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LABORATORIO DE ANLISIS DE ALIMENTOS

PRCTICA # 8
TCNICAS ANALTICAS PARA LA CUANTIFICACIN
DE COMPONENTES QUMICOS DE FRUTAS Y HORTALIZAS
DETERMINACIN DE AZCARES
INTRODUCCIN
En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los
componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azcares, almidones,
celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas.
Los azcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan
especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y
se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los
polisacridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de
desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia,
textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos
de calidad los carbohidratos desempean un papel relevante, por ejemplo, el
sabor est dado bsicamente por un balance entre azcares y cidos orgnicos.
El sabor caracterstico de y diferente de las frutas se debe a la gran variacin en
composicin y concentracin de los azcares; el color atractivo se debe
principalmente a los glucsidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza est
determinada por los polisacridos estructurales.
Es importante sealar que las proporciones de los diversos carbohidratos
existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia
de la actividad metablica, ya que durante la maduracin se producen cambios
intensos en donde los azcares son los sustratos preferidos para la biosntesis y
suministro de energa pues son oxidados (va gluclisis) hasta cido pirvico, el
cual a su vez, por descarboxilacin oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se
metaboliza, va ciclo de Krebs, dando lugar a la formacin de CO 2, H2O y
ENERGA la cual queda disponible para la biosntesis de otros componentes (otros
azcares, cidos orgnicos, cido ascrbico, protenas, nucletidos azucarados,

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glucsidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de azcares aumenta

casi

invariablemente

bsicamente

por

hidrlisis

que

experimentan

los

polisacridos, aunque algunos azcares sean utilizados como sustratos para la

actividad respiratoria.
Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios
mtodos para su determinacin:

Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon,

Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio:

Todos los azcares con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se
clasifican como azcares reductores y se transforman fcilmente en enedioles
(reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son
altamente reactivos y se oxidan fcilmente en presencia de oxgeno u otros
agentes oxidantes, por lo tanto, los azcares en solucin alcalina rpidamente
reducen iones oxidantes como Ag +, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azcares se oxidan
formando mezclas complejas de cidos. Esta accin reductora es la que se utiliza
tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.
Una de las tcnicas analticas ms potentes consiste en determinar la
cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiacin absorbida
por la misma. Esta tcnica se llama Espectrofotometra. Se puede utilizar el
espectrofotmetro para determinar la longitud de onda de la radiacin necesaria
para las determinaciones de la cantidad de azcar en las muestras bajo estudio,
comparndola despus con la radiacin absorbida por un blanco.

La regla

especfica que relaciona la cantidad de radiacin absorbida por una substancia

con la concentracin de esa misma substancia se llama Ley de Beer y se puede
establecer como sigue:
Log Io = abc
I
En donde:
Io = Radiacin incidente o radiacin transmitida por el blanco.
I = Radiacin transmitida por la muestra.
Log Io = absorbancia de la muestra

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I
En donde:
a = coeficiente de absorbancia (absortividad) las unidades dependen de las
unidades utilizadas para la determinacin de la concentracin.
b = longitud de la celda usualmente en centmetros.
c = concentracin de la muestra en las unidades apropiadas.
I
En esta prctica se emplear la tcnica colorimtrica de Nelson y Ting para
determinar glucosa, fructosa y sacarosa.
OBJETIVOS
El estudiante explicar por escrito el fundamento del mtodo empleado para
la determinacin de azcares en las muestras de frutas que se le asignarn.
El estudiante relacionar los contenidos de azcares determinados en las
muestras de diversos frutos.
El estudiante se concientizar del concepto y los instrumentos de medicin
utilizados en la espectrofotometra, y de la aplicacin de curvas estndar utilizando
el mtodo de Nelson y Ting.
MATERIAL
6 matraces volumtricos de 100 ml con tapn.
2 matraces volumtricos de 500 ml con tapn.
2 matraces volumtricos de 250 ml con tapn.
1 embudo de vidrio.
2 matraces Erlenmeyer de 125 ml.
6 pipetas de 10 ml.
2 pipetas de 1 ml.
2 pipetas de 5 ml.
2 vasos de precipitados de 250 ml.
1 bao Mara simple.
5 celdas de espectrofotmetro.
1 gradilla.
2 crculos de 10 cm de dimetro de papel filtro Whatman # 1.
Papel sanitario blanco (proporcionado por el estudiante).
Algodn o gasa .
1 cuchillo de cocina (proporcionado por el estudiante).
1 tabla para cortar la fruta (proporcionada por el estudiante).
Fruta: 3 ejemplares por especie por equipo. En el caso del meln con 1
ejemplar basta (proporcionados por el estudiante).

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EQUIPO:
1 extractor de jugos.
1 licuadora o mortero.
1 potencimetro.
1 bao Mara con control de temperatura y agitacin.
1 espectrofotmetro Spectronic 20' a 515 nm.
REACTIVOS
Solucin alcalina de Ferricianuro.
Solucin de Arsenomolibdato (25 g).
H2SO4 2N.
NaOH 10N, 1N y 0.1N.
HCl 1:1 (Vol/Vol).
Na2CO3 anhidro. (12.5 g)
Na2CO3 monohidratado. (14.3 g).
Tartrato de potasio (12.3 g).
NaHCO3 (10 g).
Na2SO4 anhidro disuelto en 35 ml de agua destilada.
CuSO4 5H2O disuelto en 50 ml. de H2O.
Glucosa (300 g/ml).
MTODO
PREPARACIN DE REACTIVOS
Reactivo de Nelson A.- Disuelva 12.5 g Na2CO3 anhidro ( 14.3 g Na2CO3
H2O), 12.3 g de tartrato de potasio, 10 g de NaHCO 3 y 100 g de Na2SO4 anhidro
en 350 ml de H2O y afore a 500 ml.
Reactivo de Nelson B.- Disuelva 7.5 g de CuSO4 5H2O en 50 ml. de H2O
y aada una gota de H2SO4.
Reactivo Alcalino de Nelson.- Mezcle 25 ml del reactivo de Nelson A +
1.0 ml. del reactivo de Nelson B.
Curva de la Glucosa.- Elaborar una solucin stock de glucosa en agua
que contenga 300 g/ml. Preparar una serie de diluciones desde 300 hasta 30
g/ml.
Reactivo de Arsenomolibdato.- Disuelva 25 g de (NH4)6Mo7O24 4H2O
(molibdato de amonio tetrahidratado) en 450 ml. de agua destilada.

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PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES

TOTALES
Prepare una serie de diluciones a partir de la solucin stock de glucosa.
Las concentraciones debern ser de 300, 150, 75 y 30 g/ml. Utilice matraces
volumtricos aforados con tapn y mrquelos con la concentracin
correspondiente.
1. Pipetee 1 ml. de cada solucin estndar de glucosa y agua destilada como
blanco en tubos de ensayo con capacidad de 25 ml. aforados.
2. Aada 1 ml. de reactivo alcalino de Nelson.
3. Mezcle. Colque los tubos en un bao de agua hirviendo durante 20 minutos y
enfrelos al chorro de agua fra.
4. Aada 1 ml. de arsenomolibdato.
5. Mezcle bien por un perodode 5 min. (para disolver el Cu 2O para reducir el
aresnomolibdato).
6. Afore a 25 ml. con agua destilada y mezcle.
7. Lea la absorbancia a 520 nm.
Grafque la absorbancia contra la concentracin (g/g). Utilice esta curva
estndar para determinar la concentracin de glucosa en las muestras de
frutas.
PREPARACIN DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIN DE
AZCARES REDUCORES TOTALES
1.- Extraiga el jugo de la fruta asignada mediante un extractor de jugos.
2.- Diluya el jugo de la muestra con agua destilada (1:49).
3.- Colque 5 ml. del jugo diluido en un matraz volumtrico de 250 ml. y afore con
agua destilada.
DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES TOTALES
1.- Transfiera 1 ml. del jugo diluido a un matraz volumtrico aforado de 100ml. y
aada 5 ml. de reactivo de ferricianuro.
2.- Colque los matraces en un bao de agua hirviendo por 10 minutos.
3.- Enfre los matraces inmediatamente bajo el chorro de agua fra.
4.- Neutralice el contenido de los matraces con 10 ml. de solucin de cido
sulfrico 2N.
5.- Mezcle los contenidos de los matraces suavemente hasta que no emanen ms
gases.
6.- Aada 4 ml. de arsenomolibdato.
7.- Mezcle una vez ms el contenido de los matraces.
8.- Afore a 100 ml. con agua destilada.

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9.- Tome una celda del espectrofotmetro y transfiera ah el contenido de cada

matraz (uno por celda).
10.- Efecte la lectura en el espectrofotmetro a 520 nm. El blanco constar de
todos los reactivos antes mencionados, excepto la muestra de jugo de fruta bajo
estudio. No olvide ajustar el espectrofotmetro con agua destilada al principio.
CLCULOS:
A partir de la curva estndar se calcula el valor k para la determinacin de
azcares reductores totales mediante la siguiente frmula:
k = c/a
En donde:
k = El factor por unidad de absorbancia o pendiente de la curva.
c = Concentracin de azcares reductores en gramos/100 ml.
a = Absorbancia de la solucin a esa concentracin.
Los valores k a diferentes concentraciones de azcar se promedian y se
designan como K. El contenido total de azcares reductores, S, de la muestra se
calcula de la frmula:
S = K.A.D.
En donde:
S = Concentracin total de azcares reductores de la muestra en
gramos/100 ml de jugo.
K = Pendiente promedio de la curva.
D = Factor de dilucin.
DETERMINACIN DE FRUCTOSA
NOTA: Esta determinacin no se realizar en esta sesin de laboratorio).
Al calentar una mezcla de glucosa y fructosa a cierta temperatura - eg.,
55C - con el reactivo alcalino de ferricianuro, la velocidad de oxidacin de la
glucosa es considerablemente menor que la de fructosa. El resultado obtenido es
conocido como fructosa aparente. sta es ligeramente ms alta que el contenido
real de fructosa en la muestra, la cual puede ser calculada usando las frmulas
adecuadas. El procedimiento para la determinacin de esta fructosa aparente es
el mismo que para el clculo de los azcares reductores totales, excepto que se
cambia la temperatura y el perodo de calentamiento a 55C por 30 minutos.
Los valores de Kf y Kg de fructosa y glucosa respectivamente, oxidados a
55C se obtienen a partir de las curvas estndar de estos dos azcares, de la
forma descrita para K. La proporcin de Kg a Kf Q se utiliza para el clculo real
de glucosa y fructosa de la muestra con las siguientes ecuaciones simultneas:

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G+F=S
G/Q + F = L
En donde:
G = Porcentaje de glucosa en la muestra.
F = Porcentaje de fructosa en la muestra.
S = Porcentaje de azcares reductores totales (Suma de G y F).
L = Porcentaje aparente de fructosa.
Q = Proporcin entre Kg y Kf (Kg/Kf)
En una mezcla de glucosa y fructosa se asume que ambos azcares
presentes son fructosa. La fructosa aparente L se calcula a partir de la frmula S
= K.A.D., sustituyendo L por S y K f por K. Se obtiene la siguiente frmula para el
porcentaje de glucosa en la muestra:
G = (S - L) X Q
Q-1
El cociente q/(Q-1), se utiliza como una constante en los clculos del valor
real de la glucosa. El valor real de la fructosa se obtiene por diferencia.
DETERMINACIN DE AZCARES TOTALES Y SACAROSA
Nota: Esta determinacin no se llevar a cabo en esta sesin de laboratorio)
La sacarosa de la muestra es invertida con el cido clorhdrico.
procedimiento se describe a continuacin:

El

1.- Se colocan 50ml. del jugo diluido en un vaso de precipitados de 150 ml. y se
aaden 10 ml. de cido clorhdrico (1:1).
2.- Se deja reposar esta mezcla durante 18 horas a temperatura ambiental.
3.- Se aaden 5 ml. de solucin de hidrxido de sodio 10N y los contenidos se
ajustan a un pH de entre 5 y 7 con una solucin de hidrxido de sodio 1N
mediante el uso de un potencimetro.
4.- Los contenidos se transfieren a un matraz volumtrico aforado de 100ml y se
afora con agua destilada.
5.- Se toma una alcuota de 1 ml de esta solucin y se pipetea en un matraz
volumtrico de 100 ml. y se sigue el procedimiento descrito para la determinacin
de azcares reductores totales.
6.- Se calcula la cantidad de sacarosa de la diferencia entre el contenido de
azcares reductores antes y despus de la inversin, multiplicada por el factor de
0.95.

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Elabore un reporte comparando los diversos valores obtenidos para cada

especie de futas estudiadas en la sesin de laboratorio.
CUESTIONARIO:
1.- Por qu la sacarosa no se considera como un azcar reductor?
2.- Para qu se utiliza el cobre en el reactivo de Nelson?
BIBLIOGRAFIA:
A.O.A.C. Official Methods of Analysis. 1980.
Washington, U.S.A.

Horwitz W. (ed). Ed. 13 th.

Ting, S.V. 1956.

Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous
Determination of Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. Agric. Food
Chem. Vol. 4(3) 263-266.