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Guia de Inmunologia PDF
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La Sra. Viviana Chevaga, secretaria del rea, los orientar administrativamente en el horario
de 13.30 a 19.30 en forma telefnica (4524-8450) o por mail a inmuno@fvet.uba.ar.
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Docentes del curso 2012
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INDICE
Sistema de evaluacin 4
Bliografa ampliatoria 5
Programa analtico 5
Conceptos bsicos de bioseguridad 8
Toma de muestras para la evaluacin del sistema inmune 12
Tcnicas de evaluacin de inmunidad innata 16
Complemento 23
Anticuerpos 25
Purificacin y fraccionamiento de anticuerpos 27
Protenas del plasma y suero 36
Electroforesis 37
Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 42
Introduccin a las tcnicas serolgicas 48
Diliciones 48
Conversin serolgica o seroconversin 50
Sensibilidad y especificidad 52
ELISA 53
RIA (radioinmunoensayo) 62
Inmunoblot 63
Inmunocromatografa 66
Inmunohistoqumica 67
Inmunofluorescencia 69
Citometra de Flujo 73
Tcnicas de interaccin secundaria: precipitacin y aglutinacin 79
Grupos sanguneos 90
Linfoproliferacin 94
Tcnica de seroneutralizacin 98
Inhibicin de la hemoaglutinacin 104
Tcnica de fijacin de complemento 106
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Tcnica de polarizacin fluorescente 109
Citotoxicidad 112
Tcnicas para la deteccin de anticuerpos maternales 117
Inmunoelectroforesis 120
Ejercicos y problemas de aplicacin 124
REGULARES: Parasitologa
Fisiologa
Microbiologa
SISTEMA DE EVALUACIN
Los alumnos sern evaluados a travs de:
a) El desempeo en los trabajos prcticos.
b) La aprobacin de los informes de laboratorio.
c) Dos parciales obligatorios.
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BIBLIOGRAFA FUNDAMENTAL
TIZARD, I. Inmunologa Veterinaria. 8Va. Edic. 2009. Editorial Harcourt Grade de Espaa
SA. 592PP.
BIBLIOGRAFA AMPLIATORIA
DAY M.J. Clinical Immunology of the Dog and Cat 2da. ed., Editorial Blackwell. 2008.
MURPHY K., TRAVERS P., WALPORT M. Inmunobiologa de Janeway, 7ma. ed., Editorial
Mc Graw Hill. 2010.
REGUEIRO GONZALEZ J., LOPEZ LARREA C., GONZALEZ RODRIGUEZ S., MARTINEZ
NAVES E. Inmunologa: Biologa y Patologa del Sistema Inmunitario, 4ta. ed., Editorial
Panamericana. 2010
PARSLOW T., STITES D. Inmunologa Bsica y Clnica, 10ma ed., Editorial Manual
Moderno. 2005.
PROGRAMA ANALTICO
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Unidad 2: Inmunoqumica
ANTGENOS
Antigenicidad e Inmunogenicidad.
Estructura fsico-qumica de los antgenos. Haptenos. Carriers. Concepto y tipos de
determinantes antignicos.
Tipos de Antgenos: propios (de rgano; de grupos sanguneos; de gnero H-Y) y extraos (de
patgenos, de tumores, de transplantes).
ANTICUERPOS
Inmunoglobulinas (Igs) de membrana y secretadas.
Estructura fsico-qumica: cadenas pesadas y livianas, dominios constantes y variables. Clases
y subclases.
Caractersticas de las Igs en las diferentes especies domsticas y de produccin: IgT en
equinos, IgY en aves e Igs en camlidos.
La Ig como antgeno: isotipo, alotipo e idiotipo.
Funciones biolgicas de las diferentes clases de Igs. Distribucin en el organismo.
RESULTADO DE LA UNION DEL ANTICUERPO CON EL AG.
Neutralizacin. Opsonizacin. Activacin del Complemento. Citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpos (ADCC).
PASAJE DE IGS MATERNO FETAL.
Incidencia de los diferentes tipos de placentacin en el pasaje de Igs. de la madre al feto en las
especies domsticas. Composicin en Igs. del calostro y leche. Importancia de la ingestin de
calostro.
Tcnicas de determinacin de la ingestin de calostro.
COLABORACIN CELULAR
Activacin de los LT, Interleuquinas. Influencia del antgeno y el microambiente en la
cooperacin celular: Perfiles Th 1 y Th 2.
Colaboracin T-B: Activacin de LB y produccin de Igs: Switch isotpico. Antgenos timo-
dependientes y timo-independientes.
Colaboracin T-T: Citotoxicidad ejercida por LT citotxicos.
Colaboracin T-Macrfagos: Macrfagos activados.
Memoria inmune.
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REGULACIN DE LA RESPUESTA INMUNE
Regulacin intrnseca: Efecto de la desaparicin del Ag., Niveles de Igs: retroalimentacin.
Regulacin por linfocitos T (Th 3).
Regulacin extrnseca: neuroinmunoendocrinologa.
Regulacin en sitios privilegiados: ojo, placenta, sistema nervioso central.
CINTICA DE LA RESPUESTA INMUNE
Respuesta inmune sistmica.
Respuesta inmune en mucosas: caractersticas diferenciales en las especies domsticas.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO I
Alergia. Shock anafilctico: rgano de choque en las diferentes especies.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO II
Daos por anticuerpos en enfermedades autoinmunes y en reacciones alogeneicas. Anemia
hemoltica en equinos y cerdos.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO III
Daos por complejos inmunes en enfermedades autoinmunes y en enfermedades infecciosas
crnicas. Pimetra en caninos.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV
Bases celulares de la hipersensibilidad retardada. Granuloma tuberculoso. Dermatitis por
pulgas en caninos.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO V
Anticuerpos anti-receptores.
FENMENOS DE AUTOINMUNIDAD
Concepto. Ejemplos de enfermedades autoinmunes especficas de rgano y sistmicas.
INMUNODEFICIENCIAS
Inmunodeficiencias primarias y secundarias. Virus inmunosupresores que afectan las diferentes
especies.
TRANSPLANTES
Mecanismos de rechazo del injerto.
RESPUESTA INMUNE A TUMORES
Unidad 7: Inmunoprofilaxis
INMUNOPROFILAXIS PASIVA
Ventajas e inconvenientes de su uso.
ELABORACIN DE SUEROS HIPERINMUNES
Uso de aves en la elaboracin de sueros hiperinmunes.
Produccin de anticuerpos por biotecnologa.
INMUNOPROFILAXIS ACTIVA
Tipos de vacunas. Ventajas e inconvenientes de su uso:
Vacunas atenuadas.
Vacunas inactivadas.
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Vacunas a subunidades. Vacunas a pptidos.
Vacunas recombinantes (a vectores).
Vacunas deleteadas.
Vacunas a DNA desnudo.
METODOLOGA DE PREPARACIN DE VACUNAS
Proceso de produccin de inmungenos a escala industrial.
Requisitos de bioseguridad.
Controles durante las diferentes etapas de produccin.
Mtodos de inactivacin.
Mtodos de atenuacin.
Uso de adyuvantes.
Aprobacin de vacunas por organismos oficiales. Controles de inocuidad, esterilidad y
potencia.
ADMINISTRACIN DE VACUNAS
Vas de inmunizacin.
Esquemas de vacunacin en las diferentes especies animales.
Vacunas mixtas.
Fracasos de la vacunacin.
Reacciones adversa a la vacunacin.
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prcticas de trabajo) que reduzca la exposicin hasta lmites mnimos, de forma que estn
expuestos al menor riesgo posible (aclarando que, el riesgo cero no existe).
Grupo 2. Aqullos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden suponer un
peligro para las personas expuestas, siendo poco probable que se propaguen a la poblacin.
Generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:
Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Salmonella sp, Shigella sp, Candida sp,
Cryptococcus neoformans.
Grupo 4. Agentes que, causan enfermedades graves en el hombre, y suponen un serio peligro
para otras personas expuestas, con muchas probabilidades de que se propague a la poblacin.
Generalmente no se cuenta con profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:
Virus de Lassa, Machupo y Ebola.
Niveles de contencin
El primer principio de Bioseguridad es la contencin.
El trmino "contencin" se emplea para describir los mtodos que hacen seguro el manejo de
materiales infecciosos en el laboratorio. El propsito de la contencin es reducir al mnimo la
exposicin del personal de los laboratorios, de otras personas y del entorno, a agentes
potencialmente peligrosos.
Se suelen describir cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten en
la combinacin, en menor o mayor grado, de tres elementos de seguridad biolgica: la tcnica
microbiolgica, el equipo de seguridad y el diseo de la instalacin. Cada combinacin est
especficamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vas de transmisin de los
agentes infecciosos y la funcin o actividad del laboratorio.
a) Nivel de contencin 1:
Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biolgicos del grupo 1.
Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de universidades o centros
docentes donde se emplean cepas no patgenas (E. coli K12, B. Subtilis, Naegleria sp,
Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos tpicos son todos los microorganismos que se
utilizan en la industria de la alimentacin para la elaboracin de quesos, cerveza, embutidos,
etc.
b) Nivel de contencin 2:
Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia
flora habitual del hombre, son capaces de originar patologas infecciosas humanas de
gravedad moderada o limitada.
Deben ser manipulados por personal especializado (tcnicos de laboratorio, especialistas en
Microbiologa) y son los que con ms frecuencia se estudian en el Laboratorio de Diagnstico
Veterinario (Ascaris sp, Estafilococos, Salmonella, Toxoplasma, Clostridium sp, etc.).
c) Nivel de contencin 3:
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Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo 3, microorganismos
que cursan con patologas graves, de difcil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas
y son capaces de producir la muerte. El mayor y ms frecuente peligro que entraan stos es la
infeccin adquirida a travs de aerosoles y fluidos biolgicos. Por ello, las principales medidas
a tomar en este caso son la correcta manipulacin y la utilizacin de cabinas de seguridad.
En los Laboratorios de Diagnstico Veterinario debe evitarse la contaminacin ambiental y la
infeccin del operador con patgenos como M. tuberculosis, Brucella sp, Virus de la
encefalomielitis equina, etc. Estos microorganismos slo pueden ser procesados por personal
calificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contencin 3, es
decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculacin de aire, con gradiente de presin,
cabinas de seguridad, etc.
d) Nivel de contencin 4:
Es el nivel requerido cuando se trabaja con un agente patgeno extico o no, que
produce una enfermedad infectocontagiosa, de alta mortalidad y para la cual no existe
tratamiento o el tratamiento existente es poco fiable. Normalmente son microorganismos de
dosis infectiva baja y alta contagiosidad.
Agentes del grupo 4 animales de experimentacin infectados con ellos: Ejemplos de este
nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus
Ebola, etc. Adems, deben incluirse en este nivel de contencin los microorganismos propios
del grupo 3 que adquieran propiedades patgenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo sera
Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso teraputico.
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Las muestras deben ir acompaadas de un protocolo de remisin de muestras que incluya
el tipo de muestra que se enva, el anlisis solicitado y una resea clnica del caso. Esta
resea debe contener la especie animal de la que provienen las muestras, edad, sexo,
sintomatologa observada, hallazgos de necropsia y el diagnstico presuntivo; de manera
que el destinatario est advertido de los riesgos potenciales antes de tomar contacto con la
muestra.
Residuos patognicos:
Son considerados residuos patognicos todos aquellos desechos o elementos
materiales en estado slido, semislido, lquido o gaseoso que presumiblemente presenten o
puedan presentar caractersticas de infecciosidad, toxicidad o actividad biolgica que puedan
afectar directa o indirectamente a los seres vivos o causar contaminacin del suelo, del agua o
de la atmsfera, que sean generados en la atencin de la salud humana o animal por el
diagnstico, tratamiento, inmunizacin o provisin de servicios, as como tambin en la
investigacin o produccin comercial de elementos biolgicos o txicos. (Ley 154 de la Ciudad
Autnoma de Buenos Aires, 18 de febrero de 1999).
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Remitir las muestras al laboratorio siguiendo las indicaciones descriptas anteriormente.
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2. En el caso de la evaluacin del sistema inmune (SI):
- Determinar los niveles de inmunoglobulinas en general o de alguna clase de
inmunoglobulina en particular, por ejemplo, cuando queremos saber si un animal tiene
niveles normales de IgG en suero.
- Determinar la relacin entre las clulas pertenecientes al sistema inmune; por ejemplo,
relacin CD4/CD8.
- Evaluar la funcionalidad de las clulas del sistema inmune, midiendo su proliferacin o la
produccin de citoquinas.
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presuntivo y una breve resea del caso en cuestin, ya que esto ser de suma utilidad a la
hora de interpretar los resultados por parte del personal del laboratorio. (Se adjunta como
ejemplo el protocolo de envo de muestras utilizado en el servicio que brinda el rea de
Inmunologa).
Extendidos de Sangre:
Los extendidos de sangre conviene hacerlos inmediatamente despus de extrada la
muestra, junto al animal. Para esto se utilizan las ltimas gotas de sangre que quedan en la
aguja. Preparados correctamente, estos extendidos son estables an si no estn fijados.
Pueden teirse hasta varios das despus si se conservan secos y protegidos de la humedad.
Envueltos en papeles limpios y colocados en un recipiente hermtico, pueden remitirse por
correo. El mtodo de fijacin puede variar segn la tincin, pero en general se pueden fijar con
calor o con distintos alcoholes. Los extendidos fijados son de estabilidad casi indefinida.
Extraccin de Suero:
Para extraer el suero de la sangre total obtenida, se la deja coagular. Una vez formado
el cogulo, se lo desprende del vidrio con la ayuda de una aguja o varilla. Para obtener la
mayor cantidad posible de suero, se coloca el tubo en una estufa a 37oC durante 30 minutos a
1 hora y luego, para obtener la mayor retraccin del cogulo, se lo deja en heladera (4 oC)
durante una noche. A partir de aqu, se puede centrifugar el tubo (a 3000 r.p.m. durante 30
minutos) o extraer directamente el suero (sobrenadante) con una pipeta. En ambos casos debe
operarse cuidadosamente tratando de evitar tocar el cogulo para no producir hemlisis.
El suero puede mantenerse a 4oC durante 48-72 horas. Si hay riesgo de contaminacin,
conviene agregarle una pizca de azida sdica (este conservante puede ser txico por lo que es
conveniente consultar al profesional del laboratorio antes de hacerlo). Si no se va a usar dentro
de ese lapso, el suero debe congelarse a temperaturas inferiores a -20oC (lo ptimo es a -
70oC). Si bien a estas temperaturas prcticamente no hay degradacin proteica, s la hay
durante cada ciclo de congelacin descongelacin.
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Ej. : PROTOCOLO DE ENVO DE MUESTRAS
AREA INMUNOLOGA
SERVICIO DE DIAGNSTICO INMUNOLGICO
N DE PROTOCOLO
Fecha de recepcin: / /
Examen solicitado:............................................................................................................
Muestra remitida:...............................................................................................................
Observaciones de la muestra:...........................................................................................
Especie: C F
Raza:.................................................................................................................................
Edad:.................................................................................................................................
Sexo: M H
Apellido y Nombre:............................................................................................................
Telfono:............................................................................................................................
Apellido y Nombre:............................................................................................................
Telfono:............................................................................................................................
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Tcnicas de evaluacin de inmunidad innata
Fagocitosis
Los mecanismos que tienen las clulas para incorporar en su interior fluidos, solutos y
partculas desde el medio externo son: pinocitosis, endocitosis mediada por receptores
especficos y fagocitosis. Mediante el proceso de pinocitosis ingresan a las clulas fluidos y
solutos. Por medio de la endocitosis mediada por receptores especficos, entran a la clula
macromolculas, virus y otras partculas de pequeo tamao. Ambos mecanismos son
independientes de la polimerizacin de la actina. En cambio, la fagocitosis, que es la ingestin
de partculas de mayor tamao, ocurre por mecanismos dependientes de la actina. Las clulas
ms eficientes para fagocitar partculas son los monocitos, macrfagos y neutrfilos a los que
se los denomina fagocitos profesionales.
La fagocitosis fue descripta por Metchnikoff en 1882 y es uno de los mecanismos
asociados al sistema inmune que aparece ms tempranamente en la escala filogentica. Se
conoce como fagocitosis al proceso por el cual una partcula es ingerida por una clula. Las
partculas pueden ser bacterias, parsitos, clulas muertas y partculas inertes como el carbn,
etc. La partcula puede ser degradada o no luego de la fagocitosis dependiendo de la
naturaleza de la misma.
No todos los microorganismos son fagocitados; muchos de ellos tratan de evadir el
reconocimiento que es la primera etapa de la fagocitosis. Simultneamente con esta evasin, el
sistema inmune de los vertebrados ha evolucionado para contrarrestarlo. Se conocen factores
sricos denominados opsoninas que favorecen el reconocimiento e ingestin de
microorganismos.
Las principales opsoninas son los anticuerpos (IgG e IgM), los factores del complemento
(C3b, C3bi, etc.) y las protenas de fase aguda. Entre las protenas de fase aguda se
encuentran la protena C reactiva, las protenas de unin al lipopolisacrido (LBP) y protenas
de alto peso molecular llamadas fibronectinas. El LBP se une al LPS bacteriano y aumenta la
unin de stos a la molcula de CD14 presente en la membrana de las clulas fagocticas. La
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fibronectina puede unirse a algunas bacterias como el Staphylococcus aureus y actuar como
puente entre la bacteria y el polimorfonuclear (PMN).
El reconocimiento del microorganismo est mediado por diferentes receptores de
membrana del fagocito pertenecientes a los PRRs o aquellos que reconocen a las opsoninas.
Estos receptores pueden estar involucrados tanto en la adherencia como en la activacin del
proceso de fagocitosis. Algunos de ellos son, por ejemplo, el receptor para el fragmento
cristalizable constante de la inmunoglobulina G (FcR), el receptor para la protena C3b del
complemento (CR1)), o para la protena C3 (CR3 o CD11b/CD18), y los receptores de
patrones (PRRs) como el receptor de manosa, y el receptor scavenger o carroero.
Se ha observado que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios para inducir la ingestin de un
microorganismo se reduce alrededor de 100 veces si ste adems est recubierto por C3b.
Estos receptores actan cooperativamente para estimular vas de sealizacin, no slo para
iniciar la polimerizacin de la actina sino tambin para activar la NADPH-oxidasa para la
produccin de O2. Este ltimo es uno de los mecanismos citotxicos que entran en juego luego
de la fagocitosis.
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1- fosforilacin en tirosina de protenas de membrana y citoplasmticas
2- hidrlisis del fosfolpido inositol de membrana
3- incremento del Ca2+ citoplasmtico
4- incremento de la actividad de la proteinquinasa C (PKC)
Mecanismo de fagocitosis
La interaccin receptor-ligando entre el fagocito y la partcula a ingerir activa la
maquinaria de la fase de ingestin para lo cual es necesario la modificacin de las protenas
involucradas en el remodelamiento de la membrana y el citoesqueleto: actina, miosina y
protenas de unin a la actina. Los microfilamentos de actina en la porcin de citoplasma que
subyace al sitio de unin comienzan a polimerizarse. Esta polimerizacin lleva a que la
membrana envuelva la partcula, formndose seudpodos (extensiones de la membrana en
forma de dedos). Estos rodean a la partcula y finalmente se fusionan formando la vescula
fagoctica o fagosoma primario. Mientras esto ocurre, los grnulos citoplasmticos se funden
con la membrana del fagosoma y se produce un fagolisosoma. En el interior del fagolisosoma,
la partcula ingerida queda expuesta a sistemas microbicidas que pueden clasificarse como
oxgeno independientes y oxgeno dependientes.
Molculas efectoras independientes del oxgeno
Estas sustancias estn localizadas en los lisosomas o grnulos citoplasmticos, se
liberan dentro de los fagolisosomas y no requieren la produccin de oxidantes para ser activas.
Pueden actuar tanto intra como extracelularmente en el caso de que la partcula sea muy
grande para ser ingerida generando lesin en el tejido subyacente y efecto conocido como
fagocitosis frustrada. Estos agentes incluyen proteasas y enzimas hidrolticas como
fosfolipasas, glicosidasas y lisozima; la fagocitina y las leucinas que actan sobre las
membranas bacterianas; la lactoferrina fija el hierro privando a las bacterias de este elemento
indispensable para su crecimiento y la lisozima, que cliva los mucopptidos de la pared celular
bacteriana.
Molculas efectoras dependientes del oxgeno
Durante el proceso de fagocitosis las clulas pueden incrementar en 50 veces la
cantidad de oxgeno consumido y metabolizar grandes cantidades de glucosa. Debido al gran
consumo de oxgeno, este fenmeno se denomina estallido respiratorio. El consumo de
oxgeno es utilizado para la produccin de metabolitos txicos como anin superxido, perxido
de hidrgeno, radicales hidroxilo, oxgeno singulete, hipocloritos y cloraminas.
Se ha confirmado experimentalmente la relacin entre la citoxicidad de los macrfagos y la
produccin aumentada de los reactivos del nitrgeno e intermediarios del oxgeno. En los
sobrenadantes de cultivo de macrfagos activados por citoquinas se encuentran niveles
elevados de nitritos inorgnicos (NO2-) y de anin superxido (O2-), ambos asociados con la
actividad antimicrobiana. Las vas oxidativas productoras de estos dos metabolitos son
diferentes y no comparten precursores comunes.
El siguiente esquema muestra las vas de produccin de molculas efectoras,
sealando algunos de los estmulos necesarios para su activacin, a saber: interfern gamma
(IFN), lipopolisacrido de E. coli (LPS) y forbomiristil acetato (PMA).
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L-arginina oxgeno
Otros reactivos
nitrito intermediarios y perxido de hidrgeno
(NO2-) molculas efectoras (H2O2)
Existen mecanismos para incrementar la capacidad microbicida del H2O2, Uno de ellos
es la accin de la mieloperoxidasa (MPO), que cataliza la oxidacin y halogenacin de
diferentes estructuras presentes en los microorganismos.
El xido ntrico (NO) posee una vida media de pocos segundos, interacta con una serie
de molculas dando como resultado citotoxicidad. En presencia de oxgeno y agua, el NO
genera otros reactivos intermedios del nitrgeno y por ltimo se descompone para formar NO 2-
y NO3-.
Los niveles de formacin de los reactivos del oxgeno y produccin de NO estn
relacionados con el grado de susceptibilidad a las infecciones. A modo de ejemplo, podemos
citar la Enfermedad Granulomatosa Crnica que se presenta en individuos genticamente
deficientes en la enzima NADPH oxidasa.
a) Quimiotaxis:
La quimiotaxis es el movimiento de los PMN a travs de un gradiente de concentracin de
sustancias (como la formil-metionina) que producen migracin dirigida. Los factores
quimiotcticos provienen principalmente de componentes bacterianos, de la degranulacin de
los mastocitos durante el proceso inflamatorio y de la activacin del complemento (el C5a est
considerado como uno de los ms potentes factores quimiotcticos).
b) Quimiotaxis y adherencia
Tcnica de migracin y adherencia a travs de una membrana: para ello se utiliza la
cmara de Boyden, que posee una membrana microporosa con poros de 3 micrones de
dimetro. Se colocan las clulas en un compartimento y los factores quimiotcticos en otro y se
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lleva a incubar. La capacidad de las clulas para migrar hacia el estmulo se evala tiendo las
que quedan retenidas en la membrana. Los resultados se comparan con los obtenidos con
clulas del mismo animal (sin estmulo) y con PMN de un individuo normal utilizado como
control de valor de animal sano.
b) Activacin:
La activacin de las clulas fagocticas se sealiza a travs de eventos de fosforilacin y
desfosforilacin de las protenas celulares involucradas en la trasmisin de la seal de
activacin. La posibilidad de identificar protenas fosforiladas con el uso de anticuerpos
monoclonales que detectan, por ej., tirosinas fosforiladas, permite identificar el primer paso de
activacin de las clulas fagocticas. Para esta evaluacin es necesario recurrir a las tcnicas
de PAGE e Inmunoblot a partir de las clulas activadas (ver captulos correspondientes en la
presente gua).
La identificacin de la migracin de protenas del citoplasma al ncleo celular para regular la
trascripcin de molculas relacionadas con la inflamacin y fagocitosis constituye tambin una
manera de identificar los primeros eventos de activacin celular. Como ejemplos de estos
sistemas podemos incluir la activacin del factor NF-kB que involucra la degradacin del factor
inhibidor de kB citoplasmtico (protena IkB) y el incremento de sus componentes p50 y p65 en
el ncleo celular. Esta modificacin en los componentes proteicos celulares tambin se estudia
utilizando anticuerpos marcados y mediante el uso de tcnicas de SDS-PAGE e inmunoblot.
c) Ingestin:
La etapa de ingestin se puede evaluar utilizando como partcula a ingerir diferentes
microorganismos. La utilizacin de levaduras como por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae,
se fundamenta en el tamao de las partculas (fcil de ver en el microscopio ptico) y la
estructura de manosas que poseen estos microorganismos que son fcilmente detectados por
los PRRs. La capacidad de ingestin de las clulas provenientes del individuo a evaluar se
determina realizando una cuantificacin del nmero de levaduras ingeridas en un determinado
tiempo de incubacin.
El recuento de las partculas o microorganismos ingeridos puede ser realizado mediante
diversas metodologas:
- Tincin de las clulas con las coloraciones de Wright o Giemsa; de esta manera se
diferencian las clulas que han ingerido de las que no. Se deben contar por lo menos 200
clulas y determinar cuentas partculas por citoplasma celular es considerado como ingestin
positiva. Los mtodos microscpicos requieren una laboriosa observacin para determinar la
asociacin de los microorganismos a las clulas y discriminar si estos microorganismos fueron
ingeridos o no.
-Marcacin de las partculas a ingerir con fluorescena; se utiliza la marcacin de la partcula
con isotiocianato de fluorescena u otro colorante fluorescente previo a la incubacin con las
clulas, luego se elimina por lavado las partculas no ingeridas y se detectan las clulas que
ingirieron por microscopia de fluorescencia o citometra de flujo (ver captulo correspondiente
en la presente gua). La utilizacin de la coloracin combinada diferencial con bromuro de etidio
permite identificar las bacterias extracelulares (fluorescen en color rojo-naranja) de aqullas
internalizadas (permanecen de color verde correspondiente a la fluorescena).
-Marcacin de componentes bacterianos como protenas, DNA y/o RNA con sustancias
radiactivas. Las bacterias se marcan durante su fase de crecimiento con aminocidos o
nucletidos marcados con 14C, 35S amino 3H nucletidos: tritio y luego del experimento de
ingestin en el que se incuban las clulas y las bacterias durante un periodo de tiempo
generalmente entre 30 a 60 minutos a 37C se lavan las clulas para eliminar las bacterias no
ingeridas y se utiliza un detector de radioactividad como un contador de centelleo lquido o
slido para cuantificar la radiactividad retenida por el sedimento celular. Esta actividad se
relaciona con el nmero de partculas radiactivas ingeridas y por lo tanto con la capacidad de
ingestin de las clulas fagocticas del individuo evaluado.
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d) Digestin:
NBT (color amarillo y soluble) + O2- ---------- Formazn (color azul e insoluble) + O2
Para esta prueba se pueden utilizar PMN provenientes de sangre entera aislados del
individuo, estimulados con levaduras o forbolmiristilacetato (PMA) Luego de una incubacin de
30 minutos a 37C, la formacin del formazn puede ser evaluada cuali o cuantitativamente.
Los cristales pueden identificarse intracelularmente por microscopa y realizar un recuento del
nmero de clulas que sufrieron estallido respiratorio, o bien los cristales pueden ser
solubilizados utilizando N,N dimetilformamida y realizar la cuantificacin por espectrofotometra
obteniendo los datos en densidad ptica.
Quimioluminiscencia
El estallido respiratorio en los PMN normales est asociado con la generacin de
energa luminosa conocida como quimioluminiscencia, la cual es dependiente de la produccin
del oxgeno singulete (1O2). Este oxgeno se produce cuando uno de los electrones
desapareados de oxgeno es elevado a una rbita superior con la inversin del spin. La luz se
emite cuando el electrn retorna a su nivel inicial y se mide como quimioluminiscencia. El
oxgeno singulete es producido por la reaccin entre H2O2 y el hipoclorito:
La luz emitida se mide por la deteccin fluoromtrica apropiada. La sensibilidad del ensayo se
incrementa por el uso de hidracina cclica, 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol)
que actan como substrato para el 1O2. La luminiscencia se mide en un contador de centelleo
usando el canal del 3H.
Produccin del NO
Los niveles de produccin de NO en los cultivos de macrfagos estimulados con
bacterias o productos bacterianos nos permiten evaluar el grado de activacin de estas clulas.
La vida media del NO es de segundos, por esto, la evaluacin de su produccin se realiza
mediante la cuantificacin de nitritos en el medio de cultivo.
La sntesis de nitritos comienza 4 a 6 horas luego del tratamiento con IFN y LPS en un cultivo
de macrfagos y es lineal por 72 horas. La identificacin de este metabolito en los
sobrenadantes de cultivo se realiza mediante la utilizacin del reactivo de Greiss (sulfanilamida
y naftiletilendiamina) que se colorea cuando reacciona con nitritos y nos permite relacionar la
coloracin con los niveles producidos en un cultivo. El cambio de color se evala por
espectrofotometra a 550 nm. Se realiza una curva patrn utilizando diferentes concentraciones
conocidas de NaNO2 y reactivo de Greiss. De esta curva se obtiene la relacin que permite
estimar la produccin de NO in vitro.
21
Los anlogos de la L-arginina,como la NG-monomethyl-L-arginina (L-NMA), poseen accin
inhibitoria de la produccin de nitritos a partir del NO por la va de la iNOS por un fenmeno
competitivo. La utilizacin de estas molculas permite confirmar que el aumento de produccin
de nitritos en un cultivo est dado por este mecanismo.
22
Bibliografa
1. Wyllie J. Currents Protocols in Immunology.1994.
2. Margni R.A. Inmunologa e Inmunoqumica. Fundamentos. Editorial Mdica Panamericana
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4. Abramson JS, Wheeler JG. The Neutrophil. Oxford University Press. 1992.
5. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocitosis in macrophages. Ann Rev Immunol
1999. 17:593-623.
Complemento
El sistema de complemento (C) est formado por unas 30 protenas del suero que
interaccionan entre s de modo regulado formando una cascada enzimtica que permite una
amplificacin de la respuesta inmune humoral.
Las principales consecuencias de la activacin del C son:
1. Lisis del microorganismo o clula diana
2. Opsonizacin, con la consiguiente mejora de la fagocitosis y destruccin del
microorganismo fagocitado
3. Quimiotaxis sobre los fagocitos
4. Accin anafilotxica,
5. Eliminacin de inmunocomplejos circulantes
23
que corresponden a la zona que va del 0 al 25% y del 75 al 100 % de hemlisis, presentan una
pendiente significativamente menor o nula.
Se define as la unidad de complemento hemoltica 50% (CH50), que corresponde a los mililitros
de suero fresco completo (como fuente de complemento) que son necesarios para producir la
lisis del 50% de los GR sensibilizados con anticuerpos, durante una hora de incubacin a 37C.
La unidad CH50 se calcula sobre 5 X 108 eritrocitos ptimamente sensibilizados, resuspendidos
en un volumen total de 7.5 ml, en presencia de concentraciones ptimas de Calcio y Magnesio,
a una fuerza inica y a un pH ptimo para cada especie.
24
Este ensayo produce tambin una curva sigmoidea si se grafica el % de hemlisis vs. la
dilucin del suero problema. El valor del 50% de hemlisis es el elegido para definir el ttulo de
un suero como la inversa o recproca de la dilucin del suero que produce un 50% de
hemlisis. Las muestras de suero que van a ser utilizadas para evaluar la funcin del C deben
ser conservadas a -70C dentro de las 2 hs de extradas, dada la labilidad de las protenas del
C. Mediante esta tcnica se evala la va clsica de activacin del complemento.
Este ensayo tambin puede ser realizado usando placas de agarosa que contienen GR
sensibilizados. El suero se agrega en hoyos cavados en la placa de agarosa y se permite que
difunda durante 20 hs a 4C. Las placas se incuban luego a 37C por 90 min para permitir la
hemlisis, que se ve como un anillo rodeando los hoyos, cuyo dimetro es proporcional al
logaritmo de la concentracin del complemento en el suero.
Anticuerpos
Anticuerpo policlonal
Figura 1: Produccin de anticuerpos policlonales.
25
El proceso de inmunizacin es aquel en el que se inyecta al animal el antgeno slo o con
adicin de adyuvantes, cuya funcin es favorecer su inmunogenicidad. Cuando la inmunizacin
se realiza sobre animales vrgenes o naive, a la primera dosis se la describe como:
inmunizacin primaria o respuesta primaria. La primer dosis induce la sensibilizacin del
individuo generando la expansin de los clonos especficos y la aparicin de clulas de
memoria, pero la calidad de la respuesta en niveles de anticuerpos y clulas especficas puede
ser incrementada y mejorada en dosis sucesivas, por lo tanto en los planes de inmunizacin se
aplican diversas dosis. Existen numerosos protocolos de inmunizacin, con una duracin
variable, aunque una fase de inmunizacin primaria suele durar de 1 a 3 meses con
inyecciones cada 15 a 21 das, y el proceso puede durar de 3 a 6 meses (puede variar tambin
de acuerdo con la especie a inmunizar). La cantidad de antgeno depender del animal
empleado. Los ms comnmente utilizados son ratn, rata, conejo, cabra y gallina. Las
cantidades oscilan de los 50 a 1000 g de antgeno para una dosis en ratn a los 0,25 a 5 mg
por dosis en el caso de la cabra o los 15 mg en el caso de caballo.
Cuando nuestro objetivo es obtener sueros hiperinmunes para utilizar como reactivos de
diagnstico o inmunidad pasiva, los planes estn compuestos por varias dosis. Si nuestro
objetivo es sueros anti-sueros de diferentes especies, debemos considerar la distancia
filogentica para la eleccin de la especie dadora de suero. Como ejemplo, la utilizacin de la
gallina como especie para obtencin de anticuerpos tiene dos ventajas: la distancia filogentica
existente con los mamferos, y la purificacin de los anticuerpos de la yema del huevo, es
engorrosa pero su obtencin no afecta la vida del animal dador.
En conclusin, se denomina suero hiperinmune al obtenido de animales que han
respondido a mltiples inoculaciones de un antgeno determinado. Las aplicaciones son
numerosas, por ejemplo, como reactivos para el diagnstico de ciertas enfermedades. Estos
sueros contendrn anticuerpos policlonales en alta concentracin contra los distintos
componentes de un antgeno.
Anticuerpos monoclonales
Anticuerpos monoclonales:
1. Son qumicamente homogneos, poseen las propiedades individuales de la secuencia de
aminocidos de ese particular anticuerpo.
2. Son de especificidad definida porque todas las molculas tienen la misma regin
hipervariable.
26
3. Poseen una nica avidez y afinidad.
4. Su estabilidad fsico-qumica depende de cada anticuerpo monoclonal en particular. Pueden
ser sensibles a cambios de pH, temperatura, liofilizacin y marcacin con enzimas o
istopos.
5. En general, no poseen reactividad secundaria, o sea, no forman complejos antgeno-
anticuerpo insolubles con antgenos mono o bivalentes. Pueden hacerlo si el antgeno tiene
epitopes repetitivos.
6. Se pueden producir en cantidades ilimitadas.
Anticuerpos policlonales:
1. Son heterogneos. Sus propiedades constituyen un promedio de las propiedades de los
distintos anticuerpos constituyentes (del antisuero).
2. Son una mezcla de anticuerpos con especificidades propias para cada epitope del
inmungeno. Por lo tanto, la probabilidad de reacciones cruzadas con epitopes de otros
antgenos es mayor a la de los anticuerpos monoclonales.
3. Su avidez y afinidad corresponden al conjunto de la mezcla de anticuerpos y varan en
funcin del momento de la respuesta inmune en que se realiz la determinacin. As, la
afinidad media de los anticuerpos detectada al comienzo de una respuesta inmune ser
menor que la detectada a medida que la respuesta inmune avanza. Estos se debe a que a
medida que la respuesta inmune se va desarrollando, se produce la maduracin de la
afinidad de los anticuerpos.
4. Son estables como consecuencia de su heterogeneidad, lo que permite que sean ms
resistentes frente a distintos cambios fsico-qumicos.
5. Poseen reactividad secundaria debido a la presencia de mltiples anticuerpos dirigidos
contra distintos epitopes en la molcula antignica, lo que permite la formacin de una red
antgeno-anticuerpo.
6. Se producen en animales inmunizados. Por lo tanto, es difcil de estandarizar.
27
Mtodos de Aislamiento y purificacin
1-a Precipitacin
Las interacciones de una protena en agua ocurren entre las molculas de protena-agua y
protena-protena. Cuando predominan las interacciones protena-agua, stas se hallan en
solucin; cuando predominan las segundas (protena-protena), stas precipitan. Cuando a una
protena que se encuentra en solucin acuosa agregamos una sal, como la sal es ms
hidroflica que la protena, interacciona con el agua, le quita el agua y hace que predominen las
interacciones protena-protena. Por lo tanto, la protena precipita.
Es importante considerar el pH de la solucin de trabajo: Cuando el pH de la solucin es
igual al punto isoelctrico (pI) de la protena, la carga neta de dicha protena es cero y por lo
tanto sus molculas no se repelen, se aglomeran y precipitan. Es conveniente trabajar con
sulfato de amonio a 4C: A mayor temperatura, mayor solubilidad proteica y viceversa; esto se
cumple para el rango de 0 a 40C.
En resumen, los factores que afectan la concentracin salina a la cual una protena en
particular precipitar son:
1- el nmero y la posicin de los grupos polares;
2- el peso molecular de la protena a purificar;
3- el pH de la solucin;
4- la temperatura a la que se desarrolla la precipitacin.
Precipitacin salina
La precipitacin salina es un mtodo que permite separar las distintas fracciones proteicas
del suero. Las sales mas comnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio.
La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas ni
a temperatura ambiente, como lo hace el sulfato de sodio. La concentracin de sal a la cual
precipitan los anticuerpos vara segn la especie. Por ejemplo, la mayora de los anticuerpos
de conejo precipitan con una solucin saturada al 40%, mientras que los anticuerpos de ratn
necesitan entre 40-50%.
1-b Cromatografa
La caracterstica que distingue a los mtodos cromatogrficos es la presencia de dos fases
mutuamente no miscibles (una mvil y una estacionaria) que se hallan en contacto. La muestra
a purificar se introduce en la fase mvil, por lo que es transportada a lo largo de una columna
que contiene la fase estacionaria homogneamente distribuida. Los diferentes componentes de
la muestra experimentan repetidas interacciones entre la fase mvil y la fase estacionaria.
Durante el proceso, los componentes de la muestra se separan en funcin de su interaccin
con la fase estacionaria: el componente que menos interacta es el menos retenido y eluye
primero, el que ms interacta resulta retenido ms fuertemente y eluye ltimo. Una separacin
ptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el componente que eluye en
segundo trmino es retenido lo suficiente como para impedir su superposicin con el
componente que eluy en primer trmino.
Las macromolculas biolgicas difieren en sus caractersticas fisicoqumicas: tamao,
forma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus grupos funcionales dentro de su estructura
tridimensional. La separacin de las muestras entre las fases aprovecha las diferencias entre
las propiedades fisicoqumicas de cada uno de los componentes de una muestra dada. Es
lgico, por lo tanto, que los mtodos cromatogrficos ms comunes para la purificacin de
estas molculas sean:
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Cromatografa de exclusin molecular (discriminacin por tamao y forma),
Cromatografa de intercambio inico (discriminacin por carga),
Cromatografa de interaccin hidrofbica (discriminacin por superficie hidrofbica),
Cromatografa de afinidad (distribucin de aminocidos especficos en la superficie de las
protenas, inmovilizacin de metales).
Fundamentos:
Este tipo de cromatografa utiliza como soporte esferas de gel con poros de diferente
tamao. Una columna construida de esta manera tendr dos volmenes medibles, el volumen
externo (Vo), constituido por el volumen intersticial (el espacio que queda entre las esferas de
gel), y el volumen interno (Vi) que es el volumen de las esferas a los que los solutos y solventes
pueden acceder cuando se introducen dentro de aqullas a travs de sus poros. Las molculas
que no puedan acceder al Vi, debido a que su tamao es mayor al de los poros, slo se
equilibrarn en el Vo, mientras que las de menor tamao se equilibrarn en ambos volmenes.
Cuando una muestra compleja de protenas y otros componentes, disuelta en un pequeo
volumen, es aplicada a una columna con estas caractersticas, filtrar a travs de la misma. Las
protenas de mayor peso molecular eluirn con el Vo y por lo tanto eluirn primero, mientras
que las protenas de menor tamao, que pueden acceder al Vi, eluirn ms tardamente y en
un volumen de elucin (Ve) determinado que depender de su peso molecular. Ver esquema
Aspectos metodolgicos:
La matriz ms utilizada en este tipo de cromatografa es Sephadex , que se expende en
forma de polvo y puede tener diferentes tamaos de poro, lo que implica la separacin de
protenas de diferente tamao.
Las muestras no pueden contener una concentracin proteica de ms de 50 mg/ml. Las
muestras deben ser clarificadas por centrifugacin a fin de eliminar todo el material
insoluble que pueda disminuir el flujo de la columna y contaminar la matriz de la misma
previo a la cromatografa.
La fuerza inica de los solventes cromatogrficos debe ser lo suficientemente elevada
como para impedir la adsorcin inespecfica del soluto a la matriz por interacciones
electrostticas o uniones de Van Der Waals
Como las molculas de IgM son mucho ms grandes que las molculas de IgG y de otras
protenas que se encuentran en el suero, la cromatografa de exclusin molecular puede
29
ser usada para separar IgM. Cuando se requiere obtener una preparacin pura de IgM, se
puede utilizar esta tcnica combinada con la precipitacin con sulfato de amonio.
Fundamentos:
La cromatografa de intercambio inico trabaja mediante la unin de biomolculas con una
carga determinada, a una matriz estacionaria de carga opuesta.
Las biomolculas se unen a resinas de intercambio inico cuando tienen carga opuesta a la de
los iones fijos de la resina. Esta unin es de tipo electrosttico y reversible: La fuerza de esta
unin puede ser modificada variando la concentracin salina y el pH de la solucin buffer
utilizada como eluyente.
La separacin de dos o ms sustancias mediante la utilizacin de resinas de intercambio
inico se consigue por un mecanismo de adsorcin reversible, que consiste en la fijacin inicial
y posterior remocin de tales sustancias a una resina estabilizada. Si las sustancias fijadas
tienen diferentes propiedades elctricas, mediante la variacin del pH o fuerza inica del
eluyente se conseguir que cada una de ellas eluya por separado.
Matrices y solventes:
La matriz puede estar constituida por silicato de aluminio, resinas sintticas, polisacridos
como la celulosa o el dextrano, etc. La naturaleza de los grupos cargados es la que determina
el tipo y la fuerza de unin del in intercambiador. Los dos tipos de resinas ms utilizadas son:
de intercambio catinico (con matrices con carga negativa) y
de intercambio aninico (con matrices con carga positiva).
La eleccin correcta de la resina, en especial en lo que se refiere al grupo funcional que le
aporta la carga, depender de la carga neta de la sustancia que se desea separar.
En los casos de molculas anfotricas como las protenas, que poseen grupos cargados
positiva y negativamente, su carga neta depender del pH del medio. Estas sustancias, segn
sea el pH del medio, podrn unirse a resinas aninicas o catinicas; en su punto isoelctrico
(pI), tendrn carga neta cero y no se fijarn a ningn tipo de resina intercambiadora.
Cromatografa de Afinidad
Fundamentos:
La tcnica de cromatografa de afinidad es una de las tcnicas ms utilizadas para la
purificacin de protenas. Consiste en una cromatografa de adsorcin en la que se aprovecha
la especificidad de interacciones biolgicas como las interacciones antgeno-anticuerpo,
enzima-inhibidor, hormona-receptor, lectina-hidrato de carbono, etc. La biomolcula que se
quiere purificar (por ejemplo, un anticuerpo) usualmente tiene un sitio de reconocimiento a
travs del cual puede interactuar con otra molcula natural o artificial a la que se llama ligando.
El ligando es inmovilizado sobre una matriz polimrica y es usado para capturar selectivamente
a la biomolcula que se desea purificar, cuando sta se encuentra en una mezcla impura. La
biomolcula deseada puede ser eluda del ligando por cambios en las condiciones externas
(pH, fuerza inica, solventes y temperatura) que desestabilizan la interaccin biomolcula
ligando y permiten que la molcula deseada sea eluida en forma purificada.
Existe una gran diversidad de biomolculas que pueden purificarse por este mtodo
cromatogrfico, entre ellas: antgenos, anticuerpos, enzimas, protenas unidas a hormonas,
protenas unidas a vitaminas, receptores, glicoprotenas, lectinas, ARN, ADN, bacterias, virus,
fagos, clulas y protenas producidas por ingeniera gentica.
La naturaleza de la matriz a la que se fijan los ligandos es muy importante, ya que en las
condiciones experimentales debe ser fsica y qumicamente estable, no debe actuar como
tamiz molecular y debe asegurar un buen flujo durante la elucin.
Existen numerosas matrices comerciales disponibles en su forma activada o sin activar para
ser utilizadas como soporte para el ligando. La activacin de la matriz se realiza para que el
30
ligando quede inmovilizado en ella a travs de una interaccin qumica que produzca una unin
estable entre matriz y ligando.
En general, se utilizan matrices de naturaleza polisacrida, en su mayora derivados de la
agarosa. Debido a su estructura qumica, estas matrices tienen la caracterstica de ser casi
inertes, de forma que no producen interacciones inespecficas. Esto es esencial porque la
cromatografa de afinidad se basa en interacciones especficas.
La seleccin del ligando utilizado en cromatografa de afinidad debe tener en cuenta:
1- que la afinidad de unin del ligando sea especfica y reversible por la sustancia que ser
purificada.
2- que el ligando posea grupos qumicamente modificables que permitan su unin a la matriz
sin que se destruya su capacidad de unin a la sustancia que ser purificada.
Por ejemplo, si el ligando es un anticuerpo, ste se va a unir a la matriz a travs de su porcin
Fc, y por lo tanto, quedar libre el sitio de unin al antgeno. Al agregar un antgeno, ste ser
reconocido y unido por el anticuerpo inmovilizado en la columna. Las dems molculas
presentes pero no unidas a la matriz (no reconocidas por el ligando) se eliminan por lavado.
Posteriormente, el antgeno unido al anticuerpo de la columna se eluye y se obtiene en forma
pura.
El ligando idealmente debera tener una afinidad de unin de 10-4 a 10-8 M-1 en solucin. Si
la constante de disociacin es mayor que 10 -8 M-1 esta tcnica no puede ser utilizada para la
purificacin de estas molculas pues la unin es muy estable y la separacin de la biomolcula
del ligando se hace muy difcil. Estas afinidades muy altas corresponden a la interaccin
hormona-receptor para lo cual este mtodo no resulta til.
Ejemplos:
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Purificacin por columnas de inmunoafinidad
En este caso se puede utilizar una columna a la que se une un anticuerpo especfico frente al
antgeno que se va a purificar o una columna a la que se une un antgeno, al colocar la muestra
a purificar solo se unirn los anticuerpos especficos frente a ese antgeno.
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Figura1: Esquema de purificacin de una protena a travs de una columna de afinidad
Matriz
+
Ligando
+ impurezas
Muestra
33
Tabla 3: Mtodos de aislamiento y purificacin de anticuerpos
Aplicaciones Ventajas Desventajas
Precipitaciones y cromatografa de intercambio inico (DEAE)
Aislamiento y concentracin de
Fcil. Bajo costo. til para Rinde anticuerpos impuros.
anticuerpos de todas las fuentes
grandes volmenes. No se usan solas. cido
y espacios. No como paso
Aislamiento
2- Fraccionamiento de anticuerpos
La tripsina acta de manera similar a la papana y permite obtener los mismos fragmentos.
34
Un tercer fragmento de anticuerpos, el Fv, es de gran utilidad para los estudios de afinidad de
antgeno y anticuerpo. Este fragmento est compuesto por las porciones variables de las
cadenas liviana y pesada, con lo cual posee un slo sitio de combinacin al antgeno. Tanto el
fragmento Fab como el fragmento (Fab)2 estn estabilizados por los puentes disulfuro
intercatenarios. Dado que el fragmento Fv no posee estas uniones, debe estabilizarse
agregando un pptido de unin o linker. El fragmento linker es una pequea secuencia que
une el extremo amino terminal de la cadena liviana con el extremo carboxiterminal de la cadena
pesada. La estructura que se obtiene recibe el nombre de single chain fraccin variable (scFv)
que se puede sintetizar mediante tcnicas de ADN recombinante.
Papaina Pepsina
Bibliografa:
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Laboratory. 1988. pp726.
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10. Wilchek, M and chailen, I. An Overview of Affinity Chromatography. 2000. Methods in
Molecular Biology. Vols 147: 1-6.
*Albminas: es la protena ms abundante del suero, vara segn la especie entre un 35 y 50%
de las protenas totales. Es sintetizada por el hgado y su principal funcin es el mantenimiento
del volumen (equilibrio osmtico). Adems es transportadora de sustancias poco solubles en
agua (ej: cidos grasos libres).
*Globulinas: la fraccin globulnica de las protenas plasmticas es una mezcla muy compleja
que se agrupa en cuatro fracciones con funciones diferentes: alfa-1, alfa-2, beta y gamma
1. -1 globulinas:
Glicoprotenas
Globulina fijadora de tiroxina
Protrombina
Antitripsinas
HDL (lipoprotena de alta densidad)
2. -2 globulinas:
Factor IX
Antiplasmina
Haptoglobina
Ceruloplasmia
Amiloide A
VLDL (Lipoprotena de muy baja densidad)
LDL (Lipoprotena de baja densidad)
3. -globulinas:
Transferrina
Fibringeno
Factores del Complemento
Protena C reactiva
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Amiloide A
Ferritina
Pueden aparecer trazas de IgM, IgA e IgG en especies domsticas.
4. Fraccin globulinas:
IgM
IgA
IgE en concentraciones nfimas
IgG
Cada especie posee un perfil electrofortico caracteristico, a modo de ejemplo se muestran los
Electroforesis
El punto isoelctrico (PI) de una molcula (en este caso una protena) es el pH en el
cual la carga neta de la misma es cero. Si se mantiene a este pH, la protena no migra cuando
se la somete a la accin de un campo elctrico. El PI es inherente a la estructura primaria de la
protena, pues depende de cules aminocidos forman la cadena polipeptdica. Por lo tanto, a
determinado pH, distintas protenas con distinto punto isoelctrico tendrn distinta carga neta,
lo que permitir separarlas e identificarlas por medios electroforticos.
J. Tiselius fue el primero que utiliz la electroforesis en 1937 para separar los
componentes del suero. Existen dos mtodos generales para separacin de protenas por
electroforesis:
electroforesis libre o de frente mvil, que se realiza en una fase lquida, y
electroforesis de zona, que utiliza una matriz slida o soporte, como el papel de filtro,
membranas de acetato de celulosa o geles de almidn, poliacrilamida, agar o agarosa. Estos
materiales son porosos e hidratados y permiten retener las protenas.
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pH alcalino, en el que todas las protenas estn cargadas negativamente y migran hacia el polo
positivo (nodo). En estas condiciones, la albmina es la que migra ms rpidamente hacia el
polo positivo, seguida por: alfa, beta y gammaglobulinas.
Tcnica
La muestra se siembra sobre un soporte de agar o acetato de celulosa y se somete a
corriente elctrica. El paso de la corriente provoca la migracin de las diferentes protenas que
conforman la muestra, pero cada una de ellas lo har a una velocidad diferente segn su punto
isoelctrico.
El pH del buffer utilizado es de 8,6, a este pH, todas las protenas estn cargadas
negativamente. La ms cargada es la albmina, con un PI mucho menor que el pH del medio
(PI de la albmina: 4,4); las menos cargadas, por el contrario, son las gammaglobulinas, con un
PI mucho ms cercano al pH del buffer (PI de las gamaglobulinas: 6,8-7,2). Por lo tanto, las
albminas son las que migran ms rpido hacia el polo positivo, seguidas por las alfa, beta y
por ltimo las gammaglobulinas.
Al efecto de la carga se suma el efecto electroendosmtico, que consiste en un
movimiento en sentido opuesto a la corriente elctrica que detiene parcialmente la corrida de
las protenas. Este es causado porque la mayora de los soportes no son neutros. Debido a su
carga fuertemente negativa, las albminas logran superar ampliamente el efecto, mientras que
las gammaglobulinas, cuya carga negativa es menor, no pueden superarlo tan fcilmente y
quedan detenidas en el punto de siembra o incluso son arrastradas hacia el polo negativo.
Materiales
Tiras de acetato de celulosa para electroforesis
Solucin amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6)
Cuba de electroforesis
Fuente de poder
Solucin colorante
Solucin decolorante
Solucin transparentizante
Densitmetro Integrador
Procedimiento
Es fundamental que todo el material que se vaya a utilizar est bien limpio y seco.
1. Se sumergen las tiras en la solucin amortiguadora (buffer) durante por lo menos 10
minutos.
2. Se elimina el exceso de lquido entre dos hojas de papel de filtro.
3. Se extienden las tiras sobre un portaobjetos teniendo la precaucin de que no queden
burbujas entre el vidrio y la tira. Las tiras de acetato de celulosa tienen dos caras diferentes:
una es la superficie penetrable donde deben sembrarse las muestras, la otra no es
penetrable de tal manera que no debe ser utilizada para la siembra. Para diferenciarlas, las
tiras tienen uno de sus ngulos recortado, este debe quedar ubicado en el ngulo inferior
derecho.
4. Se coloca el portaobjetos sobre el puente de la cuba de electroforesis.
5. Se siembran las muestras con el sembrador. Los sembradores estn estandarizados para
sembrar siempre el mismo volumen de muestra. Los equipos generalmente traen 3
sembradores de diferente volumen. Segn el ancho de sembrador que se utilice, se podrn
sembrar 1, 2 3 muestras por tira. Una de las muestras se tie con azul de bromofenol, el
cual se asocia a las molculas de prealbmina y permite identificar el frente de corrida.
6. La cuba se llena hasta una altura determinada con el buffer de corrida, se conecta a la
fuente de poder y se aplica una corriente constante de 200 voltios durante 30 minutos. El
grado de separacin obtenido para las protenas de una muestra dada, vara segn sea la
especie de la que de proceda la muestra y depende del tiempo de corrida y del voltaje
aplicado. Por lo tanto, estos parmetros deben estandarizarse previamente segn las
38
necesidades de cada caso en particular. (Por ejemplo, una muestra de suero equino se
corre a 200 voltios durante 25 minutos; una muestra de suero canino se corre a 180 voltios
durante 20 minutos).
7. Una vez finalizada la corrida, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se procede a
colorear las tiras, sumergindolas durante 5 minutos en la solucin colorante de proteinas.
8. Se procede luego a la decoloracin de la tira, sumergiendo las tiras en solucin
decolorante. El objetivo del decolorante es barrer con el colorante que no se uni a las
proteinas. Este procedimiento se repite hasta que las tiras queden blancas (es conveniente
ir renovando la solucin decolorante durante este procedimiento).
9. Las tiras se sumergen en metanol puro durante 30 segundos y luego en la solucin
transparentizante durante 1 minuto.
10. Las tiras se colocan sobre un portaobjetos con el ngulo cortado de la tira ubicado en el
ngulo inferior izquierdo (en forma invertida a como lo sembramos), de esta forma la cara
sembrada queda boca abajo, mirando el vidrio. No deben quedar burbujas entre el vidrio y
la tira.
11. Los portaobjetos se colocan en una estufa a 80 C hasta su transparentizacin total. La tira
de acetato debe quedar completamente transparente para que pueda efectuarse la
medicin por densitometra.
12. Las diferentes bandas de protenas separadas a partir de la muestra original sobre la tira de
acetato de celulosa, teidas y transparentizadas, son ledas en un densitmetro. El aparato
debe ser previamente calibrado segn la longitud de onda que vamos a utilizar
(generalmente 520 nm), el largo de la tira que vamos a medir y la concentracin de
protenas de la que partimos. El densitmetro detecta y registra los datos de absorcin de
luz de cada banda de protena y los transforma en un valor numrico de concentracin y en
un grfico (ver figura al final del tema)
Aplicaciones de la electroforesis
La electroforesis es un mtodo extraordinariamente valioso para el diagnstico de las
alteraciones en los componentes proteicos del suero, orina y lquido cefalorraqudeo (LCR).
Mediante esta tcnica se puede diagnosticar un aumento, disminucin o alteracin de las
protenas (paraprotenemias)
Por ejemplo ciertas patologas como:
Mieloma mltiple: se detecta la aparicin de una banda o curva restringida en la regin de
las gamma globulinas, asociada a hallazgos anormales en la electroforesis de orina
(protena de Bence-Jones)
Hipogammaglobulinemias: Disminucin de las gammaglobulinas.
Esclerosis Mltiple: Aparicin de bandas oligoclonales en el LCR (en humanos).
Hipoproteinemias por prdida de protenas por el sistema digestivo: Disminucin general de
todas las protenas.
Dficit de alfa-1 antitripsina: Disminucin de las alfaglobulinas.
Enfermedades infecciosas o neoplsicas agudas: Aumento de alfa-1 globulinas.
Sndrome nefrtico o procesos hemolticos: Aumento de alfa-2 globulinas.
Debe hacerse hincapi que la electroforesis es casi siempre una prueba que puede llevar a un
diagnstico presuntivo de las anormalidades de las protenas del suero, orina o LCR.
Ejemplos de hiperglobulinemias
Policlonales
- Infecciones virales, bacterianas (brucelosis, piodermis), hongos, parsitos (dilofilarias).
- Enfermedades inmunomediadas:
Lupus eritematoso sistmico
Trombocitopenia inmunomediada
Anemia hemoltica autoinmune.
Pnfigo.
Artritis reumatoidea, Poliartritis
- Neoplasias (generalmente no relacionadas con el sistema inmune)
39
Monoclonales
- Neoplasias (Mieloma mltiple, linfosarcoma, macroglobulinemia.)
Ejemplos de hipoalbuminemias
Resultado de enfermedades como insuficiencia heptica crnica y sndrome de mala
digestin mala absorcin.
Hipergammaglobulinemia
Secuestro de protenas en cavidad pleural, peritoneal y tejido subcutneo.
Dilucin por fluidoterapia.
Patologas renales (glomerulopatas).
Quemaduras
Ejemplos de hiperalbuminemia
Deshidratacin
40
Patrn electrofortico del LCR en un sujeto normal y en un enfermo con esclerosis mltiple
Bibliografa
1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunologa Mxico: Editorial Diana.1 edicin,
septiembre de 1986. Captulo 6.
2. Margni R. A. Inmunologa e Inmunohistoqumica Fundamentos. Bs.As.: Editorial mdica
Panamericana 1 edicin, octubre de 1972. Edicin consultada: 5 edicin septiembre de
1996. Captulo V.
3. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunologa Bsica y Clnica Editorial El Manual Moderno
S.A. de C. V. Mxico D.F. 7 edicin. 1993 Seccin II. Captulo 18.
4. Inmunologa bsica. Gua de trabajos prcticos. Fac. Cs. Veterinarias. Ao 2000.
41
Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)
Las muestras se siembran en un gel de poro grueso (gel de paso rpido, apilamiento o
stacking) que permite que todos los componentes de la muestra se concentren en una zona
estrecha y comiencen la migracin por el gel de separacin en forma simultnea, lo que facilita
la comparacin entre muestras y los patrones de PM.
Existen sistemas de geles continuos y discontinuos. En los sistemas discontinuos (los
ms usados) los buffers utilizados para los geles de apilamiento y de separacin poseen
diferente fuerza inica y pH.
42
En forma de sntesis los pasos a seguir son:
A- Armado del gel de poliacrilamida
B- Preparacin de las muestras
C- Siembra de las muestras en el gel
D- Corrida electrofortica
E- Tincin del gel
F- Anlisis e interpretacin de los resultados
Los geles teidos muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se observarn
un nmero de bandas variables dependiendo de las distintas protenas que componen la
mezcla. La distancia que recorri cada protena en el gel desde el sitio de sembrado de la
muestra es proporcional a su peso molecular, por lo tanto, cuanta ms distancia recorrida
menor el PM de esta protena. Las protenas del mismo PM corren en forma conjunta.
Algunas de las utilidades son:
Identificar el PM de los componentes en muestras complejas
Identificar pureza en extractos purificados
Constituir el primer paso para el anlisis antignico en muestras que se conoce como
inmunoblot
Anexo
A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un gel de poliacrilamida al
15% utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios
Bio-Rad).
1. Armado del gel entre de placas de vidrio:
Realizar una delicada limpieza de las placas de vidrio con alcohol etlico.
Formar un sndwich con ambos vidrios ubicando entre ellos los espaciadores.
Ubicar el sndwich en la abrazadera de manera que la placa ms pequea quede hacia
delante (introducir entre ambos platos la tarjeta alineadora).
Ajustar los tornillos de la abrazadera en forma manera cruzada.
Verificar que no existan prdidas de lquido: colocar agua entre ambos platos con una
pipeta plstica y observar si el nivel de agua desciende.
Si existen prdidas, rehacer el armado.
43
2. Preparacin de la solucin de poliacrilamida-bisacrilamida
El oxgeno inhibe la polimerizacin, por lo que se recomienda desgasificar el agua y todas las
soluciones a utilizar.
Preparar el gel de separacin: Agregar al frasco las respectivas cantidades de agua,
mezcla de acrilamida: bisacrilamida (en una proporcin de 30:0.8), 1.5 M Tris y SDS 10%.
Agregar los agentes iniciadores de la polimerizacin: PSA y TEMED. Se debe tener en
cuenta que la mezcla comenzar a gelificarse, de manera que los pasos a seguir debern
realizarse con la debida celeridad.
Verter la solucin con una pipeta plstica entre ambas placas hasta 2 cm por debajo del
borde superior. Agregar rpidamente unas gotitas de agua sobre la solucin para evitar el
ingreso de oxgeno que retrasa la polimerizacin de la acrilamida.
Preparar el gel de apilamiento o stacking. Hacer esto mientras gelifica el gel de separacin,
que generalmente demora entre 20 y 30 minutos. No agregar el PSA ni el TEMED a la
solucin de gel de apilamiento hasta que el gel de separacin haya gelificado.
Una vez ocurrida la gelificacin, retirar el agua, verter el gel de stacking y colocar el peine
(para generar las calles) suavemente, evitando la formacin de burbujas.
Dejar que la acrilamida polimerice durante 60 minutos a temperatura ambiente. Una vez
gelificado, retirar el peine.
3. Armado de la cuba
Con el armado de la cuba se generan las dos cmaras entre las cuales pasar la corriente
elctrica. Los geles de poliacrilamida quedarn comunicando las dos cmaras (una andica
y otra catdica) y el pasaje de corriente a travs del gel producir la corrida del material a
analizar. Por lo tanto, del correcto armado depender el xito del anlisis de la tcnica.
Se colocan ambos geles en el soporte ad hoc tomando en cuenta la limpieza de las gomas
y su lubricacin. Es fundamental que la cmara que se genera entre los dos geles no
pierda. Para comprobar esto se debe cargar con buffer la cmara interna fuera del tanque y
observar que no se produzcan prdidas. Si esto sucede es posible sellar los bordes de la
cuba con agar al 1%, hasta lograr el aislamiento de la cmara interior. Una vez logrado
esto, se coloca el soporte dentro del tanque y se llena la cmara exterior con un volumen
de buffer que llegue aproximadamente hasta la mitad de su altura. El buffer con que se
llenan las cmaras y que se utiliza para la corrida es denominado buffer electrodo.
44
4. Preparacin de las muestras
El volumen mximo de muestra que puede sembrarse por cada calle es de 20l. En este
caso, hay que considerar que la muestra est diluida en buffer muestra (preparado a una
concentracin de 2X), y por lo tanto el volumen real de la muestra ser de 10l.
Una vez diluida la muestra en su buffer se debe hervir durante 10 minutos a fin de que se
produzca la desnaturalizacin de las protenas a estudiar.
Nota: La sensibilidad de la tcnica depende del colorante de protenas que se va a utilizar para
ver las bandas, pero el rango de deteccin se encuentra entre 1 a 10g. En el caso de
muestras complejas conviene sembrar de 50 a 100g de protena total.
6. Corrida
La cuba se conecta a la fuente de poder y se corre a voltaje constante, 70 volts durante
2 a 3 horas. El frente de corrida, marcado por el colorante presente en el buffer muestra,
permite determinar en qu momento la muestra ha alcanzado la parte inferior del gel. Una vez
concluida la corrida, se desconecta la fuente de poder y se desarma la cuba. Con guantes y
una esptula se despega el gel de los vidrios. El destino de este gel puede ser la tincin o la
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transferencia a una membrana de nitrocelulosa para posteriormente identificar la protena por
inmunoreactividad.
7. Coloracin de las protenas corridas
Si el destino es la coloracin para protenas, se lo sumerge en colorante Azul de
Coomassie (Coomassie Blue). Este colorante permite detectar entre 0.2 a 0.5 g de protenas.
La solucin colorante contiene cido actico que permite fijar las protenas a la vez que se
tien.
En los casos en que la sensibilidad de la tincin con Coomassie Blue no sea suficiente, se
puede utilizar la tincin argntica (Silver stain) que permite detectar hasta 2 ng de protenas por
banda. La tincin argntica, adems es til para detectar polisacridos y protenas altamente
glicosiladas.
Bibliografa
Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell Instruction Manual. Bio-Rad
Margni, R.A. 1996. Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Ed. Interamericana.
46
47
Introduccin a las tcnicas serolgicas
El diseo de una tcnica inmunolgica est relacionado con el resultado que pretendemos
obtener. Este resultado permite clasificarlas en:
TCNICAS CUALITATIVAS
Indican la presencia o ausencia de una "sustancia" (antgeno o anticuerpo) en una muestra. En
algunos casos el resultado es suficiente para confirmar un diagnstico.
TCNICAS SEMICUANTITATIVAS
Brindan una idea de la cantidad de sustancia presente en una muestra. A tal fin, la tcnica se
realiza sobre varias diluciones de la muestra para obtener el ttulo, que es la inversa de la
ltima dilucin que da resultado positivo.
El ttulo es una manera indirecta de cuantificar la sustancia reaccionante y es directamente
proporcional a la cantidad de "sustancia" presente en la muestra y al lmite de deteccin de la
tcnica utilizada. Por esto, cuando tenemos un resultado expresado en ttulo debemos indicar
cul fue la tcnica empleada.
TCNICAS CUANTITATIVAS
Determinan la cantidad o la concentracin de la "sustancia" presente en una muestra.
Requieren utilizar estndares de concentraciones conocidas que se evalan simultneamente
con la muestra y nos permiten realizar curvas patrones.
La cantidad de la sustancia presente en la muestra se calcula a partir de la curva patrn, por
interpolacin del resultado obtenido en la medicin de la muestra problema.
Diluciones
Una dilucin es una mezcla volumen/volumen en proporciones conocidas, formada por una
cierta cantidad de la sustancia que queremos diluir, o soluto (en el ejemplo, un suero) ms una
cierta cantidad de diluyente (por ejemplo solucin fisiolgica o medio de cultivo)
Puede expresarse como una fraccin donde el numerador representa la unidad del soluto (S) y
el denominador la suma del soluto ms el diluyente (D), o sea el total de la solucin.
Por ejemplo
- Dilucin 1/2 (factor de dilucin 2): 1 parte de S + 1 parte de D.
- Dilucin 1/5 (factor de dilucin 5): 1 parte de S + 4 partes de D.
- Dilucin 1/8 (factor de dilucin 8): 1 parte de S + 7 partes de D.
- Dilucin 1/10 (factor de dilucin 10): 1 parte de S + 9 partes de D.
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Las diluciones pueden expresarse tambin en forma logartmica, con slo colocar el logaritmo
del denominador de la fraccin como potencia negativa. As, por ejemplo:
Como se ve, S est ms diluido en la dilucin 1/10 (10-1) que en 1/8, 1/5 1/2. (10-0,3) O sea,
que la mayor de estas cuatro diluciones es 1/10.
Para preparar una dilucin 1/3, por ejemplo, se pueden usar diferentes volmenes segn el
requerimiento de la tcnica a usar:
Una dilucin seriada es aqulla en la que se realizan diluciones sucesivas del soluto, de
forma tal que el factor de dilucin se mantiene constante y la dilucin anterior se utiliza como
fuente de soluto para la dilucin siguiente.
Por ejemplo:
En todos los casos, si deseamos mantener el volumen constante, se descarta del ltimo tubo la
misma cantidad que tomamos de cada uno de los tubos anteriores.
El ttulo nos da una idea de los niveles de antgeno o anticuerpo presentes en una muestra.
La principal aplicacin de este concepto se refiere al nivel de anticuerpos especficos (contra un
antgeno dado) presente en un suero u otra muestra biolgica.
Para obtener el ttulo de anticuerpos, por ejemplo, de un suero, se hace una dilucin seriada
de dicho suero y a cada dilucin se la enfrenta con una cantidad fija del antgeno para el cual
es especfico. La reaccin observada entre antgeno y anticuerpo depender de la tcnica que
se use (aglutinacin, precipitacin, ELISA, etc.).
El ttulo de anticuerpos presentes en el suero (ttulo del suero) ser la inversa de la mayor
dilucin en la que se observa reaccin positiva.
En el siguiente ejemplo:
Dilucin 1/2: reaccin positiva
Dilucin 1/4: reaccin positiva
Dilucin 1/8: reaccin positiva
Dilucin 1/16: reaccin positiva
Dilucin 1/32: reaccin positiva
Dilucin 1/64: reaccin negativa
El ttulo ser la inversa de la dilucin 1/32, es decir, 32.
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Si la dilucin 1/64 hubiese dado un resultado positivo, deberamos haber seguido diluyendo el
suero hasta llegar al primer resultado negativo: cuando nuestro objetivo es obtener el ttulo de
un suero debemos llegar hasta la dilucin lmite o final de reaccin.
Se dice que hay conversin serolgica cuando el ttulo de anticuerpos contra determinado
antgeno en un individuo aumenta en por lo menos dos diluciones seriadas entre una primera y
una segunda muestra de sangre obtenida esta ltima, por lo menos 15 a 20 das despus de
la primera. Una variacin menor a 2 diluciones podra deberse slo a variaciones en el
procedimiento, o sea al error experimental aceptado.
La seroconversin aporta datos referentes a la etapa de la infeccin en la que se encuentra un
individuo, sobre todo en enfermedades tales como toxoplasmosis o leptospirosis, en las que
nicamente el aumento del ttulo de anticuerpos contra los respectivos microorganismos indica
enfermedad aguda.
Independientemente de la tcnica utilizada para determinar el ttulo podemos decir que dado
que la capacidad de respuesta es propia de cada individuo y est influenciada genticamente,
slo una comparacin con valores propios (previos y posteriores) puede determinar si ha
aumentado o disminuido la respuesta frente al antgeno.
Fundamentos de las tcnicas serolgicas
Las reacciones antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) pueden llevarse a cabo in vitro si se respetan las
condiciones fisiolgicas en las que normalmente ocurren (pH, tonicidad, temperatura) y pueden
emplearse como una herramienta diagnstica de rutina tanto en laboratorios de investigacin
bsica como en la clnica mdica veterinaria.
La reaccin Ag-Ac implica una unin de tipo no covalente, reversible entre ambas
molculas. La forma complementaria de las nubes de electrones en el sitio de combinacin
entre el anticuerpo (paratope) y el determinante antignico (epitope) hace que las dos
molculas encajen de manera ajustada, de modo que la distancia intermolecular se torna muy
pequea y aumentan en grado considerable las fuerzas de interaccin no covalentes que
participan en la unin. Cuando la complementariedad espacial no es la ideal, se produce
superposicin de las nubes electrnicas y se generan fuerzas de repulsin que determinan que
la fuerza de unin (afinidad) sea diferente en distintos anticuerpos que reconocen un mismo
epitope.
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De Interaccin PRIMARIA:
Ocurren en milisegundos y estn determinadas por la afinidad del paratope del anticuerpo por
el epitope de un antgeno. La reaccin no se puede reconocer a simple vista, por lo tanto, para
determinar si la misma tuvo lugar se emplean mtodos en los que el antgeno o el anticuerpo
se marcan con una molcula que puede ser un radioistopo (en la prueba de RIA), una enzima
(en las pruebas de ELISA, Inmunoblot e Inmunohistoqumica) o un fluorocromo (en la
Inmunofluorescencia). Estos mtodos transforman la reaccin primaria en seales (radiactivas,
colorimtricas o fluorescentes) que pueden interpretarse y cuantificarse.
De Interaccin SECUNDARIAS:
Es la consecuencia de la unin antgeno-anticuerpo luego de ocurrida la reaccin primaria,
dadas por las caractersticas del antgeno y del anticuerpo. Si el antgeno es polivalente (varios
determinantes antignicos) y el anticuerpo acta como divalente o polivalente, se forma una
red o entramado en el que un anticuerpo est unido a por lo menos 2 partculas antignicas
diferentes y cada partcula antignica est unida a una o ms molculas de anticuerpo. Esta
reaccin puede observarse a simple vista. Segn la solubilidad del antgeno involucrado en la
reaccin (soluble o particulado) recibe diferentes nombres:
De interaccin TERCIARIAS:
Cuando el reconocimiento del antgeno por el anticuerpo ocurre in vivo, pueden presentarse
manifestaciones visibles en el animal evaluado.
No todas las pruebas serolgicas tienen la misma capacidad para diferenciar los individuos
sanos de los enfermos. Existen dos parmetros empleados generalmente para evaluar las
pruebas diagnsticas en general y las pruebas serolgicas en particular: la sensibilidad y la
especificidad, que se obtienen al comparar los resultados obtenidos en la prueba evaluada
con los obtenidos con la prueba estndar de oro o de referencia.
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Podemos definir entonces:
Tcnica de Referencia o
Infeccin Real
+ -
(enfermo) (sano)
Tcnica Objeto + A B
de Valoracin - C D
SENSIBILIDAD = A / A+C
ESPECIFICIDAD = D / B+D
En las que:
(A) Positivos en que coinciden ambos mtodos (Positivos Verdadero).
(B) Negativos reales que la tcnica objeto de valoracin da como positivos (Falsos Positivos).
(C) Positivos reales que la tcnica objeto de valoracin da como negativos (Falsos Negativos).
(D) Negativos por ambas tcnicas (Negativos Verdadero)
Poblacin sana
Poblacin enferma
Resultado de la prueba: - +
Valor de corte
52
El trmino sensibilidad posee otra acepcin que se refiere al nivel de deteccin mnimo o
lmite de deteccin de una tcnica inmunolgica. Este concepto se refiere a la cantidad
mnima de anticuerpos reaccionantes necesaria para que stos puedan ser detectados por una
determinada tcnica.
En la tabla se ejemplifican los valores de sensibilidad como lmite de deteccin de las tcnicas
inmunolgicos a fin de compararlas
Lmite de deteccin
Tcnica
(mg/ml de Ac)
RIA 0,0001
ELISA 0,0003
AGLUTINACIN 0,0300
INMUNOFLUORESCENCIA 0,5000
PRECIPITACIN (*) 1 - 4,0000
(*) Difusin doble en agar
ELISA
Como toda reaccin antgeno-anticuerpo, posee un equilibrio dinmico con una primera etapa
reversible y una etapa irreversible. Esta cintica depende de la molaridad del medio (soluciones
tamponadas -o buffers- utilizados) y del tiempo y temperatura en que se produce la reaccin
(incubacin).
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La peroxidasa y la fosfatasa alcalina son las dos enzimas ms utilizadas. Desde hace
algunos aos se ha difundido el uso de ureasa, -galactosidasa y glucosa-oxidasa.
Peroxidasa
Las peroxidasas son hemoprotenas que transfieren Hidrgeno desde un donante (DH) al O del
H2O2. La peroxidasa ms utilizada, obtenida del rabanito (HRP: Horse-Radish Peroxidase),
posee un alto contenido en hidratos de carbono que facilita la conjugacin a anticuerpos. Para
revelar la reaccin qumica producida se utilizan diferentes cromgenos, entre ellos:
2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfonato de diamonio (ABTS), que absorbe a 405 nm.
cuando se oxida vira al color verde.
3-metil-2-benzotiazolinona hadrazona (MBTH), que reacciona con el cido 3-(dimetilamino)
benzoico (DMAB), que absorbe a 590 nm.
orto-fenilendiamina (OPD) o 1,2,-bencenodiamina, que absorben a 492 nm. Cuando se
oxida vira al color ocre
Diaminobenzidina (DAB): cuando se oxida vira al color pardo
El sustrato ms utilizado con peroxidasa es el agua oxigenada o perxido de hidrgeno (H 2O2):
La accin de la peroxidasa sobre el perxido de hidrgeno degrada este compuesto dando
agua y liberando oxgeno (O-). El oxgeno, a su vez, oxida al cromgeno que pasa de incoloro
en su estado reducido a coloreado en su estado oxidado.
Como todas las enzimas, la peroxidasa acelera el proceso de degradacin del sustrato sin
perder su funcionalidad, por lo tanto, se encuentra en condiciones de reaccionar nuevamente
una y otra vez es por eso que debe agregarse una sustancia de solucin de freno o stop que
modifica el pH.
Fosfatasa alcalina
Las fosfatasas alcalinas utilizadas en los ELISAs se aslan a partir de intestino bovino o de
Escherichia coli. Estas enzimas hidrolizan una amplia gama de steres de fosfatos (como los
de alcoholes primarios, secundarios, fenoles y aminas), tienen un pH ptimo alcalino (por lo
que se emplean soluciones a base de dietanolamina con pHs cercanos a 9) y requieren Mg y
Zn como cofactores.
Los cromgenos ms utilizados para esta enzima son:
-pNPP (paranitrofosfato) que vira de incolora a amarillo.
-5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazolium (NBT/BCIP) que vira de incoloro
a azul.
54
utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS. Se incuba durante 1 hora
a 37C o durante 16 hs a 4C.
4. El exceso de solucin bloqueante se remueve mediante lavados con PBST.
5. Se agrega el suero problema y los sueros control positivo y negativo por duplicado o
triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. (El suero problema es
aqul del cual se quiere conocer si posee Acs especficos contra el Ag que se encuentra
pegado en la placa, en este caso es un suero bovino en el que se analiza la presencia de
Acs anti-B. abortus).
6. Los anticuerpos no unidos al Ag se remueven mediante lavados con PBST.
7. Se agrega un anticuerpo unido a enzima (conjugado) que reconoce a las inmunoglobulinas
de la especie de la cual estamos evaluando el suero (En este caso, el conjugado ser un Ac
anti-Ig bovina). Si el Ac especfico est presente, el anticuerpo conjugado reacciona con l y
queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C.
8. El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST.
9. Se agrega el sustrato de la enzima. La reaccin de la enzima con el sustrato resulta en un
producto coloreado y es un indicador visual de que la reaccin antgeno-anticuerpo ha
tenido lugar.
10. Dado que las enzimas pueden continuar degradando el sustrato dependiendo del
tiempo y la temperatura se realiza el frenado de la actividad enzimtica a tiempo de reaccin
determinado que se relaciona con la aparicin de color en los controles negativos de
sustrato. El freno depende de la enzima utilizada y es en el caso de peroxidasa cido
sulfrico y para fosfatasa se utiliza el hidrxido de sodio, ambos modifican el pH y la
reaccin se frena.
11. La reaccin cromtica puede ser leda a simple vista o cuantificada por
espectrofotometra. La intensidad de la reaccin es proporcional a la cantidad de enzima
activa presente en cada hoyo.
Lectura:
En caso de haber anticuerpos antibrucella en el suero bovino problema, se observar la
aparicin o cambio de color en el sustrato. En un primer paso, los anticuerpos del suero se
unen al antgeno pegado a la placa. Al agregar los anticuerpos conjugados a la enzima, stos
reconocen y se unen a los anticuerpos del suero. La enzima queda adherida y se produce as
la reaccin al agregar el sustrato.
De no haber anticuerpos especficos en el suero problema, el resto de los anticuerpos se
eliminan con el lavado. Al agregar el Ac anti-bovino marcado con la enzima, ste no reconoce
ninguna molcula especfica y se elimina al realizar el ltimo lavado. Por lo tanto, al agregar el
sustrato no se producir ninguna reaccin especfica. Se puede observar un nivel bajo de seal
por autodegradacin del sustrato o debido a la presencia de enzima por lavado ineficaz de la
placa. Por esto es tan importante que despus de cada incubacin se proceda al lavado con
soluciones salinas con detergentes suaves, a fin de eliminar las protenas unidas de manera
inespecfica a los soportes slidos.
55
5. Se agrega la muestra a evaluar (muestra problema) y los controles positivos y negativos por
duplicado o triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. (Muestra
problema es aqulla en la que se quiere determinar la presencia del Ag para el que son
especficos los Acs fijados a la placa)
6. Los antgenos no unidos al Ac se remueven mediante lavados con PBST.
7. Se aade un segundo anticuerpo especfico para ese antgeno, pero unido a una enzima
(conjugado). Si el Ag especfico est presente, el anticuerpo conjugado reacciona con l y
queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. El exceso de
conjugado se remueve mediante lavados con PBST.
8. Se coloca el sustrato de la enzima y se relaciona la actividad enzimtica observada con la
concentracin del antgeno presente en la muestra.
ELISA DIRECTO:
La muestra problema (de la cual no se sabe si contiene o no Ac o Ag) se inmoviliza sobre la
fase slida. En caso de analizar Ac, estos se detectan por medio de Ags conjugados, y en el
56
caso de analizar la presencia de Ag, estos se detectan por Ac conjugados. (Fig. 1).
Positiva
Negativa
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ELISA INDIRECTO:
En el ELISAs indirecto el antgeno o anticuerpo a identificar es capturado en la placa por la
molcula complementaria (Ag o Ac), segn corresponda. O sea, si se desea detectar Acs
especficos en un suero, se inmoviliza el antgeno en la fase slida y se lo hace reaccionar con
el suero problema. Luego se utiliza un Ac anti-Ig de la especie conjugado a una enzima. Este
sistema tiene alta detectabilidad debido a que varias molculas del conjugado enzimtico (Anti-
Ig marcados con la enzima) pueden unirse a cada molcula de Ac que reaccion a su vez con
el Ag inmovilizado, este efecto se traduce en una amplificacin de la seal. (Fig. 2)
= Ac problema o incgnita
58
2- De modulacin de actividad o competitivos
59
Muestra Muestra
negativa positiva
o incgnita
o patrn
Valor de corte = D.O promedio de los controles del suero negativo + 2 desvos estndar del
suero negativo.
El valor de corte debe ser tal que minimice los resultados falsos, ya sean positivos o negativos.
En muchos casos existe una zona de solapamiento en la distribucin de la reactividad de
sueros positivos y negativos, en la que no puede establecerse con certeza si una muestra es
positiva o negativa.
Por este motivo el valor de corte se determina de manera tal de tener ms falsos positivos o
falsos negativos, segn qu tipo de error produzca consecuencias menos graves.
Controles
Para una correcta interpretacin de los resultados deben realizarse controles de todos los
reactivos utilizados. Los controles deben permitirnos afirmar que el cambio de color detectado
corresponde a la interaccin especfica entre Ag y Ac y no a reacciones inespecficas. Si las
reacciones inespecficas se detectan estas deben ser minimizadas y tomadas en cuenta en el
momento de establecer el valor de corte.
Podemos ejemplificar los controles en un ELISA indirecto de la siguiente manera:
60
Controles del conjugado
A- Control negativo del Conjugado: Dicho control se realiza para determinar que el anticuerpo
conjugado a la enzima no interacciona con ningn otro componente del sistema que no sea el
anticuerpo primario. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antgeno, se
bloquea, no se incuba con el suero o anticuerpo primario (se mantiene el bloqueante), se
coloca el anticuerpo conjugado y por ltimo el sustrato. Este no debera reaccionar con el
antgeno pegado a la placa, dando reaccin negativa.
B- Control positivo del Conjugado: Este control se realiza a fin de determinar que el anticuerpo
conjugado a la enzima interacta correctamente con el anticuerpo primario. Se realiza de la
siguiente manera: Se pega un suero de la especie frente a la cual es especfico en conjugado.
Por ejemplo si el anticuerpo conjugado es un anticuerpo anti ratn se coloca en la placa suero
de ratn, se bloquea, no se coloca anticuerpo primario y se coloca el anticuerpo secundario
marcado con la enzima, continuando el resto de la tcnica de la misma manera. Este control
debe dar positivo, es decir debe haber color en los hoyos indicando el correcto funcionamiento
del conjugado.
Control del sustrato: Este control nos permite determinar que el sustrato de la enzima no
reacciona con ningn otro componente del sistema excepto con la enzima. Se realiza de la
siguiente manera: se pega a la placa el antgeno, se incuba con el anticuerpo 1, es decir, el
suero, y no se coloca el anticuerpo conjugado, y se coloca el sustrato el cual no debera
modificar su color, ya que no hay en los hoyos enzima que catalice la reaccin.
Protena A:
Es una protena de la pared de Staphylococcus aureus que tiene alta afinidad por los
fragmentos Fc de algunos isotipos de Igs (Ka=108 M-1). Tiene 4 sitios de unin, aunque
generalmente reaccionan slo dos.
61
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Ag* Ac-Ag*
Ac +
Ag Ac-Ag
Donde
Ac representa al anticuerpo especfico;
Ag* es el antgeno marcado (trazador) libre;
Ag es el antgeno libre no marcado de las soluciones patrones o de las muestras desconocidas;
Ac-Ag* es el complejo soluble entre el anticuerpo y el antgeno marcado, y
Ac-Ag es el complejo soluble con el antgeno no marcado.
62
Ejemplos de aplicacin de la tcnica de RIA
RAST (RadioAlergoSorbent Test) o prueba de radialergoadsorcin:
Es utilizado para la deteccin de IgE especfica de alergenos. El reactivo marcado es un Ac
(generalmente monoclonal) anti-IgE. Si el animal tiene en su suero IgE especfica contra el
alrgeno previamente adsorbido a un soporte, la radiactividad detectada por el RIA ser
directamente proporcional a la concentracin de esa IgE.
Bibliografa
Inmunoblot o Western-blot1
El anlisis de una muestra por la tcnica de inmunoblot requiere realizar una primera etapa de
separacin de los componentes en un campo elctrico en geles de poliacriamida (PAGE) y
posteriormente la transferencia de esas protenas ya separadas por peso molecular (PM), a
una membrana. Esta transferencia se realiza poniendo en contacto el gel con una membrana
de nitrocelulosa y aplicando una corriente elctrica a pH alto. Las molculas proteicas se
movilizan y contactan con la membrana, a la cual se fijan. La unin a la membrana de
nitrocelulosa es debida fundamentalmente a interacciones de tipo hidrofbico.
Las molculas transferidas a la membrana son identificadas posteriormente por interacciones
con anticuerpos especficos.
1
La transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis desde un soporte
gelificado a una membrana, fue descripta inicialmente por el Dr. Southern. Debido a ello, esta
tcnica se denomin Southern-blot. La aplicacin de esta tcnica para el estudio de RNA se
denomin Northern-blot y cuando sta se desarroll para protenas se la llam Western-blot.
Por lo tanto son sinnimos.
63
una membrana de nitrocelulosa la que se usa como antgeno para interaccionar con el
anticuerpo monoclonal. Como resultado se espera el reconocimiento de un slo componente
por parte del anticuerpo.
Las membranas teidas muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se
observarn un nmero de bandas variables dependiendo de las distintas protenas que sean
reconocidas por el anticuerpo primario que componen la mezcla. Al dato del PM se le suma la
antigenicidad de estos componentes analizados.
Anexo
A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un inmunoblot utilizando la
cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios Bio-Rad).
Materiales necesarios:
Guantes libres de talco
2 Esponjas finas tipo Scotch Brite
2 hojas de papel Whatman 3MM o equivalente
Membrana de nitrocelulosa
Aparato de electrotransferencia o electroblotting
Lapicera que permita marcar la membrana aunque est humedecida.
64
7. Se coloca una segunda pieza de papel Whatman pre-humedecido y de esponja y se
completa el armado cerrando el soporte de transferencia.
8. Se colocan los dos soportes armados en la cuba ad hoc. Se debe tener la precaucin de
controlar los cdigos de colores que indican los electrodos. Como las protenas estn
cargadas negativamente porque estn recubiertas con SDS, se mueven hacia el nodo (+:
base roja).
9. Se coloca el contenedor con hielo dentro de la cuba y se llena la cuba con buffer de
transferencia. El nivel del buffer debe superar el borde superior de la membrana, con el
objetivo de que sta quede sumergida por completo y la transferencia sea pareja.
10. La transferencia se puede realizar durante 1 hora a 100 V agregando un refrigerante en la
cuba durante 16 horas a 15-30 V en una habitacin refrigerada y con agitacin del buffer.
11. Cuando el tiempo se ha cumplido, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se
desarma el aparato. Los geles pueden ser teidos con Coomassie blue para determinar la
eficiencia de la transferencia. Si se utiliz un marcador de peso molecular preteido, ste se
puede utilizar como control de la transferencia.
12. Las membranas deben ser marcadas en sus extremos y calles para poder luego determinar
la identidad de la muestra.
En este procedimiento se logra tener las muestras (antgenos) adheridas a la membrana y en
una posicin conocida y determinada por su PM.
Las bandas donde hubo reaccin antgeno-anticuerpo se hacen visibles por la precipitacin del
colorante sobre la membrana; el fondo del papel donde no ocurri la unin se observa blanca.
Cuando la imagen es ptima, se frena la reaccin diluyendo el substrato y el colorante con
agua destilada. Luego la membrana se coloca entre papeles absorbentes y se puede registrar
el resultado mediante un scanner o cmara fotogrfica.
El poro de la membrana puede ser de 0.45m cuando se requiere retener protenas, pero
algunos poliptidos pueden atravesar estas membranas sin unirse. Esto puede solucionarse
utilizando membranas de poro ms pequeo, como por ejemplo, de 0.1m.
65
Las membranas de nitrocelulosa tienen una capacidad de unin de 80g de protena por cm2
de superficie. Otras membranas, como las catinicas de nylon (Zeta-Probe o Bio-Rad), son
ms resistentes (no se rompen al secarse) y con su utilizacin se obtiene una capacidad de
unin de protenas de hasta 500g/cm2. Esta caracterstica es ventajosa, pero por otro lado
puede ser una desventaja, ya que hace que las membranas sean difciles de bloquear.
Inmunocromatografa
Anticuerpos de deteccin
m arcados con
Oro Coloidal
Antgeno en la muestra
Siembra de la muestra
NITROCELULOSA
Anticuerpo de Captura Anticuerpo de Captura
contra anticuerpo contra antgeno
de deteccin Especfico
Resultado positivo
Resultado negativo
66
Millipore A. A short guide for developing inmunochromatographic test strips (en lnea).
2nd edition; 2001 (Fecha de acceso: diciembre 2001). URL disponible en:
http://www.com/oemproducts.
Engler KH, Efstratiou A, Norn D, Koslov RS, Selga I, Glushkevich TG, et al.
Immunochromatographic strip test for rapid detection of diphtheria toxin: description and
multicenter evaluation in areas of low and high prevalence of diphtheria. J Clin Microbiol
2002; 4(l): 80-3.
Inmunohistoqumica
Las ventajas de las tcnicas inmunohistoqumicas son que permiten una localizacin ms
precisa de la reaccin antgeno-anticuerpo; la tincin es permanente, estable, puede
contrastarse y puede evaluarse con microscopio ptico. El material as estudiado puede
archivarse por aos sin prdida de la intensidad de la reaccin.
Tiene algunas desventajas como la presencia de reacciones inespecficas o cruzadas,
especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Los anticuerpos monoclonales han
permitido aumentar la especificidad y sensibilidad de esta tcnica.
Algunos reactivos son carcingenos potenciales y su manipulacin debe ser cuidadosa,
requieren de estandarizacin precisa y estricto control de calidad.
67
Existen diversos tipos de tcnicas, cuya indicacin depender del anticuerpo a utilizar
(monoclonal o policlonal), del material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y de
los antgenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmticos o nucleares).
Estas tcnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos.
En los tejidos, las uniones inespecficas se pueden bloquear con albmina bovina, con leche
descremada, o con suero normal de alguna especie distinta y alejada filogenticamente de la
que se esta estudiando.
Enzimas utilizadas:
Las enzimas ms utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina, que reaccionan dando
distintos colores con los diferentes sustratos segn la reaccin, lo cual servir para detectar
distintas uniones antgeno-anticuerpo.
Preparacin de tejidos para inmunohistoqumica:
El xito de la inmunohistoqumica depende de la preservacin de los antgenos y del manejo de
los anticuerpos. La conservacin de los tejidos por congelacin puede afectar los tejidos y la
estructura celular, debido a la formacin de cristales de agua intracelulares. La necesidad de
mantener la estructura tisular hace de la fijacin un paso fundamental en las tcnicas
histolgicas. Esta necesidad de fijacin se contrapone al riesgo de provocar cambios
estructurales y moleculares asociados a cualquier tratamiento de las clulas o tejidos
destinados a la observacin microscpica. En IHQ, la fijacin y el tratamiento previo de los
tejidos debe satisfacer diferentes criterios como:
Retener los antgenos
Preservar la antigenicidad
Preservar la estructura
Permitir la interaccin antgeno- anticuerpo
Fijacin:
El mayor problema que suelen presentar los fijadores qumicos es que pueden impedir la unin
antgeno-anticuerpo, por el enmascaramiento del antgeno debido a cambios conformacionales
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que ocurren en el antgeno (epitope). No existe un fijador universal, en todos los casos hay que
realizar distintas pruebas con diferentes fijadores (y diferentes condiciones de fijacin) para
cada antgeno y para cada tejido. El fijador mas utilizado es el formol tamponado,
(formaldehdo al 10 % en fosfato disdico y monobsico) debido a que es ms accesible por
costos y es menos agresivo a los tejidos que el formol puro.
Preincubaciones
Una vez obtenidos los cortes y antes de iniciar las incubaciones con los anticuerpos, se han de
hacer diversas preincubaciones y lavados a fin de facilitar la penetracin de los anticuerpos y
disminuir el marcaje inespecfico. Generalmente todas las preincubaciones se realizan en
soluciones fosfato o tris-HCl o bien en solucin salina tamponada. En el caso de que el proceso
se realice sobre portaobjetos gelatinizados, hay que calentarlos previamente entre 37 y 50C
(dependiendo de la sensibilidad de los antgenos a la temperatura) durante 10 min.
Inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia es una tcnica de interaccin primaria que permite la
localizacin de antgenos en tejidos, frotis de microorganismos, clulas o cultivos en
monocapa. Tambin permite la bsqueda de anticuerpos especficos. Utiliza como reactivo una
inmunoglobulina marcada con colorantes fluorescentes.
Esta tcnica puede ser:
Directa
Indirecta
Inmunofluorescencia Directa:
Consiste en demostrar la presencia de un antgeno mediante la reaccin directa con un
anticuerpo especfico marcado con un colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a
travs de la inoculacin del antgeno en un animal de experimentacin.
69
Inmunofluorescencia Indirecta:
En este caso se busca, en el suero del paciente la presencia de anticuerpos especficos para
un antgeno determinado. Se preparan improntas de los antgenos sobre portaobjetos, por
ejemplo T. gondii, clulas infectadas por virus, etc. Sobre las improntas se coloca el suero en el
cual se sospecha la presencia de anticuerpos especficos. Si la reaccin es positiva, habr
formacin de complejos inmunes. Para hacer ostensible esta unin antgeno-anticuerpo, se
debe utilizar una inmunoglobulina (anti-especie o antigamma) marcada, que reaccionar con el
anticuerpo del paciente. La ventaja de la tcnica indirecta es que no se necesita un anticuerpo
marcado para cada antgeno
Fluorocromos
Los fluorocromos son sustancias que se utilizan para marcar estos anticuerpos especficos.
Estos colorantes permiten identificar la presencia de las sustancias marcadas con ellos, cuando
son excitados por luz ultravioleta. Para unir los fluorocromos a un anticuerpo, estos deben
cumplir con una serie de requerimientos:
Que el fluorocromo desarrolle suficiente fluorescencia para que la seal emitida sea visible y
no se vea interferida por la autofluorescencia del tejido.
Que tenga un grupo funcional capaz de fijarse a la molcula de anticuerpo.
Que sea soluble en soluciones acuosas, ya que los solventes pueden producir la
desnaturalizacin de las protenas durante la unin.
Que no pierdan fluorescencia al unirse con los anticuerpos.
70
Que no alteren la especificidad ni la actividad de los anticuerpos.
Que al formar los conjugados no pierdan su fluorescencia con la accin de la luz.
La marcacin de los anticuerpos con los fluorocromos se basa en complejas reacciones que
llevan a la formacin de uniones covalentes entre ellos y las molculas de inmunoglobulinas.
Esta unin se hace a pH alcalino. Adems, la conjugacin entre ambas molculas depende de
la temperatura y del tiempo de reaccin.
Cuando hay un exceso de anticuerpo con respecto al fluorocromo, se obtienen conjugados que
emiten escasa fluorescencia. Cuando sucede lo contrario, es decir, cuando hay mucho
fluorocromo unido al anticuerpo, se corre el riesgo de tener marcacin inespecfica.
Los isotiocianatos reaccionan con los grupos aminos libres de los aminocidos de los
anticuerpos, particularmente de la lisina. Es importante entonces que los buffers usados para la
conjugacin no tengan grupos aminos (tris, azida, glicina, amonio, etc).
El isotiocianato de fluorescena (FITC) es el fluorocromo ms usado para la conjugacin con
anticuerpos. Produce una muy buena seal de color verde, que se diferencia notablemente de
la autofluorescencia generalmente ms amarillenta y plida de los tejidos. La fluorescena es
muy sensible a las variaciones de pH: La mayor emisin se obtiene a pH 8-9. El inconveniente
ms importante es que pierde color rpidamente. Por ello, durante el tiempo que se mantengan
las improntas teidas hay que tener la precaucin de guardarlas envueltas en papel de
aluminio y en un sitio oscuro, para evitar el deterioro que les produce la exposicin a la luz.
Microscopio de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia consta de:
- el microscopio ptico
- una lmpara de mercurio o halgena que emite luz ultravioleta
- un sistema de filtros:
a) El primer filtro es el de excitacin o seleccin de luz, ubicado entre la fuente de luz y el
preparado. Tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud tal que caiga en el
rango azul, con el fin de que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y
produzca emisin de luz fluorescente.
b) El segundo filtro es el de calor y est ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitacin
en los microscopios de luz transmitida, y entre la fuente de luz y el espejo dicrmico en los
microscopios de luz incidente.
c) El tercer filtro es el de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daos retinianos
que podran ser causados por rayos ultravioletas que escapan por reflejo en el espejo
dicrmico.
71
Manejo de cortes y tejidos:
Los cortes y frotis montados sobre portaobjetos que no se estudien de inmediato, se pueden
proteger por inmersin en carbowax y almacenamiento a -20C. Los cortes liofilizados,
protegidos con resina de polister, se pueden conservar varios meses en un desecador a 0C
sin que pierdan sus antgenos.
Es preferible trabajar con cortes fijados ya que la tincin inmunofluorescente en cortes sin fijar
se acompaa de difusin o prdida del antgeno.
Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antgeno-anticuerpo, los ms empleados
son alcohol etlico al 95% entre 4-30C, alcohol metlico, acetona o formol. Para bacterias es
muy til la fijacin mediante calor. La inclusin en parafina de los tejidos es muy usado y puede
lograr una localizacin ms precisa y una tincin ms viva que con cortes en congelacin.
Bibliografa
1) Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for
Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences
2) Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc. P.O. Box 502, Pullman,
WA 99163, U.S.A.
3) Immunobiology 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Schlomchik,
Mark. Garland Publishing c 2001
4) http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
5) Manual de procedimientos. Instituto Malbrn.
72
Citometra de flujo
El sistema de citometra de flujo permite analizar partculas de 0,2 a 150 micrmetros. La luz
desviada por las partculas as como la fluorescencia emitida por ellas es captadas por lentes
posicionados para tal fin. Luego la informacin es trasmitida a detectores que producirn
seales electrnicas proporcionales a la seal ptica recibida
Es decir que el sistema electrnico convierte las seales pticas en electrnicas para que
puedan ser procesadas por una computadora. En algunos casos, cuando el aparato tiene
sistema de separacin de partculas, el sistema electrnico identifica cules de las clulas o
partculas guardar y cules desechar.
.
1-Sistema de fluidos
La zona del citmetro donde las clulas (o partculas) se juntan con el fluido se la conoce
como cmara de flujo El fluido del citmetro se encuentra a presin y conduce la muestra a
travs de la cmara de flujo. Las partculas de la muestra a ser analizadas llegan separadas y
en una corriente de fluido presurizado. El propsito de este sistema es permitir que el rayo lser
atraviese la muestra justo por el centro
2-Sistema ptico
Est formando por un sistema de excitacin y uno de recoleccin.
El sistema de excitacin consiste en un lser y lentes que se usan para enfocar el rayo lser
El sistema de recoleccin consiste en lentes que colectan la luz emitida por la interaccin entre
el rayo lser y la partcula y un sistema de espejos y filtros que encausan rangos de ondas
determinados de la luz colectada a detectores pticos especficos.
Generacin de dispersin:
Cuando una partcula es incidida por el rayo lser se produce una desviacin de la luz
que depender de las propiedades fsicas de las partculas, es decir: su tamao y complejidad
interna. La membrana celular, el ncleo, y cualquier material granular que se encuentre dentro
de la clula, afectan la desviacin de la luz. La forma de la clula y la topografa de la superficie
celular tambin contribuyen a la desviacin total de la luz.
La luz desviada hacia adelante (Forward Scattered light: FSC) es proporcional a la superficie o
tamao celular. FSC es una medida de la luz difractada y es detectada por un fotodiodo en
direccin frontal.
La luz desviada hacia el costado (Side Scattered light: SSC) es proporcional a la granularidad
celular y a la complejidad interna de las clulas. SSC es, esencialmente, una medida de la luz
refractada que ocurre en cualquier interfase dentro de la clula donde hay un cambio en el
ndice de refraccin. SSC se colecta aproximadamente a 90 grados del rayo lser mediante
lentes colectoras y luego es redireccionada a un detector.
73
Correlacionando las mediciones de FSC y SSC se pueden diferenciar tipos celulares en una
poblacin heterognea. La mayora de las poblaciones leucocitarias pueden diferenciarse
usando FSC y SSC.
Fluorescencia:
Filtros pticos:
Una vez que la partcula pas a travs del lser, la SSC y la seal fluorescente emitidas
van al fotomultiplicador, mientras que el fotodiodo colecta la FSC. La especificidad de un
detector para una tincin fluorescente en particular se puede optimizar colocando un filtro que
permite que slo un rango estrecho de longitudes de onda alcance el detector.
Deteccin de seales:
Los fotodetectores convierten las seales de luz en seales elctricas. La intensidad de
las seales elctricas es proporcional a la intensidad de las seales de luz.
Cuando la partcula se interpone en el haz de lser y comienza a desviar la luz o producir
fluorescencia, se crea un pulso. El punto ms alto de este pulso ocurre cuando el rayo incide
sobre el centro de la partcula y se capta el mximo de luz desviada o fluorescencia emitida. A
medida que la partcula se aleja del rayo, el pulso baja a la lnea de base.
Una vez que las seales de luz (fotones) golpean al fotodiodo, son convertidos en un nmero
proporcional de electrones que se multiplican para crear una corriente elctrica mayor. La
corriente elctrica viaja al amplificador y se convierte en un pulso de voltaje; este pulso
depende del nmero de fotones detectados por el fotomultiplicador.
74
Umbral:
Se usa para limitar el nmero de eventos que adquiere un citmetro. El umbral se
establece en un parmetro. Por ejemplo si el umbral se establece en FSC, slo sern
registradas las seales generadas por partculas cuyo tamao sea mayor que el umbral
establecido. Este control se usa para eliminar seales generadas por polvo, restos celulares, o
ruido electrnico en el sistema. En aquellos equipos que tienen ms de un lser, se puede
establecer un segundo umbral. En ese caso la seal emitida por la partcula a ser analizada
deber alcanzar los dos umbrales para ser procesada como un evento.
Los datos se guardan en un formato standard denominado Flow Cytometry Standard Format.
Una sola clula analizada para cuatro parmetros FSC, SSC, FITC y PE genera 8 bytes de
datos. Si se multiplica este valor para un slo dato, por el nmero de eventos que se adquieren
en cada muestra y teniendo en cuenta que cada operador procesa cerca de treinta muestras
por da, se puede tener una idea de la capacidad de almacenamiento de datos que tiene un
citmetro.
Una vez que los datos han sido guardados, pueden ser presentados y graficados en el
citmetro de diversas maneras: como histogramas, grficos tridimensionales, grficos de
puntos, etc.
Gate 1
75
Esquema de un citmetro de flujo
Muestra
Fluorescencia Verde
Lser
Dispersor de luz de
90 (granulosidad)
Collar de Dispersor de luz
carga frontal (tamao)
- +
Tubos colectores
Desechos
Una vez adquirida la muestra, los datos son guardados en la computadora del citmetro y
pueden ser analizados en cualquier momento y de diversas maneras. Por ejemplo:
76
establecido el primer marcador sobre el control negativo (M1) se ubica el segundo marcador
sobre el pico del histograma que contiene la poblacin considerada positiva (M2).
Un grfico de puntos (dot plot) muestra los datos de dos parmetros. Cada punto puede
representar uno o ms eventos, de acuerdo a lo establecido por el operador. (Ver figura 1b
izquierda y figura 2)
El marcador de cuadrantes divide un grfico de dos parmetros en cuatro secciones y permite
distinguir poblaciones negativas, positivas y doble positivas.
- El cuadrante inferior izquierdo (LL) muestra la poblacin negativa para ambos parmetros.
- El cuadrante superior izquierdo (UL) muestra la poblacin que es positiva para el parmetro
graficado sobre el eje vertical.
- El cuadrante inferior derecho (LR) muestra la poblacin positiva para el parmetro graficado
sobre el eje horizontal.
- El cuadrante superior derecho (UR) muestra la poblacin positiva para ambos parmetros.
FiGURA 1a
Negativo Positivo
M1 M2
N de clulas
Fluorescencia
77
Figura 1 b: Grfico de puntos e histograma
78
Separacin de partculas (SORTING)
En la mayora de las aplicaciones, una vez que la partcula ha pasado a travs del rayo
lser, es enviada a desecho.
El sistema de separacin de partculas permite capturar aqullas consideradas de inters para
anlisis posteriores. Una vez colectadas, estas partculas pueden ser examinadas
microscpica, bioqumica o funcionalmente.
No todos los citmetros estn equipados para hacer separacin de partculas.
Para efectuar la separacin de partculas, el equipo debe primero determinar cules son las de
inters. Una vez que la poblacin de inters ha sido identificada en una curva de adquisicin de
datos, se dibuja una regin alrededor de ella. Luego se carga esta informacin en el citmetro
como regin de separacin. Esta regin identifica aquellas clulas que sern separadas de la
corriente de fluido por donde transita toda la muestra.
A medida que cada clula pasa por el lser, el equipo determina si la misma pertenece a la
poblacin de inters. Dado que el alineamiento del lser y la velocidad de la corriente son fijos,
el tiempo que toma el pasaje de las clulas a separar desde el lser hasta el tubo de captura,
es constante.
Bibliografa:
1. Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for
Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences
2. Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc . P.O. Box 502,Pullman,
WA 99163, U.S.A.
3. Immunobiology 5th ed Janeway, Charles A.; Travers, Paul ; Walport, Mark ; Schlomchik,
Mark. Garland Publishing c 2001
4. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
Las reacciones secundarias pueden observarse a simple vista y reciben diferente nombre
segn el antgeno involucrado en la reaccin sea soluble o particulado.
Si el antgeno es soluble, hablamos de una reaccin de precipitacin.
Si el antgeno es particulado, hablamos de una reaccin de aglutinacin.
1. PRECIPITACIN
Cuando un anticuerpo bivalente es puesto en contacto con un antgeno polivalente soluble
(protenas, virus) contra el cual el Ac es especfico, se forman complejos Antgeno-Anticuerpo
(Ag-Ac) que se insolubilizan y dan lugar a una reaccin de precipitacin.
79
En los agregados de complejos Ag-Ac, cada molcula de antgeno est unida a ms de una
molcula de anticuerpo y cada molcula de anticuerpo est unida a ms de una molcula de
antgeno.
Cuando los complejos Ag-Ac se producen con haptenos monovalentes o antgenos que
poseen un solo determinante antignico por molcula, la precipitacin no se produce.
Un hecho particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales, que en su mayor parte no
muestran actividad precipitante. Esto se debe a que en muchos de los casos los anticuerpos
monoclonales reconocen a un nico epitope no repetido, lo que les impide formar agregados
(micelas) aunque el antgeno sea una macromolcula (figura 1).
Cuando se utilizan sueros inmunes obtenidos a partir de animales inoculados con estas
mismas macromolculas la precipitacin s tiene lugar, pues en estos sueros hay una
mezcla de anticuerpos que reconocen distintos epitopes del mismo antgeno, lo que
posibilita la formacin de complejos mixtos Ag-Ac insolubles.
La formacin de estos complejos ha sido explicada mediante la teora del enrejado, que
considera que la composicin del precipitado formado es una consecuencia del modo en que el
anticuerpo y el antgeno se han unido.
Dada la bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antgeno, las posibilidades de
combinacin varan segn sea que en la mezcla exista exceso de antgeno, exceso de
anticuerpo o equivalencia de ambos (figura 2).
Figura 1
80
Figura 2
81
Los anticuerpos asimtricos deben ser tenidos en cuenta en la interpretacin de los resultados
de las pruebas de diagnstico. Las pruebas que se basan en reacciones de interaccin
primaria (como ELISA o IFI) miden todos los anticuerpos especficos presentes en la muestra.
Por el contrario, las pruebas que se basan en reacciones de interaccin secundaria (como
precipitacin, aglutinacin y fijacin de complemento), slo detectan anticuerpos
funcionalmente bivalentes o polivalentes (no as los anticuerpos monovalentes).
Las proporciones relativas de anticuerpos simtricos / asimtricos presentes en los sueros
hacen que cada prueba deba interpretarse de manera diferente, dado que una misma muestra
arrojar diferentes ttulos de anticuerpos en las diferentes pruebas a las que sea sometida,
segn sea el tipo de anticuerpos que identifique la prueba. Estas diferencias deben tenerse en
cuenta cuando se realizan estudios de respuesta inmune humoral, correlaciones entre nivel de
anticuerpos y evolucin de un proceso infeccioso o grado de proteccin contra el antgeno en
estudio.
Segn sea el medio en que se realice la prueba, la precipitacin puede ser en medios lquidos
o en medios con geles.
MTODO:
Se coloca en una serie de tubos 0,2 ml del suero con Ac especficos para el antgeno en
estudio.
Se aade luego por las paredes 0,2 ml de la muestra sospechosa de contener el antgeno, en
diluciones seriadas.
Se deja en bao de Mara a 37 C durante una hora y se observa si en alguno de los tubos
aparece un precipitado anular blanco que indica reaccin positiva en ese tubo, es decir
correspondencia entre Ag y Ac especficos que producen el enrejado en el tubo que contiene
las concentraciones ptimas de ambos reactantes.
82
gradiente de concentracin. En la interfase lquido-gel no se forma precipitado debido a la alta
concentracin antignica en esta zona. La precipitacin aparece en forma de bandas en la
zona donde la concentracin del antgeno que ha difundido es la ptima. Si en el suero hay
ms de un anticuerpo y en la solucin aadida hay ms de un antgeno que se correspondan,
se formarn tantas bandas de precipitacin como sistemas hayan interaccionado.
Difusin bidireccional
En este caso ambos reactivos (antgeno y anticuerpo) migran hacia un gel intermedio (sin
reactivos) por diferencias de concentracin y forman el enrejado (precipitacin visible) en la
zona en la cual se encuentran la mayor concentracin de complejos inmune asociados.
MTODO:
Mezclar partes iguales de agar al 1% (fundido y enfriado a 50 C) y el antisuero con
especificidad contra el antgeno en estudio.
Transferir 1 ml de la mezcla al tubo de reaccin, y enfriarlo rpidamente para que solidifique.
Inmediatamente despus, aadir 0,5 ml de agar al 0,5% fundido y enfriado a 50 C.
Una vez solidificado, agregar 1 ml de una mezcla en partes iguales de agar al 1% y antgeno.
Despus de la solidificacin, dejar los tubos a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas
convenientemente tapados para evitar evaporaciones (*2)
Proceder a la lectura de los resultados. Los anticuerpos y las partculas antignicas difunden
desde la zona de agar al 1% hacia la zona de agar al 0,5%. En el punto de encuentro se
forma la banda de precipitado.
83
En los orificios restantes, colocar 2 microlitros de cada una de las diluciones del antgeno
patrn, de concentracin conocida.
Mantener las placas a temperatura ambiente, en cmara hmeda, hasta que el halo de
precipitacin no vare.
Evaluar los resultados mediante la determinacin del dimetro de los halos de precipitacin.
Los resultados pueden leerse sobre el material fresco o despus de lavar las placas (Ver
mtodo ms adelante).
Difusin doble en placa, Inmunodifusin doble o tcnica de Ouchterlony
Ouchterlony describi un mtodo interesante de difusin doble en placas, el cual
consiste en enfrentar las soluciones de antgeno y anticuerpo en perforaciones efectuadas en
el gel (agar) a distancias convenientes.
De esta manera, ambos difunden a travs del agar, se ponen en contacto y producen una
banda de precipitacin cuando las respectivas concentraciones estn en relacin ptima.
- Si las concentraciones de Ag y Ac colocados en los reservorios son las que corresponden a la
zona de equivalencia, la banda de precipitacin se forma aproximadamente en la distancia
media que separa esos reservorios.
- Cuando hay exceso de antgeno, la banda de precipitacin se forma prxima al reservorio del
anticuerpo
- Cuando hay exceso de anticuerpo, la banda de precipitacin se forma prxima al reservorio
del antgeno.
Con esta tcnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los
antgenos y anticuerpos reaccionantes, cuando se trabaja con concentraciones ptimas de Ag
y Ac.
- Si la banda de precipitacin formada es recta, indica que los pesos moleculares de ambos
son muy prximos.
- Si la banda es cncava con respecto al reservorio del antgeno, seala que el peso molecular
de ste es superior al del anticuerpo.
- Si la banda es convexa con respecto al reservorio del antgeno, seala que el peso molecular
de ste es menor que el del anticuerpo
Los dos fenmenos descritos son una consecuencia de las leyes generales de la difusin, que
establecen que la distancia a la que una sustancia difunde est en relacin directa con su
concentracin y en relacin inversa con su peso molecular.
Dependiendo de la cantidad de muestras a analizar o del tipo de estudio a realizar, se emplean
distintos esquemas reactivos, como por ejemplo:
1) 2) 3) 4)
84
Figura 3
- En el caso I, los dos sistemas Ag-Ac que reaccionan son iguales y se funden en una nica
banda de precipitacin (reaccin de identidad).
- En el caso II hay dos sistemas Ag-Ac diferentes que reaccionan independientemente y
cada uno produce una banda de precipitacin que se cruzan (reaccin de no-identidad)
evidenciando la presencia de reacciones Ag.-Ac diferentes.
- En el caso III, uno de los antgenos tiene un epitope que no existe en el otro. Por lo tanto
ambas bandas de precipitacin se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo
una prolongacin o espoln en la banda correspondiente al antgeno que contiene los dos
epitopes. Este espoln indica que en este antgeno ab hay componentes antignicos no
compartidos con el antgeno b (reaccin de identidad parcial).
La difusin doble en placa es un excelente mtodo para el estudio de la homogeneidad de
antgenos y anticuerpos purificados. Resulta muy til tambin para la bsqueda de impurezas,
lo que est limitado por la concentracin en que stas se encuentren presentes, ya que la
precipitacin se hace visible cuando los reactivos exceden valores mnimos. Para obviar este
inconveniente, se emplean generalmente altas concentraciones de Ag y Ac, lo que permite
aumentar la concentracin de las impurezas y asegurar su precipitacin.
La inmunodifusin doble es utilizada ampliamente en el diagnstico serolgico de varias
enfermedades en Medicina Veterinaria, por ejemplo para el diagnstico serolgico de la
Anemia Infecciosa Equina, mtodo denominado Test de Coggins (figura 4). En esta prueba,
en una perforacin central se coloca un purificado proteico del virus de la anemia infecciosa
equina y en seis perforaciones equidistantes del antgeno y entre s, se intercalan sueros de
animales positivos (suero control positivo) y sueros de animales que se desea investigar
(sueros problema: S1, S2 y S3).
- Si el suero problema es negativo (S3) las bandas de precipitacin de los dos sueros
positivos adyacentes se introducen en la perforacin.
- Si el suero problema es positivo (S2), se forma una banda de precipitacin entre el suero
problema y el antgeno que se fusiona con las bandas de precipitacin de los dos sueros
positivos adyacentes (reaccin de identidad).
- Si la banda del suero positivo se dobla pero no forma una banda de identidad completa, el
suero problema es considerado positivo dbil (S1).
En cualquiera de estos dos ltimos casos el animal se considera infectado.
Este esquema tambin se emplea para el diagnstico serolgico de otras enfermedades como
Fiebre Aftosa en bovinos, Brucelosis en caninos (Brucella canis) u ovinos (Brucella ovis ) o la
Enfermedad de Marek en aves.
85
Figura 4
Ag: antgeno
S1
+ + +: suero control positivo
MTODO:
En una placa de Petri o un portabojetos se vierte el agar fundido y enfriado a 50C. Se deja
solidificar y se confeccionan los orificios con un sacabocados.
Para las pruebas diagnsticas de rutina en Medicina Veterinaria, se coloca el antgeno en el
orificio central y en los orificios exteriores se intercalan el suero control positivo y cada uno
de los distintos sueros problema.
Las placas o portaobjetos se mantienen en cmara hmeda. La lectura de los resultados se
efecta a las 48 - 72 horas.
Si interesa conservar los resultados, el agar puede colorearse, previa desecacin.
- En este caso, el agar debe lavarse previamente por inmersin en solucin salina durante un
total de 24 a 48 horas, efectuando el recambio de la solucin salina cada 12 horas. Este
lavado es necesario para eliminar las protenas no precipitadas.
- Luego del lavado, el agar se cubre con un trozo de papel de filtro hmedo y se deja secar a
temperatura ambiente.
- Una vez seco, se retira el papel y se lo sumerge en la solucin colorante Azul de Coomasie
durante aproximadamente 1 hora. El exceso de colorante se elimina por inmersin en
solucin decolorante y se procede luego al secado en estufa a 50 C.
2. AGLUTINACIN
Cuando un anticuerpo (bi o polivalente) es puesto en contacto con el antgeno para el
cual es especfico, si este antgeno es polivalente y se encuentra en estado particulado
(hemates, bacterias, clulas), se forman complejos Ag - Ac que dan lugar a una reaccin de
aglutinacin.
Esta reaccin puede observarse micro o macroscpicamente como agregados o grumos de
nmero y tamao variable.
Los principios que regulan la aglutinacin son los mismos que regulan la precipitacin; la
ocurrencia de uno u otro fenmeno depende de que el antgeno sea particulado (se encuentre
en suspensin) o soluble (en solucin).
La aglutinacin se lleva a cabo en medio salino. La concentracin ptima de electrolitos es de
0,15 M. Se cree que el mecanismo de aglutinacin se debe a que los iones neutralizan en parte
las cargas superficiales de las partculas antignicas, evitando el rechazo entre ellas y
asegurando la aproximacin indispensable para que una molcula de anticuerpo reaccione
con al menos dos partculas antignicas. De esta manera se inicia la formacin de los
complejos inmunes que llevan a la aglutinacin.
86
2.a. Aglutinacin cualitativa;
Los mtodos de aglutinacin cualitativa son muy utilizados en serologa diagnstica con el
objeto de identificar bacterias, tipificar grupos sanguneos, etc. En estos casos es indispensable
disponer de anticuerpos monoespecficos.
Estas reacciones se efectan en portaobjetos mezclando las suspensiones de bacterias o
hemates a identificar, con una batera de anticuerpos con diferente especificidad. La presencia
de aglutinacin indica la especificidad del sistema reaccionante.
MTODO (Identificacin de microorganismos):
Se suspende el cultivo microbiano en estudio en solucin salina, procurando que la
suspensin sea lo ms densa posible (no menos de 2 x 10 10 bacterias/ ml).
En un portaobjetos se coloca una gota de cada uno de los anticuerpos especficos (por
ejemplo, suero anti Escherichia coli K88, suero anti E. coli K99 y suero anti E. coli F41) y otra
de solucin salina (control negativo), de modo que estn a una distancia tal que se evite su
mezcla accidental.
A cada una de estas gotas, se aade un volumen igual de la suspensin bacteriana y se
mezcla para homogeneizar. El portaobjetos se agita suavemente por rotacin manual.
Se incuba durante unos minutos a temperatura ambiente y se observa. La aparicin de
grumos o agregados en alguna de las mezclas indica la identidad de la bacteria en estudio.
Estos grumos son de tamao variable. A veces son visibles a simple vista pero otras veces es
necesario el uso de lupa o microscopio para observarlos.
87
Nacional de Erradicacin de la Brucelosis Bovina se basa en la vacunacin obligatoria de las
terneras entre los 3 y 8 meses de edad y en la posterior identificacin y segregacin de los
animales infectados. La identificacin de los animales infectados se realiza a travs de la
deteccin de anticuerpos especficos contra Brucella abortus.
En el caso particular de la cepa 19 de B. Abortus, la vacunacin desencadena en el animal
una respuesta inmune primaria, con niveles de IgM que se mantienen en el tiempo y niveles
bajos de anticuerpos de tipo IgG. Las tcnicas serolgicas de aglutinacin rpida y lenta se
emplean para diferenciar los animales que presentan anticuerpos de tipo IgM a consecuencia
de la vacunacin de aquellos que presentan anticuerpos de tipo IgG inducidos por una
infeccin activa con la cepa de campo.
Los sueros problema son analizados por la prueba de B.P.A, que permite la identificacin de
los animales que presentan anticuerpos especficos contra Brucella abortus. Esta prueba es
muy sensible pero poco especfica y adems no permite discriminar si los anticuerpos que
reaccionan son de tipo IgG o IgM. Por lo tanto, las muestras que resultan positivas a B.P.A. son
analizadas luego por las pruebas de Wright y por la Prueba del 2-mercaptoetanol. En ambos
casos se enfrentan diluciones seriadas del suero problema con una suspensin estandarizada
de Brucella abortus cepa 19. Los tubos de la prueba de 2-mercaptoetanol (2-ME) son tratados
previamente con una solucin de 2-ME que destruye los puentes disulfuro de las IgM, por lo
que estos anticuerpos pierden su poder aglutinante. De esta manera, si se observa aglutinacin
an en los tubos tratados con 2-ME, significa que la aglutinacin es debida a la presencia de
anticuerpos de tipo IgG. Los animales que resultan positivos a esta prueba son considerados
como infectados y deben ser segregados del rodeo.
MTODO:
Colocar 60ul de suero a analizar en el pocillo nmero 1 de una placa de microaglutinacin
con pocillos de fondo cnico.
Colocar una gota de buffer borato a temperatura ambiente desde el pocillo nmero 2 al
nmero 8.
Diluir el suero en el buffer borato utilizando un microdilutor, descartar el excedente del
pocillo nmero 8).
Colocar una gota de antgeno de toxoplasma en todos los pocillos.
Agitar las placas enrgicamente durante 30 segundos cuidando de que no se derrame el
contenido de los pocillos.
Colocar un film plstico a fin de evitar la desecacin e incubar 24 horas a temperatura
ambiente.
88
transformar la reaccin de precipitacin en una reaccin de aglutinacin. Esto se ha logrado
con magnficos resultados mediante la fijacin de antgenos solubles a hemates o partculas
inertes como el poliestireno, el ltex y la bentonita.
A la reaccin que resulta del empleo de glbulos rojos como soporte se la llama
Hemoaglutinacin pasiva, y simplemente Aglutinacin pasiva cuando se utilizan otros
soportes.
Generalmente las uniones de los antgenos a los soportes son no covalentes y la fijacin se
obtiene por mezcla directa. En el caso de los hemates, la fijacin de hidratos de carbono no
necesita intermediarios; en cambio para la fijacin de protenas es necesario el tratamiento
previo de los glbulos rojos con aldehdos simples como el frmico o pirvico.
La aglutinacin pasiva es un mtodo semicuantitativo que, al igual que la aglutinacin, permite
determinar concentraciones relativas de anticuerpos sobre la base de la mxima dilucin
aglutinante. Es cuatro veces ms sensible que la aglutinacin y mucho ms an que la
precipitacin. Esto es consecuencia del tamao de las partculas antignicas que intervienen
en la reaccin. En la precipitacin, el antgeno es pequeo y se necesitan muchos complejos
Ag-Ac agregados para que la reaccin se visualice, en tanto que en la aglutinacin pasiva se
ha transformado al antgeno en una partcula de gran tamao, capaz de dar aglutinados
visibles con unos pocos complejos Ag-Ac. El nmero de molculas de anticuerpo que
intervienen en uno y otro caso difieren muchsimo, de ah la distinta sensibilidad (lmite de
deteccin).
La reaccin se efecta colocando en tubos distintas diluciones del suero a valorar y un volumen
determinado del antgeno fijado al soporte. Anticuerpo y antgeno se mezclan mediante
agitacin suave y se incuban durante un tiempo determinado, en general a temperatura
ambiente. Los tubos se observan sin centrifugar, por la parte inferior, para determinar si ha
habido aglutinacin.
Esta tcnica se emplea para investigar hormonas y antgenos solubles en sangre, orina y otros
fluidos.
Fenmeno de Prozona:
Cuando se valora un antisuero, la disminucin de la concentracin de los anticuerpos por el
efecto de la dilucin del suero hace que la reaccin de aglutinacin decrezca hasta hacerse
nula. No obstante ello, en algunos sueros se observa un comportamiento particular que est
caracterizado por la ausencia de aglutinacin en los primeros tubos de la serie, en los que la
concentracin de anticuerpos es mxima, y aglutinacin positiva a diluciones mayores del
suero. A este fenmeno se lo llama prozona.
Mediante el empleo de anticuerpos marcados se ha podido demostrar que en estos tubos, an
en ausencia de aglutinacin, el anticuerpo est unido al antgeno. Puesto que existe un
marcado exceso de anticuerpos respecto a los determinantes antignicos, estadsticamente es
muy poco probable que los dos fragmentos Fab del anticuerpo puedan unirse a dos epitopes
ubicados en partculas diferentes. Este fenmeno adems est relacionado con los anticuerpos
asimtricos o monovalentes mencionados anteriormente. La reaccin de Coombs permite
identificar estas reacciones incompletas. (Ver captulo de grupos sanguneos y reacciones post-
transfusionales).
Todo esto indica la necesidad de evaluar los sueros a ms de una dilucin para descartar los
falsos negativos debidos al fenmeno de prozona.
Bibliografa
1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunologa Mxico: Editorial Diana.1 edicin,
septiembre de 1986.Captulo 6.
2. Margni R. A. Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Bs. As. Editorial medica
Panamericana 5 edicin septiembre de 1996. Captulo I.
3. Inmunologa bsica. Gua de trabajos prcticos. Fac. Cs. Veterinarias. Ao 2000.
4. Guerrero R.; Gonzalez C.L.; Medina E.L.; Epidemiologa.E.A.U.: Editorial: Addison-Wesley
Iberoamericana.1 edicin, 1981. Edicin consultada, 1986. Captulo 14.
89
5. Manual de Procedimientos para el Diagnstico de la Brucelosis Bovina. Departamento de
Brucelosis. DILACOT SENASA. 2000
90
incompatible, cualquiera sea el grupo sanguneo al que pertenezcan los eritrocitos
transfundidos, no produzca una rpida destruccin masiva, sino las siguientes consecuencias:
- Estimulacin de una respuesta inmune primaria que disminuye la vida media de los
eritrocitos transfundidos, pues los mismos son destruidos progresivamente a medida que la
respuesta inmune se desarrolla.
- Vida media ms breve de los eritrocitos transfundidos si la incompatibilidad se debe a
antgenos contra los cuales el receptor posee anticuerpos naturales.
- Sensibilizacin del animal receptor a los Ags del grupo sanguneo incompatible
transfundido. De este modo, en futuras transfusiones con sangre incompatible de igual
grupo que la primera se producir una respuesta inmune secundaria. Este efecto es
importante para grupos que provocan reaccin fuertemente hemoltica (DEA1.1 y en menor
medida DEA1.2).
- Posible sensibilizacin de la madre DEA1.1 negativa a los eritrocitos DEA1.1 del feto
durante la preez (25 % de incidencia). Esta situacin es equivalente a la sensibilizacin
por transfusin. En cuanto al recin nacido, ste puede llegar a tener problemas de
hemlisis intravascular al mamar calostro que contiene los anticuerpos maternos contra su
grupo eritrocitario (ver isoeritrlisis neonatal).
91
PRUEBA DE COOMBS
La aglutinacin es la manifestacin visible de una reaccin Ag-Ac en la cual el Ag es
particulado, como por ejemplo las bacterias y los eritrocitos.
Sin embargo, en algunos casos, si bien tiene lugar la reaccin Ag-Ac no se produce la
esperada manifestacin visible, o sea, la formacin de lo que se denomina enrejado y que se
visualiza en forma de aglutinacin.
Diversas son las causas que pueden concurrir para producir este efecto:
a- Exceso de Acs: En este caso, cada molcula de Ac se unira con la totalidad de sus
valencias a una misma partcula antignica. As, sera imposible la formacin del enrejado
pues no se produciran puentes de Acs entre las molculas de Ag.
b- Presencia de Acs monovalentes: Son Acs que debido a determinadas caractersticas de
glicosilacin se comportan como monovalentes, imposibilitando la formacin del enrejado.
Los Acs contra Ags eritrocitarios pertenecen en su mayora a este grupo.
c- Defecto de Acs: La cantidad de Acs especficos contra el Ag es muy escasa, y no alcanza
para formar un enrejado del tamao suficiente como para que resulte visible.
La prueba de Coombs, tambin llamada de la antiglobulina, permite evidenciar estas
reacciones Ag particulado-Ac mediante el agregado de anti-Igs de la especie. Las anti-Igs
agregadas (tambin llamadas suero de Coombs), harn de puente entre las regiones Fc de los
Acs unidos a las partculas antignicas, formando de este modo el enrejado que se ve en forma
de aglutinacin. La prueba de Coombs puede ser directa o indirecta.
La tcnica de Coombs directa consiste en el agregado de la anti-Ig a una suspensin de
partculas de la que nos interesa saber si ya llevan unidas anticuerpos. El diagnstico de la
anemia hemoltica autoinmune, caracterizada por la presencia de auto-Acs contra los eritrocitos
propios, constituye un ejemplo de uso de esta tcnica directa y consiste en el agregado del
suero de Coombs a una suspensin de eritrocitos de un animal sospechoso de sufrir la
enfermedad.
La tcnica de Coombs indirecta, en tanto, consiste en el agregado de anti-Ig de la especie a
una reaccin previa de aglutinacin que ha resultado negativa. Por lo tanto, implica dos pasos:
una primera incubacin de la suspensin de Ag particulado con el antisuero y una segunda
incubacin luego del agregado del suero de Coombs. De este modo podemos diferenciar los
resultados falsos negativos, cualquiera sea la causa que los provoque, de los resultados
negativos reales debidos a la ausencia de Acs especficos. La prueba de Coombs indirecta
resulta de suma utilidad para evidenciar los fenmenos de prozona y para la tipificacin de
grupos sanguneos. La reaccin de Coombs se esquematiza en la figura 1.
Figura 1
92
ISOERITRLISIS NEONATAL
Esta enfermedad, tambin denominada ictericia hemoltica del recin nacido, se produce
cuando la madre transmite Acs contra los Ags eritrocitarios del cachorro a travs del calostro,
provocando en el cachorro una reaccin de hemlisis intravascular aguda. Puede producirse
cuando una madre DEA1.1 negativa, previamente sensibilizada al Ag eritrocitario DEA1.1, tiene
un cachorro DEA1.1 positivo. El resto de los Ags de grupos sanguneos carecen de relevancia
en lo que respecta a esta enfermedad, debido a que son Ags dbiles y no provocan reacciones
de hemlisis intravascular.
La sensibilizacin de la madre puede suceder por dos circunstancias:
a- Que alguna vez haya recibido una transfusin de sangre DEA1.1.
b- Que en una anterior preez de un cachorro DEA1.1 positivo, los eritrocitos del feto hayan
pasado a la circulacin sangunea materna.
Este hecho, que cuando sucede tiene lugar en fecha cercana al parto, estimula la produccin
de una respuesta inmune especfica de tipo primaria en la madre. Esta respuesta da lugar a
una muy baja o nula cantidad de Acs anti-DEA1.1 al momento de la produccin de calostro, por
lo que no hay riesgo de isoeritrlisis neonatal en esta primera preez. No obstante, la madre
queda sensibilizada para futuras gestaciones.
En una posterior gestacin de un cachorro DEA1.1 y en el caso de que los eritrocitos del feto
pasen a la circulacin materna, la hembra ya sensibilizada (cualquiera sea la causa de la
sensibilizacin) responder a este estmulo antignico con una respuesta de tipo secundaria.
Esta respuesta dar lugar a una rpida sntesis de una elevada tasa de Acs que sern
transmitidos al recin nacido mediante el calostro. Los Acs anti-DEA1.1 al unirse a los
eritrocitos del neonato, provocarn la activacin de la va clsica del complemento con la
consecuente hemlisis intravascular aguda.
La isoeritrlisis neonatal puede prevenirse si se evita que el recin nacido mame calostro, pero
dado que el calostro es un alimento fundamental, no conviene privar de l al cachorro a menos
que exista la seguridad de la presencia de Acs anti-eritrocitos.
La realizacin de una prueba cruzada entre el suero o plasma de la madre y los eritrocitos del
recin nacido, es la herramienta con que se cuenta para tomar la decisin: Un resultado
positivo hace contraindicado el mamado de calostro. Es posible realizar esta prueba antes del
parto utilizando los eritrocitos del padre; de este modo obtenemos el dato con anticipacin para
poder preparar el manejo adecuado del recin nacido en caso de que la prueba arroje
resultado positivo (administracin de calostro artificial, bsqueda de nodriza, etc)
APENDICE
93
Sistemas Alelos o factores Grupos sanguneos (1)
A A1 - A` - H - A - H - a A1 - A` - H - A1A` - A1H - A`H - A1A`H - (-)
D D-Jd D - J - DJ - (-)
P P1 - P` - p P1 - P` - P1P` - (-)
Q Q - R - S - QR - RS - q Q - R - S - QR - QS - RS - QRS - (-)
C Cc C - (-)
K Kk K - (-)
T Tt T - (-)
U Uu U - (-)
Bibliografa:
1. Halle A. Canine blood groups and their importance in veterinary transfusion and medicine.
Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. Vol. 25, Number 6, Nov. 1995,
1323-1332.
2. Giger U et al. An acute hemolytic transfusion reaction caused by dog erythrocyte antigen 1.1
incompatibility in a previously sensitized dog. JAVMA, Vol. 206, May 1, 1995, 1358-1362.
3. Margni R. A. Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Bs. As. Editorial Mdica
Panamericana. 5 edicin, septiembre de 1996.
4. Tizard, I. Inmunologa Veterinaria. Ed. Interamericana. M.C.Graw Hill. 4 Edicin, 1995.
94
B) Cultivo en microplacas de 96 hoyos
Las clulas se resuspenden en medio de cultivo y se siembran en microplacas de cultivo de 96
hoyos. En estas placas vamos a tener:
Hoyos controles, que contienen la suspensin celular sin estimular.
Hoyos estimulados, que contienen la suspensin celular a la que se le agrega el estmulo
proliferativo, ya sea mitgeno inespecfico o antgeno.
Ambos tipos de cultivo se realizan al menos por triplicado. Las placas se incuban a 37C en
estufa con ambiente hmedo y 5% de CO2.
C) Marcacin con timidina tritiada
Luego de varios das de cultivo, se agrega timidina tritiada a cada cultivo. Las molculas de
timidina marcadas con tritio (3H) se incorporan al ADN de las clulas en proliferacin, que ahora
tendrn ADN tritiado en sus ncleos. Transcurridas 12 a 16 horas de cultivo con el medio que
contiene timidina tritiada, las clulas de cada hoyo se aspiran con un cosechador quedando
retenidas sobre filtros especiales.
D) Revelado de la proliferacin
El tritio que marca las molculas de timidina emite radiacin beta que puede ser leda en un
contador de centelleo lquido y cuantificada como cuentas por minuto (cpm) o desintegraciones
por minuto (dpm). A mayor proliferacin en cada hoyo, mayor ser la radiactividad retenida en
cada filtro, o sea mayor el nmero de cpm ledo.
Se realiza el promedio de los triplicados correspondientes a cada muestra. Los resultados se
expresan como ndice de estimulacin (I.E.), de acuerdo a la siguiente frmula:
95
Figura 1
Sangre perifrica
Gradiente de Ficoll-Hypaque
Plasma
Halo mononucleares
Ficoll Hypaque
Polimorfonucleares
Eritrocitos
Cultivo
Estimulados
Controles (SCM + medio de cultivo + estmulo:
(SCM + medio de cultivo) mitgeno o Ag)
Incubacin
Cosecha
c.p.m.
96
Se ha desarrollado una variante de la metodologa descripta, que utiliza directamente la sangre
entera heparinizada diluida en medio de cultivo como fuente de linfocitos. En caninos, se ha
demostrado que esta metodologa es comparable y an ms reactiva que la tcnica clsica
descripta. Se postula que tiene la ventaja de reproducir mejor las condiciones in vivo y evitar la
prdida de clulas (supoblaciones de L con diferentes funciones) que conlleva el proceso de
purificacin en gradiente utilizado en la metodologa convencional.
Aplicaciones
La tcnica de linfoproliferacin puede aplicarse para evaluar:
La capacidad funcional de los linfocitos. Los linfocitos normales deben presentar una
respuesta proliferativa a la estimulacin con mitgenos inespecficos.
La respuesta linfocitaria frente a un antgeno determinado, que nos permite identificar la
sensibilizacin previa del individuo frente al antgeno.
El efecto que tienen sobre la capacidad funcional de los linfocitos, aquellas enfermedades
que provocan inmunodeficiencia (ej. moquillo canino, parvovirosis canina, leishmaniasis
canina, etc.).
El efecto de los inmunoestimulantes sobre la inmunidad celular
El efecto de diferentes tipos de vacunas o esquemas de vacunacin sobre la inmunidad
celular. Para ello, se vacuna a los animales in vivo y se mide la respuesta proliferativa al Ag
in vitro.
La accin inmunosupresora de ciertos frmacos como medicamentos inmunosupresores
(utilizados para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o linfoproliferativas) o de
medicamentos cuyos efectos colaterales inmunosupresores requiere un seguimiento del
paciente.
El efecto que tienen las interleuquinas que se secretan frente a diferente tipo de situaciones
(stress, quemaduras, traumatismos, etc.) sobre los linfocitos.
Por ejemplo, la inmunodeficiencia severa combinada de los caninos (XSCID) es un desorden
gentico caracterizado por la falta de funcionalidad de linfocitos B y T. En el trabajo que se cita
infrascripto, esta anomala se evidencia in vitro mediante la prueba de proliferacin linfocitaria
en cultivos estimulados con fitohemaglutinina (PHA).
Los resultados no estn expresados en ndice de estimulacin, sino directamente en cpm.
Como puede observarse en el grfico que se reproduce, la respuesta proliferativa de los
linfocitos en los caninos con inmunodeficiencia severa combinada es significativamente menor
a la de los linfocitos provenientes de caninos normales.
cpm 30.000
20.000
10.000
Normal XSCID
97
Bibliografa
1. Ramayo. L G, Soba M G, Mundo S L. Evaluacin de la inmunidad celular en caninos:
prueba de proliferacin de linfocitos in vitro. InVet, 2005, 7 (1): 63-70.
2. Letwin, Bruce and Quimby, Fred. Effects of concanavalina-A, phytohemagglutinin,
pokeweed mitogen, and lipopolysaccharide on the replication and immunoglobulin synthesis
by canine peripheral blood lymphocytes in vitro. Immunology Letters, 14 (1986/1987), 79-85.
3. Krakowa, Steven, Ringer, Susan. Activation specificity of commonly employed mitogens for
canine B- and T- lymphocytes. Veterinary Immunology and Immunopathology, 11 (1986),
281-289.
4. Krakowa, Steven et al. Immunosuppression by canine distemper virus: modulation of in vitro
immunoglobulin synthesis, interleukin release and prostaglandin E2 production. Veterinary
Immunology and Immunopathology, 15 (1987), 181-201.
5. Millen, G.L. et al. Vaccination of racing greyhounds: effects on humoral and cellular
immunity. Veterinary Immunology and Immunopathology, 49 (1995), 101-113.
6. Cook G. et al. Transforming growth factor beta from multiple myeloma cells inhibits
proliferation and IL-2 responsiveness in T lymphocytes. J. Leukoc. Biol. 1999 Dec; 66 (6):
981-988.
7. Choudhry MA, Hockberger PE, Sayeed MM. PGE2 suppresses mitogen-induced Ca2+
mobilization in T cells. Am. J. Physiol. 1999 Dec.; 277 (6 Pt 2): R1741-8.
8. Freitag KA et al. Acute starvation and subsequent reffeding affect lymphocyte subsets and
proliferation in cats. J. Nutr. 2000 Oct.;130 (10): 2444-9.
Tcnica de Seroneutralizacin
98
Factores que influyen en la reaccin
Los resultados de las pruebas de seroneutralizacin varan segn:
- la especie y edad del individuo del cual provienen los anticuerpos
- el sistema de deteccin,
- la va de inoculacin (si se utilizan animales susceptibles),
- la estabilidad del virus a cambios de temperatura,
- el pH y otros diversos factores fsicos y qumicos.
Por esta razn conviene contar con sueros testigos positivos (con anticuerpos
neutralizantes) y negativos, pues un aumento aparente del ttulo neutralizante por elevacin de
temperatura de incubacin o por un tiempo de incubacin ms prolongado, puede deberse a la
prdida de infectividad del virus y no a la capacidad neutralizante del suero.
Aplicaciones
Esta tcnica serolgica puede ser utilizada para detectar y tipificar virus en animales
infectados o para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes en animales que han
superado la infeccin o han sido vacunados.
La seroneutralizacin permite tambin identificar individuos que carecen de anticuerpos
neutralizantes en su suero; estos individuos se deben seleccionar con preferencia en casos de
vacunaciones, ya que representan una poblacin de riesgo. Recordemos que uno de los
objetivos de la vacunacin es estimular la produccin de anticuerpos protectores, que son los
que se evalan por esta metodologa y corresponden a anticuerpos capaces de evitar la
infeccin.
Con esta prueba se pueden seleccionar los animales vrgenes para las pruebas de potencia
de vacunas y tambin evaluar la eficacia de una vacuna en desarrollo. Sin embargo, la prueba
de seroneutralizacin no revela el estado inmunitario del animal en su conjunto, ya que evala
nicamente inmunidad humoral. Esto significa que como muchas otras pruebas, no tiene en
cuenta la actividad inmunitaria de base celular.
99
b) Seroneutralizacin como mtodo de identificacin de anticuerpos neutralizantes:
En ciertos casos es til determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes homlogos en
el suero de un animal, ya que stos indican una infeccin o vacunacin anterior. Cuanto mayor
sea el ttulo obtenido indicar que cualquiera de estos eventos es ms reciente.
En seroneutralizacin existen dos tcnicas:
1- Suero variablevirus fijo (SV - VF)
2- Suero fijovirus variable (SF - VV)
Para ambas tcnicas se debe contar con sueros de referencia negativos y positivos.
Los sueros positivos se obtienen de animales que han estado en contacto anteriormente con el
antgeno (virus) y los negativos de animales que no han tenido contacto alguno con el mismo.
Los sueros se inactivan durante 30 minutos a 56C para destruir los factores termosensibles del
complemento y se titulan varias veces en cualquiera de los sistemas sensibles (clulas,
embriones de pollo, ratones, etc.) Por ltimo se calcula la media de los ttulos obtenidos en las
diferentes repeticiones. Estos sueros se conservan fraccionados a -70C.
Los sueros problema se procesan de la misma manera, es decir, se inactivan 30 minutos a
56 C antes de proceder a su estudio y se prueban en las diluciones de uso sobre el sistema
seleccionado para evaluar la seroneutralizacin, para determinar si presentan efecto de
toxicidad. En general, en bajas diluciones, la mayora de los sueros poseen efecto txico.
En estos casos se debe aumentar las diluciones y considerarse en el clculo del ndice de
Seroneutralizacin (ver anexo).
Ttulo del virus - Ttulo del virus incubado con suero problema, o
Ttulo del virus incubado con suero normal negativo - Ttulo del virus incubado con suero
problema
Por ejemplo,
Ttulo de virus= 106.33
Ttulo del virus incubado con suero problema= 103.40
IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93
10 2.93expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema.
Bibliografa
1. Gua de trabajos prcticos. Inmunologa. Ao 1980
2. Harris, RJC. Techniques in Experimental Virology. New York/London: Academic Press.
1964.
100
3. Robson, DS; Gillespie, JH; y Baker, J.A. The neutralization test as an indicator of immunity
to virus diarrhea. Cornell Vet. 50: 503-509.
4. Sorenson, DK; Chow, TL; Kowalczyk, T.; Hanson, RP.; y Brandly, CA. Persistence in cattle
of serum-neutralizing antibodies of vesicular stomatitis virus. Am. J. Vet. Res. 19: 74-77.
1958.
Anexo
Seroneutralizacin a Suero fijo-virus variable (SFVV):
En esta tcnica el suero problema se diluye entre 1/2,5 y generalmente no ms de 1/10,
dependiendo del virus con que se trabaje. Esta dilucin se siembra en cuatro tubos a razn de
aproximadamente 1ml por tubo.
Simultneamente se procede a la dilucin del virus en base 10.
Las diluciones de virus a utilizar en la seroneutralizacin dependen de que los animales a
evaluar sean libres o vacunados. Los rangos utilizados son arbitrarios, pero para su seleccin
debemos tener en cuenta el origen de los animales a evaluar:
- En el caso de ser animales libres de infeccin, se emplea un nmero bajo de dosis
infectivas ya que al tener el suero niveles mnimos o nulos de anticuerpos, se necesita
poco virus para superar el efecto neutralizante de los anticuerpos y llegar a determinar el
efecto citoptico viral necesario para calcular el ttulo.
- En cambio, si se trabaja con suero de animales vacunados, se utiliza un nmero ms alto
de dosis infectivas ya que los niveles de anticuerpos esperados son mayores.
Una vez obtenidas las diluciones del suero y el virus, se mezclan en partes iguales y se
incuban 1 hora a 37C.
Luego de la incubacin se siembran o se inoculan en el sistema elegido (clulas, ratones o
embriones de pollo). No hay que olvidarse de colocar los controles con sueros de referencia
positivos y negativos.
Estas reacciones se incuban por un perodo variable que depende del sistema y del tipo de
virus, pero que en general es de 3 a 10 das.
Las lecturas se realizan diariamente buscando el efecto de la infeccin viral segn el
sistema utilizado.
- En el caso de los cultivos celulares, las lecturas se efectan por observacin
microscpica del efecto citoptico que se pone de manifiesto como muerte celular,
modificacin de la morfologa celular, etc.
- En el caso de los huevos embrionados pueden ser la aparicin de pstulas, muerte del
embrin, etc.
- En el caso de los animales de laboratorio se tendr en cuenta si sobreviven o no.
El clculo de los ttulos se realiza utilizando el mtodo de Reed y Muench, referido a las
dosis infectivas en cultivo de tejido al punto final 50% (TCID50, por las siglas en ingls Tissue
Culture Infectious Dosis 50%). Este trmino tambin se lo puede encontrar descrito como dosis
de efecto citoptico 50% (DEC50).
En la titulacin, el punto final se toma como la dilucin en la cual cierto porcentaje de
cultivos o animales muestran lesiones. Se ha demostrado estadsticamente que el valor ms
apropiado es aqul en el que la mitad de stos muestran efecto producido por la infeccin viral
y la otra mitad no. Esta regin es la que ofrece mnimo error en lo que atae a la variacin
individual en la sensibilidad al virus. La obtencin de resultados estadsticos requiere inocular el
mayor nmero posible de rplicas y hacer diluciones poco espaciadas.
Reed y Muench idearon un mtodo simple, denominado mtodo de los totales
acumulativos. ste se basa en considerar que los animales o cultivos celulares que recibieron
menor dosis de virus infectante y presentaron lesiones, hubieran mostrado las mismas lesiones
con virus ms concentrado.
El objetivo de este mtodo es conocer la dilucin del virus que corresponde al 50% de
infeccin. Se utiliza un sistema de sumas para obtener los totales acumulados y obtener el
clculo del punto final. Los valores acumulados se obtienen sumando en el sentido de las
flechas, como se esquematiza en el siguiente cuadro.
101
Muestras o Relacin
No
animales Infectados o Valores Valores acumulados
Dilucin infectados o %
infectados / muertos acumulados acumulados positivos /
de virus vivos (1)
No (positivos) positivos negativos Total de
(negativos)
infectados acumulados
10-1 4/4 4 0 19 0 19 / 19 100
10-2 4/4 4 0 15 0 15 / 15 100
10-3 4/4 4 0 11 0 11 / 11 100
10-4 4/4 4 0 7 0 7/7 100
10-5 3/4 3 1 3 1 3/4 75
10-6 0/4 0 4 0 5 0/5 0
10-7 0/4 0 4 0 9 0/9 0
DP =. % de positivos superior a 50 50 .
% de positivos superior a 50 - % de positivos inferior a 50
En este ejemplo,
DP = 75 - 50 = 0.33
75 - 0
Luego, (DP x log. del factor de dilucin) se suma en valor absoluto al exponente de la
dilucin superior a 50.
En este ejemplo,
El factor de dilucin es 10 y el logaritmo de 10 es 1.
La dilucin que da un porcentaje de positivos superior a 50 es 10 -5
Por lo tanto, (0.33 x 1) + 5, determina que el valor es 10 5.33
En este ejemplo,
El volumen de virus inoculado fue de 0.1 ml.
El ttulo, por lo tanto, ser: 10 5.33 x 10 = 10 6.33 TCID50/ml.
Ttulo del virus - Ttulo del virus incubado con suero problema, o
Ttulo del virus incubado con suero normal negativo - Ttulo del virus incubado con suero
problema
Por ejemplo,
Ttulo de virus= 106.33
Ttulo del virus incubado con suero problema= 103.40
IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93
10 2.93expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema.
102
Seroneutralizacin a Suero variable virus fijo (SV-VF):
En esta tcnica se preparan diluciones (generalmente 1:2) de los sueros problemas y
testigos en un buffer, con el siguiente criterio:
Si los animales son vacunados se usar generalmente una dilucin entre 1/4 y 1/32 o ms,
dependiendo del tipo de vacuna.
Si los animales se trata de animales vrgenes se usarn diluciones de 1/2 a 1/8.
Para realizar esta tcnica es necesario tener el virus que se va a utilizar previamente
titulado, fraccionado y congelado a bajas temperaturas (en nitrgeno lquido a -196C, o en
freezers ultrafros a -80C).
Simultneamente se realiza la dilucin del virus de manera de obtener un inculo con las
dosis infectantes deseadas con el que se enfrentarn los sueros. En esta tcnica debe incluirse
siempre la titulacin del virus en la misma prueba, a fin de comprobar que las dosis infectantes
inoculadas fueron las correctas. Generalmente para esta prueba se utilizan 1000 dosis
infectantes/ml.
Para preparar el inculo, por lo tanto, se debe conocer el ttulo previo del virus, por ejemplo 10
7.5
TCID50/ ml. Para obtener 103 TCID50/ml hay que diluir el virus. Para calcular qu dilucin del
virus stock hay que efectuar para tener esa dosis, se realiza el siguiente clculo:
1 TCID50/ ml se obtendra en una dilucin 10-7.5
1000 TCID50/ ml se obtiene en una dilucin 1000 veces ms concentrada y ya que 1000
corresponde a 103, en este caso es 10-4.5
Es decir, que en este caso en una dilucin 104.5 de este virus habr 1000 TCID50/ ml.
La dilucin 104.5 se puede realizar de diversas formas, por ejemplo con diluciones seriadas en
base 10 mediante la cual se llega a la dilucin 10-4.
La fraccin de dilucin que falta realizar es la representada por 10 0.5. El antilogaritmo de 0,5
es 3,16. Es decir que una dilucin 1/3,16 equivale a 10 0.5.
En total, si la dilucin 1/3,16 se realiza a partir del tubo 104, se obtiene una dilucin
1/31600) que equivale a 104.5 y que contiene 1000 TCID50/ ml.
A partir de esta dilucin, se realizan tres diluciones ms en base 10 para titular el inculo
viral en simultaneidad con la prueba (control de ttulo viral).
El inculo con las 1000 TCID50 se mezcla en partes iguales con los sueros problema y con
los sueros de referencia. Dichas mezclas se incuban 1 hora a 37C y luego se siembran (sobre
cultivos celulares) o se inoculan (en ratones o embriones de pollo).
A partir de este punto las consideraciones son iguales que para la tcnica SFVV.
DP = % de no infectados superior a 50 - 50 .
% de no infectados superior a 50 - % de no infectados inferior a 50
DP = 80 - 50 = 0.5
80 - 20
103
DP x log. del factor de dilucin se suma al log. de la dilucin que presenta un porcentaje de
no infectados superior al 50%, con el fin de obtener el ndice de Seroneutralizacin.
La dilucin con un porcentaje de no infectados superior al 50% es 1/16 (log 16 es 1,2)
El factor de dilucin es 2 (log.2 es 0.3), por lo tanto
IS = 0.5 x 0.3 + 1,2 = 1,35.
El antilogaritmo de 1,35 es 22,4.
Podemos decir, entonces, que 1/22,4 es la dilucin del suero que protege al 50% de los
animales. En este caso se calcula el porcentaje de animales vivos o no infectados ya que se
desea conocer el poder de proteccin del suero.
La prueba ser considerada como vlida si el ttulo de virus obtenido es el mismo que el
ttulo previo con un margen de error de 0,3 log (una dilucin) por encima o por debajo del
mismo.
Inhibicin de la Hemoaglutinacin
Introduccin: Hemoaglutinacin
La capacidad de aglutinar glbulos rojos de ciertas especies animales (Hemoaglutinacin o HA)
fue descripta para los virus de las familias Paramixoviridae, Ortomixoviridae y Parvoviridae. Las
protenas virales responsables de esta propiedad se conocen como hemaglutininas. Estas
son protenas de superficie de los viriones que se unen con receptores de la membrana de los
hemates que poseen cido acetil neuramnico en su composicin.
Esta interaccin entre los viriones y los hemates resulta en la produccin de un cuerpo
compacto. La HA se produce cuando la proporcin entre la hemaglutinina viral y los eritrocitos
es ptima, permitiendo la unin de varios eritrocitos adyacentes a una unidad de hemaglutinina.
Esta caracterstica viral nos permite identificar y clasificar virus hemaglutinantes, aislados a
partir de individuos infectados y propagados en huevos embrionarios o cultivos celulares.
Adems, se puede titular virus por su efecto hemaglutinante, as como evaluar la capacidad de
un suero de inhibir esta hemaglutinacin.
La tcnica, que evala la capacidad de un suero de bloquear el efecto hemaglutinante del virus
se conoce como Inhibicin de la Hemoaglutinacin (IH).
Ambas pruebas (HA - IH) se realizan en microplacas de 96 hoyos con fondo en U o V.
La HA se lleva a cabo utilizando diluciones del virus en base 2 a partir de la dilucin 1:2; los
glbulos rojos (GR) capaces de ser aglutinados se colocan a una concentracin final de 0.5% o
1%. Como diluyente de los Ag y GR se utiliza solucin salina buffereada (PBS) con 0.1% de
seroalbmina bovina (BSA).
104
1/2048
Virus
A
B
C
D
E
F
G
H
Interpretacin de la Titulacin:
El punto final de la titulacin ser la dilucin ms alta del virus en la que se observe 100% de
HA. Se considera que en esta dilucin existe una (1) unidad hemoaglutinante (UHA).
105
d) Agregar 25 l de antgeno (virus) que contenga 4 a 8 unidades hemoaglutinantes, en los
hoyos 1 a 11 de la primera hilera correspondiente a cada suero. Agregar 25 l de PBS en
los hoyos 1 a 11 de la segunda hilera correspondiente a cada suero (para completar el
volumen a 50 l).
e) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubar a temperatura ambiente durante
60 minutos.
f) Aadir 50 l de suspensin de hemates al 1% o al 0,5% a todos los hoyos utilizados. La
segunda hilera de cada suero no contiene virus, slo suero y glbulos rojos y nos permite
realizar un control sobre la capacidad hemaglutinante del suero per se. Por su parte, el
hoyo 12 de cada hilera contiene glbulos rojos y el diluyente del virus (PBS), como control
para descartar una posible hemoaglutinacin inespecfica.
g) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubarla a 4C durante 16 hs.
h) Leer las placas cuando se hayan sedimentado los hemates de control (columna 12). La
lectura se efectuar inclinando las placas y observando la presencia o ausencia de un
botn bien definido similar al de los hoyos de control.
i) El ttulo de Inhibicin de la Hemoaglutinacin ser la mayor dilucin del suero que produzca
una inhibicin completa de 4 u 8 unidades hemaglutinantes de virus.
j) En todas las pruebas deber incluirse una titulacin simultnea del virus para confirmar la
presencia de las unidades de hemoaglutinacin requeridas
Las caractersticas del sistema de complemento han permitido idear una reaccin
serolgica denominada Fijacin de Complemento, la que mediante un sistema indicador
permite determinar la fijacin del C a cualquier complejo antgeno-anticuerpo, est el antgeno
en solucin o en suspensin. Como sistema revelador se emplea el denominado sistema
hemoltico, que consiste en una suspensin de complejos antgeno-anticuerpo formados por
glbulos rojos de carnero y anticuerpos con especificidad por estos hemates (hemolisina).
Esta tcnica es muy empleada para la identificacin cuantitativa de anticuerpos contra un
antgeno en particular y es la tcnica de referencia para muchas enfermedades infecciosas.
Por ejemplo, en el diagnstico de brucelosis mediante este mtodo, el suero en estudio se
incuba con una suspensin estandarizada de Brucella abortus y una cantidad conocida y
estandarizada de complemento (medida en unidades CH50). En un paso posterior se agrega el
sistema hemoltico. (Figura 1)
106
Figura 1 Componentes de la reaccin
Ag
Suspensin de antgeno
Suero problema
C GR
Complemento
Sistema hemoltico
F ig u r a 2 A F ig u r a 2 B
C
GR
C
Ag Ag
Si la muestra en estudio contiene anticuerpos especficos contra Brucella abortus, stos se fijan
a la bacteria (figura 3 A) y activan el complemento por la va clsica, que produce su lisis.
Cuando en un paso posterior se agrega el sistema hemoltico, ya no hay complemento
disponible y los glbulos rojos permanecen intactos (figura 3 B).
107
Figura 3 A Figura 3 B
GR
C
Ag
Ag
108
Bibliografa
Margni, R.A. 1996. Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976
pp.
Day, MJ. 1999. Clinical Immunology of the Dog and the Cat. Iowa State University Press.
Esta tcnica detecta la unin de pequeas molculas marcadas con fluorescena (por Ej.
antgenos) a grandes molculas (anticuerpos) cuando la muestra es incidida con un haz de luz
polarizada.
Fundamento:
Todas las molculas en solucin rotan al azar. La velocidad de rotacin depende del tamao y
es inversamente proporcional, por lo tanto las molculas pequeas rotan a mayor velocidad
que las molculas grandes.
Para realizar este ensayo se requiere de la emisin de una luz (onda electromagntica) (a partir
de una lmpara de tungsteno) cuyo campo elctrico oscila en todas las direcciones espaciales
al azar y con distintas longitudes de onda. Dicha radiacin atraviesa un polarizador de cristal
lquido que deja pasar solo un rayo de luz polarizada plana azul (481-489 nm). Al incidir la luz
polarizada plana sobre el trazador (fluorocromo ligado al antgeno), lo eleva a un estado de
excitacin, tras el cual dicho trazador vuelve al estado de equilibrio emitiendo un haz de luz
verde (525-550 nm) que es captado y analizado por el equipo.
En el caso de que el antgeno marcado estuviese unido a una molcula de anticuerpo de gran
tamao, su velocidad de rotacin disminuye y permite que la emisin de luz verde se detecte
en el mismo plano de polarizacin que la radiacin recibida, mantenindose la polarizacin.
Por lo tanto, se detecta un valor alto de polarizacin. Por lo contrario, si dicho trazador est
unido solo al antgeno (de pequeo tamao) la rotacin es rpida y la luz verde emitida se
ubicar en otro plano distinto al de la luz polarizada. De esta manera, se pierde el grado o
valor de polarizacin.
109
Emisin del haz de luz
Luz Luz azul en un nico plano
tungsteno polarizada
Polarizador
Suero positivo
Direccin del haz de luz azul Direccin del haz de luz verde
polarizada incidente emitida
Suero negativo
Direccin del haz de luz azul Direccin del haz de luz verde
polarizada incidente emitida
Anticuerpo
Durante el tiempo que la molcula conjugada con fluorescena permanece excitada, rota a una
determinada velocidad, produciendo una diferencia entre plano de polarizacin que la
excita (plano de excitacin) y el plano de polarizacin que emite (plano de emisin), sta
diferencia se cuantifica y se determina utilizando una frmula.
Expresin de los resultados: unidades de milipolarizacin (mP) del suero frente al antgeno.
Clculo de las unidades de mp de cada muestra.
mP = ( Iv (Ih x G) / (Ih x G) x 1000
El polisacrido O-: Extrado a partir del LPS de cepas lisas de bacterias gram negativas. Estos
antgenos son especficos para cada serotipo y se obtiene a partir de la purificacin del LPS.
Ej.: Brucella sp. Salmonella sp.
110
Estructura de LPS
Pptidos: Slo puede utilizarse pptidos de bajo peso molecular (que no superen los 20 kDa),
para que no interfiera su tamao en una menor rotacin del antgeno-trazador libre.
Equipamiento
Metodologa
Protocolo FPA
1) Agregar 10l de la muestra (generalmente suero del animal a evaluar) a 1 ml de buffer.
2) Leer el blanco
3) Agregar 10 l de antgeno marcado
4) Incubar no menos de 2 minutos
5) Realizar la lectura de las muestras ya sea en tubos o en multiplacas.
6) Como dato orientativo, las muestras con lecturas de 10 mP mayores al control negativo son
consideradas positivas
111
Esquema de la tcnica. Utiliza como ejemplo el Ag O de Brucella sp.
Ventajas:
Es fcil de realizar y los resultados se obtienen rpidamente.
Implica solamente 2 pasos.
Es una tcnica de alta sensibilidad y especificidad.
Permite el procesamiento de varias muestras a la vez.
Suspensiones turbias tales como leche, sueros lipmicos y yemas de huevo o soluciones
coloreadas como sueros hemolizados o sangre entera, no interfieren en la lectura de las
muestras
Citotoxicidad
Introduccin
La citotoxicidad es un mecanismo efector de las clulas del sistema inmune que permite
eliminar clulas infectadas o alteradas del organismo o clulas de microorganismos u
organismos invasores. Varios tipos celulares, receptores y mecanismos estn involucrados en
este mecanismo. Su evaluacin permite conocer el nivel de proteccin frente a enfermedades
infecciosas de origen viral, capacidad de eliminar clulas alteradas por procesos tumorales, etc.
Hay dos condiciones indispensables para que cualquier mecanismo citotxico mediado por
clulas se lleve a cabo:
1- viabilidad de las clulas efectoras
2- contacto estrecho entre la clula efectora y la clula blanco.
La lisis de la clula blanco (o clula diana) es la consecuencia de la reaccin citotxica.
Cuando se encara el anlisis de un fenmeno de este tipo es necesario contar, en primer lugar,
con un mtodo apropiado para evaluar la muerte de la clula blanco.
112
Por ejemplo, si se trata de una bacteria o un parsito, es posible observar microscpicamente
su destruccin o la inhibicin de su capacidad para proliferar en medios de cultivo adecuados,
luego de su contacto con la clula efectora. En cambio, si la clula blanco es una clula tumoral
o normal, pueden utilizarse colorantes vitales como naranja de acridina o azul tripn (trypan
blue) para poner en evidencia la lisis, ya que estos colorantes tienen la particularidad de teir
nicamente a las clulas muertas.
Asimismo, es posible recurrir a alguna caracterstica metablica particular que pueda asociarse
con la viabilidad de la clula blanco utilizada en la reaccin. Por ejemplo, si se trata de una
clula secretora, medir su capacidad para liberar un determinado producto de secrecin.
El mtodo ms difundido para el estudio de los mecanismos citotxicos es el de la
incorporacin de sustancias radiactivas a las clulas blanco. La destruccin de estas clulas
permite que la sustancia radiactiva se libere al medio y pueda ser cuantificada fcilmente.
Las sustancias radiactivas deben cumplir ciertos requisitos para ser utilizadas:
Deben incorporarse a las clulas blanco en cantidades compatibles con los sistemas de
microrreacciones.
No deben liberarse al medio espontneamente.
Su liberacin al medio debe tener correlacin directa con el efecto ltico producido
Una vez liberadas al sobrenadante, no deben ser reutilizables en forma significativa por las
clulas restantes.
Mecanismos de Citotoxicidad
Los mecanismos de citotoxicidad pueden clasificarse de acuerdo a los requerimientos del
sistema, en:
Mecanismos de citotoxicidad especficos: Si es necesaria la sensibilizacin previa del animal
del cual provienen las clulas blanco (por ejemplo, citotoxicidad por LT o ADCC).
Mecanismos de citotoxicidad innatos: Si funcionan sin necesidad de sensibilizacin previa
(por ejemplo. citotoxicidad por clulas NK o por complemento).
113
linfocitos con FcR para IgA (FcR) y los polimorfonucleares neutrfilos, son capaces de mediar
CCDA contra clulas blanco sensibilizadas con IgA. Adems, los monocitos y los
polimorfonucleares eosinfilos que expresan FcR para IgE (FcR) inducen la destruccin de
clulas recubiertas con IgE. Este ltimo sistema tiene relevancia en la inmunidad contra
parsitos.
114
- Incubar 60 min a 37C con agitacin suave.
- Lavar con medio de cultivo y resuspender las clulas marcadas a la concentracin
deseada.
2. Medicin de la actividad citotxica por medio de un ensayo de liberacin de 51Cr: La relacin
entre clulas blanco y clulas efectoras es un factor importante a tener en cuenta.
Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de clulas blanco y
clulas efectoras (por ej. 1:50).
- Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos, clulas efectoras y clulas blanco (no
olvidar los controles).
- Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las clulas e incubar a 37C por 4
hs en estufa gaseada con CO2 al 5%.
- Recoger el sobrenadante para la posterior medicin de radiactividad en contador de
centelleo.
Medicin de liberacin espontnea (cpm espontneas):
En los cultivos de clulas blanco (sin clulas efectoras), se mide la liberacin espontnea del
51
Cr fijado durante la marcacin.
Medicin de la mxima liberacin de marca (cpm mximas):
A los co-cultivos de clulas efectoras + clulas blanco se agrega un detergente (Tritn X-100)
que solubiliza las membranas plasmticas de las clulas produciendo la liberacin total del 51Cr
fijado durante la marcacin.
Las cpm espontneas no deben superar el 20% de las cpm mximas para que la prueba sea
vlida.
En algunas ocasiones es conveniente expresar los resultados como unidades lticas (UL),
correspondientes a un determinado porcentaje de lisis. Frecuentemente se utiliza el 30% o el
50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis en funcin de la relacin clulas efectoras:
clulas blanco.
115
Metodologa:
1. Sensibilizacin y marcacin de las clulas blanco:
- Se lavan las clulas tres veces con medio de cultivo. Antes del ltimo lavado se dividen en
dos alcuotas iguales.
- A una de las alcuotas se le agrega el antisuero. Este antisuero ha sido previamente
calentando a 56C por una hora, procedimiento que inactiva los factores del complemento.
A la otra alcuota se la toma como control sin suero.
- Se agrega dicromato de sodio marcado (51Cr) y se incuba a 37C por 30 min.
- Se lavan las clulas tres veces con medio de cultivo para retirar el cromo radiactivo no
incorporado.
2. Medicin de la actividad de CCDA por un ensayo de liberacin de 51Cr:
- Se prepara una suspensin de clulas efectoras, se hacen diluciones seriadas (1:2, 1:4,
1:8) y se siembran en una placa de 96 pocillos, con los correspondientes controles.
- Se agregan clulas blanco incubadas con y sin anticuerpos, marcadas con 51Cr.
- Se centrifugan las placas para aumentar el contacto entre las clulas y se incuban a 37C
por 4 a 18 hs. en estufa gaseada con CO2 al 5%.
- Luego de la incubacin, los cultivos se vuelven a centrifugar a mayor velocidad y se
levanta el sobrenadante, que se analiza en un contador de centelleo lquido. Las cpm
determinadas en el sobrenadante corresponden al radiactivo liberado por la ruptura
celular.
El porcentaje de lisis especfica debe calcularse para las clulas blanco recubiertas por
anticuerpos y paralelamente para las clulas no recubiertas por anticuerpos. El porcentaje de
CCDA se calcula restando al porcentaje de lisis especfica de las clulas recubiertas con
anticuerpos, el porcentaje de lisis encontrado para las clulas blanco sin recubrir.
Bibliografa
1. Bamford, A.I; Adair, B.M.; Foster, J.C. Primary cytotoxic response of bovine peripheral blood
leukocytes to parainfluenza Type 3 virus infection. 1995. Veterinary Immunology and
Immunopathology. 45: 85-95
2. Fainboim, L; Satz, ML; Jennifer, J. 1999. Introduccin a la Inmunologa Humana. 387 pp.
3. Margni, R.A. 1996 Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976 pp.
4. Podack, E.R. Functional significance of two cytotoxic T lymphocites. 1995. Journal of
Leukocyte Biology. 57: 548-552
5. Gondolf C, Burkhardt E, Failing K, Stitz L. A new colorimetric method for measuring cell-
mediated cytotoxicity in dogs. Vet Immunol Immunopathol. 1996 Dec; 55(1-3):11-22.
116
Tcnicas para la deteccin de anticuerpos maternales
Existen diferentes mtodos que nos permiten al veterinario detectar si en cada ternero o
potrillo, hubo (o no) ingestin de calostro y absorcin de inmunoglobulinas. Las pruebas de
laboratorio que se utilizan miden protenas en el suero del neonato y pueden clasificarse en:
Pruebas cuantitativas
Pruebas semicuantitativas
Pruebas cualitativas
Pruebas cuantitativas
a) Inmunodifusin radial o tcnica de Mancini
Es la tcnica de referencia. Permite conocer la concentracin de Igs y a la vez reconocer clases
y subclases de Igs. La desventaja es el tiempo de lectura, de 18 a 24 horas (Ver captulo sobre
tcnicas de interaccin secundaria en esta gua).
c) Electroforesis
La electroforesis clsica de protenas sricas sobre cellogel (tiras de acetato de celulosa) es
una tcnica rpida y relativamente sencilla, que permite la posterior cuantificacin de las
protenas por densitometra (Ver captulo correspondiente en esta gua).
d) ELISA
Esta es una tcnica de interaccin primaria, altamente sensible y especfica. (Ver captulo
correspondiente en esta gua).
Pruebas semicuantitativas
a) Prueba de ltex o aglutinacin pasiva
Es una tcnica confiable y rpida. Las partculas de ltex se cubren con anticuerpos anti
IgG de la especie en estudio. Al mezclarse con el suero problema, si ste tiene IgG calostrales,
117
los anticuerpos anti-IgG adheridas a las partculas de ltex se unen a las IgGs del suero y
determinan que las partculas de ltex aglutinen. Esta prueba se efecta en 10 minutos
aproximadamente.
El tiempo que tarda en producirse la aglutinacin es indicativo del estado de proteccin, ya que
la concentracin de Igs es proporcional al tiempo de lectura; cuanto ms rpido aparece la
aglutinacin, mayor es la concentracin de Igs en el suero. A modo de ejemplo, si aglutina en 2
minutos, indica buen estado de proteccin.
Solucin de sulfito
Concentracin de Igs (mg/ml) de sodio
14% 16% 18%
0a1 - - -
Menos de 5 - - +
4a5 - +/- +
6 a 12 - + +
12 a 18 +/- + +
Ms de 15 + + +
c) Refractometra
Utiliza un refractmetro que permite medir el ndice de refraccin de la luz al incidir sobre
una gota de suero. Braun y Tennat relacionaron el nivel de gammaglobulinas en suero con la
concentracin de protenas totales determinadas por refractometra. Esto le permiti clasificar el
riesgo del recin nacido.
Concentracin de Protenas
Nivel de inmunidad
totales (g/dl)
Menos de 4,9 alto riesgo
5 a 5,4 riesgo medio
5,5 a 6,9 bajo riesgo
118
- Tcnica de Biuret
- Tcnica de Lowry
- Tcnica de Bradford
Pruebas cualitativas
a) Prueba del glutaraldehdo
Esta prueba determina si hubo o no falla en la transferencia pasiva, basndose en la
coagulacin de las gammaglobulinas por el agregado de glutaraldehdo (no permite cuantificar
las Igs).
La tcnica consiste en colocar en un tubo de ensayo 0,5 ml de suero y agregar una gota de
reactivo, agitar y controlar la gelificacin cada 10 minutos durante el trmino de una hora. El
tiempo se toma desde la adicin del reactivo (minuto o tiempo cero). La reaccin es positiva
cuando se forma un gel slido (cogulo) luego de la adicin del reactivo. Esto se visualiza
inclinando el tubo unos 45, verificando que el contenido no se vuelque, es decir, que el suero
se haya gelificado.
Concentracin
Tiempo de reaccin aproximada de IgG Interpretacin
(mg/dl)
Buena trasferencia calostral
Entre 0 y 10 minutos Mayor de 800
Valor normal.
Falla parcial de trasferencia calostral.
Entre 10 y 60 minutos De 400 a 800
Animal en riesgo potencial.
Falla total de trasferencia calostral.
Mayor de 60 minutos Menor de 400
Animal en alto riesgo.
Bibliografa
1. Ing. Gabriela Catalani, Dr Guillermo Berra, Sra Ana Mate. Calostro: Rol en la crianza de
terneros. Deteccin de Inmunidad. INTA Castelar.
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12. Blum, J.W., Hammon, H. Livestock Production Science 66 (2000) 151- 159.
Inmunoelectroforesis
Materiales necesarios:-
Cuba de electroforesis
Portaobjetos limpios y desengrasados
Cmara hmeda
Agar noble
Solucin amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6)
Soluciones de antgenos y de anticuerpos a valorar
Procedimiento
1- Se colocan dos capas de agar sobre un mismo portaobjeto. La primera, denominada capa
de impregnacin, contiene una solucin de agar al 2% (0,2 g de agar en 10 ml de solucin
amortiguadora). Con un hisopo embebido en esta solucin, se cubre el portaobjetos tratando
de formar una delgada capa y luego se deja secar.
2- Los portaobjetos (con la capa de agar de impregnacin seca) se colocan en posicin
horizontal y sobre ellos se agregan 3 ml de una solucin de agar al 1% caliente. Se deja
gelificar a temperatura ambiente.
3- Se efectan dos perforaciones en el agar: una con un molde circular (sacabocado) y otra
estrecha y longitudinal. En este momento se extrae el agar slo de la perforacin circular.
4- En el recipiente de la unidad de electroforesis (cuba), se coloca la cantidad necesaria de
solucin amortiguadora (Buffer Veronal pH 8.6). Los portaobjetos con el agar perforado se
colocan en la cuba y se establece contacto entre la placa de agar y la solucin utilizando tiras
de papel de filtro previamente humedecidas con la solucin amortiguadora (uno de los
extremos de la tira se apoya sobre el agar y el otro se sumerge en la solucin amortiguadora).
5- Se conecta la cuba a la fuente de poder y se ajusta la corriente a razn de 10 voltios/cm. de
gel 8 mAmp/portaobjeto durante 15 minutos para equilibrar el sistema.
120
6- Se desconecta el aparato. Las soluciones de antgeno se colocan en las perforaciones
circulares de las placas de agar utilizando una pipeta Pasteur. Una de las muestras de
antgeno deber estar teida con azul de bromofenol para indicar el desplazamiento (frente de
corrida).
7- Se asegura que las tiras de papel de filtro estn bien colocadas y se conecta nuevamente el
aparato, cuidando que la corriente sea correcta.
8- Cuando se observa que la muestra teida ha migrado lo suficiente hacia el nodo para una
correcta separacin, se desconecta el aparato y se retiran los portaobjetos de la cuba. Se
remueve el agar del canal para colocar el anticuerpo especfico. Esto debe hacerse con rapidez
para evitar la difusin excesiva del antgeno.
9- Los portaobjetos se incuban en cmara hmeda durante 24 a 48 horas. Para una correcta
interpretacin de los resultados, la capa de agar puede teirse de manera similar a la descripta
para la tcnica de inmunodifusin doble. (Ver captulo sobre tcnicas de interaccin
secundaria)
Aplicaciones de la inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis permite separar e identificar antgenos o anticuerpos en una mezcla
antignica debido a su diferente movilidad electrofortica, observndose el resultado por medio
de la tincin de las bandas de precipitacin que se producen luego de la incubacin con el
antisuero.
Es una tcnica cualitativa y semicuantitativa, pues se puede estimar la concentracin de
antgenos segn sean las caractersticas de las bandas de precipitacin respecto de la muestra
testigo normal. En el caso de la inmunoelectroforesis en placa de agar, a mayor intensidad,
longitud y cercana de las bandas al lugar de siembra del anticuerpo, mayor es la concentracin
inicial del antgeno.
En el diagnstico de laboratorio de las paraproteinemias, los resultados de la electroforesis de
zona y de la inmunoelectroforesis debern ser combinados. As, por ejemplo:
La presencia de un aumento franco o de una espiga en la regin gamma en una
electroforesis sugiere fuertemente la presencia de una paraproteinemia monoclonal. No
obstante, es necesario llevar a cabo una inmunoelectroforesis para determinar la clase de
cadena pesada y de cadena liviana de la inmunoglobulina.
La inmunoelectroforesis puede ayudar a distinguir si un aumento en las gammaglobulinas es
policlonal o monoclonal.
La disminucin o ausencia de inmunoglobulinas que se observa en diversos trastornos o
deficiencias inmunolgicas, pueden ser analizados mediante esta tcnica.
La inmunoelectroforesis permite la identificacin de cadenas livianas en la orina de enfermos
con discracias de clulas plasmticas o trastornos autoinmunitarios, mediante anticuerpos anti
kappa o antilambda especficos. De esta manera se puede confirmar la naturaleza monoclonal
de la protena de BenceJones en el mieloma.
Finalmente, la inmunoelectroforesis es til para identificar las protenas presentes en
cantidades elevadas en el lquido cefalorraqudeo de pacientes con diversas enfermedades
nerviosas.
121
Comparacin de un proteinograma con una inmunoelectroforesis.
122
Tcnica de inmunoelectroforesis:
Bibliografa
1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunologa Mxico: Editorial Diana 1 edicin,
septiembre de 1986. Captulo 6.
2. Margni R. A. Inmunologa e Inmunoqumica. Fundamentos. Bs. As. : Editorial Mdica
Panamericana 1 edicin, octubre de 1972. Edicin consultada: 5 edicin septiembre de
1996. Captulo I.
3. Inmunologa Bsica. Gua de trabajos prcticos. Fac. Cs. Veterinarias. Ao 2000.
4. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunologa Bsica y Clnica. Editorial El Manual Moderno
S.A. de C. V. Mxico D.F. 7 edicin. 1993 Seccin II. Captulo 18.
123
Ejercicios y problemas de aplicacin
1) Realice un cuadro que incluya las clulas que intervienen en el sistema inmune innato
indicando: receptores de membrana, mecanismos involucrados en su accin (fagocitosis,
apoptosis, etc.), si actan o no como presentadoras de antgeno y patrn de migracin.
2) Complete el siguiente cuadro con los componentes humorales del sistema Inmune Innato.
IFN y
Anticuerpos naturales
Canino 2
Canino 1
Nanomoles de Oxido ntrico
6 1,4
5 1,2
4 1
0,8
3
0,6
2
0,4
1 0,2
0 0
Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus
spp. spp.
a) Indique mediante una tabla que respuesta en produccin de ON se obtuvo segn los
estmulos indicados, en los dos animales.
b) Compare los resultados obtenidos entre los animales.
c) Proponga una hiptesis que pueda justificar las diferencias observadas.
d) Disee un experimento para confirmar la hiptesis propuesta.
4) La Peritonitis pleuritis infecciosa felina (PPIF) es una infeccin de etiologa viral en la cual se
desarrolla en el animal una intensa respuesta inflamatoria por parte del sistema inmune.
Recientemente se descubri que la alfa glicoprotena cida (AGP), una protena de fase aguda,
sufre un gran incremento en el suero de los animales afectados.
En base a sus conocimientos analice las imgenes que corresponden a las electroforesis (EF)
de suero de dos felinos distintos y responda:
124
Albmina
2
1
Paciente A Paciente B
a) Que tcnica se utiliz para detectar el aumento en las protenas de fase aguda?
Describa el fundamento
b) Qu paciente sospecha que puede estar afectado de PPIF? Cul es el mecanismo
inmunolgico por el cual aumentan las protenas de fase aguda?
c) Cuales son los componentes en los cuales puede separarse un suero? Qu
componente est alterado en este caso?
A B C D
125
completo. Los resultados se expresan como nmero de bacterias
intracelulares por 100 clulas dendrticas luego de la tincin con Giemsa,
PM T0 Tf
97
50
30
25
50 kDa
25 kDa
126
8) Se evalu un nuevo kit diagnstico para virus rbico, para ello se seleccionaron 180 cobayos
libres de patgenos especficos (LPE) a los que se dividieron en dos lotes de 90 animales cada
uno. Los animales del lote N 1 se conservaron como negativos, mientras que los del lote N 2
fueron inoculados con virus rbico y presentaron las lesiones caractersticas en el 100% de los
animales (positivos).
El anlisis del suero de los 180 animales, a travs del nuevo kit diagnstico arroja los
siguientes resultados:
Lote N 1: 3 positivos y 87 negativos
Lote N 2: 85 positivos y 5 negativos
Realice un cuadro con los resultados y calcule la sensibilidad y especificidad del kit diagnstico.
Aislamiento
positivo negativo Total
positivo 3 0 3
ELISA
negativo 2 75 77
comercial
total 5 75 80
11) La Pseudorrabia es una enfermedad infecciosa, producida por el virus de Aujeszky, que
afecta principalmente a cerdos pudiendo transmitirse a otras especies. Se caracteriza
clnicamente por trastornos nerviosos, respiratorios y reproductivos, siendo el prurito
generalizado seguido de parlisis y muerte los signos caractersticos.
El agente etiolgico pertenece a la familia Herpesviridae, presenta una cpside icosadrica que
contiene glicoprotenas (GP) que son los principales componentes estructurales reconocidos
por el sistema inmune y contra las que se producen grandes cantidades de anticuerpos. La
deteccin de anticuerpos especficos contra el virus en un cerdo se considera sinnimo de
infeccin y el animal debe ser separado de la poblacin sana.
Para la prevencin de la enfermedad se utilizan vacunas que generan una respuesta inmune
similar a la infeccin natural.
127
Un grupo de investigacin gener, por tcnicas de ingeniera gentica, una variante de la cepa
de campo a la que denomin GPp 7 (-). Esta variante es idntica a la cepa de campo, excepto
que carece de una de las glicoprotenas de superficie, la GP7.
Disee un ELISA donde se pueda diferenciar animales sanos no vacunados de vacunados y de
infectados (No olvide los controles)
12) Al final de la prueba de ELISA se agrega una solucin cida (o alcalina, dependiendo del
protocolo) Cul es el objetivo?
13) Cmo sera el esquema de un ELISA diseado para detectar la presencia del virus de la
Influenza equina en muestras de secreciones nasales? Indique los reactivos que necesitara.
14) Los siguientes datos son los resultados de un ELISA de tres gatos sospechosos de
padecer VIF. Los nmeros expresan el promedio de los valores de densidad ptica de cada
muestra leda a 450 nm. Las densidades pticas comprendidas en el rango de 0.300 a 0.499
indican valores indeterminados; en estos casos se deben repetir los estudios.
PACIENTE
Control Control
Positivo Negativo
A B C
Responda:
a) Cul seria su informe sobre cada uno de los pacientes?
b) Qu sucedera si se hubiese omitido por error el agregado de los sueros, y los otros
pasos se hubiesen realizado correctamente?
c) Qu sucedera si no se hubiese lavado el conjugado Anti-inmunoglobulinas felinas
antes del agregado del sustrato?
d) Por qu repetira los resultados en el paciente B? En qu momento lo hara?
15) La anemia infecciosa equina es una enfermedad de etiologa viral de los caballos, de
carcter crnico, con aparicin de episodios agudos febriles, marcada depresin y
debilitamiento. El contagio se produce a travs de vectores hematfagos que transportan el
virus en forma mecnica desde los animales enfermos a los sanos. El diagnstico se realiza
por la identificacin de anticuerpos precipitantes en el suero de los animales infectados, test de
Coggins.
Usted tiene un laboratorio de diagnstico y realiza esta prueba de forma rutinaria. Un colega
tom muestras de sangre de tres caballos y se las remite para su anlisis.
Ag: antgeno
P: control positivo
1-2-3: muestras P
1 2
Ag
P P
3
128
Analice los resultados explicando a que se deben las bandas observadas y como las interpreta.
Indique Qu informara sobre estos animales?
19) Con el objetivo de estudiar el efecto de la inmunizacin pasiva frente al desafo viral se
obtuvieron sueros inmunes frente al virus del Sarampin de diferentes cepas de ratones y se
utilizaron para inmunizar pasivamente un grupo homogneo de ratones de la cepa Balb/c. Los
ratones tenan dos semanas de vida y se les aplic una dosis de 150ul de suero.
Se evalu la supervivencia de los ratones luego del desafo
a) Cules fueron los resultados al da 2, al da 9 y al da 17? Realice un cuadro.
b) En que consisti en control negativo y para que lo realiz?
129
c) Admitiendo que las diferencias observadas entre los tratamientos son estadsticamente
significativas Cmo interpreta los resultados?
% supervivencia
20) En la prueba de fijacin de complemento se inactivan los sueros antes de evaluarlos, cul
es el objetivo? Y cmo se realiza?
Adems, el suero en estudio debe estar completamente libre de hemlisis y de
contaminaciones. Por qu?
21) En 1974 Peter Doherty y Rolf Zinkernagel realizaron el siguiente experimento: Infectaron
cepas de ratones BALB/c y CBA con virus de la linfocoriomeningitis murina (LCMV).
Siete das despus tomaron clulas de bazo de estos ratones y evaluaron su habilidad para
lisar clulas blanco infectadas con el virus (midieron el grado de lisis por la liberacin del
radioisotopo 51Cr por parte de las clulas blanco).
a) Explique los mecanismos celulares y las molculas involucradas en esta
evaluacin.
b) En base a los resultados: Explique qu demostraron con este experimento.
130
22) Haga un cuadro en el que se comparen los siguientes mecanismos de citotoxicidad celular:
fagocitosis, actividad NK, ADCC, lisis por complemento. Mencione la clula blanco, la clula y/o
mediadores qumicos efectores, mecanismo de reconocimiento y de lisis.
23) Para evaluar una vacuna BCG recombinante, se procedi a la inoculacin de ratones
BALB/c y se evalu el porcentaje de lisis especfica utilizando diferentes tratamientos: Medio de
cultivo solo (), Anti-CD4 () y Anti-CD8 () Se realiz una estimulacin previa in vitro con un
pptido y luego se la evalu sobre clulas blanco que expresan el mismo pptido.
Explique los mecanismos celulares y las molculas involucradas en esta evaluacin.
Explique los resultados en las diferentes proporciones de clulas.
24) Como se denominan los Ac. dirigidos contra los antigenos eritrocitarios en una transfusin?
(alo iso idio)
25) Luego de una castracin, un potrillo recibe antibiticos y suero antitetnico para prevenir
complicaciones postquirgicas. Unos meses despus el potrillo es vendido y su nuevo dueo
decide vacunarlos contra el ttanos. Ante la informacin de que el potrillo ya ha recibido una
dosis de suero antitetnico, el veterinario actuante decide darle slo una dosis de vacuna y
suprimir el refuerzo, argumentando que el suero antitetnico ya recibido funcionara como
primer estmulo para el sistema inmune. Est de acuerdo con la actuacin del veterinario?
Justifique
131
madre
2 paricin
27) La Arteritis Viral Equina es una enfermedad respiratoria que puede causar abortos en
yeguas preadas. Se transmite por va area y venrea, y cura espontneamente dejando
inmunidad duradera. En los machos, el virus puede acantonarse en el tracto reproductor
transformando al animal en portador sano, que elimina virus con los fluidos seminales.
La enfermedad es endmica en Estados Unidos y Europa, donde se utiliza una vacuna a virus
vivo atenuado como herramienta profilctica.
En nuestro pas es una enfermedad extica de la que se han registrado algunos brotes en los
ltimos aos como consecuencia de la importacin de semen infectado.
Los dueos de los haras afectados solicitan que se importe y se aplique la vacuna de USA,
que ha dado muy buenos resultados.
a) Si usted fuera responsable del organismo de control sanitario nacional, permitira la
utilizacin de dicha vacuna? Por qu? De no permitirlo, proponga un plan profilctico
alternativo.
28) Las vacunas a subunidades proteicas pueden ser obtenidas por tcnicas de biologa
molecular. Utilizando clonacin en un vector de expresin (el plsmido: PRsetA este vector
agrega a la proteina una cola de histidinas) se obtuvo en un cultivo de bacterias E. coli la
siguiente protena perteneciente a una secuencia de Mycobacterium paratuberculosis. Los
cultivos de E. coli se analizaron por la tcnica de SDS-PAGE.
132
En la calle 1 se observa las protenas de los cultivos de E. coli sin transformar y en la calle 2 las
protenas de los cultivos de E. coli transformadas con el plsmido. En la calle 3 se observan los
patrones de PM. En las calles 4, 5, 6 y 7 se observan las eludos de la columna de Nquel.
a) Cul es el fundamento de la metodologa utilizada para la purificacin proteica?
b) Segn los resultados de las corridas, considera que la purificacin fue efectiva?
Justifique.
29) Un grupo de investigadores est intentando desarrollar una vacuna contra leptospirosis
bovina a subunidades, cuentan con aislamientos de las serovariedades de la zona y con sueros
de bovinos infectados.
a) Qu metodologa les propondra para la identificacin de protenas compartidas por las
distintas serovariedades?
b) Una vez identificados las protenas compartidas Cmo podran seleccionar aquellas
que son ms inmunognicas para los bovinos?
30) Para ahorrar material descartable un veterinario carga en la misma jeringa una dosis de
vacuna antirrbica (virus inactivado) y una de moquillo (virus atenuado). Es correcto
inmunizar con 2 antgenos distintos el mismo da? Y administrarlos en la misma jeringa? Por
qu?
31) Un veterinario haba odo decir que la va ideal para la inmunizacin es la puerta de entrada
natural del patgeno y saba que el virus de la Fiebre Aftosa ingresa por va aergena.
Juntando estos conocimientos, se propuso evaluar el efecto de la aplicacin en spray de la
vacuna covencional antiaftosa (virus inactivado) sobre las vas reas. Para esta evaluacin,
dividi en dos grupos losa animales de un campo en el que trabajaba; a la mitad le aplic la
vacuna por la va convencional y con la otra mitad emple el sistema de spray. Unos meses
despus un brote de aftosa afect a la gran mayora de los animales vacunados con el sistema
de spray, sin provocar alteraciones entre los animales vacunados de la manera convencional.
a) Le parece correcto vacunar con spray slo a la mitad de los animales disponible para
evaluar la eficacia del sistema? Por qu?
b) Cmo explicara los resultados obtenidos por este colega?
32) Usted debe elegir entre dos vacunas atenuadas para vacunar a todos los cerdos del pas
contra la gastroenteritis transmisible. Una contiene el virus completo y otra el virus completo
ms una protena extraa (la betagalactosidasa)
Desde el punto de vista epidemiolgico, qu vacuna le parece mejor? Justifique
33) Un laboratorio entiende que, por haber formulado una vacuna a virus atenuado con un
vehculo a base de agua destilada estril apirgena no debe realizar un control de inocuidad.
Est usted de acuerdo?
133
34) Un cerdo ingresa al pas desde un rea de USA libre de Pseudorrabia. Como los
anticuerpos contra el virus de la Pseudorrabia son protectores, se decide administrarle una
dosis de suero hiperinmune anti-pseudorrabia al momento del ingreso al pas. Al llegar al
establecimiento de destino el veterinario propone esperar unas semanas para vacunarlo contra
la enfermedad. Le parece correcto este proceder? Justifique
35) Cuando aparece un foco de una enfermedad extica es imperioso el control de dicho foco
para evitar la diseminacin de la enfermedad. Entre las medidas sanitarias que se adoptan en
estos casos se encuentran el rifle sanitario y la vacunacin en anillo de todos los animales
susceptibles que habitan las zonas lindantes a la de la aparicin del foco. Qu tipo de vacuna
eligira para aplicar en uno de estos casos:
a) vacuna a virus vivo atenuado
b) vacuna a virus inactivado
c) vacuna a subunidades? Justifique su eleccin
36) A un pueblo llega un nuevo veterinario que sostiene la teora de que es mejor no vacunar
contra el virus del moquillo debido a que, adems de no producir 100% de proteccin, esta
vacuna induce reacciones adversas en algunos de los animales vacunados. Debido a su
prdica, muchos dueos de perros dejan de vacunar contra este patgeno. Al cabo de unos
aos aparece en el pueblo un brote de moquillo que afecta principalmente a los perros no
vacunados, pero tambin a algunos que s haban sido vacunados. Cuando el veterinario es
confrontado como responsable del brote, aduce que despus de todo el tena razn, ya que
tambin haban enfermado los animales inmunizados.
a) Si usted fuera una autoridad sanitaria con jurisdiccin en dicho pueblo, cmo
respondera a la aseveracin del veterinario?
37) A una clnica veterinaria llega a consulta una perra recientemente preada. Su duea est
preocupada porque la perra nunca fue vacunada y una vecina le coment que los cachorros se
podan morir de parvovirosis. La mujer quiere saber cmo proceder.
a) Usted qu le aconsejara como veterinario? Si decide vacunarla, indique qu
tipo de vacunas utilizara y por qu?
38) Un cachorro de 2 meses recibi 2 dosis de vacuna contra Parvovirus y Moquillo. Sus
dueos lo sacan de paseo por la plaza y a la semana el perro comienza a manifestar signos
compatibles con Parvo/Moquillo. Se presentan los dueos en la veterinaria con la queja,
alegando que la vacunacin recibida por su mascota no haba sido correcta, ya que a pesar de
haber recibido 2 dosis de vacuna el cachorro se haba enfermado. Tienen razn estos
dueos? Cmo argumenta su respuesta?
39) La Rabia es una enfermedad neurolgica de origen viral. Cuando un animal se infecta, el
virus se disemina por va neurgena hacia el encfalo, donde produce las lesiones causantes
de la sintomatologa de la enfermedad. Teniendo en cuenta estas consideraciones:
a) Proponga una tcnica diagnstica que permita confirmar la etiologa rbica
frente a la muerte de un animal con signos clnicos compatibles.
b) Esquematice la metodologa propuesta.
c) Indique reactivos y equipamiento necesarios.
134
d) Explique ventajas y desventajas de la administracin del antisuero a otro animal.
41) En la Clnica veterinaria, es recibido un paciente canino con signos de anemia aguda
severa.
Entre las pautas iniciales de manejo, el profesional actuante decide instaurar una
hemotransfusin.
Dada la urgencia del caso y considerando que el animal no haba recibido transfusiones
previas se decide recurrir a Lucy, mascota de la veterinaria, como donante de sangre. El
paciente comienza a manifestar vmitos, hipertermia y signos compatibles con un shock
incipiente. Explique:
a) Qu mecanismos inmunolgicos podran estar involucrados?
b) Cmo se podra confirmar el diagnstico?
c) Cmo se podra haber prevenido el agravamiento del caso?
42) El virus de la linfocoriomeningitis murina infecta, entre otras, a las clulas dendrticas. En
ellas disminuye la expresin de molculas de MHC clase II, CD40 y CD80. Cules sern las
consecuencias de esta accin en el desarrollo de la respuesta inmune contra el virus?
Explique.
43) Usted trabaja en un laboratorio y lo consultan porque una empresa desea exportar plasma
bovino.
Para ello la aduana le exige un anlisis cualitativo del mismo.
Usted en su laboratorio slo posee los siguientes reactivos:
Anti IgG bovina marcada con fluorescena.
Anti plasma bovino.
Anti IgA bovina marcada con fosfatasa alcalina.
Con sus conocimientos sobre tcnicas Inmunolgicas y con los reactivos que usted
posee:
Qu tcnica puede usted realizar que le permita determinar si lo que se est
exportando es plasma bovino? Explique brevemente cmo la realizara.
44) Estoy desarrollando una vacuna inactivada para caninos y quiero efectuar una prueba de
potencia.
a) Cul es la especie de eleccin?
b) Qu caractersticas debern tener los animales en los que se lleve a cabo la
prueba?
c) Cmo disea y evala la prueba?
45) Los potrillos son susceptibles de padecer neumona por Rhodococcus equi. Esta es una
bacteria intracelular facultativa, que se aloja en los pulmones y causa lesiones que suelen
llevar a la muerte.
Al estudiar las causas de la marcada susceptibilidad de los potrillos, se encontr que los
animales jvenes tienen deficiencia de IFN gamma, lo que afecta su respuesta inmune.
a) Describa alguna tcnica in vitro que le permita demostrar la diferencia en la produccin
de IFN gamma.
b) Cmo se ver afectada la respuesta inmune a esta bacteria por la deficiencia de IFN
gamma?
46) Un perro de cinco aos de edad sufre una herida el ojo. Tiempo despus, presenta lesiones
oculares resistentes a la teraputica convencional. Este animal no tena historia previa de
enfermedad autoinmune. Se le detectan anticuerpos contra antgenos de la retina en suero.
Por qu normalmente un individuo no tiene anticuerpos contra antgenos de la retina en
suero? Por qu se podran haber desarrollado en este caso?
135
47) Dentro de las patologas del tracto digestivo que afectan a los terneros neonatos, la
Rotavirosis es una de las ms relevantes. Este virus ingresa al organismo por va oral e infecta
los enterocitos de las vellosidades intestinales, generando las lesiones responsables del cuadro
de diarrea observado.
Responda:
a) Qu mecanismos efectores del sistema inmune consideran que tendrn mayor
importancia para lograr una respuesta inmune efectiva frente a Rotavirus?
b) Proponga un modelo de vacunacin para la prevencin de esta enfermedad en
terneros neonatos, explicando qu tipo de vacuna, justifique.
48) Se presenta a consulta una gata siamesa de 5 aos de edad con 5 cachorros de los cuales
1 estaba muerto y otros 2 presentaban decaimiento e ictericia. El veterinario sospecha de
isoeritrlisis neonatal.
a) Qu le preguntara a los dueos (anamnesis)?
b) Qu tcnicas utilizara para comprobar sus sospechas?
51) Los individuos positivos (con anticuerpos frente al Dengue) fueron seleccionados a travs
de la tcnica de ELISA, y se los consideraba como tal a aquellos que presentaban ttulos en
suero mayor o iguales a 256.
a) Describa el tipo de ELISA utilizado, materiales, fundamento y controles.
136
b) Indique las diluciones de uso de los sueros, teniendo en cuenta que ttulos >
256 son considerados positivos y la dilucin final de uso fue de 1/2048. Cmo
realiza las diluciones teniendo en cuenta que el volumen a utilizar es de 20 l de
suero?
52) Un paradigma clsico de la inmunologa plantea que para que ocurra cambio de isotipo en
los anticuerpos es condicin sine qua non la presentacin del antgeno a un linfocito T helper
(LTh) por parte de una clula presentadora de antgeno (CPA). En el presente trabajo se
present un modelo animal, ratones BALB/c, de respuesta inmune frente a dos antgenos
tpicos. Se utiliz dextran como Ag T independiente y seroalbmina bovina como Ag T
dependiente, y se estudi la respuesta analizando los isotipos de los anticuerpos producidos.
Se utilizaron 12 ratones BALB/c machos y 12 ratones BALB/c hembras de entre 5 y 8 semanas
de edad y fueron divididos en dos grupos de 12 animales c/u (6 machos y 6 hembras) Los
animales fueron inoculados intraperitonealmente con seroalbmina bovina el grupo 1 y con
Dextran el grupo 2, los das 1 (preinmune), 7,14 y 28 (A la vez se tomaron muestras de sangre
del seno venoso retroorbital).
Los ensayos para evaluar respuesta inmune se realizaron mediante un ELISA y los sueros
utilizados en una dilucin 1/250
Responda:
a) Qu isotipos deberan evaluarse para conocer la respuesta inmune primaria
y secundaria?
b) Establezca los pasos del ELISA utilizado
c) Si la dilucin utilizada fue siempre la misma Cmo se evaluaron los niveles
de Ac. medidos en este trabajo?
d) Grafique la respuesta primaria y secundaria esperable para ambos antgenos,
indicando el isotipo predominante. Si existen diferencias, A que las atribuye?
e) Analice los grficos de deteccin de anticuerpos frente a ambos antgenos.
Encuentra diferencias? Explique
f) Qu control agregara?
137
53) Una Cabaa vende un torito a un establecimiento ganadero. Para prevenir la Fiebre de los
transportes, antes de subir al camin, el torito recibe una vacuna contra IBR y Pasteurella
multocida (principales agentes causales de la enfermedad).
Cinco das despus de llegar a destino el torito muere sbitamente. La necropsia se realiz
inmediatamente, se observaron lesiones compatibles con neumona. Durante la anamnesis se
inform que el animal recibi 2 dosis de vacuna contra IBR hace 1 ao, no as contra
Pasteurella. Se sospecha de Fiebre de los transportes
Se toman muestras y se envan al laboratorio.
Los resultados son concluyentes. La muerte se debi a una infeccin aguda por P. multocida,
sin participacin del virus de IBR.
Discuta
a) 1 Qu muestras envi al laboratorio?
b) 2 Qu estudios solicit? Descrbalos y fundamente su eleccin
c) 3 Cmo debieron ser los resultados para asegurar que la muerte del animal se
debi a una pasteurelosis aguda y que el virus de IBR no puede ser acusado de
toricidio
d) 4 Qu medidas se deberan haber tomado para evitar esta muerte?
54) La produccin industrial de pollos para carne se ve afectada por la ocurrencia de diferentes
enfermedades virales (Bronquitis infecciosa, Gumboro, New Castle, etc) que se transmiten muy
rpidamente entre los pollos de un galpn de engorde
Las gallinas transfieren anticuerpos en forma pasiva a sus pollitos a travs del huevo, que lo
protegen contra enfermedades especficas durante un perodo variable de tiempo (hasta un
mximo de 40 das) si stas fueron correctamente inmunizadas.
Para evaluar la eficacia de esa transferencia se emplea la tcnica de ELISA indirecto. Se
toman muestras de sangre de 30 cada 10.000 aves. De acuerdo a los valores de D.O.
obtenidos (en relacin directa con la concentracin de anticuerpos especficos contra la
enfermedad en cuestin) se elaboran histogramas de frecuencia segn rangos de D.O.
establecidos por estudios estadsticos. De acuerdo a la distribucin de las D.O. obtenidas se
establece el grado de proteccin o status inmunitario del lote frente a esa enfernedad y se
anticipa o retrasa el momento de vacunacin activa para mantener las aves en un alto status
inmunitario durante todo el perodo de produccin (45 60 das).
138
1.01 1.20 6
1.21 1.40 7
1.41 1.60 8
1.61 1.80 9
1.81 2.00 10
cantidad de muestras
20 17 8 7
6
15 13 6 5 5
4
10 4 3
5 2
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Grupo 1 Grupo 2
cantidad de muestras
cantidad de muestras
15 13 10 8
8 7
9 6
10 8
6 4
4 3
5 2
2
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Grupo 3 Grupo 4
55) Se sabe que el Virus de la Inmunodeficiencia Felina (VIF) infecta a los linfocitos T CD4+,
causando una deplecin de los mismos y que en esta infeccin, la relacin CD4:CD8 de
linfocitos circulantes constituye un factor pronstico. Los siguientes grficos corresponden a la
corrida en un citmetro de flujo de la muestra de sangre de un paciente felino recin
diagnosticado. Para marcarla se emplearon 3 anticuerpos: anti CD3 (maracador de LT), anti
CD4 y anti CD8; cada uno marcado con un fluorocromo distinto.
139
Teniendo en cuenta que la relacin CD4:CD8 esperada para un felino sano es
aproximadamente 2:1, analice e interprete estos resultados:
SSC-Height ->
Linfocitos
CD8: 19% CD4: 10%
Los grficos CD8 vs. CD3 y CD4 vs. CD3 fueron construidos considerando solamente los
eventos incluidos en la regin linfocitaria (gate linfoide)
56) Un grupo de cientficos est investigando la respuesta inmune de porcinos frente al virus de
la Peste Porcina (VPP). En este problema se muestran los resultados de uno de sus ensayos,
donde realizaron una prueba de linfoproliferacin de sangre perifrica de animales infectados
con el virus. Emplearon como estmulo linfoproliferativo una solucin de virus inactivado.
140
b) Luego, evaluaron las citoquinas producidas por los LT CD4+ proliferados usando la
citometra de flujo.
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