Universidad de Carabobo

Facultad de ciencias de la salud

Escuela de Bioanlisis

Departamento de microbiologa

Manual
de
Pruebas
bioqum
icas
Profesor: Alumna:

Tomas Rojas. Dorelis Bujatto.

Jueves, 2 de febrero de 2017

 1- Prueba de Fenilalanina-Desaminasa:
Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminocido
fenilalanina en cido fenilpirvico por su actividad enzimtica de fenilalanina desaminasa,
con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas
las especies del gnero Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar
ambos gneros de otras enterobacterias.

Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del bisel con

abundante inculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se aade 0,2ml de una
solucin de cloruro frrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento.

Interpretacin de resultados:

La presencia de cido fenilpirvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparicin de un

color caracterstico verde oscuro o verde-azulado.

2- Prueba rojo de metilo:

La prueba del rojo de metilo (RM) se basa en el empleo de un indicador de pH, rojo de
metilo, para determinar la concentracin de iones hidrgeno presente cuando una bacteria
cataboliza la glucosa. Con esta prueba se investiga si el microorganismo acta por la va
cido mixto sobre los azcares, sta es una va metablica en la que se producen cidos del
tipo frmico, actico, lctico y succnico (cidos muy fuertes dentro de la debilidad de los
cidos orgnicos).

Interpretacin de resultados:

Si el microorganismo ha producido cidos a partir de la glucosa, se mantendr rojo el

indicador. Medio cido indicador rojo RM (+) (Escherichia coli) Medio neutro indicador
amarillo naranja. RM (-) (Klebsiella)

3- Prueba de Indol:
Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de las bacterias para producir indol a
partir del triptfano. Ayuda a la diferenciacin entre los generos Edwardsiella (+) de
Salmonella (-), Escherichia coli (Por lo general +) de Klebsiella-Enterobacter (Por lo
general -).

Se inocula un tubo del medio con el asa de platino, transfiriendo una porcin del cultivo
puro y se incuba a 37C por 40 a 48 horas. Luego se aaden 0,5 mL del reactivo de Kovac
y se agita suavemente.
Interpretacin de resultados:

Una reaccin positiva es indicada por la aparicin de un anillo rojo en la superficie del
medio (capa alcohlica)

4- Prueba del citrato:

Con esta prueba se determina si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
nica fuente de carbono para el metabolismo, provocando una alcalinizacin en el medio.

Los microorganismos que utilizan el citrato tienen la enzima citrato permeasa, que permite
el paso del citrato a travs de la membrana celular. El medio a utilizar para esta prueba es el
Kocer Citrato (lquido) o Citrato de Simons (slido e inclinado en tubo).

Estos medios contienen citrato como nica fuente de carbono, sales minerales, y adems un
indicador de pH, el azul de bromotimol.

Ayuda a la diferenciacin entre los gneros Edwardsiella (-) de Salmonella (por lo general
+), Serratia liquefaciens (+) de Yersinia peudotuberculosis (Por lo general -) y
Y.enterocolitica (-), Klebsiella (+) de Actinobacillus equui (-), Klebsiella enterobacter (+)
de Escherichia coli (-).

Interpretacin de resultados:

El medio en un principio es de color verde y cuando un microorganismo utiliza el citrato

ocurre una alcalinizacin del medio, variando de verde a azul.

Color azul en el medio, prueba del citrato +

Color verde en el medio, prueba del citrato

5- Reaccin de Voges-Proskauer: acetoina

La reaccin de VP se basa en la deteccin del acetilmetilcarbinol (acetona) a partir de le
fermentacin butanodilica de la glucosa. Las bases bioqumicas de la prueba consideran
que a partir del cido pirvico, una bacteria puede seguir vas metablicas diferentes para la
obtencin de energa, segn la composicin de sus sistemas enzimticos. Una de estas vas
es la fermentacin butanodilica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la
acetona es su precursor.

La prueba de VP se basa en la deteccin de este ltimo metabolito. La acetona que se

produce en la fermentacin cuando reacciona con el hidrxido de potasio (al 40% p/v) es
oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos guanidnicos de la arginina,
que est presente en las peptonas que constituyen el medio, dando una coloracin rojiza.
Para esta prueba se utiliza el mismo medio que se usa para la prueba del rojo de metilo. Se
siembra el microorganismo problema y se incuba a 37C durante 48 horas. La lectura se
realiza agregando el cultivo 6 a 8 gotas de una solucin de KOH al 40% y luego 1 ml de
solucin alcohlica del alfa naftol al 5% (p/v). Se debe esperar hasta 20 minutos para
realizar la lectura, tiempo en el cual se deja en la estufa, el cultivo con los reactivos
agregados.

Interpretacin de resultados:

La formacin de un anillo rosa fluorescente en la superficie del tubo indica que la prueba es
positiva. Escherichia coli es VP - Klebsiella sp es VP +

6- Reaccin de la Ureasa:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de los microorganismos para hidrolizar
la rea, formando dos molculas de amonaco por la accin de la enzima ureasa.

Esta actividad enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre
todo para diferenciar lo organismos Proteus rpidamente ureas positivos de otros miembros
de las Enterobacteriaceae; otro gneros pueden ser positivos retardado como Klebsiella (+)
de Escherichia (-), Proteus (+ rpido) de Providencia (-).

Con el asa de platino se transfiere una porcin de cultivo puro proveniente de un medio
slido y se incuba a 37C por 24 horas.

Interpretacin de resultados:

Una reaccin positiva (hidrlisis de la urea) es indicada por un cambio de color del amarillo
(pH 6,8) al rojo cereza (pH 8,1 o ms alcalino).

7- Prueba de la descarboxilacin de la lisina:

Se usa para medir la capacidad enzimtica de un organismo para descarboxilar un
aminocido para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad.

Las pruebas de las descarboxilasas se emplean fundamentalmente para determinar grupos

bacterianos entre la Enterobacteriaceae.

Con el asa de platino se transfiere una porcin de cultivo puro al caldo lisina. Se incuba a
37C por 24 horas luego se cubren los tubos inoculados con una capa de 4-5 mm de
parafina estril.
Interpretacin de resultados:

Las enterobacterias, por fermentacin de la glucosa producen cido, el cual hace virar el
indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina descarboxilasa, por la
descarboxilacin de la lisina se producir una amina, la cual neutralizar el cido producido
por la fermentacin de la glucosa retornando el medio a su color original violeta.

8- Pruebas con agar hierro Kligler:

Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de
carbono especfico incorporado a un medio de crecimiento bsico as como producir gas y
cido sulfhdrico. Se utiliza para identificar diferentes especies bacterianas pertenecientes a
la familia Enterobacteriaceae.

Se realiza mediante la inoculacin de cada uno de los microorganismos aislados por

puncin y por estra en el mismo tubo de medio agar hierro de Kligler. Se incuban a 37 C
durante 18-24 horas.

La utilizacin de un hidrato de carbono implica la liberacin al medio de productos cidos

capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo es incapaz de
utilizar el hidrato de carbono, consume las peptonas del medio liberando productos que
alcalinizan el medio. Cuando se interpretan los resultados de esta prueba deben analizarse
los siguientes aspectos:

A) Utilizacin del hidrato de carbono:

- Si el microorganismo en estudio slo fermenta la glucosa:

a) en superficie: reaccin alcalina, color rojo.

b) en profundidad: reaccin cida, color amarillo.

- Si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar tanto la glucosa como la lactosa:

a) en superficie: reaccin cida, color amarillo.

b) en profundidad: reaccin cida, color amarillo.

- Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa ni la lactosa (no

entrico):

a) en superficie: reaccin alcalina, color rojo.

b) en profundidad: si el microorganismo es aerobio no se observa crecimiento ni cambio de

color; si el microorganismo es facultativo, reaccin alcalina, color rojo.
- Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla:

a) en superficie: reaccin cida a tiempos cortos y luego alcalina, color rojo.

b) en profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color.

B) Produccin de gas:

Si el microorganismo en estudio es aerognico, la produccin de H2 y CO2 se manifiesta

mediante la formacin de una o varias burbujas o el desprendimiento del medio del fondo
del tubo dejando un rea clara.

Si el microorganismo en estudio es anaerognico, no hay produccin de

gases.

C) Produccin de cido sulfhdrico (SH2):

Si el microorganismo en estudio produce este cido, se manifestar por la

presencia de un precipitado negro de sulfuro de hierro en la parte profunda
del tubo.

Si el microorganismo en estudio no produce este cido, se manifestar por

la ausencia de dicho precipitado.

9- Pruebas de tolerancia:
BHI con cloruro de sodio al 6,5%

Se estudia sembrando el microorganismo en un medio capaz de soportar su desarrollo, al

cual se le ha agregado NaCl en la concentracin referida. El medio puede usarse solo, en
cuyo caso se lee simplemente por observacin de crecimiento o no, o puede adicionarse con
glucosa al 1% y un indicador de pH, como el rojo fenol, para facilitar la lectura. En este
ltimo caso, los microorganismos capaces de fermentar la glucosa, y tolerar la
concentracin salina del medio, desarrollan y acidifican, con el consiguiente viraje de color
en el medio

Interpretacin de resultados:

Crecimiento: Tolera la concentracin de sal

No crecimiento: no tolera la condicin

BHI con pH 9,6

Puede usarse el caldo nutritivo como base, ajustando el pH a 9,6 antes de su esterilizacin.
Puede adicionarse glucosa y un Indicador de pH, como se indic en el caso anterior, para
facilitar la lectura de resultados
Interpretacin de resultados:

Crecimiento: Tolera el nivel de pH a 9,6

No crecimiento: no tolera la condicin

10- Prueba de la esculina en medio con bilis:

Medio utilizado para el aislamiento e identificacin presuntiva de estreptococos del grupo
D, los cuales crecen rpidamente en el agar bilis esculina e hidrolizan la esculina, que en
presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde oliva hasta negro. Las sales
biliares presentes inhiben el desarrollo de la flora acompaante.

La prueba se realiza mediante la siembra del material en estudio en tubo o placa segn la
preferencia luego se incuba hasta 3 das a 35-37 C, en aerobiosis.

Interpretacin de resultados:

Medio preparado: mbar u oscuro ligeramente opalescente. El medio con esculina tiene un
leve tinte azulado.

11- Prueba de oxidacin fermentacin de carbohidratos:

Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de

utilizacin. Se usa el medio OF de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de
carbono en una relacin 1:5. Al ser menor la concentracin de peptonas, hay menor
produccin de productos de oxidacin a partir de los AA que tienden a elevar el pH y
pueden neutralizar los cidos dbiles producidos por los microorganismos no
fermentadores. El medio posee azul de bromotimol como indicador de pH. El test es til en
la diferenciacin de los Gneros incluidos en la Familia Micrococcaceae como para
diferenciar miembros de la Familia Enterobacteriaceae de las Pseudomonas.

Se utilizan 2 tubos con el medio O-F glucosa o lactosa o cualquier otro carbohidrato por
cada agente a estudiar. Se hace la siembra profunda con aguja de platino. Uno de los tubos
queda expuesto al aire, y el otro se cubre con parafina estril (1,5 a 2 cm de alto) para crear
condiciones anaerobias. Se incuba a 37C por 24 horas y hasta 14 das dependiendo del
microorganismo. Los organismos oxidativos y fermentativos utilizan el carbohidratos tanto
el tubo aerbico (sin parafina) como en el anaerbico, acidifican el medio y provocan el
viraje del color del indicador de verde a amarillo. Los microorganismos oxidativos slo
podrn utilizar el carbohidrato en el tubo aerbico. Como la produccin de cido en algunas
especies puede ser lenta, se recomienda incubar el medio por 7-14 das, a menos que se
observe cambio con anterioridad.
Interpretacin de resultados:

Microorganismos oxidativo: producen cido solo en el tubo expuesto al O2 atmosfrico.

Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosfrico cambia su color original a
amarillo.

Microorganismos fermentadores: producen cido en los 2 tubos. O sea que los dos tubos
viran del verde al amarillo.

Bacterias sacarolticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino despus de la
incubacin, conservando su color original.

12- Prueba de la motilidad:

Se incluyen en este apartado 2 pruebas debido a que pueden realizarse cultivando el
microorganismo en un nico medio (el Manitol Movilidad), que se prepara en tubo con
agar en taco y se siembra en picadura, incubndose a 37C durante 24 horas. Tambin
existe la posibilidad de hacer las pruebas en medios separados.

Prueba del Manitol: Sirve para detectar si los grmenes son capaces de fermentar el
manitol liberando productos cidos que sern detectados gracias al indicador rojo de fenol
que cambiar a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l
de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis,
Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clnica, la
prueba del manitol sirve para diferenciarStaphylococcus aureus (+) de Staphylococcus
epidermidis (-).

Prueba de la Movilidad: Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las

bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente
entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos mviles.

El medio manitol movilidad permite la realizacin de esta prueba gracias a ser semislido
ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias mviles
producirn un enturbiamiento homogneo del medio debido a la distribucin aleatoria de
los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmviles permanecern en la misma
lnea de la picadura en que se sembraron.

Entre las Enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el gnero Klebsiella (-) de
las restantes que suelen poseer movilidad (+). Dentro del gnero Bacillus, nos permite
diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).
 13- Prueba de licuefaccin de gelatina:
Detectar la produccin de una enzima proteoltica extracelular por parte de las bacterias que
es la GELATINASA. Permite diferenciar gneros productores de Gelatinasa, que
hidrolizan la Gelatina tales como: Staphylococcus: (+ muy rpida), Bacillus (+),
Micrococcus: (+ lenta), Clostridium (+ lenta), Streptococcus (negativos), Listeria (-).

Se siembra el microorganismo en medio rico en Gelatina por puncin profunda

Ej. Agua Peptonada + 12% gelatina

Caldo nutritivo + 12% gelatina (esterilizados previamente)

Se incuba por varios das (20 das) a 20-22C y se coloca en una nevera 30 antes de la
interpretacin

Interpretacin de resultados:

Medio se derrite (lquido) Gelatinasa + (bacteria hidroliz gelatina)

Medio est slido Gelatinasa - (bacteria no hidroliz gelatina)

14- Prueba de la hidrlisis de almidn:

Permite investigar la presencia en el microorganismo en estudio de una enzima capaz de
hidrolizarel almidn. Esta enzima es muy comn en distintos miembros del gnero
Bacillus.

Se siembra el microorganismo en estudio por estra en una placa con agar almidn. Se
incuba a 37 C hasta observar desarrollo. Inundar la placa con lugol por 10 minutos.

Interpretacin de resultados:

Prueba positiva: halos de degradacin (marrones o transparentes) alrededor de las colonias

sobre fondo azul.

Prueba negativa: ausencia de halos; coloracin azul alrededor de las colonias (presencia de
complejo Iodo-almidn).

15- Prueba de la catalasa:

La catalasa es una enzima respiratoria, es una porfirina de hierro cuya funcion es desdoblar
los peroxidos en H2O y O2. Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que
se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen
citocromo. La principal excepcin es Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar los gneros: Streptococcus (-) de
Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria
monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+)de Erysipelothrix (-)

Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la
precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del
medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo.

1. Mtodo del portaobjetos (recomendado):

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas
y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el
microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).
Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua
oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
2. Mtodo del tubo de ensayo:
Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en bisel
densamente inoculado.
Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).
16- Prueba de la oxidasa:
La Prueba de la Oxidasa hace una diferenciacin inicial de las bacterias Gram negativas. Se
basa en que determinadas bacterias poseen las enzimas citocromo oxidasa o indofenol
oxidasa, que catalizan el transporte de electrones. En esta prueba, un tinte incoloro, como el
dihidrocloruro de p-fenilendiamina sirve como un aceptor artificial de electrones para la
enzima oxidasa. El tinte es oxidado y forma el compuesto coloreado, azul de indofenol.

Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus, Staphylococcus y

Micrococcus (-) de algunas especies de Pseudomonas u Aeromonas (+).

La prueba se realiza levantando con el asa de platino una colonia del cultivo puro, se aplica
dicha colonia sobre la tira de papel de filtro embebida con el reactivo de oxidasa,
asegurndose de extender bien el material se esperar 5-10 segundos y se observa la
coloracin.

Interpretacin de resultados:

Prueba positiva: la tira de papel de filtro embebida en reactivo de oxidasa vira al color azul
por oxidacin de dicho compuesto a azul de indofenol.
Prueba negativa: el color de la tira de papel de filtro embebida en reactivo de oxidasa no se
modifica.

17- Prueba de reduccin de nitratos:

Se determina la capacidad de un organismo de reducir el nitrato a nitrito o en nitrgeno
libre. Muchos organismos pueden llevar a cabo una reduccin no asimiladora del nitrato,
que acta como aceptor final de electrones. Este proceso es facultativo y se produce cuando
hay disponibilidad de oxgeno muy baja o nula. Corresponde a una respiracin anaerobia,
es un proceso de oxidacin por el cual las sustancias inorgnicas, especialmente el nitrato
que proporciona el oxgeno para que sirva como aceptor de electrones para suministrar
energa.

La reduccin del nitrato da lugar a nitrito como producto final, que a su vez puede ser
reducido hasta la produccin de derivados gaseosos (desnitrificacin).

La presencia de nitritos en el medio de cultivo, originados por la reduccin de los nitratos,

puede detectarse con reactivos adecuados.

El caldo base se debe ajustar a un pH = 7.0. Extracto de carne 3 g, peptona 5 g, KNO3 1 g,

agua destilada 1 L.

Una vez preparado el medio se coloca en tubos que deben contener campanas Durham para
detectar produccin de gases. Luego se esteriliza el medio a 121C durante 20 minutos.

Despus de inocular los tubos, estos deben ser incubados a 37C durante al menos 24 horas
y hasta cinco das. Luego se procede a la lectura, observndose en primer lugar la presencia
o no de gases. Luego se adicionan los reactivos de nitratos, un ml de solucin A y un ml de
solucin B, a cada tubo. La aparicin de un color rojo intenso indica la presencia de nitritos
en el medio y por tanto la positividad de la reaccin.

A los casos que resulten negativos se les debe agregar granalla de zinc para determinar si
los nitratos han sido reducidos, si aparece una coloracin roja es debido a que en el medio
existen nitratos; una ausencia de color rojo indicara que no hay nitratos en el medio (estos
han sido reducidos inicialmente a nitritos, y despus a gas), siendo en este caso la prueba
considerada como positiva.

Reactivo A: Solucin al 0,8% de cido sulfanlico en cido actico 5N.

Reactivo B: Solucin al 0,5% de alfa-naftilamina en cido actico 5N.

Ambas soluciones se disuelven por calentamiento suave.

Esta prueba ayuda a la identificacin de Enterobacterias que por lo general reducen los
nitratos.
 18- Prueba de extraccin de pigmento con cloroformo
Esta prueba bioqumica permite investigar los pigmentos producido por cepas de
Pseudomonas.

Para realizar la prueba se siembra el microorganismo en estudio en caldo nutritivo, se

incuba a 37 C y luego se agrega 1 ml de cloroformo al contenido del tubo.

Interpretacin de resultados:

Prueba positiva: La fase clorofrmica toma color azul verdoso por extraccin de piocianina.

Prueba negativa: La fase clorofrmica permanece amarilla (no se extrajo pigmento).

19- Prueba de la leche con tornasol

Permite diferenciar organismos sobre la base de sus mltiples reacciones metablicas en un
medio lcteo como: fermentacin de lactosa, caselisis, y coagulacin de la casena. Ayuda
a la diferenciacin de especies sobre todo del gnero Clostridium.

El tornasol incorporado a la leche es un indicador de pH y de oxidacin-reduccin que hace

que el medio pueda indicar diversas funciones metablicas. La leche contiene lactosa,
casena, lactalbmina y lactoglobulina, por lo tanto, un organismo puede mostrar una o
varias propiedades metablicas en la leche tornasolada ayudando as a la identificacin
bacteriana:

1. Fermentacin de lactosa.

2. Reduccin del tornasol.

3. Formacin de cogulo.

4. Peptonizacin (digestin).

5. Formacin de gas.

Indicador de pH: Tornasol

cido: Color rojo (pH = 4.5)

Alcalino: Color azul ( pH = 8.3)

Medio no inoculado: Azul purpreo (pH = 6.8)

Interpretacin de resultados:

Rojo rosado: cido; fermentacin de lactosa

Azul purpreo: No fermentacin de lactosa; sin cambio del indicador de pH.

Azul: Alcalino; Ausencia fermentacin de lactosa. El organismo ataca las sustancias

nitrogenadas que se encuentran en el medio.

Blanco: Reduccin del tornasol a una leucobase.

Formacin de cogulo: Coagulacin de la protena de la leche.

Aclaracin del medio: Digestin; se ha ingerido la protena de la leche.

Gas: Produccin de burbujas en la campana de Durham.

20-- Prueba de reduccin de la leche con azul de metileno:

Permite diferenciar organismos por su capacidad de reducir el azul de metileno en un medio
con leche. El sistema citocromo oxidasa activa la oxidacin del citocromo reducido por el
oxgeno molecular que a su vez acta como un aceptor de electrones en el periodo terminal
del sistema de transferencia de electrones. Cuando existen condiciones aerbicas el oxgeno
es el aceptor final del hidrgeno, produciendo agua o perxido de hidrgeno segn la
especie bacteriana y su sistema enzimtico.

Los sustratos artificiales como el azul de metileno, pueden sustituir a los aceptores de
electrones naturales en cualquier lugar de la cadena de transporte de electrones, donde
actan como reductores del sistema citocromo.

Cuando se agrega el colorante sinttico reducible, azul de metileno a un medio que

contenga organismos metabolizantes, los electrones producidos por un sustrato oxidable
son desplazados de su ciclo normal, si se produce reductasa y son utilizados para reducir el
colorante.

Esta capacidad enzimtica se utiliza fundamentalmente para diferenciar los enterococos

(especies de Streptococcus del grupo D) de otros miembros del gnero Streptococcus.

_ Microorganismos positivos Enterococos (Streptococcus del grupo D)

_ Microorganismos negativos Especies de Streptococcus que por lo general no son

enterococos.

Interpretacin de resultados:

Positiva: Incoloro; reduccin

Negativa: Azul; no hay reduccin.

 21-Prueba de la fosfatasa alcalina termorresistente:
Se usa para la identificacin del genero Pseudomonas, determinando la actividad
enzimtica termolbil de la fosfatasa alcalina que presenta este microorganismo.

La prueba se realiza utilizando el indicador incoloro p-nitrofenil fosfato, el cual se desdobla

para dar p-nitrofenol (compuesto de color amarillo) y fosfato inorgnico, cuando acta
sobre el la enzima fosfatasa producida por todas las especies Pseudomonas, sin embargo, la
mayora de estas bacterias son inactivadas al ser calentadas a 70C, solamente la P.
aeruginosa, P. pseudomallei y P.boreopolis son termorresistentes.

Interpretacin de resultados:

Tubo calentado Tubo no calentado (Control)

Pseudomona Termolbil Negativa (incolora) Positiva (color amarillo)
Pseudomona Termorresistentes Positivo (color amarillo) Positivo (color amarillo)
Otro microorganismo Negativo (incolora) Negativo (incolora)

22- Prueba de solubilidad en la bilis:

Se usa para diferenciar entre el Streptococcu pneumoniae, Haemophilus influenzae, H.
aegyptius soluble en bilis y otras especies de Haemophilus y streptococcus alfa-hemoliticos
no solubles en bilis.

La prueba se realiza para controlar en un tiempo y a una temperatura especifica la

capacidad celular de un microorganismo de producir lisis en presencia de sales biliares
(desoxicolato de sodio o taurocolato de sodio son las ms utilizada por ser los cidos lticos
ms activos). Se utiliza el indicador rojo de metilo que en medio alcalino produce una
coloracin roja o rosada y en medio acido un color amarillo.

Interpretacin de resultados:

Cuando la solucin es clara o comienza aclarar significa que el microorganismo es soluble

en bilis, hay presencia de S. pneumoniae pero si la solucin se mantiene turbia igual que el
control la especie es alfa-Streptococcus u otro organismo.

23- Prueba de fermentacin de los hidratos de carbono:

Se realiza para determinar la capacidad de un organismo de degradar un hidrato de carbono
especifico incorporado a un medio bsico, produciendo acido o acido con gas visible.

Esta prueba se usa para las especies que fermentan glucosa como la Enterobacteriaceae y
para las que fermentan tanto glucosa como lactosa: Escherichia coli, Klebsiella y grupos
Enterobacter. Tambien a diferenciar entre los generos Listeria monocytogenes de especies
de Corynebacterium.

La fermentacin es un proceso metablico de oxidacin-reduccin anaerbico en el cual un

sustrato orgnico sirve como el aceptor de hidrogeno final (aceptor de electrones) en lugar
del oxgeno.

Algunas bacterias pueden fermentar anaerbicamente la glucosa, otras la oxidan y algunas

pueden metabolizarla por ambos mtodos, mientras que otras, aun, son incapaces de utilizar
la glucosa. No todos los monosacridos son degradados por todas las especies bacterianas;
sus formas de fermentacin difieren, ayudando a la identificacin del grupo, gnero o
especie.

Una bacteria puede utilizar diferente ciclos para formar acido pirvico y en el mismo
organismo puede ocurrir simultneamente ms de un ciclo. Pueden emplearse las pruebas
de fermentacin de los hidratos de carbono para determinar que productos terminales se
han formado, pero no los ciclos utilizados.

El indicador de pH que se utiliza para mostrar que un hidrato de carbono ha ido fermentado
es el rojo de fenol, ya que la mayora de los productos finales de metabolismo de los
carbohidratos son cidos orgnicos. Con el rojo de fenol el cambio de color se aproxima al
pH original del medio.

Interpretacin de resultados:

Positivo: Coloracin amarilla, acido (6,8), la produccin de gas es variable.

Negativa: Coloracin rosa-rojizo, alcalina.

24-Prueba del Malonato

Evala la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato como nica fuente de
carbono y la desaminacin de la fenilalanina, en forma combinada. Las Enterobacterias no
tienen la capacidad enzimtica de realizar las dos reacciones simultneamente, por lo que, o
se observa la utilizacin del malonato o la desaminacin de la lisina.

Interpretacin de resultados:

Un viraje de color verde al azul, da una reaccin positiva, de lo contrario es negativa

25-Prueba de la beta-galactosidasa (ONPG)

En esta prueba se determina la capacidad que presentan algunas bacterias, que poseen el
enzima beta - galactosidasa, para fermentar la lactosa originando glucosa y galactosa.
Para realizar la prueba se aade un sustrato artificial que al ser hidrolizado por la beta -
galactosidasa origina un compuesto de color amarillo.

Interpretacin de resultados:

Kleibsella = + (amarillo)
Proteus = - (transparente)
Para diferenciar a Neisseria lactmica de otras especies de Neisseria. Tambin permite
diferenciar a Enterobacterias como: E. coli, Kleibsella, Aerobacter y Enterobacter, que dan
la prueba positiva, de otras especias como Proteus, Salmonella, Shigella y Pseudomonas,
que la dan negativa.