Clase n 4: Tecnologa del DNA

Se conocern tcnicas que han permitido estudiar la molcula del DNA. Son las
tcnicas bsicas, la importancia de ellas en niveles clnicos. Las tcnicas del
DNA si utilizan para:

Detectar mutaciones en el DNA responsables de enfermedades: La

tecnologa del DNA se ocupa para buscar mutaciones en el material
gentico. Cuando se descubre una nueva patologa se estudia el gen que
codifica para cierta protena o que no est codificando una cierta
protena.

Ciencia Forense: en investigacin. Identificacin, se basa en el estudio

de las paternidades.

Creacin de frmacos: muchos de los genes que se pueden aislar por la

tecnologa del DNA, si se asla y se logra expresar en un sistema a
mayor escala, este producto celular se convierte en un frmaco. Ej:
Aislar o clonar el gen de la insulina, factores de crecimiento, disolventes
de cogulos.

Estudio: generalmente se desarrolla en universidades y luego cuando va

creciendo y se van obteniendo resultados llega a un nivel clnico. Se
desarrolla en universidades, en el rea de las ciencias bsicas, dado que
posee un alto costo el desarrollar las tcnicas.

1. Tcnicas bsicas del anlisis del DNA

2. Aislamiento y produccin de secuencias de DNA por clonaje y PCR
3. Aplicacin a ingeniera gentica.

Endonucleasas de restriccin

La primera herramienta bsica que se utiliz para el estudio del DNA y

que permiti el desarrollo de la tecnologa del DNA fueron enzimas que
se denominan endonucleasas de restriccin. Endonucleasas quiere decir
que son capaces de cortar una hebra de DNA en el interior. (Las
exonucleasas son las que se van comiendo el DNA). Estas
endonuclaseas se utilizan para cortar la molcula del DNA, dado sta es
enorme y por lo tanto es mucho ms fcil trabajar con fragmentos y se
puede controlar esos fragmentos porque sabemos que secuencias
vamos a cortar.
Las endonucleasas de restriccin se caracterizan porque son
endonucleasas que cortan secuencias especficas de DNA. Por eso estn
restringidas a una secuencia especfica que la endonucleasa reconoce
y corta ambas hebras del DNA
 Estas enzimas se descubrieron en las bacterias. En estas existen estas
enzimas y estn presentes como mecanismo de defensa a la invasin de
un genoma extrao. En las bacterias no es poco frecuente que las
bacterias que se mueren o que se lisan viertan el contenido de DNA, y
parte de este DNA entre por un complejo, por un poro de membrana, a
otra bacteria. Esa bacteria se defiende de esta invasin de un DNA
extrao teniendo estas enzimas de restriccin. La estrategia que ocupa
la bacteria es que las endonucleasas cortan secuencias del DNA extrao
y lo degradan, pero que su propio DNA no tiene; por eso que las enzimas
de restriccin que estn en una determinada especie celular es porque
su propio genoma no posee ese sitio de corte.
De ah viene la nomenclatura de endonucleasas.
- ECO RI, es de escherichia coli
- HAE III, Haemophilus aegyptius: por lo tanto sabemos que el genoma
de esta bacteria no posee la secuencia que la endonucleasa
corta.

De esta forma se descubrieron, aislaron y se visualizaron como una

herramienta importante para poder estudiar el DNA. Como el corte es a
nivel de una secuencia especfica, es un corte que va a ser igual
siempre. Se puede controlar y se conoce lo que se va a cortar, no es al
azar.
Las endonucleasas se clasifican en dos tipos, de acuerdo al tipo de
extremo que dejan cuando cortan el DNA

- Extremos cohesivos o escalonados: en donde cada extremo posee

un pequeo fragmento de DNA de hebra sencilla.

- Extremos romos: las endonucleasas cortan a la misma altura, las

secuencias estn a la misma altura del sitio de corte.

Las secuencias palindrmicas son secuencias que se leen exactamente

igual de 5 a 3 y de 3 a 5.
 Los sitios de restriccin son caractersticos de una molcula de DNA.
Para una determinada hebra de DNA van a existir diversos sitios de
corte, con enzimas de restriccin distintas. Los fragmentos, que son el
resultado del corte por enzimas de restriccin se pueden analizar por
ELECTROFORESIS.

Electroforesis en gel de Acarosa

La electroforesis por DNA tiene el mismo principio que la electroforesis

de protenas, separa por tamao, en donde los fragmentos ms grandes
van a avanzar ms, y los fragmentos ms chiquititos van a avanzar
menos.
El DNA como molcula es un polianin, tiene cargas negativas por los
muchos grupos fosfatos que posee, por lo tanto no es necesario hacer el
tratamiento con SDS que se le hace a las protenas.
Respecto al gel que se ocupa, se utiliza un polmero distintos que la
agarosa (las protenas se hacan con del de poliacrilamida) y se separa
en un campo elctrico y as se separan los fragmentos generados por la
enzima de restriccin por tamao.
De igual forma, si se tiene un patrn de pesos moleculares, que en la
figura se expresan como pares de bases, se puede determinar el
tamao del fragmento. Por otra parte, si se tiene al lado un patrn de
fragmentos con pesos conocidos, por comparacin, se puede determinar
el tamao de los fragmentos en estudio.
Si ese mismo DNA se somete a otra enzima de restriccin el patrn de
bandas que se obtendr ser distinto. Y cada vez que se someta el DNA
a una misma enzima de restriccin se obtendr el mismo patrn de
banda.
Refirindose a la imagen azul: En la electroforesis hay una etapa de
tincin donde se tie con un colorante especfico que puede ser
fluorecente, que tia mi DNA. En esta imagen podemos apreciar una
electroforesis que se ha hecho con un patrn doble, se pueden realizar
patrones simples y patrones dobles. Luego este DNA teido con
fluorocromos se observan con la luz de una lmpara y se aprecian las
bandas.
Los fragmentos ahora se pueden someter a una secuenciacin.
Secuenciacin

Los fragmentos de DNA se pueden someter a una secuenciacin, este es

un proceso que se ocupa para conocer la secuencia nucleotdica de los
fragmentos.

Este estudio se realiza cuando se quieren investigar presencia de

mutaciones. Cuando se sospecha que la causa de una patologa es una
protena mutada el gen que codifica para esta protena se puede aislar y
una vez que se asla se debe secuenciar. Para demostrar que el paciente
posee una patologa se ocupa la secuencia del gen de esa protena de un
paciente control o sano, de esta forma se comparan ambas secuencias y
queda demostrada la presencia de una protena mutada.

La secuenciacin se basa en la incorporacin de nucletidos durante el

proceso de replicacin. Se utiliza un nucletido modificado que es un di-
desoxinucletido.

Los di-desoxinucletidostrifosfato, que son los sustratos que ocupa la

DNA polimerasa durante el proceso de replicacin tienen un extremo OH
que es fundamental para que la polimerasa le una el nucletido que
sigue de acuerdo a una secuencia molde sobre la que se esta replicando.
Sobre este grupo OH que esta en el carbono 3 de la desoxirribosa se
forma el enlace fosfodister. Si se agrega en el proceso de replicacin,
donde tengo un molde de DNA y la DNA polimerasa un
didesoxinucletidostrifosfato que no tiene este grupo OH, va a poder
agregar este nucletido modificado a la cadena, sin embargo, como este
 no tiene el grupo OH (grupo funcional necesario para poder agregar otro
nucletido a la cadena) no puede.

Dicho de mejor manera: El mtodo dideoxi de secuenciacin ideado por

Sanger est basado en el empleo de didesoxinucletidos que carecen de
uno de los grupos hidroxilo, de manera que cuando uno de estos
nucletidos se incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, est
cadena no puede continuar elongndose ya que la ADN polimerasa
necesita un extremo 3 OH para aadir el siguiente nucletido y el
desosinucletido incorporado carece de este grupo hidroxilo.

Por lo tanto, la DNA pol al incorporar el nucletido modificado, para la

sntesis de ese fragmento.

Qu es lo que se hace?

Antes de entrar en el procedimiento en s, debemos saber cmo se prepara

el estudio:

- Se tiene un fragmento de DNA que se quiere secuenciar. Se toma uno de

los fragmentos obtenidos por electroforesis, se toma el pedacito del gel
y se corta con un bistur, hay millones de molculas de DNA en ese
pedacito, pero son todas iguales.
- La secuenciacin se basa en el proceso de replicacin. Se desnatura el
DNA, se generan los moldes y en un tubito se pone un pequeo primer,
porque la DNA polimerasa siempre necesita un primer, el cual tiene
secuencias cortitas que se hacen al azar, dado que no se sabe la
secuencia del DNA a analizar, pero cualquier combinacin de 4
nucletidos lo ms probable es que lo ocupe rpidamente y encuentre su
secuencia complementaria.
- Esta tcnica se basa en la fe de que el primer se vaya a unir lo ms al
extremo posible. Si se obtiene una secuencia con muchos nucletidos
menos de lo que s pesa el fragmento de DNA se ensaya con otro primer
distinto, de manera que quede lo ms en el extremo posible.
- Ese primer va a reconocer su secuencia complementaria y se va a unir.
Se tiene en un tubito: DNA polimerasas, magnesio y nucletidos
normales y en ese mezcla se pondr en una proporcin mucho menor a
la de los nucletidos normales los didesoxinucletidos trifosfato.
 - De esta manera de esas millones de molculas de DNA, que las
polimerasas van a partir replicando en una porcin baja de ellas se va a
ir incorporando al azar por ejemplo la didesoxiadenida y la sntesis de
esa cadena replicada va a parar.
- El primer lleva una marca (de radioistopo o de fluorocromo), de manera
de que si separo las hebras y lo analizo nuevamente en una
electroforesis lo nico que voy a ver son esos fragmentos porque tienen
la marca del primer.

Procedimiento

1) Se divide y se montan cuatro tubitos distintos, cada uno de ellos con el

DNA desnaturalizado que se va a secuenciar, DNA polimerasa, todos los
nucletidos trifosfatos (a,t,g,c) y en una pequea proporcin, en un
tubito se agregar ddTTP, en el otro ddATP, en el tercero ddCTP y en el
cuarto ddGTP.
2) Se deja que la DNA pol. replique. La polimerasa incorpora por ejemplo
ddATP, en todas las posiciones en que la adenina es una base
complementaria, todo el protocolo est diseado para que el
didesoxinucletido pueda marcar la posicin de adenina en todo ese
fragmento de DNA, por lo tanto la secuencia y las posiciones de la
adeninda van a estar dado por el largo de los fragmentos que se
generen en el tubito que tenia la ddATP. (Por este sistema, en cada
mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de ADN de
nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo
nucletido y marcadas todas radiactivamente por el primer)
3) Se lleva esto a electroforesis y se analizan los resultados. Lo nico que
se ven son los fragmentos generados con el primer que poseen una
longitud en particular.
4) El gel que se ocupa es poliacrilamida, este separa de mejor forma los
fragmentos cortos que difieren en nucletidos.
5) Se debe hacer la lectura de secuencia. Esta se hace analizando el
fragmento que migr ms, este que migr ms posee un primer ms un
nucletido y podemos saber cul es cuando vemos en qu tubito
estamos viendo esto. Se lee desde abajo hacia arriba, es un orden
creciente de tamao. Se est leyendo de 5 a 3 dado que se esta
leyendo de la forma en que replic la polimerasa.
 - Automatizacin de la secuenciacin

El Boom se produjo con el Proyecto del Genoma Humano, este proceso se hace
computarizado.
Se basa en lo mismo, la diferencia es que lo que tiene la marca es el didesoxi,
pueden estar marcados con fluorescencia y la marca se va leyendo con un
computador que va entregando pics de fluorescencia, segn el color del pic
que se entregue, uno podr determinar el nucletido. El DNA debe estar muy
puro.

Hibridacin

Es una caracterstica del DNA. Tiene que ver con la complementariedad de

bases. Si la doble hebra en un tubo se desnatura, por T o pH y luego se vuelve
lentamente a las condiciones ptimas de renaturalizacin, se reconocen las
hebras complementarias. A esta propiedad de las dobles hebras se denomina
hibridacin. Esto ocurre entre DNA/DNA, DNA/RNA, RNA/RNA.

*Los colores difieren porque son 4 cadenas distintas, con secuencias

diferentes.
Las condiciones de reconocimiento se pueden controlar en el laboratorio. Estas
pueden ser poco restrictivas o muy restrictivas.

- Condiciones que son poco restrictivas: esto quiere decir que al

renaturalizarse una cadena de DNA se puede hibridar pero la cadena con
la que se reconoce no va a ser 100% complementaria. (T bajas).
- Condiciones muy restrictivas: la unin de cadenas va a ser 100%
complementaria. (T altas)

Hibridacin In situ

La hibridacin del DNA, esta propiedad, se puede utilizar para realizar ciertas
tcnicas como la hibridacin In situ. En esta tcnica se hibrida a travs de
sondas. Las sondas son las hebras de DNA, que pueden ser de DNAds, RNAss,
RNAds y RNAss (se mandan a hacer). Se denominan sondas porque son los
pedacitos que se utilizarn para reconocer una secuencia especfica, estos
pedacitos estas marcados con fluorescencia o radioactividad.

Ej. : Las sondas se pueden ocupar para la localizacin de genes en un

cromosoma, como el gen de la insulina. Se construye una sonda especfica
para el gen de la insulina. Los cromosomas, preferentemente mitticos, se
tratan con un tratamiento desnaturante lo suficientemente fuerte o dbil para
que se relaje la estructura del cromosoma pero este no se me desarme. Se
incuba el cromosoma con la sonda, que est en altas concentraciones y que
compite con la hebra complementaria normal y sta logra intercalarse dentro
de la estructura. De esta forma se busca la localizacin del gen, al extremo de
uno de los brazos, al medio, etc.

Ej. : Se puede localizar tambin RNA. Se determina la localizacin de un RNAm

de la protena delta C. El RNAm se ocupa para determinar la expresin del gen
de la protena en clulas, dado que el gen est en todas las clulas, pero se
expresa solo en algunas. Hay un patrn de expresin.

Dado que la protena delta C est relacionada con la diferenciacin neuronal,

cuando se utiliza esta tcnica en por ejemplo embriones de peces cebra, se
estar buscando dnde se formar el tronco neuronal. Se determina donde se
expresa esa protena.
Southern Blot

Inicialmente se digiere el ADN que queremos estudiar con una o ms encimas

de restriccin, las cuales cortan en puntos especficos de la secuencia,
generando fragmentos de varios tamaos. Seguidamente, estos fragmentos se
separan por su tamao en un gel de agaroza empleando corriente elctrica y
luego se transfieren a una membrana de nitrocelulosa. Para la deteccin del
fragmento de inters en la membrana, utilizamos otro fragmento de ADN o
ARN que se llama sonda y que contiene la secuencia complementaria al
fragmento que queremos identificar. La sonda, se marca con un istopo
radiactivo, se agrega a una solucin y se incuba con la membrana por varias
horas. Este hibridizacin, hace que la sonda se adhiera la fragmento de ADN en
la membrana el cual contiene las bases complementarias. Al exponer la
membrana a una pelcula de fotografa, podemos identificar el fragmento y
establecer as si est o no est contenido en el ADN que estamos estudiando.
Las condiciones restrictivas ocupadas son altsimas.

Se ocupa por ejemplo para detectar el gen de una protena en otra especie. Yo
tengo mi secuencia de genes de una protena de erizo, pero quiero saber si ese
patrn de genes est en otra especie, para eso ocupo el southern blot.
Ej. : Deteccin de anemia falciforme. Esta enfermedad se debe a la mutacin
de una protena. Se toma sangre de tres pacientes distintos y se utilizan dos
sondas, una con la secuencia complementaria del gen normal, y otra con la
secuencia complementaria del gen mutante. Condiciones restrictivas altsimas.
1: homocigoto para el gen normal. 2: homocigoto para el gen mutante. 3:
heterocigoto para el gen mutante y el gen sano.
 - Paralelo entre Southern, Wester, Northern:

Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR

(Amplificacin in vitro del DNA)

El objetivo principal del PCR es amplificar una cadena de DNA. Amplificar

significa hacer muchas copias de esa secuencia especfica. Un requisito
fundamental del PCR es que se debe conocer en parte la secuencia que se
desea amplificar.

Los requisitos prcticos, es decir los ingredientes para hacer este estudio son:

- Templado
- dNTPSs
- Oligonucletidos
- Cebadores, primer
- DNA polimerasa termoestable
- Catin divalente, magnesio

Se basar en la replicacin para amplificar muchas secuencias de DNA. Esta

tcnica utiliza distintas temperaturas como agente desnaturante del DNA, para
poder abrir la doble hebra y poder hacer la copia de lo que se quiere amplificar.

El requisito de conocer la secuencia de parte del DNA que se quiere amplificar,

es porque a travs del diseo de los primers o cebadores se va a delimitar lo
que se quiere amplificar. En una doble hebra del DNA se coloca un primer y se
dice: desde esta regin quiero amplificar hasta la posicin del DNA donde se
pone el primer para la otra hebra. Se ponen en direcciones contrarias porque
van en direcciones anti-paralelas. Por eso se debe saber en parte de la
secuencia del DNA.

Esto se puede hacer con el objetivo de aislar un gen completo, donde se tiene
la parte final, la parte inicial y se obtendrn muchas copias de ese gen. La
ventaja que se tiene es que como se basa en la amplificacin a travs de
primer especficos que se van a unir por hibridacin solo una secuencia del
DNA, no se necesita cortar el DNA ni separarla del resto.

Etapas del PCR

Varan porque se va variando la temperatura. Esta tcnica se desarrolla gracias

al descubrimiento de esta enzima polimerasa termoestable que no se
desnaturaliza con los cambios te temperatura. Fue aislada del termofilus
acuaticos que vive en las cercanas de los gaysers. Toda la maquinaria de estas
bacterias puede resistir altas temperaturas y la enzima tiene una actividad
cataltica ptima a 72.
Cada ciclo de la amplificacin esta constituido por tres etapas y los ciclos se
repiten muchas veces. Es un mecanismo in vitro donde se tiene el DNA blanco,
que es el que quiero amplificar, se tienen los primers y de esta manera se
puede iniciar un ciclo.

1) Desnaturacin del DNA:

A 95 C se desnaturaliza el DNA, se separan las dos hebras y se tienen
las hebras de DNA sencillas que van a servir como molde.
2) Hibridacin de los primers:
A 55-65C se produce la hibridacin de los primers, que estn a una alta
concentracin. A esta temperatura se asegura que ms del 50% de mis
hebras del DNA han reconocido al primer que se dise. Hay un primer
forward y un primer reverse.
3) Polimerizacin:
A los 72C la DNA polimerasa con todos los nucletidos que puede
tomar, parte del primer sintetizando. Replica entonces, desde el principio
del primer, hasta el final del cromosoma.

El ciclo se vuelve a repetir:

Al final empiezan a aparecer fragmentos del DNA que tienen el tamao exacto
de las posiciones donde yo puse los primers. Siempre van a quedar pedacitos
del DNA que son ms largos que la secuencia que se desea amplificar, sin
embargo luego de 30 ciclos se produce una amplificacin de 2 elevado a 30
veces de la molcula original en donde el 99,8% de las bandas son las del gen
aislado y la cantidad de las otras es despreciable.

- Murris, que es la persona que invent este estudio lo realizaba con

baos termorregulados, sin embargo despus de un tiempo se invent
un instrumento que se denomina un termociclador, en el cual se
 programan los ciclos que duran app. 3 minutos. Entre una hora y hora y
media se tienen amplificados los genes que se queran.

Amplificacin de RNA

Tambin se pueden amplificar RNA como el mensajero. Sin la amplificacin se

corre el riesgo, de cuando se quiere detectar una molcula de RNAm, la tasa de
RNAm es tan baja que no se logre ver ese RNAm y se produce as un falso
negativo. Es negativo porque la cantidad es tan baja que no se puede detectar,
pero no porque no se detecte significa que no se est expresando. Para evitar
este tipo de errores se ocupa PCR.

- Se asla el RNA mensajero, y a esta molcula la transformo en una hebra

que se denomina complementaria. Antes de hacer la amplificacin por
PCR se hace uso de una transcriptasa inversa que sintetiza la hebra de
DNA complementaria a la del RNA (ocupa el RNA como molde). El primer
que se utiliza est diseado para amplificar especficamente los RNA
mensajeros de los genes de la protena que yo quiero amplificar.
- Luego la hebra complementaria, que es hbrida, ya que est conformada
por RNA y DNA se trata con una enzima especfica que degrada el RNA y
luego se agrega el segundo primer y la polimerasa sintetiza la hebra
complementaria a la del DNA.
- Una vez que se obtiene el amplificado se observa en una electroforesis.
Como se conoce el gen que se quiere amplificar, al llevarlo a
electroforesis, el amplificado debera tener la misma cantidad de
nucletidos.
- En un caso especial, si en la electroforesis no se obtiene una sola franja,
se entiende que el primer no era lo suficientemente especfico. Hay dos
formas de solucionar esto; cambiar el primer o aumentar las condiciones
restrictivas. Para poder reafirmar que lo que se amplific es
verdaderamente el gen que yo quera aislar, se debe secuenciar.

- Deteccin de RNA viral por PCR

Para detectar el SIDA se ocupa un mtodo serolgico, en el cual se utilizan

anticuerpos anti-sida. Hoy en da se verifican los resultados con PCR. De
acuerdo a la viremia, tambin se puede detectar la respuesta del paciente a los
tratamientos, lo cual no se puede hacer con una prueba serolgica.