Servicio de Higiene Hospitalario

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INSTITUTO PASTEUR DE LA CIUDAD DE LILLE ( FRANCIA)

FUNDACIN RECONOCIDA DE UTILIDAD PBLICA

ESTUDIO DE LA EFICACIA DEL PRODUCTO ALKACIDE LOTE 1095 SOBRE

EL PODER INFECCIOSO DEL VIRUS HIV1 ( agente etiolgico del SIDA.)

I. INTRODUCCIN

El propsito de la pericia es determinar la concentracin y el tiempo de accin necesario

para un producto desinfectante para inactivar por lo menos 105 partculas infecciosas del
virus HIV1.
Se realizaron dos tipos de pruebas:
- Accin del desinfectante sobre la enzima del virus HIV1
- Estudio del poder infeccioso residual para la lnea de linfocitos T humanos MT4.

II. MATERIAL

a) Producto sometido a estudio: ALKACIDE Lote 1095: Es un desinfectante lquido

para la desinfeccin del material termo sensible utilizado en el examen medical.
Entregado al laboratorio el 1ero de abril de 1993, este producto nos fue remitido por el
laboratorio ALKAPHARM ubicado en calle de Rvilly, nmero 83 75012 PARIS.
PH medido en el laboratorio: pH 5.2
Color : azul
Olor : irritante
Acondicionamiento en frasco de plstico de 250 ml.

b) El virus HIV1: El virus ( cepa HTLV IIIB ) se obtuvo de un sobrenadante de cultivo

celular MOLT 4 infectada y mantenida activa en el laboratorio.
La titulacin del lquido sobrenadante fue evaluado mediante dosificacin de la actividad
de la transcriptasa inversa ( ATI ) y por medicin de la infecciosidad para la lnea
continua en la prueba ( MT4 )
Virus experimental de la transcriptasa inversa ( ATI ) : 2,2 x 106 CPM equivalentes / ml
del ttulo infeccioso despus de 2 semanas de cultivo = 106 de partculas infecciosas
Este documento consta de 8 pginas

c) La lnea de clulas T humanas ( MT4) utilizada durante la prueba cuando

llevo a cabo la infeccin por el virus HIV, permite la observacin de un
efecto citopatgeno ( ECP ). Este efecto citopatgeno est directamente
correlacionado con la cantidad de virus utilizado para la infeccin, a su
replicacin y a la expresin de los antgenos virales por clulas.
Toda inhibicin de este efecto citopatgeno corresponde a una inhibicin de la
multiplicacin del virus HIV1.

En una tabla, indicaremos la fecha de aparicin de un efecto citopatgeno ( ECP ) en

los cultivos de la siguiente manera:
++++ ECP mximo ( 100 % de muerte celular )
+++ ECP al 70 %
++ ECP al 50 %
+ ECP al 10 %
0 ECP no detectado

MTODOS

Tratamiento del virus HIV1 por medio del desinfectante ALKACIDE Lote 1095

Utilizamos el lquido sobrenadante viral citado anteriormente. Para cada dilucin del
desinfectante, y con los tiempos de incubacin establecidos, se utilizan 2 tubos de
ensayo de 0.5 ml de sustancia viral sobrenadante ( CMP equivalentes / tubo de
ensayo ).

El desinfectante sometido a estudio ALKACIDE diluido en medio proteico ( medio

de cultivo al 10 % de suero de feto de ternera ) no revela ningn precipitado.
Se transfiere el virus a cada uno de los tubos para reaccin y se agrega el
desinfectante sometido a prueba ( 0.5 ml ) con las diferentes concentraciones, se
homogeneiza y se respeta el tiempo de inmersin ( diluciones en agua destilada ). La
reaccin se detiene al aforar todos los volmenes a 1 ml con agua destilada.
Se centrifugan los tubos de ensayo para concentrar el virus residual.
Se procede de la misma manera para los tubos testigo no tratados.
Cada cuajo viral es transferido a una almohadilla Tris-EDTA ( pad ) dividida en
dos partes iguales.
- La primera parte despus de haber adicionado TRITON ( x 10 ) al 0.1 % servir
para dosificar la actividad de la transcriptasa inversa residual.
- La secunda parte, despus de realizar dos lavados en RPMI, se incuba en
presencia de clulas MT4 sensibles durante un periodo de 1 hora 30 minutos a
37 C.
Estas clulas se cultivan en un medio RPMI que contiene 10 % de suero de feto de
ternera, 1 % de glutamina y 1 % de antibiticos.
Los cultivos se mantienen por pasaje ?durante 2 semanas despus de la aparicin
de un efecto citopatgeno ( ECP ) caracterstico dentro del grupo Testigo de virus
no tratado, sea un total de 3 semanas.
Al final del periodo de cultivo, una lisis celular se realiza mediante la adicin de
Triton ( x 100 ) al 0.1 % de punto final. La presencia de virus intracelular no
detectado por la lectura del ECP ser evidenciado mediante una dosificacin
enzimtico de la P24 especfica del virus HIV1.
Utilizamos el kit comercializado por la compaa ABBOTT que permite detectar 50
picogramos / ml de P24.
De acuerdo con este experimento, podemos determinar las condiciones de eficacia
de un producto desinfectante que desactiva por lo menos 105 unidades infecciosas
de virus HIV1.

Medicin de la actividad de la Transcriptasa inversa

La actividad de la transcriptasa inversa se dosifica a partir de 0.5 ml de lquido
sobrenadante viral experimental tratado o no por el desinfectante, despus de
obtener una concentracin por centrfuga 5 a 100 00 rpm. Cada cuajo viral se
vuelve a transferir a 40 l de almohadilla NTE. 20 l servir a dosificar ATI
despus de agregar 0.1 % de TRITON ( x 100 ).

Se revela la actividad enzimtica mediante la adicin de 20 l de mezcla para

reaccin como se indica a continuacin:
Tris 50 m M con un pH de 7.9
Kcl 20 m M
Mg Cl2 5 m M
Ditiotreitol 1 m M
Poli rA 0.005 OD / ml
Oligo dT 12-18 0.05 OD / ml
3 H TTP 5 Ci

Despus de una incubacin de una hora a 37 C, los productos cido insolubles

forman un precipitado por medio de cido tricloroactico al 20 %, filtrados con
membrana de microcelulosa de 0.45 m y la radioactividad se mide mediante un
medidor a titilacin KONTRON.
 TABLA 1

CONDICIONES DE TRATAMIENTO DE LA SOLUCIN VIRAL

Muestras Producto Dilucin Tiempo de incubacin

A1 ALKACIDE 0.25 % 5 minutos

A2 ALKACIDE 0.25 % 10 minutos
A3 ALKACIDE 0.25 % 15 minutos
A4 ALKACIDE 0.5 % 5 minutos
A5 ALKACIDE 0.5 % 10 minutos
A6 ALKACIDE 0.5 % 15minutos

B Grupo testigo -- -- 15 minutos

Virus no tratado

C Grupo testigo -- -- --
Clulas MT4
 TABLA II
ACCIN DEL PRODUCTO ALKACIDE SOBRE EL VIRUS HIV MEDIANTE
DOSIFICACIN DE LA TRANSCRIPTASA REVERSA RESIDUAL.

Muestras ATI Actividad viral Inhibicin virucida en %

Cmp / ml en %
B1 Grupo testigo 207684 100 % --
Virus no tratado 15
mn
ALKACIDE diluido
al 0.25 %
A1 : 5 minutos 2125 1% 99.0 %
A2 : 10 minutos 1286 0.6 % 99.4 %
A3 : 15 minutos 1010 0.4 % 99.6 %
Testigo Positivo de la 309897
reaccin enzimtica
Testigo negativo de
la reaccin 315
enzimtica

La Tabla muestra que se vuelve a encontrar la actividad de la transcriptasa inversa

mnima ( porque es muy cercana al ruido de fondo ) despus del tratamiento del
virus por ALKACIDE diluido al 0.25 % durante un periodo de contacto 5, 10 y 15
minutos.

TABLA II Bis

ACCIN DEL PRODUCTO ALKACIDE SOBRE EL VIRUS HIV MEDIANTE

DOSIFICACIN DE LA TRANSCRIPTASA REVERSA RESIDUAL.

Muestras ATI Actividad viral Inhibicin virucida en %

Cmp / ml en %
B2 Grupo testigo 284213 100 % --
Virus no tratado
Tiempo de inmersin
en concentraciones
A1 : al 50 % 278 0.1 % 99.9 %
A2 : al 25 % 356 0.1 % 99.9 %
A3 : al 10 % 336 0.1 % 99.9 %
Testigo Positivo de la 318657
reaccin enzimtica
Testigo negativo de
la reaccin 198
enzimtica ( ruido de
fondo )
La Tabla muestra que no se ha encontrado ninguna actividad de la transcriptasa
inversa despus del tratamiento del virus por ALKACIDE diluido al 0.5 % durante
un periodo de contacto de 5, 10 y 15 minutos.

TABLA III
ESTUDIO DEL PODER INFECCIOSO RESIDUAL DE CADA MUESTRA POR
CULTIVO SOBRE CLULAS MT4

Evaluacin del efecto citopatgeno viral ( estudio microscpico )

MUESTRAS D+4 D+7 D+10 D+14 D+17 D+21 P24 en pg / ml Lisis

terminal
C Grupo testigo Clulas 0 0 0 0 0 0 299.1
MT4 0 0 0 0 0 0 347.6
B2 Grupo testigo ++ +++ -- -- -- -- > 1000
Virus no tratado destruido

++ +++ -- -- -- -- > 1000

destruido
ALKACIDE diluido a 0.25 %
A1 : 5 minutos 0 0 0 0 0 0 218.8
A2 : 10 minutos 0 0 0 0 0 0 394.9
A3 : 15 minutos 0 0 0 0 0 0 299.8

ALKACIDE diluido a 0.5 %

0 0 0 0 0 0 106.2
A1 : 5 minutos
0 0 0 0 0 0 310.7
A2 : 10 minutos 0 0 0 0 0 0 377.6
A3 : 15 minutos

Esta Tabla muestra que el poder infeccioso ha desaparecido despus del tratamiento
del virus HIV1 por ALKACIDE diluido al 0.25 % o al 0.5 % durante un periodo de
contacto de 5, 10 y 15 minutos.
 TABLA IV
ESTUDIO DEL PODER INFECCIOSO DEL LQUIDO SOBRENADANTE
VIRAL EXPERIMENTAL
( Toma de muestra 100 )

Evaluacin del efecto citopatgeno viral sobre cultivo de MT4 por Lisis terminal
medio de estudio microscpico Dosificacin
enzimtica de P24
en pg / ml

Dilucin del D+4 D +7 D + 10 D + 14

lquido
sobrenadante
viral
experimental

10-1 +++ ++++ destruido -- -- NT

10-2 ++++ ++++ destruido -- -- NT
10-3 0 ++ ++++ destruido -- > 1000
10-4 0 ++ ++++ destruido -- >1000
10-5 0 ++ ++++ destruido -- >1000
10-6 0 0 0 0 170.6
10-7 0 0 0 0 156.8
10-8 0 0 0 0 152.2

Testigo
clulas MT4 0 0 0 0 171.5

CONCLUSIN
Mediante el estudio conjugado de la transcriptasa reversa y del poder
infeccioso residual, podemos concluir que el desinfectante ALKACIDE tiene
actividad sobre el virus HVI1 cuando se utiliza en concentracin al 0.5 %
durante un periodo de contacto de 5, 10 y 15 minutos.

Lille al 7 de junio de 1993

Responsable tcnico Jefe del Servicio

Jolle DEWULF Doctor C. KREMBEL
INSTITUT
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LILLE