Tema 7

El cultivo in vitro y la
Mejora de plantas

CULTIVO IN VITRO

INVESTIGACIN BSICA
SOBRE FISIOLOGA VEGETAL

INVESTIGACIN APLICADA
ORIENTADA A PRODUCCIN
Y MEJORA VEGETAL

-Cultivo de pices caulinares

-Cultivo de yemas axilares
-Morfognesis adventicia
-Semilla artificial
-Cultivo de meristemos
-Microinjerto

P
R
O
D
U
C
C
I
O
N

-Seleccin somaclonal

-Saneamiento del
material vegetal

-Obtencin de lneas puras

(diplo-haploides)

-Cultivo de anteras
-Cultivo de microsporas

-Polinizacin y fertilizacin in vitro

-Cultivo de embriones
-Hibridacin sexual
-Hibridacin somtica

-Reproduccin vegetativa

M
E
J
O
R
A

Aprovechamiento de la
variacin extraespecfica

Aprovechamiento de la variacin
somaclonal (intraespecfica)

METODOS PARA GENERAR VARIABILIDAD

1. Variacin somaclonal
2. Cruzamiento
Hibridacin sexual
Fertilizacin asistida
Rescate de embriones
Hibridacin somtica

METODOS PARA ACELERAR PROGRAMAS DE

MEJORA
3. Obtencin de dihaploides a partir de
microsporas y anteras

1. Variacin somaclonal

Definicin
Es la variacin gentica que surge como consecuencia
del cultivo in vitro y, ms concretamente, de los
procesos de regeneracin por va indirecta, es decir,
los que implican una fase de callo ms o menos larga.

Se describe por vez primera en la caa de azcar y la

patata (vegetativas) y actualmente tambin en cereales
(trigo, maz, avena y arroz) y dicotiledneas (tabaco,
tomate, zanahorias, apio, leguminosas
y plantas
ornamentales como Petunia y Pelargonium).

Causas de la variacin somaclonal

Variacin somaclonal debida al explante
-Variacin preexistente en el explante de partida (mixoploida)
-Quimieras naturales: plantas que contienen sectores que
proceden de capas meristemticas con distinta constitucin
gnica
-Existencia de mutaciones somticas en los explantes de partida
Variacin somaclonal a lo largo del cultivo
-Debida al estrs que representa el cultivo in vitro
-cambios en el metabolismo (produccin de sustancias
mutagnicas)
-aceleracin de los procesos de replicacin
-anormal duplicacin de los bloques de heterocromatina
-alteracin de los planos de divisin celular
-cambios gnicos: mutaciones puntuales, cambios
estructurales y numricos)
-cambios en el genoma del cloroplasto y de la mitocondria
-cambios epigenticos

Genotipo
-diferencias a nivel de especie e incluso variedad, cultivar o
lnea
Nivel de ploida
> vs en poliploides
Va de regeneracin
-embriognesis < organognesis???

Formacin de callo, periodo de cultivo y nmero de subcultivos

-el crecimiento desorganizado en el callo genera desrdenes
metablicos y cromosmicos, que se traducen en variacin

Medio de cultivo
-auxinas: aumento de la frecuencia de metilCitosina
-deficiencia de oxgeno
-excesos o deficiencias en minerales

Niveles de deteccin de la VS
DETECTAR para:
seleccionar caracteres de inters
Abordar estudios bsicos acerca de la
variacin y el posible control
CMO?
Usando Marcadores

Tipos de marcadores
Marcadores morfolgicos
Marcadores fisiolgicos
Resistencia a enfermedades
Tolerancia a herbicidas
Tolerancia a salinidad o pH extremos

Estudio del cariotipo:

Cambios en nmero y estructura del cromosoma

Translocaciones
Inversiones
Deleciones
Duplicaciones
Otras tcnicas: Bandeo cromosmico, Hibridacin in situ

Tipos de marcadores

Bioqumicos
Sistemas isoenzimticos
Son productos de genes (alelos) expresados
cuya regulacin puede estar afectada por
factores ambientales o fisiolgicos
Slo se transcribe y traduce una pequea
proporcin del genoma

Tipos de marcadores
Moleculares
Secuencia de ADN semejante en todas las
clulas, independientemente del estado
fisiolgico o de desarrollo de las mismas
RAPD
AFLP
Microsatlites

Aplicacin de VS en Mejora
Ventajas
Rapidez
Econmica
Altas tasas de mutacin
Menor nmero de cambios no deseados
xito para eliminar uno o pocos caracteres
en cultivares bien adaptados
til con especies de propagacin sexual y
asexual

Aplicacin de VS en Mejora
Desventajas
Variantes sin inters prctico
Prdida de capacidad morfognica
Inestabilidad
de
los
somaclones,
especialmente
los
originados
por
variacin epigentica
Presencia de alteraciones no deseables
como esterilidad, aneuploidas
No se tiene control del tipo de variacin ni
de los factores

NO INTERESA VS
PROPAGACIN CLONAL Y SANEAMIENTO
ESPECIES DE COSECHA Y CICLO LARGO
SEMILLA ARTIFICIAL
CONSERVACIN DE GERMOPLASMA
OBTENCIN DE DIHAPLOIDES
TRANSFORMACIN GNICA

Requisitos de una VS desde un p.v.

productivo y comercial

Involucrar caracteres agronmicos tiles

Nivel de expresin del carcter superior
al de sus progenitores
El carcter mejorado debe estar
combinado con el resto de caracteres
agronmicos importantes para el cultivo
Variacin heredable

Seleccin de variantes tiles

-Seleccin celular
imponiendo presin selectiva en el cultivo
celular
-Seleccin somaclonal
identificando los genotipos deseables a
nivel de planta

Corolario

De todo lo dicho, se deduce que el

cultivo in vitro acta como un simple
amplificador del suceso mutacional ya
que, por un lado se aprovechan las
mutaciones preexistentes en los
materiales de partida, as como las que
aparecen de novo a lo largo del cultivo
celular.

2. Cruzamiento

CRUZAMIENTO=INCORPORACIN DE GENES

MEJORA CLASICA

CULTIVO IN VITRO

Via sexual
Va asexual

HIBRIDACIN SEXUAL
HIBRIDACIN SOMATICA

Hibridacin sexual
-Fertilizacin in vitro
-Rescate de embriones

La hibridacin sexual concentra en un individuo caracteres

distribuidos entre miembros diferentes de una especie o de diferentes
especies.
La fertilizacin implica la germinacin del grano de polen sobre el
estigma, su avance por el estilo hasta llegar al vulo, descargando dos
espermtidas para formar zigoto y endospemo. Es un proceso
controlado.
BARRERAS A LA FERTILIZACIN EN LA HIBRIDACIN SEXUAL
A. Pre-fertilizacin
Incapacidad del polen a germinar sobre
estigma extrao
Fallo del tubo polnico para alcanzar el
vulo
Estilo muy largo
Crecimiento del tubo lento
Aborto del tubo polnico dentro del estilo

FERTILIZACION IN VITRO

B. Post-fertilizacin
El embrin no alcanza la
madurez

RESCATE DE EMBRIONES

1. Fertilizacin in vitro
La doble fertilizacin en plantas superiores es un proceso muy
complejo en comparacin con lo que ocurre en el resto de los seres
vivos y ha siso muy complicado realizarlo in vitro.

La fertilizacin ASISTIDA implica la polinizacin controlada y

artificial de la hembra con el polen de un macho seleccionado.

POLINIZACION IN VITRO (Test-tube fertilization):

- ESTIGMTICA (se aplica el polen al estigma)
- PLACENTAL (se aplica el polen al vulo ligado a la placenta)
- OVULAR (se aplica el polen al vulo aislado)

1. Fertilizacin in vitro
Para lograr el xito se deben precisar:
a) Los tiempos de antesis, dehiscencia de anteras y
polinizacin
b) Receptividad del estigma
c) El momento adecuado para la polinizacin
d) El tiempo adecuado para recoger el polen

2. Cultivo de vulos completo y

Rescate de embriones

El rescate de embriones consiste en aislar los

embriones de los vulos de una planta y cultivarlos
en un medio estril que contenga los nutrientes
esenciales que les permita concluir su desarrollo
normal y germinar.
Relativamente fcil con embriones maduros

2. Rescate de embriones
-Sortear barreras de autoincompatibilidad
-Rescate de embriones abortivos derivados de la hibridacin
interespecfica o intergenrica debido a incompatibilildad con
el endosperma
-Superar problemas de abscisin precoz del fruto
-Recuperar embriones de cruzas interespecficas que
conducen a la obtencin de haploides
-Acortar el periodo de dormicin
-Fallos en el endosperma
-Especies leosas que tienen dificultad en la germinacin de
sus semillas o escasa produccin de semillas
-La posibilidad de cultivar embriones ex-vulo proporcion
una excelente oportunidad para llevar a cabo estudios de
nutricin y de la capacidad de regeneracin de las partes del
embrin.

Influencia del medio de cultivo

-Cambio de heterotrofa a autotrofa
-Importancia de la fuente de carbono como nutriente
y como osmtico (el embrin in situ est rodeado
de un fluido de alta osmolaridad). A medida que
desarrolla el embrin necesita medios con
progresivas disminuciones en los niveles de
sacarosa

Problemas
-Germinacin precoz
Formacin de la plntula sin haber completado el
desarrollo embriognico normal.

Hibridacin somtica
-Fusin de protoplastos

Introduccin. La transferencia de material

gentico entre individuos se logra por
cruzamiento. El cultivo de protoplastos abre una
nueva va a la introduccin en una clula vegetal
de nuevo material gentico, lo que unido a su
capacidad de regeneracin de planta completa,
es considerado un mtodo til en mejora.
Protoplasto=Una
clula
vegetal
desnuda,
rodeada
por
la
membrana
plasmtica,
potencialmente capaz de regenerar la pared
celular, crecer y dividirse.
Historia. Cocking (1969) aisla protoplastos en
grandes cantidades por mtodos enzimticos.
Explante=Normalmente, se usan clulas del
mesfilo de hojas jvenes totalmente expandidas
Enzimas fngicas
-Actividad celulasa, pectinasa y hemicelulasas

Protocolo del cultivo de protoplastos

1. Obtencin, preparacin y desinfeccin del material vegetal
2. Eliminacin de la pared celular mediante enzimas lticos en una
solucin con potencial osmtico ligeramente hipertnico (0,30,8 M) para evitar la lisis del protoplasto y sales de CaCl2 que
incrementan la estabilidad de la membrana.

3. Eliminacin del material sin digerir, lavado de enzimas y

purificacin en un gradiente de densidad.

4. Cultivo en un medio adecuado para promover la divisin celular

REGENERACIN DE LA PLANTA

Factores que inciden en el cultivo de protoplastos

Naturaleza del material de partida
Hojas de tejidos jvenes y cutcula fina, verdes.
Estado metablico y de diferenciacin
-Tejido de reserva-latente
-Hojas de mesfilo-fotosntesis
-Suspensiones celulares-divisin activa

Medio de cultivo
A definir para cada especie e incluso para distintos explantes
Concentracin de osmtico que forme una solucin levemente hipertnica,
que favorezca la plasmolisis o separacin del protoplasto de la pared
celular, (y evite que exploten) y que luego ira decreciendo gradualmente.

La eficacia de placa
proporcin de protops. que se dividen; depende de la densidad del cultivo
(104-5x105 ml-1).

Fusin de protoplastos
Los protoplastos, al estar desprovistos de la pared celular, son aptos
para varias tcnicas de manipulacin gentica, entre ellas la fusin de
diferentes tipos de protoplastos. Especialmente importante en cultivos
donde la reproduccin sexual sea dbil o ausente: caa de azcar,
patata, banana, etc.

HETEROCARIONTE

CIBRIDOS

HIBRIDO

HIBRIDOS PARCIALES

Mecanismos de fusin
Mtodos qumicos
-sales tipo nitrato sdico
-compuestos de alto peso molecular
polietilenglicol
-en presencia de Ca++ y pH (8-10)

tipo

Electrofusin
-dielectroforesis: los protoplastos se comportan
como dipolos
-alineamiento (collar de perlas)
-pulsos cortos de corriente que rompen las
membranas, formando poros
-las membranas en contacto se fusionan

Identificacin de hbridos somticos

1. Marcadores morfofisiolgicos
En ciertos casos es posible diferenciar los callos hbridos de los
parentales
2. Seleccin por complementacin (lneas resistentes a herbicidas o
antibiticos).
el mutante A crece en el medio A (agente selectivo A)
el mutante B crece en el medio B (agente selectivo B)
los hbridos A+B crecern en el medio A+B

3. Citofluorgrafo.
-Se marcan las poblaciones de clulas con diferentes marcadores
fluorescentes (fluorescena y rodamina)

4. Pruebas moleculares
-anlisis de isoenzimas
-anlisis de DNA nuclear
-anlisis de DNA mitocondrial

Aplicaciones de la fusin de protoplastos

INTRODUCCIN DE GERMOPLASMA DE
CULTIVOS AGRCOLAS DE CARACTERES
CON UTILIDAD AGRONMICA, PRESENTES
EN ESPECIES SALVAJES QUE SON
SEXUALMENTE INCOMPATIBLES

3. Obtencin de
dihaploides

Definicin
Haploide
Individuo que posee la mitad del
nmero
cromosmico
normal
contenido en las clulas somticas de
la especie

Identificacin de haploides
Morfologa
suelen ser plantas ms pequeas

Poliembrionia
La presencia de poliembrionia facilita la deteccin de
embriones haploides

Genes marcadores
Cualquier par de alelos cuyos fenotipos dominante y
recesivo sean fcilmente distinguibles y posean
manifestaciones fenotpicas claras en semilla o en plntula
y as hacer una seleccin ms econmica en tiempo y
esfuerzo.

Antecedentes
Se conocen desde 1922, cuando se observ la
produccin espontnea de los mismos. Actualmente,
hay ms de cien especies vegetales capaces de
producirlos in vivo si bien la frecuencia es muy baja
(0,001-0,01%)
Guha & Maheswari (1964,1966) Cultivo de anteras en
Datura innoxia in vitro. Frecuencia de induccin del
100% y un rendimiento de ms de 100o plntulas por
antera en condiciones ptimas.

Ventajas del uso de haploides en Mejora

Los consumidores quieren el esprrago macho

Planta dioica: XX-XY: 50% XY

Obtencin de haploides
Ginognesis
Desarrollo de un gameto femenino no fecundado

Andrognesis
Cultivo de anteras
Cultivo de microsporas

A partir de alguna clula haploide del saco

embrionario
distinta
del
gameto
femenino
(sinrgidas o antpodas)
Cruzamientos interespecficos o intergenricos con
eliminacin cromosmica
El cigoto diploide pierde cromosomas en las sucesivas
mitisis

Cultivo de anteras

Se cultivan anteras inmaduras en un medio de induccin donde las

micrsporas competentes originarn callos, que sern transferidos
a un medio apropiado para la regeneracin de plantas
Factores que influyen:
Genotipo
% albinismo
Condiciones de crecimiento de las plantas donantes
Anteras de las primeras floraciones

Estado de desarrollo de las microsporas

Microspora uninucleada

Pretratamientos
Bajas temperaturas, calor, choque osmtico

Composicin del medio de cultivo

Medios de induccin y de regeneracin

Condiciones de incubacin

Protocolo de obtencin de haploides

Eliminacin de yemas florales (Brassicas) o espigas (cebada) en la

etapa seminucleada, es decir, antes de la divisin de la microspora
para formar los ncleos vegetativo y generativo. Se supone que estn
en condiciones aspticas.
Pretratamiento de las flores o espigas como permanecer 4-28 das a 415 C en oscuridad.
Se cortan las anteras, se cultivan en un medio con niveles elevados de
fuente de carbono y aditivos como aminocidos, reguladores del
crecimiento inductores de embriognesis (2, 4 D) y carbn activo
(absorbe sustancias inhibidoras)
Al cabo de 4-8- semanas, las microsporas se dividen dando callo o
directamente embriones somticos.
Germinacin para dar un haploide

Inconvenientes
Alto nivel de manejo y experiencia
Elevada incidencia de albinismo, especialmente en cereales

Protocolo de obtencin de dihaploides

Duplicacin cromosmica
La planta haploide, sin duplicar, es estril por lo que
no podra producir semillas
Duplicacin espontnea
Sustancias qumicas
Colchicina, entre otras

Puede aplicarse a plntulas, plantas adultas, semillas,

microsporas y anteras
Tratamiento
Sumergir las races en una solucin acuosa

Microinyeccin
Tratamiento de callos con colchicina antes de ponerlos en el
medio de regeneracin
Cultivo de micrsporas y anteras en medio de induccin con el
agente duplicador

Produccin de haploides por hibridacin distante

Hordeum vulgare
2n=14
VV

Hordeum bulbosum
2n=14
BB

VxB Zygoto

V Zygoto

Rescate de
embriones

Cultivo

Duplicacin
cromosomas

Homozigoto
frtil

GRACIAS POR SU ATENCIN