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MANUAL DE

PRCTICAS DE
LABORATORIO

CARRERA
ASIGNATURA
FICHA TECNICA
MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO ITA-IBT

PRCTICA DE LABORATORIO
MICROBIOLOGA GENERAL

Fecha: 03-SEP-2015
Nombre del catedrtico: JUANITA YAZMIN DAMIAN ALMAZO

Nombre de la prctica: TCNICAS TINCIN Y VISUALIZACIN DE MICROORGANISMOS EN MICROSCOPIO

Clave:
ID. 1619
Nmero de prctica: 03 Duracin en horas: 03

Justificacin: El uso de tinciones de microorganismos obtenidos de diversos ambientes y su


observacin en microscopio es una herramienta bsica para iniciar una caracterizacin
morfolgica preliminar, por ello es importante que el alumno conozca las tcnicas de
frotis y fijacin de microorganismos de muestras slidas y lquidas y aprenda a
seleccionar el tipo de tincin adecuado para visualizar una caracterstica morfolgica
particular.
Objetivos/Resultados de - Que el alumno reconozca las partes de un microscopio y aprenda a utilizar los
aprendizaje: diferentes aumentos para determinar caractersticas morfolgicas de
microorganismos.
- Que el alumno conozca y aplique tcnicas de frotis de muestras slidas y lquidas as
como tcnicas de fijacin de bacterias y de hongos.
- Que el alumno conozca y aplique diferentes tipos de tincin bacteriana a muestras
obtenidas de diversos ambiente y con ello sea capaz de dar una descripcin
morfolgica bsica del microorganismo.
- Que el alumno pueda relacionar el efecto de las diferentes tinciones bacterianas con
una caracterstica celular de los microorganismos.
Laboratorio donde se desarrollo de la prctica:
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA
Actividades a desarrollar:
1.- Identificacin de partes de un microscopio.
2.-Preparar frotis de muestras slidas y lquidas de diversos microorganismos.
3.- Fijar los frotis generados a partir de muestras slidas y lquidas fijadas.
4.- Aplicacin de tinciones simples y diferenciales.
5.- Uso de los diferentes objetivos del microscopio para observar caractersticas morfolgicas, tipos de agrupaciones y
movilidad de bacterias, hongos y protozoarios.
Evidencia a generar en el desarrollo de la prctica:
1.- cuestionario pre-laboratorio
2.- reporte de prctica por equipo de trabajo
3.- portaobjetos con muestras fijadas de diversos ambientes
4.- video de movimientos de protozoarios en muestras liquidas y fotografas de morfologa de bacterias y hongos.

COMPETENCIAS HABILIDADES
Capacidad para aplicar conocimientos de biologa Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de:
celular de procariontes para seleccionar los tipos - Hacer frotis y fijacin de microorganismos obtenidos de
de tincin a usar. muestras slidas y lquidas para poder aplicar tcnicas
Habilidad en el uso de tcnicas de manipulacin, de tincin dependiendo de la caracterstica morfolgica
fijacin y tincin de microorganismos. que se quiera determinar mediante microscopia.
Capacidad de trabajar en equipo.

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Elabor: Juanita Yazmin Damin Almazo Revis:


INTRODUCCIN
PRELABORATORIO:
Emplea las siguientes preguntas para armar la introduccin y antecedentes de tu reporte de
prctica, NO las coloques textualmente.
1.- Qu es un frotis? Cmo haces un frotis de muestras lquidas y slidas?
2.- Qu tcnica usas para ver movilidad de microorganismos?
3.- Para que sirve la fijacin de un frotis?Cules son los diferentes tipos de tcnicas de fijacin que
existen?
4.- Qu es una tincin? Cuntos tipos de tinciones hay?Porqu se clasifican as?
5.- Cules son los tipos de colorantes que existen para hacer tinciones? Cmo los clasifican? Por qu se
clasifican as?
6.- Por que todas las bacterias se tinen con el cristal violeta?
7.- Que caracteristicas tienen los colorates que utilizaste en la prctica?
8.- Investiga que tipos de variables pueden ocasionar un resultado no deseado al realizar la tincion
9.- Qu caractersticas morfolgicas, de agrupacin o movimiento puedes observar con las tinciones?
10.- Cules son los diferentes tipos de agrupaciones bacterianas?Cules son los tipos de movimientos
bacterianos?Cmo puedes describir la morfologa bacteriana?
11.- Cmo puedes distinguir los protozoarios de las algas?Qu estructuras puedes ver en microscopio?
12.- Cules son las formas de visualizar hongos filamentosos en microscopio?Cules son las
precauciones que debes tomar para manipularlos?Cmo se clasifican los micelios de los hongos?

OBJETIVO

Aprender a visualizar en microscopio diversos tipos de microorganismos identificando sus


principales caractersticas morfolgicas mediante el uso de tinciones.

MATERIALES REQUERIDOS POR EQUIPO (Cristalera)


CANTIDAD MATERIAL ESPECIFICACIONES
1 Vaso de precipitado 100 ml

1 Puente de varillas de cristal


1 Pinzas
1 Mechero de Bunsen
12 Portaobjetos
12 Cubreobjetos
8 Goteros o pipetas Pasteur
1 Perilla de goma para pipeta Pasteur
2 Asa bacteriolgica
1 Piceta
1 Recipiente con fondo bajo
1 Cultivo bacteriano lquido* 1 ml
2 Cajas con cultivo bacteriano*
1 Caja con cultivo de hongo filamentoso*
*Estas muestras ya se prepararon en las prcticas anteriores

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EQUIPO REQUERIDOS
NOMBRE ESPECIFICACIONES
1 Microscopio

OTROS MATERIALES REQUERIDOS


(No suministrados por el Laboratorio)
CANTIDAD MATERIAL ESPECIFICACIONE
S
1 Papel absorbente paquete
1 Atomizador con alcohol
1 Encendedor
1 Marcador permanente SHARPIE
1 Cinta adhesiva transparente 1cm x 1cm
4 Palillos
1 Guantes
1 Cubrebocas
1 Agua de charco o florero con sedimento 5 ml
1 Solucin desinfectante lquida 40 ml
1 Tinta china 0.5 ml
1 Bolsa plstica para desecho de papel
1 Recipiente de vidrio con tapa para desechos lquidos 300-400 ml

REACTIVOS REQUERIDOS
NOMBRE CANTIDAD S I R O

Nigrosina o tinta china 2 ml


Cristal violeta 5 ml
Solucin idica de Gram 5 ml
Safranina 5 ml
Lactofenol azul de algodn 2 ml
Azul de metileno 5 ml
Aceite de inmersin 2 ml
Alcohol etlico 10 ml
Agua destilada 50 ml
Solucin desinfectante 90 ml

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S: Riesgo a la Salud I: Riesgo de Incendio R: Riesgo de reactividad O: Riesgo Especifico

PROCEDIMIENTO O METODOLOGA
NOTA.- Deposita todos los desechos generados de los lavados en el puente de varillas de cristal en la
charola de fondo bajo

1.- OBSERVACIN DE ALGAS Y PROTOZOARIOS

NOTA: Es indispensable que durante la realizacin de esta prctica se utilicen guantes y cubrebocas.

a) Despus de verificar que los portaobjetos y cubreobjetos se encuentran limpios se aplica con la ayuda de
los palillos una muy pequea muestra del sedimento del agua estancada en la parte central del portaobjetos
tratando de desbaratarla lo mas posible, y con ayuda del gotero se coloca una muy pequea cantidad del
agua de la muestra sobre el sedimento.

b) Se coloca con cuidado el cubreobjetos sobre la muestra procurando que no queden burbujas de aire.

c) El portaobjetos con la muestra se coloca sobre la platina del microscopio y la muestra se observa con el
objetivo de 10X, una vez localizado algn microorganismo se hace la visualizacin con el objetivo 40x.
Registra las observaciones de los diferentes microorganismos que se hayan encontrado en la muestra
(apariencia, estructuras celulares y descripcin de movimiento) con cada uno de los aumentos.

d) Despus de concluir la observacin de la muestra el portaobjetos se deposita en un recipiente con


solucin desinfectante.

2.- FROTIS, FIJACIN Y TINCIN DE BACTERIAS

2.1 FROTIS DE MUESTRAS

NOTA: Es indispensable que durante la realizacin de esta prctica se utilicen guantes y cubrebocas.

2.1.1 MUESTRA LQUIDA

a) Se esteriliza el asa bacteriolgica en la flama del mechero y se deja enfriar.

b) En condiciones estriles se toman dos o tres gotas del pre-inculo lquido (previamente agitado para
homogenizar el cultivo bacteriano) utilizado en la Prctica 2: TCNICAS Y MTODOS DE AISLAMIENTO Y
SELECCIN DE MICROORGANISMOS con el asa bacteriologica esteril y se colocan en la parte central un
portaobjetos limpio y rotulado en un extremo procurando extender las gotas en forma circular sin que
alcancen los bordes del portaobjetos.

c) Despus de extender la muestra sobre el portaobjetos el asa bacteriolgica se esteriliza inmediatamente


flamendola en el mechero y se deja enfriar.

d) El portaobjetos con la muestra se deja a temperatura ambiente hasta que el lquido se evapore.

2.1.2 MUESTRA SLIDA

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a) Se esteriliza el asa bacteriolgica en la flama del mechero y se deja enfriar.

b) Con ayuda del asa bacteriolgica estril se colocan una o dos gotas de agua sobre la parte central de un
portaobjetos limpio y rotulado en un extremo con el nombre de la muestra.

c) Inmediatamente despus el asa bacteriolgica se esteriliza en el mechero y se deja enfriar.

d) En condiciones estriles se toma una pequea cantidad de una colonia (la ms aislada) de las cajas con
el pre-inoculo estriado o plaqueado en la prctica 2: TCNICAS Y MTODOS DE AISLAMIENTO Y SELECCIN DE
MICROORGANISMOS y con ayuda del asa se dispersa en la gota de agua colocada en el portaobjetos.

e) Inmediatamente despus de extender la muestra sobre el portaobjetos, el asa bacteriolgica se esteriliza


flamendola en el mechero y se deja enfriar.

f) El portaobjetos con la muestra se deja a temperatura ambiente hasta que el lquido se evapore.

g) Se repite el procedimiento (incisos (a-f)) para tener dos portaobjetos con frotis de colonias de pre-inculo
(cajas de la prctica 2: TCNICAS Y MTODOS DE AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS) y dos
portaobjetos con frotis de una colonia obtenida de muestras ambientales (cajas de la prctica 1:
PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO)

2.2 FIJACIN DE MUESTRAS

NOTA: Es indispensable que durante la realizacin de esta prctica se utilicen guantes.

a) Una vez que los frotis con muestras lquidas y slidas estn secos se pasan dos o tres veces sobre la
flama del mechero siempre con la muestra hacia arriba para no quemarla. Se debe de evitar que el calor sea
excesivo para no alterar la muestra (se puede sujetar el portaobjetos con pinzas para ayudar a flamearlo y
evitar quemaduras).

2.3 TINCIN DE BACTERIAS

2.3.1 TINCIN SIMPLE

NOTA: Es indispensable que durante la realizacin de esta prctica se utilicen guantes.

a) Se coloca un portaobjetos de la muestra fijada con el frotis del pre-inculo en medio lquido, y un
portaobjetos con el frotis fijado del pre-inculo en medio slido y un portaobjetos con el frotis fijado de la
muestra ambiental de medio slido sobre el puente de varillas de cristal y con ayuda de un gotero se cubren
las muestras con azul de metileno evitando que escurra.

b) Se deja actuar el colorante durante 1 minuto sobre la muestra, posteriormente se escurre el exceso del
colorante y se lava suavemente el portaobjetos con la piceta de agua destilada para eliminar el exceso de
colorante.

c) Los portaobjetos se colocan sobre papel absorbente y las gotas de agua remanentes se dejan secar a
temperatura ambiente.

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d) Una vez secos se coloca un cubreobjetos sobre la muestra y se observa en microscopio. La ubicacin de
los microorganismos puede hacerse con el objetivo del menor aumento y despus se emplea el objetivo
100x para observar sus caractersticas. Previo a la observacin con el objetivo 100x debe colocarse una
gota de aceite de inmersin entre el cubreobjetos y el lente del microscopio.

e) Una vez registradas las observaciones de morfologa y agrupacin bacteriana el portaobjetos se retira del
microscopio y se coloca en un recipiente de vidrio con solucin desinfectante y el lente con el objetivo 100x
del microscopio se limpia para eliminar el aceite de inmersin.

2.3.2 TINCIN NEGATIVA

NOTA: Es indispensable que durante la realizacin de esta prctica se utilicen guantes.

a) Se coloca un portaobjetos limpio y rotulado sobre el puente de varillas de cristal y con ayuda del asa
bacteriolgica estril se coloca una pequea gota de nigrosina o tinta china en un extremo del portaobjetos
(aproximadamente a 0.5 cm del borde).

b) El asa bacteriolgica se esteriliza en el mechero y ya que se ha enfriado se toma en condiciones estriles


una colonia bacteriana de las cajas estriadas o plaqueadas con pre-inoculo (prctica 2: TCNICAS Y
MTODOS DE AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS) y se mezcla cuidadosamente en la gota
de colorante que esta sobre el portaobjetos.

c) Inmediatamente despus el asa bacteriolgica se esteriliza en la flama del mechero y se repite el


procedimiento del inciso (a) y (b) empleando una colonia obtenida de muestra ambiental (prctica1:
PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO).

d) Con el extremo de otro portaobjetos se extienden las gotas de la muestra mezclada con el colorante a lo
largo de la superficie del portaobjetos donde esta contenida. El portaobjetos que se us para hacer la
extensin del cultivo se deposita en solucin desinfectante.

e) Los portaobjetos con la mezcla de colorante y bacterias extendidas se dejan secar a temperatura
ambiente. NO SE FIJAN CON CALOR.

f) Una vez secos, se coloca un cubreobjetos sobre la muestra y se observa en microscopio con los objetivos
10x, 40x y 100x. Previo a la observacin con el objetivo 100x debe colocarse una gota de aceite de
inmersin entre el cubreobjetos y el lente del microscopio.

g) Una vez registradas las observaciones el portaobjetos se retira del microscopio y se coloca en un
recipiente con solucin desinfectante y el lente con el objetivo 100x del microscopio se limpia para eliminar
el aceite de inmersin.

2.3.3 TINCIN DE GRAM

NOTA: Es indispensable que durante la realizacin de esta prctica se utilicen guantes y cubrebocas.

a) Se coloca un portaobjetos con el frotis fijado del pre-inculo en medio slido y un portaobjetos con el frotis
fijado de la muestra ambiental de medio slido sobre el puente de varillas de cristal y con ayuda de un
gotero se cubren las muestras con cristal violeta evitando que escurra.

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b) Se deja actuar el colorante sobre las muestras durante 30 segundos, posteriormente se escurre el exceso
del colorante y se lavan suavemente los portaobjetos con la piceta de agua destilada aproximadamente
durante dos o tres segundos.

c) Con ayuda de un gotero las muestras lavadas se cubren con la solucin idica de Gram y se deja actuar
durante 1 minuto.

d) Se escurre la solucin y las muestras se lavan con alcohol etlico 95% (durante 10 a 20 segundos).
Posteriormente los portaobjetos se lavan durante unos segundos con la piceta de agua destilada

e) Con ayuda de un gotero las muestras se cubren con safranina y de deja actuar durante 20 segundos.
Posteriormente la solucin de safranina se escurre y las muestras se lavan con la piceta de agua destilada.

f) Los portaobjetos se colocan entre papel absorbente para secar las gotas de agua remanentes.

g) Una vez secos, se coloca un cubreobjetos sobre las muestras y se observa en microscopio con los
objetivos 10x, 40x y 100x. Previo a la observacin con el objetivo 100x debe colocarse una gota de aceite de
inmersin entre el cubreobjetos y el lente del microscopio.

h) Una vez registradas las observaciones el portaobjetos se retira del microscopio y se coloca en un
recipiente con solucin desinfectante y el lente con el objetivo 100x del microscopio se limpia para eliminar
el aceite de inmersin.

2.4 TINCIN DE HONGOS FILAMENTOSOS

NOTA: Es indispensable que durante la realizacin de esta prctica se utilicen guantes y cubrebocas.

a) Se coloca un portaobjetos limpio y rotulado sobre el puente de varillas de cristal y se le adiciona en la


parte central una gota de colorante lactofenol azul de algodn con ayuda de un gotero.

b) Con la ayuda de las pinzas previamente esterilizadas en mechero se toma un trozo de cinta adhesiva de
aproximadamente 1cm2.

c) En condiciones aspticas se abre la caja del cultivo con el hongo y se presiona ligeramente la parte
adhesiva de la cinta contra el micelio.

d) Se coloca la cinta sobre la gota de lactofenol azul de algodn del portaobjetos procurando que quede
extendida evitando hacer mucha presin para evitar daar hifas y cuerpos fructferos. Inmediatamente
despus se esteriliza la pinza utilizada en el mechero.

e) Una vez extendida la cinta adhesiva con el micelio en el portaobjetos se adiciona una gota del colorante
lactofenol azul de algodn sobre la cinta y se coloca un cubreobjetos.

f) La muestra se coloca en el microscopio y se registran las observaciones hechas con los objetivos de 10x y
40x.

g) Una vez registradas las observaciones de morfologa del hongo, el portaobjetos se retira del microscopio
y se coloca en un recipiente con solucin desinfectante.

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REPORTE DE LA PRCTICA
El reporte de la prctica se realizar tomando en consideracin los apartados a evaluar en la rbrica
de evaluacin descrita en la matriz de sesiones.

Toma video o fotografa de los resultados vistos en el microscopio para anexarlos al reporte de tu
prctica y poder correlacionarlos con la estructura celular de los microorganismos

EVIDENCIAS DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS DURANTE LA


PRCTICA

DISCUSIN

CONCLUSIN

BIBLIOGRAFA
Consultada por el maestro y por el alumno