CAPITULO La estetra de ua protein determina faci liga, tant ise ure 2 fecilada lo, camo se muesta en la fiw, escape de a proteins completamente (lustacén de Iving Geis, Imagen de ection Howard Hy HMI Repeducié slo autrizcién.) Funci6n de las proteinas: mioglobina y hemoglobina 1. Mioglobina 3. Cooperacién A, Estate def miglbina ‘A. Mecanismo de coperacion en la hemugloina Fanci de a micgoina B, Ptenasabstricas 2. Hemoglobina 4, Hemoglobinas anémalas A. Esiuctura dela hemeglobing BL Unién del ongeo ala hemopobina182 Figura 7-1. Estructura de ia lopotina de cackaloe, Esta proteina monomérica de 153 resduos ext formada or ocho héles a, rtuadas de A aH, conectadas por uniones polipepiicas coras (la dime mitad de lo que se pensdorignalmente como la equine EF se derostré que forma una hice cor desgnadahélice FE grupo eno se muestra en rj, (lustacin, Ing Geis. Imagen de Inving Geis Collectionoward Hughes Medical Institue Derechos perteecintes a HHMI, Reproducién sii con autrizacion) 62 Vase ojricio 6-1 de Kiemages. Capitulo 7 Funcién de ls protenas: mioglobina y hemoglobina En los dos capitulos precedentes se ilustré un panorama amplio de las pro- piiedades fisicas y quimicas de las proteinas pero no se profundizs en las propie~ dades fisioldgicas. Sin embargo, no deberia sorprendemnos que la complejidad estructural y la variedad de las protefnas les permita desempefiar un espectro enorme de iareas biol6gicas especializadas. Por ejemplo, la catlisis enzimitica de Virtualmente todas las reacciones metabslicas se realiza por proteinas (trata- ‘emos las enzimas en detalle en los caps. 11 y 12). La informacién genética que~ darfa encerrada en el DNA sino fuera por las protefnas que participan en la de~ codificacién y Ia transmisién de esa informacién. Sorprendentemente, los miles de proteinas que pattcipan en la construccién, la estructura, el reconocimiento, el transporte y la transformacién de componentes celulares actian con velocidad ¥y exacttud inerefbles, y en muchos casos estén sujetos a numerosos mecanismos, ‘de regulacién, Las funciones especializadas de las proteinas, desde las protefnas fibrosas que estudiamos en la seccién 6-IC hasta las enzimas metabdlicas que regulan con presicién que trataremos en capitulos posteriores, pueden comprenderse al tomar en cuenta emo estas protefnas se unen e interactian con otros componentes de Jos sistemas vivientes. En este capitulo nos centraremos en las protejnas que ‘gan oxigeno, la mioglobina y la hemoglobina, Sus estructuras pueden estudiarse ‘como ejemplos de los principios destacados en los capitulos precedentes. Tanto la mioglobina como la hemoglobina son proteinas globulares cuyas estructuras, primarias, secundarias y terciaria (y estructura cuatemaria en el caso de la he- ‘moglobina) se conocen en detalle. Sus funciones son de importancia vital en Ia salud humana, Lo mas importante es que sirven como modelos ilustrativos de las relaciones variadas entre la estructura de la proteina y su funciGn, Los estudios, de la mioglobina y la hemoglobina representan algunos de los avances en Bio- quimica hist6ricamente més significativos y estas proteinas mantuvieron su po- siciGn como modelos valiosos para muchas de las protefnas que veremos cuando estudiemos el metabolismo y el manejo de la informacién genética, fl. Mioglobina ‘Nuestro estudio de la funcién proteica comienza con la mioglobina, la pri- mera proteina cuya estructura fue determinada por cristalograffa de rayos X. Ade- ‘més de su importancia como proteina ligadora de oxigeno, su estructura y su fun- i6n aportan informacién sobre la estructura y la funcién de la hemoglobina, que un fetrémero de polipéptidos del tipo de la mioglobina. A Estructura de la mioglobina La mioglobina es una protnainracelular pequefia del masculo de los ver- tebrados. Su estructura por difraccién de rayos X, deteminada por John Ken- drew en 1959, revels que Ia mayora de los 133 residos de a moglobina se dis pone en ocho helices ot (radieionalmenterotladas de A a H) que forman una Proteina globular con dimensiones de alrededor de 44 x 44 x 25 A (fig. 7-1. as mioglobinas, otros miembros de a fanilia globular de las proteins (se- cin 5-48) algunas otras proteins como la citoeromo c (ecciones 5-44 y 6- 2D) contienen un solo grupo hemo (ig. 7-2). Este hemo est estrechamente cal- zado en un boli hidrSfobo entre ls helices Fy F en la mioglobina. El tipo de anillo heterocctico del hemo es un derivado dela porfirina que conten ca- tro grupos pirrols(rorulados A-D) nis por puettes metenos (ors potr- nas varan sus sustiuyentes unos aos anllos A-D)-Elstomo de Fe( en el centro del hemo est coordinado con cuatro somos de N de la potirina y un N de un cadena lateral de His lamada, en na nomenclaura peculiar par a mio- elobina y Ia hemoglobin, His F8 porque es el octavo residuo de la bélice F).i ig OS Gl Habel Figura 7-2 1 grupo hemo, £1 tomo Fel) central se muestra igado a cuatro sores del ailo Ae porn, cuyes grupos pirlicos estan rotlados de a DE hem es un sistema conjugado, de manera que tods las uniones FsN son equivalents. El Fell) est undo también a une cadena leeral de His, cuando esti present, al Op. Los seis igandos estén dspusts en ls esquins de un otaeto centrada en el ion Fe (geomet ota. Una molécula de O, puede actuar como sexto ligando del étomo de hierro. La His E7 (el séptimo residuo de la hélice F) une un hidrégeno al O. con la geo- ‘metrfa que se muestra en la figura 7-3. Dos cadenas laterales hidréfobas sobre cl lado de unién del O» del hemo, Val E11 y Phe CDI (el primer residuo en el segmento entre las helices Cy D), ayudan a mantener el hemo en el lugar. Es- tas cadenas laterales presumiblemente se balancean a un lado mientras la prote= {na “respira” (secciGn 6-4B), lo que permite al Oy entrar y salir. En presencia de oxigeno, el stomo de Fe(II) de un hemo aislado se oxida de ‘modo irreversible a Fe(III, una forma que no permite la unién del Os. La por- ‘cin proteica de mioglobina (y de hemoglobina, que contiene cuatro grupos hemo ‘en cuatro cadenas globulares) evita esta oxidacién y hace posible que el O2 se luna reversiblemente al grupo hemo. La oxigenacién altera el estado electrSnico del complejo Fe(II)-hemo, como se indica por su cambio de color de morado os- ccuro (el color de la hemoglobina en la sangre venosa) a escarlata brillante (el co lor de la hemoglobina en la sangre arterial), En ciertas condiciones, el Fe(It) de a mioglobina o de la hemoglobina se oxida a Fe(III) para formar metamioglo- bina o metahemoglobina, respectivamente; estas protefnas son responsables del color marrén de la came vieja y la sangre seca. ‘Ademds del O,, otras pequerias moléculas como CO, NO y HaS pueden unirse aos grupos hemo de las proteinas. Estos otros componentes se unen con mucha ‘mayor afinidad que el O, lo que explica su toxicidad. El CO, por ejemplo, tiene 200 veces mayor afinidad por la hemoglobina que el Oa B Funcién de la mioglobina Aungue a la mioglobina originariamente seta considers s6lo una protena que almacenaba oxigeno, en la actualidad parecerta que su papel fsioldgico princi- peal es el de faciiar la difusion de oxigeno en el misculo (el tejido de mayor Seccin 7-1 Miaglobina 183 wwoteat Figura 7-3 El complejo hemo dela miolbia. nel Alibjo superior, ls tomos estn representads en forma de proyeccién tridimensional (ls tomas de H no se rmvesra) El dibujo inferior muestra el esquleto. correspondiente con una linea entecertada que representa enlace de hidrgeno ene la His E7y el O unio. 2 Vase eerccia 6-1 de Knemages.184 Ccpitlo 7 Funcién de las proteinas: mioglobina y hemoglobina respiracién en condiciones de gran esfuerzo). La velocidad a la que el O» puede dlifundirse desde los capilares hacia los tejidos est limitada por su baja sotubi- lidad en solucién acuosa (10 M en sangre). La mioglobina aumenta la solu- bilidad efectiva del O2 en las células musculares y actiia como un tipo de reser- vorio molecular para aumentar la velocidad de difusién del O3, La funcién de slmacenamiento de oxigeno de la mioglobina probablemente sea sGlo significa- tiva en mamiferos acuéticos como las focas y las ballenas, cuyas concentracio- nes de mioglobina en sus misculos son cerca de 10 veces mayores que en los, ‘mamifferos terrestres (raz6n por la que Kendrew eligié la mioglobina del cacha- Tote para sus estudios por cristalograffa de rayos X). Sin embargo, los ratones en los que el gen de la mioglobina se elimin6 son aparentemente normales, a pesar de que sus misculos son de color ms claro que los del rat6n de tipo silvestre. Este experimento sugiere que la mioglobina no es requerida por los masculos en condiciones metabélicas normales. Por el contratio, una protefna del tipo de la mioglobina en el cerebro, llamada neuroglobina, recién descubierta, podria ser ‘esencial para mejorar la concentracién de O; en tejidos neuronales, que son me- tabélicamente muy activos. Por ejemplo, el cerebro constituye s6lo el 29% de la ‘masa corporal humana, pero consume cerca del 20% del oxigeno disponible. La curva de unién de oxigeno de la mioglobina es hiperbdlica. La unign re- versible de O, a la mioglobina (Mb) esté descrita por una reaccién de equilibrio simple: Mb + 02 == MbO, (7-1) Nétese que los bioguimicos generalmente expresan el equilibrio en términos de constantes de disociaci6n, Ia inversa de las constantes de asociacién prefeti- ddas por los quimicos, La disociacién del O» de la mioglobina puede ser caracte- rizada por su saturacién fraccional, Yo,, que esté definida como la fraccién de sitios de unién de O» ocupados por Ox: IMbO,} Yer ipa eer ral Yo, varfa de cero (cuando no hay O; unido a las moléculas de mioglobina) a ‘uno (cuando los sitios de unin de todas las moléculas de mioglobina estén ocu- pados), La ec, 7-1 puede corregirse a IMbIIO2) K ‘Cuando esta expresién para [MbO3] se reemplaz6 por ec. 7-2, la saturacién fraccional se transforma en [MbO2] (7-3) [MbII0.) Yo= aay tr on IMbIIO.1 . (Mb] + K AA simplificar el término [MbY/K en el numerador y el denominador tenemos = [Oa Yo F10d 751 ado que el O» es un gas, su concentracin se expresa convenientemente comoSecon 7-2 Hemoglabina 185 las presiones parciales, pO, (también Ilamadas presi6n de oxfgeno). Por Io tanto, lec, 7-5 puede expresarse como = — Pz Yo." Re pO, Esta ecuacién describe una hipérbola rectangular y es idéntica a las ecuaciones que describen la unién de una hormona a la superfi- cie de su célula receptor o la unién de una pequetta molécula sustrato Al sitio activo de una enzima. Esta funcién hiperbélica puede repre- sentarse grificamente como se muestra en la figura 7-4, A bajas pO, muy poco O; se une a la mioglobina (Yo, es muy pequeiio). A medida ‘que la pO; aumenta, mas O> se une a la mioglobina. A pO: muy al- tas, todos los sitios de uni6n del O> virtualmente estin ocupados y se afirma que la mioglobina esti saturada con Os, La pendiente de Ia hipérbola por una simple unin, como el O, al Unirse a la mioglobina, aumenta a medida que el valor de K disminuye. Esto significa que cuanto menor es el valor de K, mayor es la unidn. Kes equivalente a la concentraci6n molar del ligando al cual la mitad de los sitios de unin estan ocupados. En otras palabras, cuando la pO> = K, la mioglobina esté hemisaturada con oxigeno. Esto puede demos- sarge algebraicamente al sustituir pO; por K en la ec, 7-6: pOz PO» Toni :geu poy poget (74 4.00 oa 60 : 0,40, 0,20 oo! inn Entonces, K puede definirse en forma operativa como el valor de pOs en el que Y= 0,5 (fig. 7-4). Es conveniente definir K como pso, esto es, la presién de oxigeno a la cual ka ‘mioglobina esté un 50% saturada. La pso para la mioglobina es 2,8 mm Hg (760 mm Hg atm). Sobre el rango fisiol6gico de pO, en la sangre (100 mm Hg fn sangre arterial y 30 mm Hg en sangre venosa), la mioglobina esté saturada con oxfgeno casi por completo; por ejemplo, Yo, = 0,97 a pO, = 100 mm Hg y 0,91 a 30 mm Hg. En consecuencia, fa mioglobina capta eficientemente oxigeno desde los capilares hasta las células musculares. La mioglobina, una cadena polipeptidica simple con un grupo hemo y por lo tanto un sitio de unién de oxigeno, es un modelo I para otras proteinas de tunién. Aun las proteinas con varios sitios de unién para la misma molécula pe- {quefia 0 ligando generan curvas de unin hiperbélicas como la de la mioglobina ‘cuando los ligandos interactian con cada sitio de unin en forma independiente. En la préctica, la afinidad de un ligando por su protefna de unién puede desco- nnocerse, La construccién de una curva de unién como la que se muestra en la fi- gura 7-4 puede aportar esta informacién. 2 Hemoglobina La hemoglobina, una proteina intracelular que le aporta a los eritrocitos su color, es una de las proteinas mejor caracterizadas y fue una de las primeras ‘que se asocié con una funcién fisiol6gica especifica (transporte de oxfgeno). Sin ‘embargo, no es un simple tanque de oxfgeno; es un sistema sofisticado de en- ‘uega que provee la cantidad apropiada de oxigeno a los tejidos en una amplia ‘ariedad de circunstancias, Los animales que son demasiado grandes para entre- {ar suficiente oxfgeno a sus tejidos por una simple difusién (> 1 mm de espesor) tienen sistemas circulatorios que contienen hemoglobina o una proteina de fun- cin similar (véase recuadro 7-1) La eficiencia con que la hemoglobina se une y libera el O2 nos recuerda la cspecificidad y la eficiencia de las enzimas metabslicas. La hemoglobina se Hamé 6 10 15 2 2 2 (PO (mm Hg) Figura 7-4 Cuma de unig dt oxigen at miogotina. La miglbina est hemisaturada con (Yo, = 0,5. ura resin de crigen (p0,) de 2,8 mm Hg. La Yorma hiperdlica dele cura de uidnestpica de una unin ‘ple de una mocula pequefa a ura prtena.186 Capitulo’? Funci6n de las protenas:miogloina y hemoglobina RECUADRO 7-1 La presencia de 02 en la atmésfera terrestre y su utilizacién en la combustion de las fuentes de energia para el metabo- lismo llew6 al desarrollo de varios mecanismos de almacena- rmiento y transporte de oxigeno. Los organismos pequerios tranportan el O» por difusién para abastecer sus necesidades respiratorias. Sin embargo, dado que la velocidad a la que se difunde una sustancia varia inversamente con el cuadra- do de la distancia a la que debe difundise, los organismos de > 1 mm de espesor estén obligados a difundir el Op con sis- ‘temas circulatorios y aumentar la solubilidad limitada del O2 fen el agua con proteinas transportadoras especificas de 0. Muchos invertebrados, y aun algunas plantas y bacterias, contienen una proteina que liga al O» basada en el hemo. Las hemoglobinas de una sola subunidad y multiméricas se encuentran tanto como proteinas intracelulares o como en componentes extracelulares en la sangre y otros Iiquidos cor- porales. La presencia de proteinas del tipo de la hemoglobi- ha en algunas especies de bacterias es evidencia de la trans- ferencia de genes de animales a bacterias en uno o més, puntos durante la evolucién. En las bacterias estas proteinas pueden funcionar como sensores de las condiciones ambien- tales como la concentracién de Oz local, En algunas plantas leguminosas, las llamadas leghemoglobinas se ligan al O» que de otra forma interferir'a con la fijacién de nitrdgeno que lle- va a cabo la bacteria que coloniza los nédulos de la ralz de la planta (secci6n 20-7), Las clorecruorinas, que se obser- vvan en algunos anélidos (p. ej, lombriz de tierra), contienen tna clase de derivado diferenciado de porfirina diferente al de la hemoglobina, que explica su color verde. Los otros dos tipos de protefnas que ligan Oa hem ray la hemocianina (ninguna de las cuales contiene grupos he- mo), estan presentes sélo en animales invertebrados. La hemeritrina, que se encuentra sélo en unas pocas especies de invertebrados marinos, es una proteina intracelular con una su- bunidad de -13 kDa de masa. Contiene dos atomos de Fe li- ¢gados por His y residuos &cidos. Es rosa viokécea cuando esta ‘oxigenada e incolora cuando est desoxigenada. Las hemocianinas, que son exclusivamente extracelulares, transportan O2 en moluscos y artr6podos. Las hemocianinas de rmoluscos y artrOpodos difieren en su estructura molecular en ‘todos los niveles, a pesar de que ambos tipos son grandes pro- tefnas multiméricas. La subunidad de la hemocianina de los artropodos es de ~75 kDa, mientras que la subunidad de los moliscos es de 350-450 kDa y contiene siete u ocho uni- erspectivas en Bioquimica Otras proteinas transportadoras de oxigeno dades globulares que ligan O2. A pesar de las diferentes es- tructuras terciarias y cuaternarias de las hemocianinas, que re. flejan distintas estructuras primarias, los sitios de unién del cxigeno son bastante similares, contando con un par de ato- mos de cobre, cada uno ligado a tres residuos de His (véase fig.). El complejo incoloro se wuelve azul cuando se une al On, ‘Las hemocianinas deben estar presentes en grandes con- centraciones para funcionar eficientemente como transporta- doras de oxigeno. Por ejemplo, la hemolinfa del pulpo (su equi- valente de la sangre) contiene alrededor de 100 mgml de hemocianina. Sin embargo, esto puede generar presiones os- méticas altas que resultan ser intolerables. Las hemocianinas de los artrépados y los moluscos minimizan este inconve- niente al formar estructuras multiméricas con masas tan grandes como 9 x 10° D en algunas especies (los vertebra- dos realizan esto al atrapar la hemoglobina en ertrocitos Idel griego, erytrhose, rojo, y kytos, vaso huecol). Las grandes moléculas extracelulares transportadoras de O2 frecuentemente son las protefnas extracelulares predominan- tes y, por lo tanto, pueden tener funciones adicionales como buffers que estabilizan los cambios de pH y las fluctuaciones ‘osméticas. En algunas especies de invertebrados las hemocia- hinas pueden servi como reserva nutricional, por ejemplo, du- rante las metamorfosis 0 mudas. Vege ‘Sito de unin del Ode a hemocianina del cangreja de mar con forma de herradua Limulus plyphemus. Las atmos estn cleeados sein el ipo C fen gts, N en azul, 0 en rj y Cu en violet. (Basado en la estructura por itacion de rays X de Win Hal, Universi of Washington Schoo of Medicine, POBIS 10K"), “enzima honoraria” debido a que muchas teorias formuladas para explicar la uunién del O, a la hemoglobina también explican el control de la actividad enzi- iética. En esta seccidn se incluye un estudio de la estructura de la hemoglobina y su comportamiento cooperative de unin de oxigeno. A Estructura de la hemoglobina La hemoglobina de los mamiferos, como vimos en la figura 6-33, es una pro- tena tetramérica con la estructura cuatemaria 2B (un dimero de protémerosSecciin 7-2 Hemoglobina 187 RECUADRO 7-2 La determinacién de la estructura tridimensional de las protel- nas se transformé en un hecho tan comiin que es dificil apre- Ciar los desafios de los primeros cristaldgrafos de proteinas. Max Perutz fue un pionero en esta drea e invirtié muchos afios en la determinacion de la estructura de la hemoglobina a ni- vel de su resolucién atomica para luego usar esta informacién para explicar la funcién fisioldgica de la proteina. En 1934, dos afios antes de que Perutz comenzara sus es- tudios doctorales en Cambridge, J. D. Bernal y Dorothy Crow- foot Hodgkin habian ubicado un cristal de la proteina pepsina fen un haz de rayos X y obtuvieron un patron de difraccién. Pe- rutz probé el mismo experimento con hemoglobina, que eligié bor su abundancia, facilidad de cristalizacion y evidente im- portancia fisiolégica, Los cristales de hemoglobina originaron patrones de difraccidn con miles de maximos de difraccion (la- rmados reflexiones), el resultado de la dispersién de rayos X por rmiles de atomos en cada molécula de proteina. Hasta ese ‘momento la cristalografia por rayos X se habfa usado para de- terminar las estructuras de moléculas con no mas de alrede- dor de 40 atomos y entonces la perspectiva de la aplicacién de esta técnica en la determinacién de la estructura atémica de la hemoglobina parecla imposible. Sin embargo, Perutz, ‘aceplt el desafio y pasé el resto de su larga carrera trabajan- do con la hemogiobina, En la cristalografia de rayos X la intensidad y la posicién de los haces reflejados puede determinarse répidamente, pero los valores de sus fases (las posiciones relativas de los picos de las ondas, cuyo conocimiento es tan importante como la am- plitud de las ondas para la reconstruccién de la imagen) no puede medirse directamente. A pesar de que se habian desa- rrollado las técnicas de computacién para la determinacién de valores de las fases para moléculas pequetas, la aplicacién de las métodos para solucionar este denominado “problema de fase” para entidades tan complejas como las proteinas pare- cia dificil de alcanzar. En 1952, Perutz se dio cuenta de que el método denominado “reemplazo de isoformas” podria so- lucionar el problema de fase para la hemoglobina. En este método, un tomo pesado como el i6n Hg**, que es rico en electrones (las particulas que dispersan los rayos 0, debe unir- se a sitios especificos sobre la protefna sin alterar significat- vamente su estructura (lo que cambiaria las posiciones de las reflexiones). Si esto causara cambios mensurables en la inten- sidad de los haces reflejados, estas diferencias nos darian la informacién para determinar sus fases. Con ansiedad seguida de alegria, Perutz observé que ls cristales de hemogiobina mo- aminos ae gescubrimientos ‘Max Perutz y estructura y funcién de la hemoglobina Max Perutz (1914-2002) (y O2-B;) involucran 19 residuos. Estas interacciones son predo- rinantemente hidrofobas, a pesar de que numerosos enlaces hidrdgeno y varios pares de fonestambign esin involucrados, Sin embargo, nétese que Is interac- tones 0 y B-Bo en realidad son tenues porque estos pares de subunidades ‘estéin separados por un canal de ~20 A de didmetro Ileno de solvente paralelo al eje de simetria doble exacta de la hemoglobina de 50 A de longiwud (ig. 7-5). Cuando se une el oxigeno, ls contatos de fs Bs (¥ @a-B,)varian, lo que produce un cambio en la estructura cuaternaria, La oxigenaciGn rota un dimero ‘GB ~15° respecto del otro dimero cf (fig. 7-6), lo que pone las subunidades B rs juntas y afina el canal central Hleno de solvente de la hemoglobina (fg. 7- 5), Algunos étomos en las interfaces @-Bo ds-By varfan tanto como 6 A (la oxigenacién provoca cambios en la estructura cuatemaria tan grandes que los eristales de desoxihemoglobina se destrozan en presencia de Oa). Esta reorgani- Zacin estructural es un elemento esencial en el modo de unig del oxigen a la hemoglobina (a) Desoxit Figura 7-6 as cfrecias estuctrals principals ete ‘a estctra cuatemara dela dsoxiemoglbia (a la hemoglobin (1. En a oxigenacifn los poténeros af (sombreade) y cafe (resafad] se meen, coma se indica la derecho, como unidades riidas de manera que hay un cen de rolacién externa de -15° de un protimero en relacin con el tro que presen la simetriaexcta en dos dimensiones de la moléula Notes cimo cambia la pascn de la His FAB (pentagon) respect de Th C3a, Thr C64 Pro CD2a (punts amar) en ls interfaces ca Bo yd. La vita es deste el ado derecto en relacion con el de la figura 75, tlustracin, ining Ges Imagen de Ing Geis Collection/Honard Hughes Medical Institute. Derechos pertenecents a HHMI Reproducién sdlo con autoizacidn)190 Capitulo 7 Funcién de las protenas: miglobina y hemoglbina Figura 7-7 Claes de! funcionamena, Cura de unin el oxigena dela hemogotina. En a sangre eter a hemegobina est hemisaturada a una pesin de cxgeno 26 mm Hg. Los aloes nomales de pO, humana aera y veosa a nivel del mar estan consignados (la pO, atmostrica es de 160 mm Ha nivel del mar). La cuva e unidn de. para la miglobin est inclida para su comparacin. La linea punteada es una curva de unin de 0, hiperblica con la misma psp que la hemoglobin. © Veanse figuras animaas. B Uni6n del oxigeno a la hemoglobina La hemoglobina tiene una po total de 26 mm Hg (0 sea la hemoglobina esté hhemisaturada con O, con una presiGn de oxigeno de 26 mm Hg), que es casi 10 ve- ces mayor que la psp de la mioglobina, Ademds, no presenta una curva de unin de oxigeno hiperbdlica como la de la mioglobina. En este caso, la unién del O, a la hemoglobina esté descrita por una curva sigmoidea (forma de S) (fig. 7-7). Esto permite a la sangre en- Iregar mucho mas Oa os tejidos que sila hemoglobina twviera una ‘curva hiperbica con la misma pso (nea punteada en la fig. 7-1 Por ejemplo, la hemoglobina esté saturada casi en su totlidad con (Op a presiones arteries de oxigeno (Yo, = 0,95 a 100 mm Hg) pero s6lo aproximadamente hemisaturada a presiones venosas de oxigeno (Yo, = 0.55 a 30 mm Hg). Esta diferencia de 0.40 en la saturacién de oxigeno, una medida de la habilidad de la hemoglobina para en- tregar Os desde los pulmones hasta los tejdos, seria slo de 0,25 si la hemoglobina presenta un comportamientohiperbstico du En todo sistema de unién, una curva sigmoidea es indicadora de tua interac cooperatiaenre los sitios de unin. Esto significa que ta unin de un ligando aun sito afecta la unin de Tgandosadiciona- les a otros sitios. En el caso de la hemoglobina, la unin de O» a una subunidad aumenta su afinidad con las subunidades restanes. La pen- diene inicial dela curva de unin de oxigeno (li. 7-7) es baja, mien- tras las subunidades de hemoglobina compiten independientemente por el primer O> Sin embargo, una moléeuln de O» unida una de as subunidades de la hemoglobi- ta aumenta su afinidad para unre a sus otras subuniades, lo que explicaentonces 1 aumento de la pendiente de In pore central de la curva sigmoidea. la ecuacién de Hill describe fa curva de unién de Op de la hemoglobina, 1 primer intento de andisis de la curva sigmoidea de disociacion de O> de la he- moglobina fue formulada por Archibald Hill en 1910, Hill supuso que la hemo- ¢globina (Hb) unfa n moléculas de Os en un solo paso, Hb +n 0, —> Hb(O,),, © sca, con cooperatividad infinita. Por lo tanto, anslogamente con la derivacién de la ec. 7-6, (00,)" Yo Gal + @OF mi que se conoce como ecuacién de Hill, Como la ec. 7-6, ésta describe el grado de saturacién de la hemoglobina como una funcién de pOs La cooperatividad infinita en a unién de Os, como la supuso Hill, ¢s una impo- sibilidad fisca. Sin embargo, n puede tomarse como un parmetro no integral rela- cionado con el grado de cooperatividad entre las subunidades de hemoglobina inter- actuantes més que el nero de subunidades que se unen al O3 en un solo paso, La ‘ecuaci6n de Hill entonces puede tomarse como una curva empirica de ajuste de la ‘elaciGn més que un indicador de un modelo en particular de unién de ligando. El valor n, el coeficiente de Hill, aumenta con el grado de cooperatividad de luna reaccién y por lo tanto aporta una caracterizacién conveniente aunque sim- plista de la reaccién de unién del ligando. Si n = 1, 1a ec, 7-8 describe una hipé- ‘bola como lo hace la ec. 7-6 para la mioglobina y se indica que la reaccién de ‘uniGn del O; es mo cooperativa. Sin > I, la reaccién esti descrita como positiva- ‘mente cooperativa porque la unin del O» aumenta la afinidad de la hemoglobina ppara uniones posteriores de Os (la cooperatividad es infinita en el limite donde el niimero de sitios de unin de O> en la hemoglobina). Recfprocamente, si 1n <1, la reacci6n es negativamente eooperativa porque la unién de Os reduciria Juego la afinidad de la hemoglobina en Ia unién de los O> siguientes.El coeficiente de Hill, n,y el valor de psy que describe mejor la curva de sa- turacién de la hemoglobina pueden determinarse grificamente al reordenat la ec, 7-8. Primero, se dividen ambos miembros por 1 ~ Yo, (703)" (woy" Yo. OY 1GOF . Gal +YOF yy Ke Ly (@0,)" Da" + @OF Si se simplifica el término [(pso) + (pO2)] el resultado es T= Yo, ~ [pay + (70¥T= PO) oy MO ‘Al tomar el logatitmo de ambos miembros obtenemos una ecuacién lineal: log pO; ~ n log pso (uy tog (22 Me (=e ET grfico lineal de log [Yo ~ Yo) versus log ps, el grfico de Hil, tiene una pendiente-m yuna interseecén de log Po con el ee Tog de POs (re cuerde que Ia euacién lineal y = ms + b deseribe una nea con tna pendicnt mm yuna intersocién x de ~ bn, En la figura 7-8 se muestran los gificos de Hill ara la miglobina y a he- moglobina purificada. Paral mioslobina, el grfico es lineal con na pendient de I, como es esperable. Sin embargo, no todas ls subunidades de hemoglobina se unen al Os en un solo paso como se supaso al dervar la ecuacién de Hil cl srifico de ill es esencialmentelincl para valores de Yo, ene 0,1 0.9. Cuando 702 Pn Yo, =05 y (72) ‘Como puede verse en la figura 7-8, ésta es la regién de pendiente maxima, euyo valor se toma hhabitualmente como el coeficiente de Hill, n, Para la hemoglobina humana normal, el coeficiente de Hill esté entre 2.8 y 30; 0 sea, la unin de oxi geno de la hemoglobin es altamente pero no finitamente cooperativa. Muchas hemoglobinas ‘anormales presentan coeficientes de Hill meno- res (seccin 7-4) lo que indica que tienen un _grado de cooperatividad menor que el normal. La hhemocianina del escorpi6n, un multimero de 24 subunidades, cada una con un sitio de unién de oxigeno, tiene un coeficiente de Hill de ~20, lo ‘que indica un alto grado de cooperatividad, A valores de Yo, cereanos a cero, cuando po- ‘eas moléculas de hemoglobina se unieron a por lo menos una molécula de Os, el gefico de Hill para la hemoglobina adopta una pendiente de 1 (ig. 7-8, asintota inferior) porque las subunidades ‘dehemoglobina compiten independientemente por (©, como lo haven las moléculas de mioglobina. A valores Yo, cercanos a 1, cuando por lo menos tres de los cuatro sitios de unin de (Op de la hemoglobina estén ocupados, el grfico de Hill también adopta una pen- dliente de 1 (fig. 7-8, asintota superior) porque los pocos sitios remuanentes no oct pados estan en diferentes moléculas y por lo tanto unen Os en forma independiente, Alextrapolar la asintota inferior en la figura 7-8 al eje horizontal, de acuerdo con la ec. 7-11, se indica que la psp = 30 mm Hg para unir el primer O; a la 100 20 oa oon ot ont Seccién 7-2 Hemoglobin 191 098 05 Yo, oot 1 10 1.000 PO (mm He) Figura 7-€ Grtcas de Hil paral migobinay la hemoglbia prea, Notese que éste es un grtica logsog. A 90> = peo Yo! (1~ Yo.) = 1. (La Pao pare hemoglbina in vivo es mds elvada Que la pun de a hemaglobna puriicadadebido a su unin a cietas sstancias presents en los eritoctos[véase abajo)192 Capitulo 7 Funci6n de las protenas: mioglobina y hemoglobina Hobice F Figura 7-© Movinion del hema y la lice F durante La AeansiciénT—> Ren la hemoglobia. En a forma T (au, et Fe est 0,6 A por encima del centro conforma de copula el anil de portrna. Suponiendo la forma R (ro, el Fe ‘se mueve hacia el plano en la poirna aor sin cla, onde puede use al 0» mds ferent, , al hace, fempula a His FB y su hice F unida con el eanse ejerccio 6-4 de Kinemages y figuras anima, hemoglobina purificada. Del mismo modo, al extrapolar Ia asintota superior se “obtiene psy = 0.3 mm He para la unign del cuarto O» de la hemoglobina. Por lo tanto, el cuarto Oz que se une a la hemoglobina lo hace con 100 veces més afi- znidadl que el primero, Esta diferencia, como veremos en la secci6n 7~3A, se debe {otalmente a la influencia de la cadena globular sobre la afinidad del hemo. En el anilisis de la uniGn cooperativa del O, a Ia hemoglobina se desarrolla- ‘ron modelos mas realistas que los utilizados en Ia derivacién de la ecuacién de Hill, Los trataremos en la seecién 7-34. Ba Cooperacién La cooperacién entre los sitios de unién en las macromoléculas es un fe~ ‘némeno que no esté limitado a la unién de oxigeno en las proteinas, De hecho, cl comportamiento cooperativo es un rasgo comin en Tas enzimas y les provee ‘un mecanismo sensible para la regulacién de su actividad catalitica, En esta sec- cin examiinaremos la base molecular para la cooperacién en la hemoglobina y se expondrin algunos de los modelos usados para evaluar el comportamiento ge~ neral de unidn con cooperatividad A Mecanismo de cooperacién en ta hemoglobina La cooperacinen Iau dl oxigeno ala hemoglobin surge del efecto que viene luni da gando a uno de os grupos hemo sobre la anda de la union Cal ligand de tro hemo. Los hemos estan scparados por una distancia de 25 4 537 As demasiado lejos uno del oto para intrituar elecricamente La infor- macin sobre el estado de unin de Ode un grupo hemo se transite en forma tecnica los olos grupos por movimientos de la protena. Estos movimientos Uesritosen la figura 1-3 son responsabls por las diferentes etrctaraseuater narias de oxihemoglobina y desoxihemoslobina. La hemoglobina tiene dos estados conformacionales. Sobre la base de la estruc- tira po difacidn de rayos X del oxihemoglobina y la desoxihemoslobina,Pe- Tut formuld un mecanismo para la oxigenacién dela hemoglobins. En el mecanismo de Peru, la hemoglobina tiene dos estados con- Jomacionaes estble, el estado T (la conformacign de a dsoxihe- ‘moelobina) el estado (la conformacign de la oxihemoglobina)-Las Conformaciones de las cuatro subunidadesen la hemoglobinaen eles tad T fren de aque en el estado R. La unin del oxigen ini- tia una serie de movinientos coodinados fo que da come resultado un cambio del estado T al estado R en unos pocos mierosegundos: 1. En elestadoT el Fe(l) en cada uno de los eutr hemos se ubica 10,6 A fuera de plano del hemo debid al movimiento en forma de cpu pramidal del grupo poctina hacia la His F8 Big. 79) Launién del O; cambia el estado cletebnico del hemo, que acorta cLenlace Fe—Nyai€-0.1 A y provoca qu la porfirina forme tna eipula hacia abajo. En consecuencia, durante la tansicién TT R-el Fell) se mueve hacia el cena del plano del hemo, 1 Fe(H) arastra consigo la His F8 unida covalentemente Sin em- bargo, e1 movimiento directo de la His F8 de 0,6 A hacia el plano del hemo provocariasucolisién con el hemo. Para evitar este cho- aque estérico, la hélce F unida se incinay taslada —1 A, y eruza el plano det hemo, 2 3. Los cambios en la estrctira teciara estan acoplads a una varacié en cl ordenamiento de ls cuatro subunidades de la hemoglobina. El cambio mas grande producido por la tanscion T > R es el resultado de los mo- wimientos de os residuos en ls interfaces os y ea-Br en ora palCooperacién 193, bras, en fa interfaz entre las dos unidades protoméricas de la hemoglobina En el estado T, la His 97 en la cadena B hace contacto con la Thr 41 en la cadena ot (fig. 7-10a). En el estado R, la His 97 hace contacto con Thr 38. que esté ubicada una vuelta atrs a lo largo de la hélice C (fig. 7-106). En < 7 toy Y 20 Se 9 G1 (9 | To | e355 “mira ssp.) an fires «: Three = "9 io oba + oon + (a) Estado ¥ (desoxi) Figura 7-10 Canbias en ta imertaro-B durante la wasiciénT > R en a En os ciujossupeies, a hemoglobin, (2 lesa T; (0) El esta C esti representada por una cinta vile; los resides que h ntact famando el contacto a\0-BuFG se muestan en forma de pails colreaos pr tpa de atmo (C en verde, N en azul y 0 en sus superficie de colores. Los dbus inf ayC-B,F6, Durante la Yan 0 @ lo larg dela hice aC sin un intermediaroestabe (re acién TR, la egidn BF cambia de un (0) Estado R (ox) ambasconfrmaciones, ls prtubeanclasfrmades par las cadens eters de His 978 y Asp 998 encajn ete los suas sobre las hlics C formas por las cadenasltrales de Thr 380, They Po Adu) Las subunidades estan unas po iferentesenloeshidrégeno en los dos estado cutee ‘igus 75 y 7-6 apart vistas estutuaesadienales de estes intraciones. (Gesado en las estructura por difaccién de aos X de Giulio Fermi, Max Petz y Boaz Shaenan, MRC Laburatoy of Molecular Bag, Cambridge, U.K. POBICS (a) 24H y (0) HHO). 62 Vase ejercicio 65 6 Kinemages,194 Capitulo? Funoén de la protenas: miolobina y hemoglobina () Cadena a (b) Cadena ap val us us Nominal J comin one Ctemina 9 val val His to a 7 8 sop op ws % Be Be Figua 7-11. Redes de pars iia enlaces de bidgene ena esti indcados por signs posts blancs. (sac, Iving Geis. tmagen tesoxihengfoina. Estos enlaces, que ivlucan los ios dos resduos de delving Geis Collection Howard Hughes Metical Institute, Derechos (a) as caenas cy (las cadens B, s rompen ef la ranscién TR. Dos _prtenecintes a HHMI, Repreduccién sto con autriacin.) pos que se desprtaranparialment en el estado R (are del efecto Botn) ambas conformaciones, os “abultamientos” de una subunidad se acomo- dan adecuadamente en las “cavidades” de la otra. Una posici6n interme dla serfa severamente resistida porque pondsfa la His 97 y la Thr 41 de- ‘masindo juntas (0 sea, bultos sobre bulto). 4, Los tesiduos C-terminales de cada subunidad (Arg 14a. © His 1468) en ta hemoglobina en estado T participan cada uno en una red de pares de io- nes intrasubunidad e intersubunidad (ig. 7-11) que estabiizan el estado T. Sin embargo, el cambio conformacional en la transicién T —> R artanca estos pares de iones en un proceso que esta conducido por la energta de la formacién de los enlaces Fe—O3 Hay evidencia experimental considerable que respalda la secuencia de los st- esos moleculares desertos. Por ejemplo, la hemoglobina se modifies por inge- nierfa al reemplazar la His F8 por Gly. El grupo imidazolfaltante de Ia cadena lateral de His luego se reempla6 por imidazol libre. Sin un enlace covalente que uniera el anilloimidazol al resto de la proteina, la hemoglobina modificada ge- néticamente era capaz de unit O>, pero la mayor parte no sufte los cambios con formacionales inducidos por el O> desde el movimiento de la hice F hasta et movimiento de 15° de uno de los o protémeros en relacién con el otro, ‘La caracterstca esencial dela transcion de la hemoglobina T —> R es que sus subunidades etn tan estrechamente acopladas que los grandes cambios estructi- rales teriarios en una subunidad no pueden producirse sin cambios estructurales ‘cuaternarios en toda la proteina tetramérica. La hemoglobin esté limita a s6lo dos formas cuatemarias, Ty R, porque los contactos intersubunidad que se mues- tran en la figura 7-10 actdan como un interruptr binario que permite slo dos po- siciones estables de las subunidades en relacién una con la ora. La infleibilidad dd ls interfaces @y-By y ca-B> requere que el cambio T —» R se genere simulté- neamente en ambas interfaces @-B> y dz-By. Ninguna subunidad ni dimero pue- ‘den tener cambios grandes en su conformacin con independencia de resto. ‘Ahora estamos en una posicin de racionalizar en forma estructural Ia coo- peracién de la unién de oxigeno a la hemoglobina, El estado T de la hemoglo-Secclén 7-3 Cooperation 195 bina tiene baja afinidad por el Os, sobre todo por el largo mayor en 0,1 A de su enlace Fe—O; en relacién con el estado R (pe. la es- tructura azul que se muestra en la figura 7-9). La evidencia experi- mental indica que cuando por lo menos un Os se uni a cada dimero a ta resistencia en el estado T de la molécula de hemoglobina es suficiente para arrancar el par de iones C-terminal, lo que lleva beus- ccamente la proteina al estado R. Todas las subunidades son de este modo convertidas en forma simulténea dela conformacién del estado R tengan © n0 O» unido. Las subunidades no ligadas en la confor- ‘macién del estado R aumentaron Ia afinidad por el O> porque ya es- tn en la conformacién de unién de Oz, Esto explica la alta afinidad de la hemoglobina casi saturada, El transporte del didxido de carbono y el efecto Bohr. Los cambios 6080 conformacionales de la hemoglobina que se producen durante la unin pO, (tor) con el oxigeno disminuyen los pK de varios grupos. Recuerde que la Figura 7-12 El efcto Bot. La afiidad del 0, por la tendencia por un grupo a ionizar depende de su microambiente, que puede incur _hemeltiraaumeta cone aunt pH La ies cvros grupos ionizables. Por ejemplo, en cl estado T de Ia hemoglobina, los gru- _priata nda a en un misculo que resp os amino N-terminales de las subunidades cy la His C-terminal de la subunidad tome. (omao de Benes RE y Benesch Ady B estén cargados positivamente y participan en pares de iones (véase fig. 7-11). La Potin Chem 1974; 28, 212) 6 Weanse figuras formacién de pares de iones aumenta los valores de pK de estos grupos (los hace Ca ‘menos dds y por lo tanto es mis fil que abandonen sus prtones) En a he- moglobina en estado R estos pares inicos estn ausentes y el pK de los grupos baja (con lo que se wuelven ms éidos y tienen mayores posbilidades de coder protones) En consecuenca, en condiciones fsioléyicas, a hemoglobina libra -0,6 protones por cada Op que une. Refprocamente, al aumentar el pH, o sca, elimina protones, se estimula a fa hemoglobina a unir mis O, a presiones menores de ox eno (ig. 7-12). Este fendmeno se conoce como efeeto Bohr, por Christan Bohr (padre del fisico Niels Boh), quien fue el primero en informs en 190s El efecto Bohr tiene funciones de importancia fisil6gica en el transporte de (desde los pulmones hacia el tejido que respira y en el transporte de CO: pro- disuelto forma bicarbonato (HCO) slo muy lentament, por Ia reaccisn CO; + 20 —=H* + HCOs a aa #20 ote ‘ *, ee b ct ras ‘MbO, Et ro +> 0,4] 0% HbO, ‘Mb: 0,=100 mn p02 Fa 7-13 ch 6 cain. pl gb 1 sea pa tain 20:9 0 es cobs netics, Newt elope eden ples rere romper pen pe see se mga resin ye CO, (como HCD) desde ls tejios hasta os pulones. El oigeno _(cuya afinidad po el ongeno es superior que la dela hemeglobina. Esto se inal hacia ns pulmones 2 eevadaf0>, donde se une ala hencgobina en aumertala velocidad ala cul el O» puede cfundse desde los capiares hacia la sangre. EO, lvago se transport a os tjidos que respira, donde la pO, es ns tds aumentando en efecto su sla. La HD y el CO (mayormente baja EO; entonces se cisocia de la Hb se difunde hacia los tejids, donde coma HOOs") luego regesan alas puimones, dane el CO se exh,196 Capitulo 7 Funeién de las rotlnas lobia y hemoglobina Sin embargo, en el eritrocito la enzima anhidrasa carbénica acelera pode- rosamente esta reaccin, Por lo tanto la mayorfa del CO, en la sangre se trans- porta en forma de bicarbonato. En los capilares, donde la pO, es baja, los H* generados por la formacién de bi- ‘arbonato son tomados por Ia hemoglobina en la formacién de pares de iones del ‘estado T; de esta forma se induce a la hemoglobina a descargar su O> unio, Esta toma de H", ademas, facilita el transporte de CO, al estimular la Formacign de bi- carbonato. Reeiprocamente en los pulmones, donde la pO, es alta, lt unin de Os por la hemoglobina rompe Ios pares de iones del estado T para formar el estado R Jo que libera entonces los protones de Bohr, que se recombinan con bicarbonato para generar el COs, Estas reaccionesestin estrechamente ensamblads, de manera «que provocan may pocos cambios en el pH de a sangre (véase recuadro 2-2). El efecto Bohe proporciona un mecanismo donde el oxigeno adicional puede suministrarse a misculos altamente activos, donde la pO; puede ser < 20 mm Hg. Estos misculos generan dcido letico (seccién 14-3A) con tanta rapidez que bajan el pH de la sangre que pasa de 7,4 a 7,2. A pO> de 20 mm Hg la hemo- ‘lobina libera 10% mas O> a pH 7.2 que lo que hace a pH 7,4 (fig. 7-12) 1 CO, también modula la unién de oxgeno a la hemoglobina al combinarse reversiblemente con grupos amino N-terminales de proteinas de la sangre para formar earbamatos: RONH; + CO; —=R—NH—COO™ + HY La forma T (desoxi) de la hemoglobina une ms CO; como carbamato que la forma R (oxi). Cuando la concentracin de CO; es alta, como lo es en los capi- lures, el estado T estéfavorecdo, lo que estimula la hemoglobina a liberar su O2 tunido. Los protones liberados por la formacién de carbamato después promueven Ja liberacion de Os mediante el efecto Bohr. Sin embargo, a pesar de las diferen- Figura 7-14 Los efectos del BPG y el CO sabre la curva e isociacion del 0, de la hemoblogina. La eriogjobina desnuda (iaquierda) tiene mayor afinidad por el O> que la sangre completa (cuna roa. Agregando BPG 0 Cp, ‘© ambos, la hemoglebina cambia la curva de disciacin de regeso a la derecha (baja la afnidad de fa hemoglobina ‘or el 0), (De Kilmartin JV y Ross-Bernardi L. Physio! 30. 40 «5060 ‘Rev 1973; 83, 884.) 6% Véanse figuras animadas, Pp (mm He)Secclén 7-8 Coopera 197 cias en la unin del COs entre los estados de I hemoglobina oxi y desoxi que ex- plica s6lo ~5% del total de COs de la sangre, éste es responsable de cerca de la ritad del CO, transportado por la sangre. Esto es asf porque slo ~10% del COs total de la sangre se pierde a través de los pulmones en cada ciclo circulatorio. Ehisfosfoglicerato se une ala desoxihemoglobina, La hemozlobinaatamente pu- rifieada (“desnuda”) tiene mucha mas afinidad por el oxfgeno que la hemoglobina en la sangre entera (fig. 7-14), Esta observacién condo a Joseph Barcrof en 1921, a pensar que la sangre contenia alguna otra sustancia ademas del CO, que afectaba Ja unign con la hemoglobina, Este compuesto es el n-23-bistosfoglicerato (BPG). n—C—opot H—C—orot hk -2,-bsfostogicerato (BPG) EL BPG se une fuertemente a la desoxihemoglobina pero slo de manera d&- bil ala oxihemoglobina. Pr lo tanto, la presencia de BPG en eritroctas de ma imiferos disminuye la afinidad de ta hemoglobina por el oxfgeno al manteneria «en la conformacisn desox. En otros vertebrados, diferentes compuestos fostor- lados preducen ef mismo efecto. ELBPG tiene una func isiol6gica indispensable en la sangre arterial, donde Ia 70> ¢s -100 mm Hg, la hemoglobina esti el ~95% satrada con Os, pero en la sangre venosa, donde la pO, es ~30 mm Hg, esta sélo el 55% saturada (fig. 7-1), En consecuencia, al pasar por los capilares la hemoglobina des- carga ~40% de su O, unido. En ausencia de BPG, poco de este O> ‘nido seria liberado debido a que la afinidad de la hemoglobina por ©, esta incrementada, lo que cambia la curva de disociacion de O> signifcaivamente hacia menores ps (fig. 7-14, fquierda). EI BPG tambien cumple un importante papel en Ia adaptacion a altitudes ele ‘vadas (véase recuadro 7-3). En la estructura por difaceidn de rayos X del complejo BPG-des- oxihemoplobina se muesta que el BPG se une en la eavidd central de In desoxihemoglobina (ig. 7-15). Los grupos aninicos del BPG estén ana distancia suficente para formar enlaces hidrdgeno y permit el apareamiento de los iones de los grupos amino N-terminal de ambas ‘subunidades 3. Las transformaciones T — R ponen las dos hélices BH {juntas lo que angosta la cavidad central (Compare as figs. 7-5a y 7-5b)y exple al BPG, También se ensancha la distancia etre los gr pos B Neterminales de 16 220 A, lo que evita el enlace hideigeno si mlneo con los grupos fosato del BPG. Po lo tanto, el BPG se une ¥ estabilza slo la conformacién T de la hemoglobina por unién cr Zada de ss subunidades . Esto despaza el equlibrio T = R hacia cl estado y baja a afnidad de fa hernogobina por cl Os Figura 7-15 Unié dl BPS a a desoribemopotna. £1 BPS (rj) se une a la cavidad central de a hemoglbina. EI BPG, que tiene una carga de -6 en condiciones isola, est odeado por ocho grupos ctinicos (az que seextendieron desde las dos subunidades Enel estado R, la cavidad central es demasiado angosta para canter BPG, Algunas dels pares de ions y enlaces de hicrgeno que ajudan a stablizar estado T (ig, 7-116) estn indicados abajo a la dereca. (lustracin, Irving Ges. Imagen de Ivng Geis ColletionHoward Hughes Medical Isiue. Derechos perteecietes a HHMI, Reproduccifn slo con autrzacin) 2 Vase ecco 6-3 de Kinemages,198 Capitulo 7 Funclén de las protenas: miglobina y hemoglobina RECUADRO 7-3 10g! Adaptacién a las grandes alturas La presién atmosférica decrece con la altitud, de forma que la presion de oxigeno a 3.000 m es s6lo -100 mm Hg, 70% de la presion a nivel del mar. Se requiere una variedad de res- puestasfisiologicas para mantener la entrega normal de oxige- no (sin adaptacién, los niveles de pO, de 85 mm Hg o menos provocan dafio mental. La adaptacion a la altitud es un proceso complejo que im- plica aumentos en las cantidades de hemoglobin por eritroci- to yen el numero de eritrocitos. Normaimente se requieren va~ rias semanas para completar esta adaptacién. Aun asi, como ‘est claro para todo el que haya ascendido a superficies muy ‘elevadas, un solo di alli provoca un grado notable de adapta- Cidn. Este efecto es resultado de un incremento rpido de la cantidad de BPG sintetizada en los eritracitos (de ~4 mM a ~8 mM; el BPG no puede cruzar a membrana del eritrcito. ‘Como s@ilustra en los graficos de Yo, versus pOz, el ineremen- to en BPG inducido por la altitud elevada provoca que la cur- va de unién de O, de la hemoglobina varfe su posicién a nivel del mar (Jinea negra) a una posicién de menor afinidad (linea 1). K nivel del mar, la diferencia entre p> arterial y veno- sa es de 70 mm Hg (100. mm Hg - 30 mm Hg) y la hemo- ‘globina descarga el 38% del 0 ligado. Sin embargo, cuando la p02 arterial cae a 55 mm Hg, como se observa a una alt tud de 4 500 m, la hemoglobina podré descargar solo el 30% de su 02. La adaptacion a Ia altitud (que disminuye la cant dad de 0» que la hemoglobina puede unir en los pulmones pe- ro, en una extensin mayor, aumenta la cantidad de Oz que I bera en los tejidos) permite que la hemoglobina entregue un casi normal 37% de su O2 unido, Las concentraciones de BPG también se incrementan en personas que padecen afecciones due limitan la oxigenacion de la sangre (hipoxia), como varias anemias e insuficiencia cardiopulmone. La concentracién de BPG en los ertrocitos puede ajustarse mas répidamente de lo que la hemoglobina puede sintetizarse (recuadro 14-2; los eritrocites carecen de ntcleo y, por lo tan- {o, no pueden sintetizar proteinas). Un nivel alterado de BPG ‘también es un regulador més sensible de la entrega de oxige- no que una velocidad respiratoria alterada. La hiperventilacin, otra respuesta temprana a la altitud, puede conducir a alcalo- 203 vel del mar 1 pO, arent a wenose 4 500m eo) ce 4 «60 _PO3 mm He) sis respiratoria(recuadro 2-2). Curiosamente, individuos de po- blaciones de largo asentamiento en los Andes o el Himalaya ‘muestran capacidad pulmonar elevada, acompatiada con altos niveles de hemoglobina y, frecuentemente, ventriculos dere- cchos agrandados (lo que refleja un aumento en el volumen mi- ‘nuto cardiaco), comparado con individuos de poblaciones en altitudes bajas. Al contrario de lo que se observa con el mecanismo de adap- tacién humano en la altitud, le mayoria de los mamiferos que ‘normalmente vive en esas condiciones (p. ¢., la llama) modi- ficaron genéticamente sus hemoglobinas para poseer mayor af- nidad por el Op que las de sus primos a nivel del mar. Por ende, tanto la elevacion como el descenso del pao de la he- ‘moglobina puede prover una adaptacion a la altitud, La hemoglobina fetal tiene baja afinidad por el BPG. Los cfectos del BPG tam- bign ayudan en la provisién de oxigeno del feto, Un feto obtiene su O> de la cit= culacién matema por via de la placenta. La concentracién de BPG es igual en los eritrocitos de los adultos y en los fetos, pero el BPG se une més fuertemente la hemoglobina de los adultos que a la fetal. Esta mayor afinidad por la he- ‘moglobina fetal facilita la transferencia del O, al feto. La hemoglobina fetal est compuesta por las subunidades ots en Ta cull 1a subunidad es una variante de la cadena i (seccidn $-4B), El residuo 143 de la ea dena B de la hemoglobina del adulto tiene un residuo histidina (His) catinico, ‘mientras que la cadena y tiene un residuo Ser sin carga. La ausencia de esta His,Secciin 7-3 Cooperacién 199 climina un par de interacciones que estabilizan el complejo BPG-desoxihemo- lobina (fig. 7-15). B Protefnas alostéricas La cooperacién del oxigeno con la hemoglobina es un modelo cldsico del com- pportamiento de muchas otras proteinas con multisubunidades (incluso ciertas en- Zimmas) que unen moléculas pequefias. En algunos, casos la unién de un ligando un sitio aumenta la afinidad de los otros sitios de unidn sobre la misma prote- fna (como en la unin del O» a la hemoglobina). En otros casos, un Tigando dis ‘minuye la afinidad de otros sitios de unin (como cuando la unién de BPG re- duce la afinidad de la hemoglobina por el O,). Todos estos efectos son el resultado de las interacciones alostéricas (del griego: allos, otras + stereos, sido 0 es- pacio). Los efectos alostéricos, en los que la unién de un ligando en un sitio afecta la unién de otro ligando en otro sito, generalmente requieren interaccio- nes entre las subunidades de proteinas oligoméricas. La transici6n T —> R en las subunidades de la hemoglobina explica Ia diferencia en las afinidades por el oxi- geno entre la oxihemoglobina y la desoxihemoglobina, Otras protenas presen- tan cambios conformacionales similares, aun cuando los mecanismos molecula- res que provocan estos fenémenos no se comprenden por completo, Dos modelos que explican la unin cooperativa del ligando recibieron la ma- ‘yor atencién. Uno de ellos, el modelo de simetria de alosterismo, formulado en 1965 por Jacques Monod, Jeffries Wyman y Jean-Pierre Changeux, esta definido por las reglas siguientes: 1, Una proteina alostérica es un oligmero de subunidades relacionadas de manera simétrica (a pesar de que las subunidades ay B de la hemoglobina estén s6lo seudosimétricamente relacionadas). 2. Cada oligémero puede presentarse en dos estados conformacionales de- signados R y T; éstos estén en equilibrio. 3. El ligando puede unirse a una subunidad en cualquier conformacién. Sélo el cambio conformacional altera la afinidad por el ligando. 4. La simetria molecular de la proteina esté conservada durante el cambio conformacional. Por lo tanto, las subunidades deben cambiar Ia confor- ‘macién de manera concertada; en otras palabras, no hay oligémeros que contengan simultineamente subunidades en el estado R y T. En la figura 7-16, el modelo de simetria esta diagramado para una protefna de unin tetramérica. Si un ligando se une mas fuertemente en el estado R que cen el T, su unién promoverd el cambio T > R, y de esta manera se incremen- tard la afinidad de las subunidades no unidas por el ligando, Una de las objeciones principales para el modelo de simetrfa es que es difi- cil ereer que la simetria oligomérica esta perfectamente preservada en todas las proteinas, 0 sea, que el cambio T — R se produce simulténeamente en todas, las subunidades sin importar el niimero de ligandos unidos. Ademés, el modelo de simetria puede explicar sélo la cooperacién positiva, a pesar de que algunas protefnas presenten cooperacién negativa, Una alternativa del modelo de simetria es el modelo secuencial del aloste- rismo, propuesto por Daniel Koshland. De acuerdo con este modelo, la unién del ligando induce un cambio conformacional en la subunidad a la que se une, y sur- Figura 7-16 El moelo de simetia de alosterisme Los cuadraosy los cruls repesentan los cestados Ty R de las suburidades, espectvamente, de una protein tetramérca. Lo estado Ty R estén en equlo sin tomar en cuenta ef nimero de ligandos representa por S) que se uieron la protein, Todas ls subunidadesdeben estar en a forma T o en aR; el modelo no permite combinacions de los estados Ty R de las subunidadesen la misma patina, Subunidades ‘en estado T ab ‘Subunidades | fen estace R E ry T $3.200 Capitulo 7 Funcin de las proteinas: mioglobina y hemoglobina Ba 6:9 Figura 7-177 El modelo secuecial del aloterino, La unin dels ligandes _uridos, La simetia dela proenaoigomica no ests presenada en este induce progesvamente cambios contracinaes en las subuniddes; as rooesa como lo esti en el modelo de sinatra, rmayres varacianes se preducen en las subunidades que tienen igandos ‘gen interacciones cooperativas por la influencia de estas variaciones conforma- ‘cionales en las subunidades vecinas, Los cambios conformacionales se producen secuenciadamente a medida que se ocupan més sitios de unién eon el ligando (ig. 7-17), La afinidad de la uni6n del ligando a una subunidad varia con su con- formacién y puede ser mayor o menor que la de las subunidades de Ia protefna libre de ligandos. Por lo tanto, las proteinas que siguen et modelo secuencial de alosterismo pueden ser cooperativas de manera positiva 0 negativa. Si el acoplamiento mecdnico entre las subunidades es en particular fuerte en ‘el modelo secuencial, los cambios conformacionales se producen simulténea- ‘mente y el oligémero conserva su simetria, como en el modelo de simetria. En- tonces, el modelo de simetrfa del alosterismo puede considerarse un caso extremo {del modelo secuencial mas general. ‘La unién del oxigeno a la hemoglobina presenta caracteristicas de ambos ‘modelos, El cambio conformacional cuaternario T —> R esti concertado, como lo requiere el modelo de simetria, Sin embargo, la unién del ligando al estado T provoca pequefas alteraciones estructurales terciarias, como lo predice el modelo secuencial, Sin duda, estos cambios conformacionales menores son res- pponsables de la formacién de una estructura que eventualmente dispara la tran- sicién T > R. Por lo tanto, parecerfa que la complejidad de las interacciones ligando-proteina en la hemoglobina y otras proteinas permite en los procesos. de unién un ajuste preciso a las necesidades del organismo sometido a varia- cciones de condiciones externas o internas. Revisaremos los efectos alostéricos ‘cuando tratemos las enzimas en el capitulo 12. [BH Hemoglbinas andmalas Antes del advenimiento de las téenicas de DNA recombinante, las hemoglo- binas mutantes provefan Io que era esencialmente Ia nica oportunidad de estudiar Jas relaciones entre estructura y funcién en las proveinas. Por esto, y por muchos afios, a hemoglobina fue la nica proteina de estructura conocida que tenia un gran rndimero de variantes naturales posibles bien caracterizadas. El estudio de indivi- ‘duos con discapacidades fisioldgicas, junto con et eribado electroforético de mues- tras de sangre humana, condujeron al descubrimiento de cerca de 900 variantes de hhemoglobina, de las cuales > 90% resultan de sustituciones tinicas de aminodcidos, en cadenas polipeptidicas de globina. En efecto, cerca del 5% de la poblacién hu- ‘mana mundial es portador de una variante de la hemoglobina heredada, 'No todas las variantes de las hemoglobinas producen sintomas clinicos, pero algunas moléculas de hemoglobinas anormales causan enfermedades debilitantes, (300 000 individuos con serias alteraciones de hemoglobina nacen todos los alos; Jas variantes naturales de la hemoglobina letales, por supuesto, no se observan).. En el cuadro 7-1 se enumeran algunas de estas variantes de Ia hemoglobina. Las ‘mutaciones que desestabilizan la estructura terciaria 0 cuatemaria de la hemoglo- bina alteran la afinidad de la hemoglobina por la uniGn del oxfgeno (pso) y redu- ‘cen su cooperacién (Coeficiente de Hill). Adem, las hemoglobinas inestables se degradan en los eritrocitos, y sus productos de degradacién a menudo hacen queSecclin 7-4 Memoglobinas anémalas 201 Cuadro 7-1 Algunas variantes de la hemoglobina Nombre” Mutacion Efecto. Hammersmith Phe CDI(42) + Ser __Debilta la unin det hemo Bristol ValE11(67)8 > Asp Debilita 1a unin del hemo Biba Lew H19(136)a—>Pro Rompe la hélice H Savannah Gly B6(24)B — Val Rompe lt interfaz de la lice BHE Philly ‘TyrCI(3s)a—> Phe Rompe Ia unidn hidrgeno en la interfaz 0-8 Boston His E7(S8)a Tyr Promueve la formacién de metahemoglobina Mitwaukee Val EL1(67)B—> Glu Promueve la formacion {de metahemoglobina Iwate His F8(87)a > Tyr Promueve la formacion ‘de metahemoglobina Yakima Asp GI(99)f > His Rompe el enlace hidrigeno que ‘estabiliza la conformacion T Kansas Asn G4(102)8 > Thr Rompe el enlace hidrzeno que estabiliza la conformacion R “Las varanes dela hemeoobina se denminan po rela geeral de acveto con e agar de sa descurimiento (pe, Hemoglobina Boston.) los eritrocitos se lisen (rompan). La anemia hemolitica resultante (anemia es Ia deficiencia de eritroctos) compromete la entrega de O2 a los tejidos.. Ciertas mutaciones en el sitio de unién del O; de la cadenas 0. 0 B favorecen Ia oxidacién del Fe(ID) a Fe({Il). Los individuos portadores de la subunidad de ‘metahemoglobina resultante presentan cianosis, un color de piel azulado, debido ‘ala presencia de metahemoglobina en su sangre arterial. Estas hemoglobinas tie- nen reducida su cooperacién (coeficiente de Hill ~1,2 comparado con un valor ‘miximo de 2, debido a que sélo dos subunidades de cada una de estas metahe- ‘moglobinas pueden unir oxigeno) Las mutaciones que aumentan la afinidad de la hemoglobina por el oxfgeno originan un incremento det nimero de eritrocitos para compensar Ia menor ean- tidad de oxigeno liberado en los tejidos respecto de lo normal. Los individuos con esta afecci6n, llamada policitemia, frecuentemente tienen una cotoracién rojiza ‘Anemia de células falciformes. Las variantes de la hemoglobina més graves se prodlucen en s6lo unos pocos individuos del total de los que presentan la mutacién, Sin embargo, ~10% de los negros americanos y hasta el 25% de los negros africa ‘nos son portadores de una sola copia (son heterocigotos) del gen de a hemo- slobina de células falciformes (hemoglobina S). Los individuos portadores de dos copias (son homocigotos para) del gen para la hemoglobina S sufren anemia de células faleiformes, donde la desoxihemoglobina S forma filamentos insolubles que deforman los crtroctos (fig. 7-18). En esta enfermedad dolorosa, debilitante y fre~ ccuentemente fatal, las células rigidas faliformes no pueden pasar con faciidad a través de los capilares, En consecuencia, en una “erisis” de eélulas falciformes, la sangre que corre a algunos tejidos puede bloquearse por completo y provocar a muerte del tejido, Ademés, Ia fragilidad mecéinica de las células deformadas provoca anemia hemolitica, Los heterocigotos, cuyas. hemoglobinas son ~40% Figura 7-118 Micoapaia electric de bari de ertoctos humanos. a) Los eritacitos rermaes son discos bicéncaosflenbles que pueden tlrr lgras dstosiones cuando pasan 2 ‘raves de capilares (muchos de los cuales tone digmetos menores que ls ertocitos). (David M. Philpsisuals Unlimited) (6) Los ertoctsfacfres de n individu con anemia de Blas {aliarnesestn elongadesy riids y no pueden pase fécilmente através de los capes. (Bill, Longcorehoto Researches, In.) 6)202 —copitilo 7 Funcién de tas proteinas: mioglbina y hemoglobine Figura 7-20 Wicrotpaia electnica de irs de desoxienogloina $ de un eritocto roto esparcids. (Cotesia de Robert Josephs, University of Chicago) Figura 7-19 Estuetura de ua fibra de desoritemogotnaS. (a La dspesiién de las models e desonheroglobina S en la itr. Solo se muestra tres subundades de cada molécula de tesonernoglbina S. (0) La cadena lateral del mutante Val 6 en a cadena ld una molécula de hemeeabia § (punto amarillo en pare a) se une aun bos hidobo sobre a subunided By de una molécul vcina de desoxieroglobig S (lutacién, Ining Ges. Imagen de Inving Geis Colecton Howard Hughes Medical Insite. Derechos pertnecientes @ HHMI Reproduccién so con atrizacién) hemoglobin S, genealmente evan una vida normal, a pes de ue sus eritoci- tos tienen un tiempo de vida menor que el normal En 1945 Linus Pauling present la hipotesis de que la anemia faleiorme era resultado de una hemoglobina mataate, y en 1949 demosts que la hemoglobina fhutante tenia una carga {nica negativa menor que la hemoglobina den adulto normal, Esta fe la primera evidencia de que una enfermedad poriaprovenir de tna ateracién en la estructura molecular de la proteina, Ademés, como la ane- tna fleiforme es una enfermedad herditaria, el gen defectuoso debe ser el res- posable dela proteina anormal. Sin embargo, el defecto molecular en la hemo- {lobina faleiforme no se identficé hasta 1956, cuando Vernon Ingram demostr6 {que la hemoglobina S conten Val en lugar de Gi en la sexta posicin de cada adena B. Esta fue la primera vez que se demostr6 que una enfermedad heredi- tara surgia a partir de'un cambio especfico de un aminoeido en una proetna. ‘Actualment, se identificaron mis de 1500 “genes de enfermedades” donde una rmutacign eonduce a la produccién de una proteina defectuosa que es dieeta- mente responsable de los efectos patoligicos, La estructura or dfracién de rayos X dela desoxihemoglobina S revelé que ‘una cadena lateral con la Val mutante en cada tetramero de hemoglobina S se in- ‘troduce en un “bolsillo” hidréfobo sobre la superficie de una subunidad fen otro tetximero de hemoglobina (fg. 7-19), Este contacto intermoleular permite que los tettimeros de hemoglobin $ formen polimeroslineaes. Los agregados de I e- bras que se enollan unas con otras forma fibras con un didmetro de ~220 A. Las fibras se extienden alo largo del extocito (ig. 7-20). El bolsllohidrfobo en la subunidad B no puede acomodarnormalmente la cadena lateral de Glu, y este bol- silo est ausenteen la oxihemoglobina. En consecuencia, la hemoglobina normal ¥ la oxihemoglobina $ no pueden polimerizar. De hecho, ls ibras de hemoglo- bina $ se disuelven en esencia instantineamente en la oxigenacdn, de manera que ninguna est presente en la sangre arterial. El peligro de las faleformes es mayor ‘cuando los eitrocitos pasan a través de los capilares, cuando se prosiuce la des- ‘oxigenacién, La polimerizacién de las moléculas de hemoglobina S depende del tiempo y Ia concentracién, lo que explica por qué se produce el bloqueo del jo de sangre s6loesporidicamente (en la “exsis" de la esl fliforme). Es interesante observar que muchas hemoglobinas S homocigotaspresentan sélo una forma moderada de anemia faleforme porque expresanniveles reatvamentealtos de hemoglobina fetal, que contiene mas cadenas 7 que las cadenas B defec- tuosas. La hemoglobina fetal diluye la hemoglobina S, lo que hace mis dificil para Ja hemoglobina S su agregacién durante los 10-20 s que le toma a un eritacito via- Jar desde los tejdos hacia los pulmones para la reoxigenacién. La administracién de hidroxiurea, ° I H.N—C—NH—OH Hidroxiurea cl primero y atin tinico tratamiento efectivo para la anemia de células falefor- 1mes mejora los sintomas al inerementar la fraccién de eélulas con hemoglobina fetal (a pesar de que el mecanismo por el cual acta la hidroxiurea se desconoee. Paludismo y hemoglobina S, Antes del advenimiento de las terapias paliativas, ‘modemas, los individuos con anemia faleiforme raramente sobrevivian a a ma- ‘durez, Sin embargo, la seleccién natural no minimiz6 la prevalencia de Ia varie~ ‘dad hemoglobina S, dado que los heterocigotos son mas resistentes al paludismo, La enfermedad es la més letal de las infeeciones que afectan en el presente a la umanidad: de los 2 500 millones de personas que viven en las éreas endémicas de paludismo, 100 millones estin clinicamente enfermas de manera permanente y alrededor de 1 millén, la mayoria nifios muy pequefios, mueren por esta afec- ‘i6n todos los alos. El paludismo es causado por el protozo0 Plasmodium falci- parum transmitido por la picadura de! mosquito, que habita en el eritrocito du- rante la mayoria de su ciclo de vida de 48 h. Los eritrocitos infectados se adhieren a las paredes de los capilares y causan la muerte cuando las células impiden que la sangre fluya hacia un érgano vital. Las regiones de Africa ecuatorial donde el paludismo es la mayor causa de ‘muerte coinciden precisamente con las reas donde prevalece el gen de las cétu- las aleiformes (fig. 7-21), lo que sugiere entonces que éste confiere resistencia al paludismo. ;Cémo lo hace? El plasmodio sumenta la acidez, de los ertrocitos in- fectados en ~O.4 unidades de pH. El pH bajo favorece la formacién de desoxihe- moglobina mediante el efecto Bohr, lo que aumenta entonces la probabilidad de falciformes en los eritrocitos que contengan hemoglobina S, Los ertrocitos fae formes se eliminan normalmente de la circulacién por el bazo. Durante las etapas tempranas de! paludismo, cuando los eritrocitos parasitados se pegan a las pare- des de los eaplares (presumiblemente para evitar que el bazo los elimine de la circulaci6n), los faleiformes pueden destrozar mecénicamente al parésito. En con- secuencia, los heterocigotos portadores de hemoglobina S en la reyiGn de palu- puede ser de 10 mm Hig en ta su petficie de la ella y de 1 mm Hg en la mitocondria (orgénulo ‘donde tiene lugar el metabolismo de oxidacién). Use la ec. 7-6 para demostrar e6mo Ia mioglobina (eo = 28 mm Hg) facilita la ifusibn del O; através de estas esllas 4. Bn los seres humanos la rgencia por respirarproviene de la ata ceancentracién de CO; en la sangre; no hay sensores isolgicos directs de la pO; de la sangre, Los buceadores a menudo hiper- ventlan (respitan eipido y profundamente por varios minutos) justo antes de sumergrse creyendo que eso incrementar la con- ‘centracién de Os en la sangre, (a) {Se produce eso? (b) Aplique 10. ‘mds de una hora, sumerge su presa para asfixiarla y luego come tranquil, Como adaptacidn que ayuda al cocodrilo en esto, puede tutlizar viralmente el 10066 del Oy de su sangre mientras que los seres humanos, por ejemplo, podemos extrr slo ~65% del (0. en su sangre. La Hb del cocodrilo no se une al BPG. Sin em ‘argo, la desoxiltb del cocodilo preferentemente se une al HCO {sCémo ayuda esto al cocorlo en la obtencién de su comida’? Algunos animales primitivos tienen una hemoglobina que presenta dos subunidades idnticas. (2) Represente una curva de unin de oxigeno para esta proeina. (b) Cus es el rango probable para el coeficiente de Hill para festa hemoglobins?CAPITULO Los azicres son moléculselativamente simples que pueden units de vais maneras gaa formar obras ms grandes, por eeple, el amin, Est forma de alnacenamiento de crbohicrals es a fuente de enegla primar en muchos alimentes, includes e pan, el ara 1 las pasts, (Chaves. WintersPhoto Researchers.) Carbohidratos 1. Monosacéridos 3. Glucoprateinas A. Clsifcain de ks moesackios A. Preeglcans BB, Canfgractn ycontrmacion Paes elles batrinas CC. Ostia oes ateaes C. Protas gucasiadas 2. Polisacéridos D. Funcones de ls oligosacros A, Disactridos 1B. Plsacdries esteturales: cella y qutna CC. Pieces de almacenamient: amin ygluctge 1. Glucosamingglucanos 206