crecimiento bacteriano en muestras no tratadas) como se describe anteriormente
[22].

Modelo animal

Se obtuvieron ratones C57BL / 6 de tipo salvaje, as como animales CXCL10 - / - y

CXCR3 - / - de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU.). Neutralizacin
mediada por anticuerpos de CXCL9, CXCL10, CXCL11, y CXCR3 se logr
utilizando protocolos publicados [23, 24]. Brevemente, se administraron ratones
C57BL / 6 (hembras, de 6-8 semanas de edad) i.p. Inyecciones de suero de cabra
contra CXCL9 recombinante, CXCL10 o CXCL11 (R & D Systems, Minneapolis,
MN, EE.UU.) o un pptido que constituye el trmino NH2 de CXCR3 murino; Los
animales de control recibieron un volumen igual de suero de cabra normal de
rebao donante (SeraCare Life Sciences, Milford, MA, EE.UU.). La neutralizacin
se inici 24 horas antes de la estimulacin de esporas, y se realiz diariamente a
lo largo del periodo de estudio (20 d). Para la neutralizacin de un solo ligando o
receptor, los animales recibieron aproximadamente 6 mg de IgG de cabra total
diariamente; Para la neutralizacin de mltiples ligandos, los animales recibieron
cantidades iguales de los sueros neutralizantes indicados, aproximadamente 15
mg de IgG total. Anticuerpo capacidad de neutralizacin y la selectividad se han
descrito anteriormente [23]. Los desafos de esporas intranasales de B. anthracis
se realizaron despus de sedacin con ketamina / xilazina (60/6 mg / kg de peso
corporal, i.p.). Se colocaron gota a gota veinte microlitros de suspensin de
esporas (1-6 107 esporas totales) sobre las fosas nasales de los ratones, y los
animales se mantuvieron en posicin vertical hasta que la respiracin volvi a la
normalidad. Los animales fueron monitoreados para detectar signos de
enfermedad segn un sistema de puntuacin aprobado por el IACUC teniendo en
cuenta el nivel de actividad, la postura y la respiracin; Animales sacrificados
moribundos fueron eutanasiados con una sobredosis de ketamina.

Determinacin de UFC de tejidos

Todos los tejidos usados en la determinacin de CFU se cosecharon despus de

la eutanasia y se homogeneizaron a mano sobre hielo en PBS estril. Las
diluciones de la muestra se prepararon por duplicado, y posteriormente se
plaquearon en agar BHI (Remel, Lenexa, KS, USA); Las placas de muestra se
incubaron durante la noche a temperatura ambiente antes de la enumeracin de
colonias. Todas las muestras de tejido se sembraron tratamiento trmico a 65
C durante 30 minutos para distinguir entre esporas y formas vegetativas de B.
anthracis.

Imgenes bioluminiscentes

Se adquirieron imgenes de ratones estimulados con esporas y seales

luminescentes utilizando el espectro de sistema de imgenes in vivo (IVIS)
(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EE.UU.). Para la obtencin de imgenes,
los ratones se anestesiaron con isofluorano al 2,5% mezclado con oxgeno y se
suministraron mediante el sistema de anestesia de gas XGI-8 suministrado con el
IVIS Spectrum. Las imgenes fueron adquiridas de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante, y la emisin de fotones de animales vivos se
analiz utilizando el software Living Image 2.5.

Deteccin y cuantificacin de LF
La toxina de ntrax funcional LF se midi en sueros animales preparados a partir
de sangre completa recogida mediante puncin cardiaca. La cuantificacin se
bas en la matriz de asistida por lser de desorcin / ionizacin (MALDI) de tiempo
de vuelo (TOF) espectrometra de masas (MS) como se describe anteriormente
[30]. En resumen, se us MALDI-TOF MS para detectar productos peptdicos
especficos generados despus de la escisin mediada por LF de un sustrato
peptdico sinttico; Las concentraciones de LF se determinaron posteriormente
mediante MS de dilucin isotpica.

Anlisis estadstico
Las diferencias significativas entre los grupos de tratamiento in vitro se
determinaron usando ANOVA unidireccional con una prueba de comparacin
mltiple de Bonferroni; Logartmica (log10) transformacin de CFU valores se
realiz antes de la evaluacin estadstica. Los valores de concentracin efectiva
mxima (EC50) informados se determinaron utilizando la ecuacin sigmoidal
dosis-respuesta de regresin no lineal y se presentan como un intervalo de
confianza de EC50 95%. Se determinaron diferencias significativas en los
recuentos de bacterias y concentraciones de LF entre grupos de tratamiento con
animales usando la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney para datos no
paramtricos. La supervivencia del husped se analiz de acuerdo con el mtodo
del lmite del producto Kaplan-Meier; Las comparaciones par-wise se hicieron
usando la prueba log-rank.

Referencias
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innata y adaptativa. J Invest Dermatol. 2005; 125: 615 - 628. [PubMed]
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