Universidad de Guadalajara martes, 16 de febrero de 2016

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Nombre Cdigo
Aniela J. Rosales Borrayo 213495793

INDICACIONES
Realice una bsqueda en la bibliografa acerca del modelo murino Thy-1 Crh-2 YFP.

1. Desarrolle un ensayo acerca de cmo funciona este modelo neuroanatmica y

molecularmente.

2. Comprelo con otros modelos semejantes.

3. Indique sus ventajas y desventajas con respecto a tcnicas inmunofluorescentes

regulares

Realice una bsqueda en la bibliografa acerca de la tcnica de Clarity.

1. Desarrolle un ensayo acerca de la metodologa para realizar esta tcnica.

2. Comprela con otras tcnicas semejantes.

3. Indique sus ventajas y desventajas con respecto a tcnicas inmunofluorescentes

regulares

MODELO MURINO THY1-CHR2-EYFP

El promotor Thy1 es un antgeno precursor de las clulas T en el timo, presente en los
timocitos murinos. La canalrodopsina-2 (ChR2) es una protena que acta como un
interruptor neuronal ya que, al ser administrada al cerebro, se aloja en la membrana
celular, y esta (al ser sensible a la luz), cuando es expuesta a una luminiscencia
despolariza la membrana (abrindola) permitiendo el paso de partculas. La EYFP
(Enhanced Yellow Fluorescent Protein) es un gen mutante de la protena verde
fluorescente (GFP), la EYFP es una de las ms usadas debido a sus caractersticas
fluorescentes (una de las ms brillantes protenas) y sus tiles propiedades para la
microscopa fluorescente.

El Thy1-ChR2-EYFP es inyectado al genoma del ratn. Con estos ratones transgnicos

es posible realizar diferentes estudios morfolgicos como la optogentica, en la que se
puede controlar la activacin de las clulas exponindolas a la luz azul, mediante el
interruptor ChR2. Con este estudio es posible controlar clulas cerebrales especficas
del ratn, como sus movimientos. La canalrodopsina-2 est adherida con la protena
amarilla fluorescente, para hacer visible los circuitos neuronales y los tipos celulares.
Estas protenas estn bajo el control del antgeno (Thy1).

Existen diferentes modelos similares al Thy1-ChR2-EYFP como el Omp-ChR2-EYFP. La

cual usa el promotor Omp, que es una protena asociada nicamente a las neuronas
receptoras olfativas. El ratn responder a los estmulos de olor.

Otro modelo similar sera el Vglut2-ChR2-YFP, donde el Vglut2 es un transportador de

glutamato vesicular que se encuentra en las neuronas de la regin locomotora de la
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mdula espinal. Cuando se activa el ChR2, se crea una fotoestimulacin de las

neuronas glutamatrgicas, que son las que generan y controlan las actividades rtmicas
que se generan en el aparato locomotor.

El modelo Thy1-ChR2-EYFP tiene un parecido con las tcnicas inmunofluorescentes,

debido al uso de las protenas fluorescentes, pero aun as este modelo tiene sus
ventajas y desventajas con respecto a esas tcnicas. Una de las ventajas podra ser
que con el modelo murino no es necesario fijar la muestra y permear la membrana
para permitir la penetracin de anticuerpos y con este modelo es posible etiquetar la
totalidad de la morfologa de algunas neuronas, como los axones y de las
terminaciones nerviosas. Las desventajas podran ser que son sensibles a los iones de
cloruro, y que en las tcnicas fluorescentes se pueden obtener resultados ms rpidos
puesto que para el modelo murino se necesita primero activar la protena ChR2.

BIBILIOGRAFA
http://www.technologyreview.es/biomedicina/35560/una-tecnica-para-recuperar-la-
vista/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3433654/

http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/fpintro.html

https://www.jax.org/strain/007612

CLARITY
Clarity es un mtodo creado por Karl Deisseroth y colegas de la Universidad de
Stanford, con el cual es posible extraer los lpidos del cerebro u otros rganos a partir
de una tcnica de limpieza, lo que causara que los rganos se vuelvan estructuras
transparentes, ya que los lpidos son los que les dan color. A partir de esto, el rgano
puede ser inducido a tcnicas de tincin para localizar estructuras especficas, clulas,
conectividades, etc. Debido a la prdida de las membranas celulares es posible
visualizar cada clula, su estructura y sus componentes.

Para llegar a estos resultados se tiene que seguir una serie de pasos. Primeramente,
hay que exponer el rgano a una temperatura de 4C (hasta que se enfre) y
sumergirlo en formaldehido sobre una infusin de monmeros de hidrogel. El hidrogel y
las biomolculas se hibridan despus de haber incrementado la temperatura a 37C en
un lapso de 3 horas. El formaldehido facilitar la unin de las protenas y cidos
nucleicos a la estructura de hidrogel hbrido. Durante este proceso las nicas
biomolculas que no se adjuntan son los lpidos por lo que podremos extraerlos para
as obtener un rgano pticamente transparente. Para esto aplicamos un campo
elctrico (electroforesis) al tejido, el cual va a estar sumergido a una solucin de
detergente inico (dodecilsulfato sdico [SDS]), estos campos acelerarn el transporte
del detergente para que llegue ms rpido a los lpidos, los cuales sern disueltos para
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luego ser extrados, esto dura entre 5 a 8 das. Terminando este proceso obtenemos un
rgano completamente clarificado, en donde todas sus estructuras se mantienen en su
lugar.

A pesar de ser una tcnica nueva, existen otras ya parecidas que usan las mismas
tcnicas, pero para otros fines, como lo es la tcnica de electroforesis en gel de
poliacrilamida, que es usada para la separacin de biomolculas a travs de un campo
elctrico dependiendo de su carga, peso y estructura. Esta tcnica tambin hace uso
del detergente dodecilsulfato de sodio, pero para analizar el peso molecular de
protenas, adems de identificarlas y monitorearlas. A diferencia del Clarity, en esta
tcnica se tiene que hacer el gel, en donde se le va a implementar el campo elctrico
para separar las biomolculas que le fueron aadidas.

La tcnica Clarity usa la Yellow Fluorescent Protein (YFP) a diferencia de las tcnicas
inmunofluorescentes (IF) regulares que hacen uso de la Green Fluorescent Protein
(GFP). Las ventajas de usar clarity es que slo tiene un 8% de prdida de protenas
celulares, pero mantiene las estructuras. Tambin que al no tener bicapa lipdica hace a
la membrana permeable, por lo que permite el paso de sondas moleculares y as los
anticuerpos localicen a sus antgenos con mayor facilidad, a diferencia de las IF que
hay que poner en un portaobjetos el antgeno donde se le tiene que unir un anticuerpo
especfico, luego se le aade un suero anti-inmunoglobulina humana la cual est unida
con una molcula fluorescente y finalmente hay que esperar a que esta molcula se
una al anticuerpo especfico . Adems, no es necesario que el rgano este recin
sacado del cuerpo, tambin se puede aplicar Clarity a rganos que han sido guardados
desde hace mucho tiempo (pero mantenidos en buen estado) y es aplicable a muchos
tipos de tejidos y rganos de cualquier tamao. Pero como cualquier cosa, Clarity tiene
sus desventajas a comparacin de las IF; como el que esta tcnica es un proceso con
varios pasos y que se lleva a cabo durante varios das, las IF son al momento los
resultados; tambin el aplicarle tcnicas de inmunotincin a rganos o tejidos ms
gruesos requiere de mucho tiempo y el costo de los materiales es alto.

BIBLIOGRAFA
Clarity for mapping the nervous system, Kwanghun Chung y Karl Deisseroth. Junio
2013, Nature Methods 10, 508-513.

Structural and molecular interrogation of intact biological systems, Kwanghun Chung,

Janelle Wallace, Sung-Yon Kim, Sandhiya Kalyanasundaram, Aaron S. Andalman,
Thomas J. Davidson, Julie J. Mirzabejov, Kelly A. Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra K.
Denisin, Sally Pak, Hannah Bernstein, Charu Ramakrishnan, Loagan Grosenick, Viviana
Gradinaru y Karla Deisseroth. Marzo 2013, Nature.

http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-bioq-gen/archivos/Lomonte%20-
%20Cap13%20PAGE.pdf

http://exa.unne.edu.ar/bioquimica/inmunoclinica/documentos/Laboratorio_TPN8.pdf