Tesis Santos Ruiz, 2015 Funcio Ü Mitocondrial Hepatocitos

ESTUDIO COMPARATIVO DE LA
FUNCIN MITOCONDRIAL, COMO

MECANISMO DE DAO HEPTICO,
EN RATONES CON DEFICIENCIA
PARCIAL DE INSULIN-LIKE
GROWTH FACTOR-1 (IGF-1).
EFECTO HEPATOPROTECTOR DE
LA TERAPIA SUSTITUTIVA.
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MDICAS BSICAS.

SECCIN DE FISIOLOGA.
UNIVERSIDAD SAN PABLO CEU.
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA
FUNCIN MITOCONDRIAL COMO
MECANISMO DE DAO HEPTICO EN
RATONES CON DEFICIENCIA DE
INSULIN GROWTH FACTOR-1 (IGF-1).
EFECTO HEPATOPROTECTOR DE LA
TERAPIA SUSTITUTIVA.
Memoria que presenta para optar al grado de Doctor la licenciada:
Mara Olleros Santos-Ruiz
Licenciada en Farmacia.
Directora:
Dra. Inma Castilla de Cortzar Larrea.
Dra. en Medicina y Ciruga.
Catedrtica de Fisiologa.
Codirectora:
Dra. Mara Cruz Sdaba Argaiz.
Dra. en Ciencias Biolgicas.
Profesora de Fisiologa.
Lugar de realizacin.
Universidad San Pablo CEU
Inma Castilla de Cortzar Larrea, Dra. en Medicina, Catedrtico de Fisiologa

Mdica como directora y Mara Cruz Sdaba Argiz, Dra. en Biologa, profesora
de fisiologa de la Facultad de Medicina de la Universidad CEU-San Pablo de
Madrid como codirectora del presente trabajo,
CERTIFICAN:
Que la memoria presentada por Da. Mara Olleros Santos-Ruiz con el
ttulo: Estudio comparativo de la funcin mitocondrial como mecanismo de
dao heptico en ratones con deficiencia de insulin growth factor-1 (IGF-1).
Efecto hepatoprotector de la terapia sustitutiva, rene los requisitos
requeridos para ser presentada y juzgada por el Tribunal correspondiente para
optar al Grado de Doctor.
En Madrid a 23 de Junio de dos mil quince
Fdo. Dra. Inma Castilla de Cortazar Larrea

Argaiz.
Fdo. Dra. Mara Cruz Sdaba
A Juan.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad CEU San Pablo por haber permitido que desarrollara este trabajo.
A la directora de esta Tesis Doctoral, la Dra. Inma Castilla de Cortzar Larrea, por su
direccin en la realizacin de esta Tesis y haber demostrado su confianza en m.
A la Codirectora de la misma, la Dra. M Cruz Sbada Argiz, por la magistral direccin
en el trabajo diario, su infinita ayuda y paciencia, todo un ejemplo.
A mis compaeras de trabajo, Irene, Elena, Cristina y Susana, por todas las horas y
largos das que hemos compartido en el laboratorio.
A mis compaeros de Docencia, Dra. Esther Escudero, Dra. M Jos Borrego, Dra.
rsula Muoz, Dr. Juan Enrique Puche, Dra. Isabel Snchez Vera, Dra. Rima Barhoum,
Dra. Corona Rodrguez por apoyarme desde los primeros momentos en el desarrollo de
la Tesis.
A Juan, porque este camino no hubiera sido posible sin su apoyo y su paciencia.
A mis padres y mi hermana Ana, que me han animado en todo momento y les debo la
persona que soy.
A lo que est en camino y los que vendrn.
A mi abuelo ngel, por su ejemplo de constancia diaria y humidad en el trabajo, que
desarroll tanto en campo de la investigacin como en la docencia.
INDICE GENERAL
INTRODUCCIN
21
1.1. LA MITOCONDRIA
22
1.2. ESTRUCTURA MITOCONDRIAL
23
1.2.1. MEMBRANA EXTERNA.
24
1.2.2. ESPACIO INTERMEMBRANA.
24
1.2.3. MEMBRANA INTERNA.
25
1.2.4. PROTENAS TRANSPORTADORAS MITOCONDRIALES.
26
1.2.5. CADENA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES Y COMPLEJO ATP SINTASA.
28
1.3. FOSFORILACIN OXIDATIVA.
32
1.3.1. FOSFORILACIN OXIDATIVA Y CONSUMO DE OXGENO
34
1.3.2. FOSFORILACIN OXIDATIVA Y POTENCIAL DE MEMBRANA.
36
1.4. MITOCONDRIA Y ESTRES OXIDATIVO.
39
1.5. INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR 1 (IGF-1) O FACTOR DE CRECIMIENTO TISULAR 1.
42
1.5.1. ESTRUCTURA Y EXPRESIN GNICA DE IGF-1.
42
1.5.2 REGULACIN DE LA PRODUCCIN DE IGF-1.
45
1.5.3. PROTENAS TRANSPORTADORAS DE IGF-1 (IGFBPS).
47
1.5.4. RECEPTORES DE MEMBRANA Y VAS DE SEALIZACIN.
48
1.5.5. FUNCIONES FISIOLGICAS DE IGF-1.
49
1.5.5.1. Crecimiento y desarrollo corporales.
49
1.5.5.2. Funciones metablicas de IGF-1.
51
1.5.5.3. Modulacin inmunolgica.
51
1.5.5.4. Desarrollo del Sistema Nervioso Central (SNC).
52
1.5.5.5. Desarrollo y proteccin cardiovascular.
52
1.5.5.6. Gametognesis
53
1.5.5.7. Desarrollo y funcin renales.
53
1.6. CONDICIONES DE DEFICIENCIA DE IGF-1.
54
1.6.1. SNDROME DE LARON (SL).
54
1.6.2. ENFERMEDAD HEPTICA CRNICA.
56
1.6.3. ENVEJECIMIENTO Y ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA EDAD.
58
HIPTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS
61
2.1. ANTECEDENTES E HIPTESIS DE TRABAJO
62
2.2. OBJETIVOS
62
MATERIALES Y MTODOS
64
3.1. MATERIALES, ANIMALES DE EXPERIMENTACIN Y MUESTRAS BIOLGICAS.
65
3.1.1. MATERIALES.
65
3.1.1.1. Obtencin de muestras biolgicas tisulares.
65
3.1.1.2. Extraccin de muestras de sangre
65
3.1.1.3. Genotipado de ratones.
65
3.1.1.4. Tratamiento de ratones con la solucin correspondiente.
66
3.1.1.5. Determinaciones analticas.
66
3.1.1.6. Cuantificacin de IGF-1
66
3.1.1.7. Reactivos y soluciones a varias tcnicas.
66
3.1.1.8. Aislamiento de mitocondrias.
67
3.1.1.9. Determinacin de la concentracin de mitocondrias
67
3.1.1.10. Determinacin del potencial de membrana, produccin de radicales libres y

estudio del proton leak mediante citometra de flujo
67
3.1.1.11. Cuantificacin del consumo de oxgeno mediante electrodo de Clark.
68
3.1.1.12. Cuantificacin de oxidacin lipdica mediante la determinacin

Malndialdehdo (MDA).
69
3.1.1.13. Cuantificacin de los niveles de Protein Carbonyl Content (PCC)
69
3.1.1.14. Determinacin de la actividad de la enzima Catalasa
70
3.1.1.15. Determinacin de la actividad de la enzima Superxido Dismutasa
70
3.1.1.16. Determinacin de la actividad de la enzima Glutation Peroxidasa
70
3.1.1.17. Estudios histolgicos.
70
3.1.1.18. Genmica
71
3.1.1.19. Aparataje usado comnmente en diversas tcnicas como: cuantificacin

proteica, determinaciones colorimtricas, homogeneizacin de muestras, separacin de
fracciones, agitacin, incubacin y medicin de pH.
3.1.2. ANIMALES DE EXPERIMENTACIN.
72
72
3.1.2.1. Procedencia y Generalidades
72
3.1.2.2. Obtencin de las colonias
74
3.1.2.3. Diseo y procedimiento experimental.
75
3.1.3. MUESTRAS BIOLGICAS.
76
3.1.3.1. Obtencin de muestra de cola de ratn.
76
3.1.3.2. Obtencin de suero sanguneo.
76
3.1.3.3. Obtencin de muestras tisulares.
77
3.2. MTODOS.
3.2.1. CARACTERIZACIN DEL GENOTIPO DE LOS ANIMALES.
78
78
3.2.1.2. Obtencin de ADN genmico a partir de muestras de cola de ratn.
78
3.2.1.3. Genotipado de los ratones mediante PCR convencional.
78
3.2.2. DETERMINACIONES ANALTICAS EN MUESTRAS PROCEDENTES DE SUERO DE RATN.
80
3.2.2.1. Cuantificacin de Glucosa.
80
3.2.2.2. Triglicridos.
81
3.2.2.3. Albmina.
81
3.2.2.4. Colesterol.
81
3.2.3. DETERMINACIN DE LAS CONCENTRACIONES CIRCULANTES DE IGF-1.
82
3.2.4. AISLAMIENTO DE LAS MITOCONDRIAS.
82
3.2.5. DETERMINACIN DE LA DENSIDAD DE MITOCONDRIAS AISLADAS A PARTIR DE

TEJIDO HEPTICO FRESCO.
83
3.2.6. ESTUDIO DE LA FUNCIN MITOCONDRIAL MEDIANTE CITOMETRA DE FLUJO.
84
3.2.6.1. Caracterizacin de la poblacin mitocondrial.
84
3.2.6.1. Determinacin del potencial mitocondrial mediante citometra de flujo.
85
3.2.7. ESTUDIO DEL CONSUMO DE OXGENO POR MITOCONDRIAS AISLADAS DE TEJIDO

HEPTICO.
88
3.2.8. MEDIDA DE LA RELACIN ENTRE EL CONSUMO DE OXGENO Y EL POTENCIAL DE

MEMBRANA MITOCONDRIAL: CUANTIFICACIN DE LA FUGA DE PROTONES (PROTON
LEAK).
90
3.2.8.1. Determinacin del consumo de oxgeno en el Estado II en presencia de

competidores del succinato.
90
3.2.8.2. Determinacin del potencial de membrana en el Estado II en presencia de

91
3.2.9. ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD AL ATRACTILSIDO: VULNERABILIDAD A LA APERTURA

DE PORO (ANT).
92
3.2.10. ESTUDIO DE LA PRODUCCIN DE RADICALES LIBRES POR PARTE DE MITOCONDRIAS

AISLADAS.
92
3.2.11. ESTUDIO DEL DAO TISULAR DEBIDO AL ESTRS OXIDATIVO.
95
3.2.11.1. Determinacin en tejido heptico de la peroxidacin lipdica mediante la

cuantificacin de los niveles de Malondialdehdo (MDA).
95
3.2.11.2. Determinacin de la oxidacin de protenas mediante la cuantificacin de los

niveles de Protein Carbonyl Content (PCC).
3.2.12. ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA ANTIOXIDANTE.
96
97
3.2.12.1. Determinacin de la actividad de la enzima Catalasa.
97
3.2.12.2. Determinacin de la actividad de la enzima Superxido Dismutasa (SOD).
98
3.2.12.2.1. Determinacin de la actividad de la enzima Superxido Dismutasa (SOD)

citoplasmtica.
98
3.2.12.2.2. Determinacin de la actividad de la enzima Superxido Dismutasa en

mitocondrias aisladas de tejido heptico (SOD).
99
3.2.12.3. Determinacin de la actividad de la enzima Glutation Peroxidasa (GPX) de

tejido heptico.
99
3.2.13. ESTUDIOS HISTOLGICOS DE MUESTRAS DE TEJIDO HEPTICO PROCEDENTE DE

RATONES CONTROL, HETEROCIGOTOS Y HETEROCIGOTOS TRATADOS.
3.2.13.1. Procesado de las muestras.
101
101
3.2.13.2. Anlisis de la estructura tisular heptica de ratones control, heterocigotos y

heterocigotos tratados mediante tinciones de Hematoxilina-eosina y Tricrmico de
Masson.
102
3.2.13.2.1. Tincin Hematoxilina-Eosina.
102
3.2.13.2.2. Tincin de Tricrmico de Masson.
103
3.2.14. ESTUDIO DE LA EXPRESIN DE PROTENAS PRESENTES EN EL COMPLEJO II Y EN EL

COMPLEJO IV DE LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL MEDIANTE
INMUNOHISTOQUMICA E INMUNOFLUORESCENCIA.
103
3.2.14.1. Estudio de la expresin de la SDHB y de la COXIV mediante

inmunohistoqumica.
104

inmunofluorescencia.
105
3.2.15. ADQUISICIN DE IMGENES.
105
3.2.16. ESTUDIO DE LA EXPRESIN GNICA MEDIANTE ANLISIS DE MICROARRAYS.
106
3.2.16.1. Extraccin de ARN mensajero procedente de tejido heptico.
106
3.2.16.2. Determinacin de la integridad del arn purificado a partir de tejido heptico.
106
3.2.16.3. Anlisis del transcriptoma mediante microarrays.
107
3.3. ANLISIS ESTADSTICO.
110
RESULTADOS
111
4.1. ESTUDIO DE LA CONCENTRACIN PLASMTICA DE IGF-1 EN FUNCIN DE LA EDAD DE

LOS ANIMALES.
112
4.2. EFECTO DE LA DEFICIENCIA DE IGF-1 SOBRE EL PESO CORPORAL.
113
4.3. RELACIN ENTRE LA DEFICIENCIA DE IGF-1 Y LOS PARMETROS ANALTICOS EN SUERO

DE
RATN.
115
4.4. ESTUDIO DE LA FUNCIN MITOCONDRIAL EN MITOCONDRIAS AISLADAS: EFECTO DE LA

4.4.1. DETERMINACIN DEL POTENCIAL DE MEMBRANA POR CITOMETRA DE FLUJO.
116
116
4.4.2. ESTIMACIN DEL CONSUMO DE OXGENO Y DEL NDICE RCR POR PARTE DE
MITOCONDRIAS AISLADAS DE TEJIDO HEPTICO.
117
4.4.3. ESTIMACIN DEL ESCAPE DE PROTONES (PROTON LEAK) EN MITOCONDRIAS

AISLADAS DE LOS TRES GRUPOS EXPERIMENTALES.
120
4.4.4. SENSIBILIDAD AL ATRACTILSIDO COMO EXPRESIN DE LA MENOR

VULNERABILIDAD A LA APERTURA DEL PORO EN EL ANT.
4.5. ESTUDIO DE LA RELACIN ENTRE LOS NIVELES DE IGF-1 Y DE ESTRS OXIDATIVO.
121
122
4.5.2. RELACIN ENTRE LA DISFUNCIN MITOCONDRIAL Y EL DAO OXIDATIVO EN EL

HGADO DE RATONES CON DEFICIENCIA PARCIAL DE IGF-1, SIN DAO EXGENO ALGUNO
123
4.5.2.1. Determinacin de la peroxidacin lipdica mediante la cuantificacin de los

niveles de malondialdehdo en homogeneizados hepticos.
123
4.5.2.2. Determinacin de la oxidacin de protenas mediante la cuantificacin de

proten carbonil content.
4.5.3. Estudio de la relacin entre los mecanismos oxidantes y los niveles de IGF-1.
124
125
4.6. ESTUDIO DE LA RELACIN ENTRE LOS NIVELES DE IGF-1 Y LA ESTRUCTURA

HEPATOCITARIA.
127
4.7. ANLISIS DE LOS COMPLEJOS DE LA CADENA RESPIRATORIA MEDIANTE ESTUDIO

INMUNOHISTOQUMICO Y DE FLUORESCENCIA.
129
4.7.1. ESTUDIO DE LOS NIVELES DE SUCCINATO DESHIDROGENASA (COMPLEJO II).
129
4.7.2. ESTUDIO DE LA SUBUNIDAD IV DE LA CITOCROMO OXIDASA (COMPLEJO IV).
130
4.8. DEFICIENCIA DE IGF-1 Y EXPRESIN HEPTICA DE GENES QUE CODIFICAN PARA

PROTENAS PROTECTORAS DE LA MITOCONDRIA
132
DISCUSIN
134
5.1. ESTUDIO DE LA CONCENTRACIN PLASMTICA DE IGF-1 EN FUNCIN DE LA EDAD DE

LOS ANIMALES.
139
5.2. EFECTO DE LA DEFICIENCIA DE IGF-1 SOBRE EL PESO CORPORAL.
141
5.3. RELACIN ENTRE LA DEFICIENCIA DE IGF-1 Y LOS PARMETROS ANALTICOS EN SUERO

DE
RATN.
142
5.4. ESTUDIO DE LA FUNCIN MITOCONDRIAL EN MITOCONDRIAS AISLADAS: EFECTO DE LA

5.4.1. DETERMINACIN DEL POTENCIAL DE MEMBRANA POR CITOMETRA DE FLUJO.
145
145
5.4.2. ESTIMACIN DEL CONSUMO DE OXGENO Y DEL NDICE RCR POR PARTE DE
MITOCONDRIAS AISLADAS DE TEJIDO HEPTICO.
146
5.4.3. ESTIMACIN DEL ESCAPE DE PROTONES (PROTON LEAK) EN MITOCONDRIAS

AISLADAS DE LOS TRES GRUPOS EXPERIMENTALES.
148
5.4.4. SENSIBILIDAD AL ATRACTILSIDO COMO EXPRESIN DE LA MENOR

VULNERABILIDAD A LA APERTURA DEL PORO EN EL ANT.
148
5.5. ESTUDIO DE LA RELACIN ENTRE LOS NIVELES DE IGF-1 Y LA ESTRUCTURA

HEPATOCITARIA.
149
5.6. ANLISIS DE LOS COMPLEJOS DE LA CADENA RESPIRATORIA MEDIANTE ESTUDIO

150
5.6.1. ESTUDIO DE LOS NIVELES DE SUCCINATO DESHIDROGENASA (COMPLEJO II).
151
5.6.2. ESTUDIO DE LA SUBUNIDAD IV DE LA CITOCROMO OXIDASA (COMPLEJO IV).
151
5.7. ESTUDIO DE LA RELACIN ENTRE LOS NIVELES DE IGF-1 Y DE ESTRS OXIDATIVO.
152
5.7.1. PRODUCCIN DE ESPECIES REACTIVAS DEL OXGENO (EROS) POR MITOCONDRIAS

HEPTICAS.
153
5.7.2. RELACIN ENTRE LA DISFUNCIN MITOCONDRIAL Y EL DAO OXIDATIVO EN EL

HGADO DE RATONES CON DEFICIENCIA PARCIAL DE IGF-1, SIN DAO EXGENO ALGUNO
155

niveles de malondialdehdo (MDA) en homogeneizados hepticos
155

protein carbonil content.
155
5.7.3. ESTUDIO DE LA RELACIN ENTRE LOS MECANISMOS ANTIOXIDANTES Y LOS NIVELES

DE IGF-1.
156
5.8. DEFICIENCIA DE IGF-1 Y EXPRESIN HEPTICA DE GENES QUE CODIFICAN PARA

PROTENAS PROTECTORAS DE LA MITOCONDRIA
157
CONCLUSIONES
159
BIBLIOGRAFA
162
7.1. BIBLIOGRAFA
163
NDICE DE FIGURAS Y TABLAS
INDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Estructura mitocondrial. A) Imagen de la estructura mitocondrial obtenida

mediante microscopa electrnica en la que se pueden observar la membrana interna,
externa y las crestas mitocondriales. B) Esquema representativo de la estructura
mitocondrial.
Figura 2. Esquema representativo de la translocacin de las protenas desde el citosol a
la matriz mitocondrial (A) y de la insercin de las protenas transmembrana (B).
Figura 3. Representacin esquemtica de la estructura mitocondrial. Se pueden
observar las invaginaciones o crestas de la membrana interna mitocondrial las cuales
tienen como objetivo aumentar la superficie de la membrana interna para contener ms
unidades de la cadena de transporte de electrones y del complejo ATP sintasa.
Figura 4. Representacin esquemtica de los complejos que forman parte de la
fosforilacin oxidativa. La cadena de transporte de electrones est formada por cuatro
complejos (I-IV). El complejo II y III estn conectados por la coenzima Q y los
complejos III y IV por el citocromo c. El ltimo complejo lo constituye la ATP sintasa.
Figura 5. Representacin esquemtica del complejo ATP sintasa.
Figura 6. Representacin esquemtica del transporte de electrones a travs de la cadena
respiratoria. Se puede observar que los electrones se mueven a favor de gradiente
energtico, liberando energa que se usa para el transporte de protones.
Figura 7. Representacin esquemtica de la cadena de transporte de electrones y de la
fosforilacin oxidativa. El NADH procedente del ciclo de Krebs cede los electrones y
tambin los protones al complejo I. La succinato deshidrogenasa, componente del
complejo II de la cadena de transporte cataboliza el succinato y los electrones generados
tambin son cedidos a la cadena de transporte de electrones. Finalmente los electrones
son transferidos al oxgeno y el gradiente de protones se usa para la formacin de ATP.
Figura 8. Medida del consumo de oxigeno mediante Electro de Clark. En la figura se
pueden observar los diferentes ratios en el consumo de oxgeno al aadir succinato
(Estadio 2), ADP (Estadio 3) y cuando se consumen las molculas de ADP (Estadio 4).
Modificado de Puente-Maestu et al. J.Appl.Physiol (Puente-Maestu et al., 2013).
Figura 9. Representacin esquemtica de la relacin entre el consumo de oxgeno y el

potencial de membrana. Modificado de Divakaruni et al. Physiology. (Divakaruni et al., 2011).
Figura 10. Representacin esquemtica de los cambios de potencial de membrana en
funcin de los estados metablicos. Como se puede observar al aadir succinato el
potencial de membrana aumenta de -150 mV hasta aproximadamente -220 mV. Sin
embargo, al aadir ADP el potencial de membrana disminuye hasta valores
aproximados de -180 mV. Cuando se agotan las molculas de ADP el potencial de
membrana vuelve a aumentar hasta valores aproximados de -220 mV.
Figura 11. Representacin esquemtica del bombeo de protones y de la fuga de
protones a travs de la membrana mitocondrial interna. Modificado de Jastroch et al.
Essays Biochem. (Jastroch et al., 2010a).
Figura 12. Mecanismos del dao oxidativo celular y enzimas antioxidantes. Se pueden
observar las funciones de las enzimas antioxidantes y las consecuencias de un
desequilibrio en la produccin de radicales libres.
Figura 13. Estructura secundaria de la hormona IGF-1. Modificado de Candice et al. Front
Endocrinol. (Candice G.T.Tahimic, 2013).
Figura 14. Esquema del splicing alternativo del gen IGF-1. La variante de IGF-1Ea se
genera por splicing de los exones 4 y 6. La variante IGF-1EB se genera por splicing de
los exones 4,5 y 6.
Figura 15. Evolucin de las concentraciones plasmticas de IGF-1 con la edad. Se
pueden observar que los niveles de IGF-1 aumentan durante la infancia hasta alcanzar
un pico justo antes de la pubertad. Despus de la pubertad la concentracin de IGF-1 va
disminuyendo paulatinamente.
Figura 16. Eje GH/IGF-1. La GHRH producida por el hipotlamo estimula la secrecin
por parte de la hipfisis de GH, que a su vez estimula la sntesis de IGF-1. Este factor
promueve el crecimiento de diversos rganos. Adems, IGF-1 inhibe su propia sntesis,
ya que inhibe la produccin de GH de manera directa y tambin de manera indirecta,
estimulando la secrecin de somatostatina por parte del hipotlamo. Las lneas
continuas indican estimulacin y las lneas a trazos indican inhibicin. Modificado de Rees
et al. Nature Reviews Nephrology (Rees et al., 2011).
Figura 17. Estructura terciaria de las principales protenas de unin a IGF-1 (IGFBPs).
Figura 18. Representacin esquemtica de los receptores de IGF-1, IGF-2 e insulina. Se
puede observar que IGF-1, IGF-2 e insulina se unen a sus receptores especficos y
tambin, con menor afinidad, a los receptores caractersticos de las otras hormonas.
Figura 19. Hiptesis de la regulacin del crecimiento sea mediado por la GH e IGF-1.
Hasta hace uno aos se pensaba que las acciones de la GH estaban mediadas por la
hormona IGF-1. Sin embargo, segn la hiptesis actual, la hormona GH tiene acciones
directas sobre el hueso y tambin promueve de manera indirecta el crecimiento sea
mediante la produccin endocrina de IGF-1 por el hgado y estimulando la produccin
por parte del hueso de IGF-1, que acta de forma paracrina. Modificado de Ohlsson et
al. Endocr.Rev. 2009. (Ohlsson et al., 2009).
Figura 20. Paciente de 2 aos con Sndrome de Laron. Se pueden observar las
alteraciones fenotpicas caractersticas como prominencia frontal e hipoplasia del puente
nasal. (Laron Z, 2011)
Figura 21. Paciente con cirrosis heptica asctica y grave desnutricin. Se puede
observar el abdomen hinchado as como la prdida de masa muscular y de tejido graso y
la marcada ginecomastia.
Figura 22. Representacin esquemtica de la modificacin gentica de los ratones
igf1tm1Arge. El gen que codifica para IGF-1 est compuesto por 6 exones (A) y
codifica para un pptido de aproximadamente 70 aa (B). Los ratones igf1tm1Arge tienen
una modificacin gentica que consiste en la insercin de neomicina en el exn 4 (A) y
el producto resultante es un pptido de mayor peso molecular y con uno de los dominios
truncado (C).
Figura 23. Representacin esquemtica de la estructura terciaria del factor de
crecimiento IGF-1 normal y mutado. El IGF-1 producido por el gen codificante normal
presenta tres puentes disulfuro (A), sin embargo el IGF-1 producido por el gen truncado
presenta slo un puente disulfuro (B).
Figura 24. Representacin en un rbol genealgico de los cruces y de los ratones
obtenidos. Los crculos representan a las hembras, los cuadrados a los machos. Los
smbolos blancos representan ratones control, los smbolos con media parte sombreada
representan a ratones heterocigotos y los smbolos totalmente sombreados a los ratones
KO. Las camadas mostraron los siguientes porcentajes, 25% de ratones control y 50%
de ratones heterocigotos y 25% de ratones KO.
Figura 25. Representacin esquemtica del diseo experimental desarrollado. Los
ratones controles se trataron con succinato y los ratones heterocigotos se trataron con
succinato o con IGF-1.
Figura 26. Imagen representativa de la amplificacin por PCR del gen igf-1. En el
primer carril se observan los marcadores de peso molecular, en el segundo carril el
producto resultante de un ratn wild type y en el tercer carril el producto resultante de
un ratn heterocigoto.
Figura 27. Caracterizacin de la poblacin mitocondrial en base a su tamao y
complejidad. La ventana dibujada (R1) representa la poblacin mitocondrial ms
homognea, y por lo tanto con un estado funcional ptimo.
Figura 28. Estudio del potencial de membrana en funcin del estado metablico
mitocondrial. Se puede observar que el potencial de membrana (medido en unidades
arbitrarias de fluorescencia UAF) aumenta al aadir succinato en comparacin al estado
basal (Rotenona). Sin embargo, al aadir ADP el potencial de membrana tiene unos
valores intermedios entre el estadio basal y el estado II. Finalmente, cuando se aade
un desacoplante como el CCCP el potencial de membrana disminuye hasta unos valores
inferiores al estado basal.
Figura 29. Representacin del consumo de oxgeno de mitocondrias extradas de tejido
heptico medido mediante electrodo de tipo Clark. En la figura se puede observar la
concentracin de oxgeno al aadir en primer lugar las mitocondrias, en segundo lugar
succinato (Estado II), en tercer lugar ADP (Estado III), en cuarto lugar al acabarse las
molelculas de ADP (Estado IV) y por ultimo al aadir un desacoplante (CCCP).
Figura 30. Estudio de la produccin de radicales libres por mitocondrias aisladas de
tejido heptico mediante citometra de flujo. Se puede observar la produccin de
radicales libres por las mitocondrias en estado basal (Rotenona), al aadir un sustrato
metablico (Succinato), al aadir ADP y finalmente al aadir un desacoplante (CCCP).
Figura 31. Resumen del protocolo seguido para el anlisis del transcriptoma mediante
microarrays.
Figura 32. Estudio de las niveles de IGF-1 en sangre en funcin de la edad, en ratones
control y heterocigotos. En el eje de las X se representa la edad de los ratones y en el eje
de las Y las concentraciones de IGF-1. Co= ratones Control; Hz= ratones Heterocigoto.
Figura 33. Estudio de la relacin entre el peso corporal (gr) y los niveles de IGF-1. Las
barras representan la media del peso de los ratones. Co= ratones control, Hz= ratones
Heterocigotos y Hz+IGF-1= ratones Heterocigotos tratados con IGF-1.
Figura 34. Representacin de los valores medios de triglicridos en los animales
control, Hz y Hz+IGF-1. Co= ratones Control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1=
ratones Heterocigotos tratados con IGF-1.
Figura 35. Estudio del potencial de membrana en mitocondrias aisladas hepticas. Las
barras representan la media del potencial de membrana medido en U.A.F de
mitocondrias aisladas de tejido heptico fresco tras aadir el sustrato mitocondrial
succinato. Co= ratones Control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1= ratones
Heterocigotos tratados con IGF-1.
Figura 36. Representacin grfica del consumo de oxgeno. Se puede observar la
diferente tasa de consumo de oxgeno en Estado 2 (succinato), Estado 3 (ADP) y
Estado IV (cuando se han gastado las molculas de ADP. El mximo ratio se obtiene al
aadir el descoplante mitocondrial CCCP.
Figura 37. Estudio de la relacin entre la produccin de ATP y el nmero de molculas
de Oxgeno consumidas en mitocondrias aisladas de tejido heptico fresco. Las barras
representan la media de los ratios ADP/O en los tres grupos experimentales. Co=
ratones Control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1= ratones Heterocigotos
tratados con IGF-1.
Figura 38. Estudio de la relacin entre el consumo de oxgeno y la generacin del
potencial de membrana. En el eje de las X se representa los nmoles de oxgeno
consumido por mg de protena en un minuto y en eje de las y el potencial de membrana
medido en U.A.F. Co= ratones Control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1=
ratones Heterocigotos tratados con IGF-1.
Figura 39. Estudio de la funcionalidad del ANT. En el eje de las X se muestran los
pmoles/ml de atractilsido aadido al medio. En el eje de las Y se refleja el consumo de
oxgeno por mg de protena en un minuto. Co= ratones Control, Hz= ratones
Figura 40. Anlisis de los niveles de radicales libres en mitocondrias aisladas de tejido
heptico de los animales control, heterocigotos y heterocigotos tratados con IGF-1.
Representacin de la produccin de EROS, medido en U.A.F. las barras representan la
intensidad media de fluorescencia.
Figura 41. Cuantificacin de MDA en homogenizado de tejido heptico. El grfico
representa los valores medios de MDA por mg de protena en un ml. Co= ratones
Control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1= ratones Heterocigotos tratados con
IGF-1.
Figura 42. Determinacin de PCC en homogenizado de tejido heptico en ratones

Control, heterocigotos y Heterocigotos tratados con IGF-1. La grfica muestra las
medias de PCC en mmoles por mg de protena en un ml.
Figura 43. Estudio de la actividad de la enzima Catalasa en homogenizado de tejido
heptico. Las ratones control (Co) se representan en verde, los ratones heterocigotos
(Hz) en naranja y los ratones tratados (Hz+IGF-1) en azul. Las barras representan la
media de la actividad de la enzima (Unidades/mg protena).
Figura 44. Anlisis mediante tincin con Hematoxilina-Eosina de la estructura
heptica. Como se puede observar, en los tres grupos experimentales el tejido heptico
muestra una arquitectura tpica, en la que se puede observar la triada portal de
morfologa caracterstica, arquitectura hexagonal hepatocelular y canalculos biliares
conservados. Imgenes capturadas a 400 aumentos.
Figura 45. Anlisis de la estructura tisular mediante la tincin de Tricrmico de Masson
en ratones control, ratones heterocigotos y ratones heterocigotos tratados con IGF-1.
Los ncleos se tien de negro debido a la hematoxilina frrica. No se observan septos
fibrosos (azul) entre las hileras de hepatocitos. Las imgenes fueron capturadas a 400
aumentos.
Figura 46. Estudio de los niveles de la enzima succinato deshidrogenasa mediante
inmunohistoqumica e inmunofluorescencia. Para la realizacin de las
inmunohistoqumicas (A, B y C) las muestras fueron reveladas con diaminobenzidina
(marrn) y fueron contrastadas con hematoxilina. Los tres grupos muestran el patrn
tpico punteado citoplasmtico, debido a la localizacin mitocondrial de la enzima
succinato deshidrogenasa. Las inmunofluorescencias (D, E y F) se tieron con el
fluorocromo rodamina (rojo). Co: ratones control. Hz: ratones heterocitogotos.
HZ+IGF-1: ratones tratados. Las imgenes fueron tomadas a 400 aumentos.
Figura 47. Estudio de los niveles de la subunidad IV de la citocromo oxidasa mediante
inmunohistoqumica e inmunofluorescencia. Para la realizacin de las
inmunohistoqumicas (A, B y C) las muestras fueron reveladas con diaminobenzidina
(marrn) y contrastadas con hematoxilina, que tie los ncleos de azul. Los tres grupos
mostraban el patrn tpico punteado citoplasmtico, debido a la distribucin
mitocondrial de la subunidad B del complejo IV. Las inmunofluorescencias (D, E y F)
se tieron con el fluorocromo rodamina (rojo) Al igual que ocurre con las
inmunohistoqumicas, se observa un patrn punteado citoplasmtico. Co: ratones
control. Hz: ratones heterocigotos. HZ+IGF-1: ratones tratados. Las imgenes fueron
tomadas a 400 aumentos.
Figura 48. Anlisis de los niveles de la subunidad IV del complejo citocromo oxidasa
en hepatocitos. Las ratones control (Co) se representan en verde, los ratones
heterocigotos (Hz) en naranja y los ratones tratados (Hz+IGF-1) en azul. Las barras
representan la media de intensidad media de fluorescencia.
Tabla 1. Protocolo de amplificacin del gen igf-1 y del gen truncado igf-1. Tabla 2.
Soluciones empleadas para el desarrollo de los distintos estados metablicos
mitocondriales.
Tabla 3. Soluciones empleadas para el estudio de la produccin mitocondrial de

radicales libres.
Tabla 4. Protocolo para la cuantificacin de la actividad de la enzima GPX.
Tabla 5. Estudio del peso corporal tras el tratamiento con IGF-1 o succinato en los tres
grupos de animales.
Tabla 6. Cuantificacin mediante analizador Cobas de parmetros bioqumicos en suero
de ratn.
Tabla 7. Estudio del consumo de oxgeno y clculo del ndice de control respiratorio
(RCR) en mitocondrias aisladas de tejido heptico.
Tabla 8. Estudio de la actividad antioxidante de las enzimas catalasa, Superxido
Dismutasa y glutatin peroxidasa.
Tabla 9. Estudio de la expresin gnica de genes relacionados con la funcin
mitocondrial.
Tabla 10. Efectos secundarios de la terapia con IGF-1 en dosis superiores a
60,g/kg/da.
NDICE DE ABREVIATURAS
NDICE DE ABREVIATURAS
INTRODUCCIN
Abreviatura
ADNmt
ADNn
ANT
ATPsintasa
BHE
BHT
BSA
CCCP
CoQ
COX IV
DAPI
DHRh-123
DNPH
DPX
EDTA
EGTA
EROs
FSH
GH/GHRH
GuHCl
H2O-DEPC
HOHO2.
LH
MDA
OXPHOS
PBS
Rh-123
ROS
SDH
SL/GHI
SNC
SOD
TFG
TIMs
TK
TMOP
TMPD
TOMs
U.A.F
VCAC
Significado
cido Desoxirribo Nucleico mitocondrial
cido Desoxirribo Nucleico nuclear
Protena Transportadora de Nucletidos de Adenina
Adenosn Trifosfato Sintasa
Barrera Hemato Enceflica
Butilhidroxitolueno
Bovine Serum Albumin
Carbonylcyanide m-chlorophenilhidrazone
Coenzima Q
Citocromo C Oxidasa Subunidad IV
4-6-diamino-2-fenilindol
DihidroRhodamina-123
2,4-Dinitrofenilhidrazina
Medio de montaje para preparaciones disuelto en Xileno
cido Etilendiaminotetractico
cido Ethylene Glycol Tetraacetic
Especies Reactivas de Oxgeno
Hormona Folculo Estimulante
Hormona del Crecimiento/Hormona liberadora de la GH
Guanidine Hydrocloride
Agua Dietilpirocarbonatada
Anin Hidroxilo
In Hidroperoxil
Hormona Luterizante
Malndialdehdo
Proceso de Fosforilacin Oxidativa
Phosphate Buffered Saline
Rhodamina 123
Especies Reactivas de Oxgeno
Succinato Deshidrogenasa
Sndrome de Laron/Insensibilidad Primaria a la Hormona del
Crecimiento
Sistema Nervioso Central
Superxido Dismutasa
Tasa de Filtracin Glomerular
Complejos Transportadores de Protenas (Membrana Interna)
Tirosn Kinasa
Tetrametoxipropano
N,N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylenediamine
Complejos Transportadores de Protenas (Membrana Externa)
Unidades arbitrarias de fluorescencia
Canal Aninico Selectivo Dependiente de Voltaje
Incremento de Potencial de Membrana
20
INTRODUCCIN
INTRODUCCIN
21
INTRODUCCIN
1.1. LA MITOCONDRIA
Las mitocondrias fueron descubiertas a finales del siglo XIX por el botnico suizo
Kolliker, aunque otros autores atribuyen su descubrimiento a Richard Altmann. Hoy en
da, se piensa que realmente el descubrimiento de las mitocondrias fue un hecho
colectivo, ya que numerosos investigadores detectaron la presencia de unos corpsculos
en el citoplasma celular, utilizando distintos nombres para referirse a dicho orgnulo.
De hecho, en 1918 Cowdry recogi en una publicacin, citada posteriormente por
Lehninger (Takamura et al., 2012), ms de una docena de trminos que se referan a las
mismas.
Las mitocondrias son orgnulos ovoides, de un dimetro transversal variable
comprendido entre 0,1-0,5 m y presentan una longitud de 1-2 m (Fernandez et al.,
1964; Westermann, 2008; West et al., 2011). Son las nicas organelas que contienen
ADN, el cual codifica para algunas de las protenas presentes en las mismas. Esto ha
hecho pensar que derivan de organismos procariotas que establecieron una relacin
simbitica con clulas eucariotas. Desde entonces, estos orgnulos habran perdido gran
parte de su genoma por lo que la mayora de sus protenas estn codificadas por genes
del ncleo (Alberts B et al., 2007).
El nmero de mitocondrias presentes en cada clula es muy variable, variando
desde 0 en los eritrocitos a 10.000 en las fibras musculares (O'Rourke, 2004).Esto es
debido a que una de sus funciones principales es la de producir ATP, moneda
energtica de las clulas eucariotas, mediante un proceso denominado fosforilacin
oxidativa. Por este motivo, en algunos casos, se mantienen en una posicin fija en la
que pueden proporcionar ATP directamente a lugares de consumo anormalmente
elevado del mismo, como por ejemplo las que se encuentran empaquetadas entre las
miofibrillas de las clulas del msculo cardiaco, o alrededor del flagelo en los
espermatozoides (Lehninger A.L., 1978).
No obstante, las nuevas tcnicas de imagen han revelado que en la mayora de las
clulas las mitocondrias son orgnulos mviles y plsticos que cambian constantemente
de forma. Lo que es ms, se fusionan unos con otros y se vuelven a separar en dos
estructuras independientes (Kaasik et al., 2007; Aon et al., 2006; Takamura et al.,
2012), constituyendo lo que se ha denominado red mitocondrial (Benz, 1990).
22
INTRODUCCIN
Adems, estos orgnulos regulan una serie de procesos fisiolgicos, tales como la
termognesis, la homeostasis del calcio (Ganitkevich, 2003), la formacin de especies
reactivas de oxgeno (EROs) (Ganitkevich, 2003), la respuesta inmune innata (Boveris
et al., 1972) y la apoptosis (West et al., 2011).
Todas estas funciones mitocondriales estn ntimamente relacionadas con su
compleja estructura.
1.2. ESTRUCTURA MITOCONDRIAL

Cada mitocondria est limitada por dos membranas altamente especializadas: la
membrana externa y la membrana interna (Figura 1). Cada una de las membranas
presenta diferente composicin, estructura y funcin (Palade, 1952), como se describe
detalladamente a continuacin.
Figura 1. Estructura mitocondrial. A) Imagen de la estructura mitocondrial obtenida mediante

microscopa electrnica en la que se pueden observar la membrana interna, externa y las crestas
mitocondriales. B) Esquema representativo de la estructura mitocondrial
23
INTRODUCCIN
1.2.1. MEMBRANA EXTERNA.
La membrana externa est compuesta, como toda membrana biolgica, por una
bicapa lipdica que le confiere una serie de propiedades fisicoqumicas. En primer lugar,
slo es permeable a molculas neutras de menos de 10.000 daltons (<10kDa), es decir
molculas pequeas, como O2, CO2, H2O. En segundo lugar, permite el movimiento de
pequeas molculas hidroflicas a bajo o cero potencial de membrana (Lemasters et al.,
2006).
No obstante, el componente mayoritario de la membrana externa mitocondrial lo
representan las protenas (60-70%). Estas ltimas son muy importantes, entre otras
funciones, para el transporte de molculas que no pueden atravesar la bicapa lipdica
como pequeas protenas de menos de 5kDa e iones (Benz, 1990). De hecho, la
membrana externa contiene numerosas copias de una protena de transporte, llamada
porina, pertenece a una familia de protenas integrales de membrana (Benz, 1990), que
forma grandes canales acuosos a travs de la bicapa lipdica (Alberts B et al., 2007). En
eucariotas, el principal es el canal anin- selectivo dependiente de voltaje (VDAC), que
en vertebrados presenta tres isoformas (VDAC1, VDAC2 y VDAC3) (Lemasters et al.,
2006).
Tambin constituyen un componente fundamental los complejos transportadores
de protenas (TOMs) que interaccionan con otros complejos presentes en el espacio
intermembrana y en la membrana interna que se describen en el apartado 1.2.4. de la
introduccin.
1.2.2. ESPACIO INTERMEMBRANA.
La zona situada entre la membrana externa y la membrana interna mitocondrial se

denomina espacio intermembrana. Este compartimento, contiene enzimas y molculas
importantes como la adenilato quinasa, creatina fosfoquinasa y citocromo c. Tambin
contiene protenas que transportan molculas desde la membrana externa hasta la
membrana interna, que se describen en el apartado 1.2.4. de la introduccin.
Adems, esta regin es fundamental para una de las principales actividades
mitocondriales, la generacin de un gradiente de protones (H+) que se va a usar para la
generacin de energa en forma de ATP segn un proceso que se describir ms
adelante.
24
INTRODUCCIN
1.2.3. MEMBRANA INTERNA.
La membrana interna, tambin est compuesta por lpidos, principalmente de

cardiolipina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina, que hace que la membrana sea
permeable para algunas molculas pequeas, como O2, CO2, H2O y que por el contrario
sea impermeable a iones y cationes. No obstante, la mitocondria no es impermeable al
medio que la rodea, ya que contiene protenas, componente mayoritario de la membrana
interna, las cuales tienen entre otras funciones la de permitir el paso de diversas
molculas a travs de la membrana mitocondrial.
La presencia de canales inicos como los que intervienen en el flujo del potasio
son fundamentales en el balance hdrico ya que el desequilibrio de este flujo induce el
intercambio de agua a travs de la bicapa lipdica. En este sentido, tambin es de gran
relevancia los canales para el agua o acuoporinas (Kaasik et al., 2007).
Otros canales presentes en la membrana interna son los del calcio, que permiten el
paso del mismo en funcin de las demandas energticas (Fieni et al., 2012; Kirichok et
al., 2004). De hecho, en condiciones en las que el trabajo cardiaco est aumentado, la
adrenalina promueve la activacin de los complejos de deshidrogenasa y 2-oxoglutarato
deshidrogenasa mediante el aumento de la concentracin intramitocondrial de Ca2
(McCormack et al., 1984).

Adems de estas importantes funciones, los canales del potasio (Mito-KATP9 y
de Ca2+ (Mito-KCa2+) estn relacionados con la necrosis celular y la apoptosis
(Crompton et al., 1999; Crompton, 1999; Duchen, 1999; Fieni et al., 2012), lo que
explica su importante papel en la cardioproteccin frente a la lesin isqumica (Aon et
al., 2006; O'Rourke, 2004).
Adems, las molculas utilizadas por las mitocondrias para obtener energa, como
aspartato, glutamato, fosfato, piruvato, cidos grasos, ornitina, glutamina o carnitina
requieren portadores especficos para cruzar esta membrana (Jeremy M.Berg et al.,
2012; Finsterer, 2004). Las protenas mitocondriales sintetizadas en el citosol, son
importadas hacia su lugar de destino mediante los TOMs y los complejos
transportadores de protenas presentes en la membrana interna (TIMs).
25
INTRODUCCIN
1.2.4. PROTENAS TRANSPORTADORAS MITOCONDRIALES.
El complejo TOM comprende diferentes subunidades: Tom5, Tom6, Tom7,

Tom20, Tom22, Tom37, Tom40 y Tom70. El complejo TOM reconoce una secuencia
de orientacin N-terminal caracterstica de las protenas mitocondriales ms inmaduras
que atraviesan la membrana a travs del poro formado por las subunidades Tom37 y
Tom70.
TIM, a su vez, integra dos complejos con funciones diferentes (Kerscher et al.,
1997; Koehler et al., 1998a; Sirrenberg et al., 1996; Sirrenberg et al., 1998). Un
complejo TIM contiene las subunidades Tim11p, Tim44p, Tim17p y Tim23p. Un
segundo complejo TIM incluye las subunidades transmembrana Tim22p y Tim54p y las
subunidades unidas a la cara exterior de la membrana interna Tim9p, Tim10p y Tim12p
(Kerscher et al., 1997; Koehler et al., 1998a; Sirrenberg et al., 1996; Sirrenberg et al.,
1998; Koehler et al., 1998b).
El transporte de protenas a travs del espacio intermembrana de TOM a los
complejos transportadores de protenas TIM est mediada por el complejo Tim9pTim10p, situado en el espacio intermembrana (Glick et al., 1991b; Glick et al., 1991a;
Pfanner et al., 1996; Pfanner et al., 1997). Estas interacciones son posibles debido al
hecho de que las protenas contienen secuencias de carga positiva y los dos complejos
de protenas portadoras presentan dominios de carga negativa (Dietmeier et al., 1997;
Komiya et al., 1998; Kubrich et al., 1998).
El primer complejo TIM est implicado en la translocacin de todas las
protenas de la matriz y algunas protenas del espacio intermembrana en un proceso
dependiente de ATP.
El segundo complejo TIM media la insercin de las protenas transmembrana a
travs de un mecanismo regulado por el potencial de membrana mitocondrial
(Lemasters et al., 2006; Koehler et al., 1998b) (Figura 2).
26
INTRODUCCIN
Ribosoma
Ribosoma
Citosol
Membrana Externa
Espacio
Interembrana
Membrana Interna
Matriz
Protena madura
(Protena Transmembrana)
Proteasa
Protena de
trnsito
Protena
madura
Figura 2. Esquema representativo de la translocacin de las protenas desde el citosol a la matriz

mitocondrial (A) y de la insercin de las protenas transmembrana (B).
Durante todo este proceso, las protenas se escinden, pliegan y se colocan en el

sitio idneo (Kerscher et al., 1997; Koehler et al., 1998a; Sirrenberg et al., 1998;
Kubrich et al., 1998), como por ejemplo las que constituyen los complejos de la cadena
de transporte de electrones y el complejo ATP sintasa. De hecho, la membrana interna
mitocondrial presenta invaginaciones o crestas (Jeremy M.Berg et al., 2012) para
aumentar su superficie (Alberts B et al., 2007) y con ello el nmero de estas unidades
(Alberts B et al., 2007), como se muestra en la figura 3.
27
INTRODUCCIN
Figura 3. Representacin esquemtica de la estructura mitocondrial. Se pueden observar las

invaginaciones o crestas de la membrana interna mitocondrial las cuales tienen como objetivo aumentar la
superficie de la membrana interna para contener ms unidades de la cadena de transporte de electrones y
del complejo ATP sintasa.
1.2.5. CADENA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES Y COMPLEJO ATP

SINTASA.
La cadena de transporte de electrones est formada por cuatro complejos (I-IV),

que estn constituidos por un nmero variable de protenas y tambin por grupos
prostticos de tipo flavina o citocromo, centros Fe-S y protenas con cobre (Tanaka et
al., 1995). Adems de estos complejos, forman parte de la cadena respiratoria la
coenzima Q, que acta como nexo de unin entre los complejos I y II y el complejo III,
y el citocromo c, que transfiere los electrones desde el complejo III al IV (Figura 4).
28
INTRODUCCIN
Figura 4. Representacin esquemtica de los complejos que forman parte de la fosforilacin

oxidativa. La cadena de transporte de electrones est formada por cuatro complejos (I-IV). El
complejo II y III estn conectados por la coenzima Q y los complejos III y IV por el citocromo c. El
ltimo complejo lo constituye la ATP sintasa.
a) Complejo I: NADH-CoQ Reductasa

El complejo I est integrado por 42 43 subunidades diferentes, de los cuales 7
estn codificados por el ADN mitocondrial (ADNmt).
Las subunidades del complejo I se disponen en una estructura en L. Un brazo de
la estructura se encuentra inmerso en la membrana mitocondrial mientras que el otro
penetra dentro de la matriz. Dentro del brazo de la matriz se sita la enzima NADH
deshidrogenasa, que contiene dos fracciones hidroflicas, una que incluye el
mononucletido de flavina, y otra con al menos cuatro ncleos hierro-azufre. El brazo
unido a la membrana forma la fraccin hidrofbica y contiene las siete subunidades
codificadas por el ADNmt, uno o dos ncleos hierro-azufre y presenta actividad
ubiquinona reductasa (Walker et al., 1995).
La funcin del complejo I es catalizar la transferencia de electrones cedidos por el
NADH (producido en el ciclo de Krebs), desde el complejo I al complejo II, este hecho
permite el paso del primer par de protones desde la matriz mitocondrial al espacio
intermembrana (Lodish H et al., 1997).
29
INTRODUCCIN
La rotenona es un inhibidor de la cadena de transporte de electrones a nivel del

complejo I, bloqueando la transferencia de electrones desde el centro hierro-azufre a la
ubiquinona (Bailey et al., 1999). Al bloquear el paso de electrones del complejo I al II,
se utiliza en ensayos de metabolismo celular cuando se aade el sustrato especfico de
este ltimo como el succinato. Por este motivo, se usa en los estudios que analizan la
funcionalidad mitocondrial al aadir un sustrato caracterstico del complejo II.
b) Complejo II: Succinato coenzima Q reductasa

El complejo II est formado por cuatro pptidos y es el nico complejo que no
tiene subunidades codificadas por el ADNmt. Se puede dividir en dos fracciones: una
soluble formada por la enzima succinato dehidrogenasa (SDH) y otra que sirve como
anclaje a la membrana.
La enzima SDH oxida el succinato a fumarato en el ciclo del cido ctrico. Esta
enzima es muy activa en mitocondrias hepticas, siendo la tasa de respiracin desde el
succinato dos veces ms rpida que desde el sustrato NADH (Lodish H et al., 1997).
Una vez que han sido cedidos los electrones por el complejo I, estos se mueven
por a travs de la fraccin transmembrana del complejo II. Al pasar al complejo
siguiente, otro par de protones pasarn de la matriz mitocondrial al espacio
intermembrana. La reaccin completa que cataliza este complejo es la siguiente (Lodish
H et al., 1997).
Succinato + CoQ Fumarato + CoQH2
c)
Complejo III: CoQHs Citocromo c reductasa

Este complejo est integrado por once subunidades, de las cuales una, el
citocromo b, est codificado por el genoma mitocondrial; el resto de polipptidos estn

codificados por el ADN nuclear (ADNn) (Lodish H et al., 1997).
Las subunidades que contienen centros de xido-reduccin son el citocromo b y el
grupo Fe-S (centro tipo Rieske Fe2S2, tipo de protena de hierro-azufre presente en los
citocromos) (RIESKE et al., 1964).
Los electrones procedentes del complejo II son captados por la coenzima Q
(CoQ), producindose la reduccin de la misma. La CoQ reducida dona los electrones al
siguiente complejo y se regenera coenzima Q oxidado. Dentro del complejo los
electrones son transferidos a una protena tipo Fe-S, a dos citocromos tipo b y al
citocromo c1. Al final los dos electrones pasan al citocromo c, una protena soluble en
30
INTRODUCCIN
el espacio intermembrana. Este proceso permite el paso de dos protones desde la matriz
al espacio intermembrana (Lodish H et al., 1997).
La antimicina es un inhibidor de la cadena de transporte a este nivel,
interrumpiendo el flujo de electrones dentro del complejo III (Bailey et al., 1999).
d) Complejo IV: Citocromo C oxidasa

Est formado por 13 subunidades. Las tres mayores (I, II y III), codificadas por el
ADNmt, estn asociadas al grupo prosttico (grupo Hemo con Cua y Cua3) (Tsukihara
et al., 1995) y realizan funciones catalticas y de bombeo protnico. Las 10 ms
pequeas estn codificadas por el ADNn, y su funcin consiste en modular la actividad
total de la enzima (Rubio et al., 1998). El complejo posee dos grupos hemo, un
citocromo a, un citocromo a3, as como dos centros de cobre (Cua y Cub). El centro de
reduccin del O2 a agua tiene lugar en el hemo a3 y en el Cub, denominndose centro
binuclear de la Citocromo C Oxidasa (Tsukihara et al., 1995).El citocromo c transporta
de uno en uno los electrones procedentes del complejo III, al complejo citocromo c
oxidasa que utiliza cuatro electrones para reducir el O2 produciendo H2O (Rottenberg H,
1998).
El proceso anterior permite la salida de dos protones desde la matriz al espacio
intermembrana. Parte de estos protones se utilizan para la formacin de agua.
e)
Complejo V: ATP sintasa

El complejo V, formado por 16 protenas
diferentes, tiene dos componentes principales: F0 y

F1. El dominio hidrofbico F0 est formado por 5
subunidades integradas en la membrana interna, por
el contrario el dominio hidroflico F1 est compuesto
por
tres
subunidades
situadas
en
la
matriz
mitocondrial (Figura 5).

La
funcin
de
la
ATP
sintasa
est
estrechamente ligada a la protena translocadora de
Figura 5. Representacin esquemtica del

complejo ATP sintasa. Modificado de
Molecular Cell Biology. Sixth Edition.
nucletidos de adenina (ANT). El ANT es una

protena situada en la membrana interna constituida por un homodmero compuesto por
dos subunidades de 30.000 Daltons. El ANT transporta el ATP desde la matriz
mitocondrial al citosol y el ADP en sentido contrario en una relacin 1:1, ya que estos
31
INTRODUCCIN
nucletidos de adenina son molculas hidroflicas muy cargadas por lo que no pueden
atravesar la membrana mitocondrial (Thomas M.Devlin, 2004).
La ATP sintasa (F0F1 ATPasa) acopla el movimiento de protones a favor de
gradiente electroqumico con la sntesis de ATP, a partir del ADP introducido por el
ANT y fosfato (Saraste, 1999).
En resumen, el resultado final es el consumo de oxgeno y la produccin de
energa en forma de ATP, por lo que el proceso se denomina fosforilacin oxidativa.
En condiciones ideales, al finalizar el proceso de OXPHOS se generan 36
molculas de ATP a partir de una molcula de glucosa.
1.3. FOSFORILACIN OXIDATIVA.

La oxidacin mitocondrial empieza cuando la enzima citoslica piruvato
deshidrogenasa genera acetil CoA a partir de piruvato, el cual procede del metabolismo
de la glucosa a travs de la va glucoltica. Tambin se puede generar acetil CoA en la
matriz mitocondrial mediante la -oxidacin de los cidos grasos.
El acetil CoA citoslico o mitocondrial se incorpora al ciclo de Krebs, el cual
produce protones en forma de NADH y FADH2 y electrones. Estos ltimos son
captados por la cadena de transporte de electrones, movindose a travs de los cuatro
complejos descritos anteriormente a favor de gradiente energtico (Figura 6).
32
INTRODUCCIN
Figura 6. Representacin esquemtica del transporte de electrones a travs de

la cadena respiratoria. Se puede observar que los electrones se mueven a favor
de gradiente energtico, liberando energa que se usa para el transporte de
protones.
Segn la teora quimiosmtica de Mitchell, la energa liberada durante este

transporte es utilizada para bombear los protones generados desde la matriz
mitocondrial hacia el espacio intermembrana. Como consecuencia de este proceso, se
genera un gradiente electroqumico que se usa para la generacin de ATP.
Finalmente, los electrones generados por el ciclo de Krebs son captados por el
oxgeno, que se transforma en agua (Mitchell, 1961; Mitchell et al., 1965; Mitchell et
al., 1969), mediante una reaccin catalizada por el complejo IV (Figura 7).
33
INTRODUCCIN
Figura 7. Representacin esquemtica de la cadena de transporte de electrones y de la fosforilacin

oxidativa. El NADH procedente del ciclo de Krebs cede los electrones y tambin los protones al complejo
I. La succinato deshidrogenasa, componente del complejo II de la cadena de transporte cataboliza el
succinato y los electrones generados tambin son cedidos a la cadena de transporte de electrones.
Finalmente los electrones son transferidos al oxgeno y el gradiente de protones se usa para la formacin
de ATP.
1.3.1. FOSFORILACIN OXIDATIVA Y CONSUMO DE OXGENO
El consumo de oxgeno puede ser determinado mediante el Electrodo de Clarke.

Con este aparato se puede analizar el consumo de oxgeno en los diferentes estados
metablicos mitocondriales (Figura 8).
34
INTRODUCCIN
Figura 8. Medida del consumo de oxigeno mediante Electro de Clark. En la figura se pueden observar los
diferentes ratios en el consumo de oxgeno al aadir succinato (Estado 2), ADP (Estado 3) y cuando se
consumen las molculas de ADP (Estado 4).
Modificado de
Puente-Maestu et al. J.Appl.Physiol
(Puente-Maestu et al., 2013).
Como se puede observar, al aadir mitocondrias a un medio respiratorio, ests

prcticamente no consumen oxgeno ya que no disponen de un sustrato caracterstico
del ciclo de Krebs que genere electrones.
Sin embargo, cuando se aade un sustrato como el NADH o el succinato (Estado
2), se producen electrones que son transportados a travs de la cadena de transporte,
aumentando as el consumo de oxgeno.
No obstante, al aadir ADP (Estado 3) se obtiene la mayor tasa de consumo de
oxgeno, ya que es el nico factor limitante de la velocidad de transporte de electrones.
Por ello, cuando se consume todo el ADP (Estado 4), la velocidad de consumo de
oxgeno vuelve a ser muy parecida al Estado 2.
Dado que durante todo el proceso de fosforilacin oxidativa se suceden reacciones
estequiomtricas, el nmero de molculas de oxgeno consumido para transformar todo
el ADP aadido en ATP, o ndice ADP/O (Ochoa S, 1943b; Ochoa S, 1943a), es uno de
los mejores indicadores de la eficacia del estado mitocondrial.
35
INTRODUCCIN
En condiciones normales, el ndice ADP/O presenta un valor aproximado de 3

cuando se usa NADH e inferiores a 2 cuando se usa succinato como sustrato (Hinkle,
2005). Esto es debido a que el transporte de electrones iniciado por un sustrato del
complejo I libera ms energa que cuando es inducido por un sustrato del complejo II
(Figura 6).
El estado de desacoplamiento mitocondrial se consigue al aadir CCCP al medio,
lo que ocasiona la apertura de poros y la prdida del gradiente de protones. Esto provoca
un gran incremento del consumo de oxgeno para intentar mantener el potencial de
membrana (Nieminen et al., 1994; Zamzami et al., 1995; Pfeiffer et al., 2001; Gunter et
al., 2004; Lopez-Mediavilla et al., 1995).
1.3.2. FOSFORILACIN OXIDATIVA Y POTENCIAL DE MEMBRANA.
Como se ha indicado anteriormente, el objetivo del transporte de electrones y el

consiguiente consumo de oxgeno es generar la energa necesaria para bombear los
protones generados en el ciclo de Krebs desde la matriz mitocondrial al espacio
intermembrana. Por lo tanto hay una relacin directa entre el consumo de oxgeno y el
potencial de membrana (Figura 9).
Figura 9. Representacin esquemtica de la relacin entre el consumo de oxgeno y el potencial de

membrana. Modificado de Divakaruni et al. Physiology. (Divakaruni et al., 2011).
36
INTRODUCCIN
Cuando se usa el NADH como sustrato metablico la relacin H/O es de 10 y

cuando se usa succinato como sustrato la relacin H/O es de 6, por lo que es necesario
menos oxgeno para sintetizar ATP cuando se usa NADH (Tasa P/O de 10/4) que
cuando se usa succinato como sustrato (Tasa P/O de 6/4).
Como los protones tienen carga positiva, la expulsin de protones al espacio
intermembrana tambin supone cambio en el potencial de la membrana mitocondrial,
que en situaciones de reposo es aproximadamente de -150 mV (negativo en el lado de la
matriz). Si este orgnulo dispone de un sustrato oxidable como el succinato se
incrementa la diferencia del potencial de membrana hasta aproximadamente -220 mV
(Estado 2). Al aadir ADP (Estado 3) el gradiente de protones es aprovechado por la
ATP sintasa para producir ATP y se produce la cada inmediata del potencial a unos
-172 Mv (Figura 10).
Figura 10. Representacin esquemtica de los cambios de potencial de membrana en funcin de los
estados metablicos. Como se puede observar al aadir succinato el potencial de membrana aumenta de
-150 mV hasta aproximadamente -220 mV. Sin embargo, al aadir ADP el potencial de membrana
disminuye hasta valores aproximados de -180 mV. Cuando se agotan las molculas de ADP el potencial
de membrana vuelve a aumentar hasta valores aproximados de -220 mV.
37
INTRODUCCIN
Finalmente, al aadir un agente desacoplante como el carbonylcyanide mcholorophenilhydrazone (CCCP), el cual forma poros en la membra interna, se produce
el paso a favor de gradiente de los protones a la matriz mitocondrial y como
consecuencia la cada del potencial de membrana. Otros agentes capaces de desacoplar
la fosforilacin oxidativa, son los ionforos valinomicina y nigericina, los cuales
permiten el paso de iones potasio (Prebble, 2013).
Por lo tanto, el potencial de membrana tambin es un parmetro importante para
valorar la funcionalidad mitocondrial (Lopez-Mediavilla et al., 1995; Juan et al., 1994).
En este sentido, la citometra de flujo es uno de los mtodos de referencia para
medir el potencial de membrana mitocondrial (Lopez-Mediavilla et al., 1995; O'Connor
et al., 1988a; O'Connor et al., 1988b; Almeida et al., 1994). Para ello, se usan
fluorocromos catinicos y lipoflicos como la rodamina 123 (Rh-123). Al ser una
molcula lipoflica, atraviesa la membrana mitocondrial y se acumula en la matriz en
funcin del potencial de membrana. Al aumentar el potencial de membrana, pasa ms
rodamina al interior de la mitocondria y por lo tanto la intensidad de fluorescencia
aumenta. La magnitud de este cambio refleja la funcionalidad de la mitocondria (LopezMediavilla et al., 1995; Cossarizza et al., 1996).
Lamentablemente, al igual que ocurre con el consumo de oxgeno, este proceso no
es perfecto ya que los protones pueden volver a la matriz sin pasar a travs de la ATP
sintasa, a este proceso se le denomina fuga de protones o Proton Leak (Jastroch et
al., 2010a). Los mecanismos de fuga de protones incluyen la difusin de los mismos a
travs de la membrana, y tambin el flujo a travs de protenas integrales de membrana,
como las protenas de desacoplamiento (UCP1, UCPx) y los ANT (Figura 11) (Jastroch
et al., 2010a).
38
INTRODUCCIN
Figura 11. Representacin esquemtica del bombeo de protones y de la fuga de protones a travs
de la membrana mitocondrial interna. Modificado de Jastroch et al. Essays Biochem. (Jastroch et
al., 2010a).
En cualquier caso, en condiciones normales, existe una relacin estequiomtrica

entre el consumo de oxgeno, el potencial de membrana y la formacin de ATP, y se
dice que la mitocondria est acoplada. Sin embargo, si se pierde esa relacin decimos
que la mitocondria est desacoplada.
1.4. MITOCONDRIA Y ESTRES OXIDATIVO.

Como se ha comentado anteriormente, durante la fosforilacin oxidativa la
mayora del oxgeno es convertido en agua en una reaccin catalizada por el complejo
IV. Sin embargo, un 1-2% (Serviddio et al., 2010; St-Pierre et al., 2002) del oxgeno
capta electrones directamente y genera iones superxido (O2.), principalmente en los
complejos mitocondriales I y III, aunque tambin en los complejos II y IV (Aroor et al.,
2012; Ji, 1999; Kowaltowski et al., 2009).
39
INTRODUCCIN
Debido a este fenmeno, la fosforilacin oxidativa es la principal fuente de

especies reactivas del oxgeno (EROs) (Boveris et al., 1972; Chance et al., 1979), ya
que adems, el in superxido se puede convertir en hidroperoxil (HO2.) y en el anin
hidroxilo (HO-) (Nohl, 1994; Kowaltowski et al., 1999; Lu et al., 2002).
A este tipo de molculas tambin se les conoce como radicales libres, las cuales se
forman por la prdida o captacin de un electrn o por fisin homoltica de un enlace
covalente. A consecuencia de estas reacciones qumicas, los radicales libres presentan
uno o ms electrones desapareados en su orbital ms externo (Halliwell, 2001). Dentro
del trmino EROs se incluyen adems otras molculas derivadas del oxgeno que no son
radicales pero s altamente reactivas como es el singlete de oxgeno (1g O2) y el
perxido de hidrgeno (H2O2) (Halliwell, 2001).
A pesar de tener una semivida del orden de milisegundos (Sies, 1993), estas
molculas tienen una gran importancia fisiolgica ya que intervienen en mecanismos
como, vasodilatacin, proteccin frente a bacterias,
No obstante, debido a su estructura atmica los radicales libres son molculas
muy reactivas, y pueden producir la oxidacin de diversas molculas como colgeno,
elastina, mucopolisacridos, lpidos, e incluso ADN. Para evitar este dao celular, en
situaciones de homeostasis, el interior celular es un ambiente reductor ya que tanto la
mitocondria como la clula poseen mecanismos antioxidantes, como por ejemplo la
coenzima Q, el glutatin y las enzimas antioxidantes que se describen a continuacin.
En primer lugar, la enzima superxido dismutasa (SOD), ya sea en el citosol
(SOD1) o las mitocondrias (SOD2) transforma el anin superxido en perxido de
hidrgeno (H2O2) (Boveris et al., 1972; Boveris et al., 1973; Loschen et al., 1974). Este
ltimo es transformado en agua por las enzimas citoplasmticas catalasa y glutation
peroxidasa. Otro mecanismo de gran importancia para la eliminacin de estas especies
es la reaccin de Fenton (Figura 12).
40
INTRODUCCIN
Figura 12. Mecanismos del dao oxidativo celular y enzimas antioxidantes. Se pueden observar las
funciones de las enzimas antioxidantes y las consecuencias de un desequilibrio en la produccin de
radicales libres.
El problema aparece cuando existe un desequilibrio entre la produccin de

especies reactivas del oxgeno y la capacidad de la clula de eliminar dichas especies o
reparar el dao resultante, producindose un aumento del estrs oxidativo que provoca
daos en la propia mitocondria (Gadaleta et al., 1998; Wei et al., 2002; Troen, 2003) y
en la clula.
De hecho, hoy en da se cree que el estrs oxidativo tiene un papel principal en un
proceso como es el envejecimiento, que sera resultado, segn la teora de los radicales
libres propuesta por Denham Harman en 1973, de una inadecuada proteccin contra el
dao producido por los radicales libres (Harman, 1973; Harman, 1992; Harman, 2006).
La teora sugiere que, con el tiempo, el dao acumulado en las mitocondrias comporta la
disminucin en la produccin de ATP y en general un dao mitocondrial, lo que a su
vez incrementa la produccin de radicales libres, acelerando as el dao. En
consecuencia, los tejidos que forman el organismo empiezan a fallar. De hecho,
numerosos estudios demuestran que existe un desequilibrio entre los mecanismos
prooxidantes y antioxidantes que aumenta con la edad (Beckman et al., 1998; Liu et al.,
1999). Otro dato que apoya esta hiptesis es que se ha encontrado una buena correlacin
entre los niveles celulares de superxido dismutasa (enzima con accin antioxidante) y
la longevidad de diferentes primates (Tolmasoff et al., 1980).
41
INTRODUCCIN
Adems, tambin existen numerosos estudios que avalan el importante papel que
juega la mitocondria y el estrs oxidativo en el desarrollo de enfermedades
neurodegenerativas (Toescu, 2005) como el Alzheimer, Parkinson (Knott et al., 2008),
y la esclerosis mltiple (Mahad et al., 2008; Mahad et al., 2009) o en enfermedades
como el cncer (Gupta-Elera et al., 2012). Tambin existen numerosos trabajos que
avalan el papel del estrs oxidativo en procesos inflamatorios como diabetes (Lee et al.,
2015), artritis (Sahebari et al., 2015) y enfermedades cardiovasculares (Ballard et al.,
2015).
Por todo ello es de gran inters conocer los mecanismos que regulan la funcin
mitocondrial y la produccin de radicales libres.
En este sentido trabajos previos de nuestro grupo avalan que la hormona insulinlike growth factor 1 (IGF-1) puede jugar un papel clave en la funcin mitocondrial y
tambin, todava no conocemos si de manera directa o a travs de la regulacin de la
funcin mitocondrial, en la disminucin del estrs oxidativo.
1.5. INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR 1 (IGF-1) O

FACTOR DE CRECIMIENTO TISULAR 1.
1.5.1. ESTRUCTURA Y EXPRESIN GNICA DE IGF-1.
El factor de crecimiento semejante a la insulina tipo 1 (IGF-1, Insulin-like growth

factor-1) o tambin conocido como somatomedina C, es en el humano una hormona
polipeptdica de 71 aminocidos, que tiene un peso molecular de aproximadamente 7,6
KDa. Adems de efectos endocrinos, tambin presenta acciones, paracrinas y
autocrinas. Comparte ms de 60% de homologa con IGF-2 y alrededor de un 50% con
la estructura de la proinsulina (Le et al., 1997). La estructura secundaria general de IGF1 humana se muestra en la figura 13.
42
INTRODUCCIN
Figura 13. Estructura secundaria de la hormona IGF-1.
El gen que codifica para la sntesis de IGF-1, se localiza en el brazo largo del
cromosoma 12, y presenta al menos 5 exones. El gen humano est identificado como
IGF-1 [Homo sapiens] GenBank: CAA01954.1.
El mRNA, nmero de acceso A29117, tiene una longitud de 216 pares de bases.
No obstante, existen dos formas transcripcionales distintas, IGF-1a e IGF-1b, las cuales
presentan diferencias en la regin 3, o lo que es lo mismo en la regin carboxiterminal
(dominio E) (Figura 14). Lamentablemente, todava hoy en da no se conoce en detalle
el significado funcional que tienen estas dos formas transcripcionales (Langford et al.,
1993; Lonergan et al., 2000).
43
INTRODUCCIN
Figura 14. Esquema del splicing alternativo del gen IGF-1. La variante de IGF-1Ea se genera por
splicing de los exones 4 y 6. La variante IGF-1Eb se genera por splicing de los exones 4,5 y 6.
Modificado de Candice et al. Front Endocrinol. (Candice G.T.Tahimic, 2013).
Adems, tambin puede existir una modificacin a nivel postranscripcional, ya

que la accin de una proteasa puede transformar el IGF-1 en des(1-3)IGF-1 (Sara et al.,
1990).
Debido a su parecido estructural de los pptidos IGF-1 e IGF-2 con la proinsulina,
se denominan factor de crecimiento semejante a la insulina tipo 1 y tipo 2, ambas
molculas cumplen con los criterios que caracterizan a las somatomedinas: Poseen
actividad semejante a la insulina en presencia de anticuerpos anti-insulina (Froesch et
al., 1963; Zapf et al., 1978); son factores de sulfatacin (Zapf et al., 1978; Froesch et
al., 1976); pueden actuar como mitgenos (Zapf et al., 1978; Rinderknecht et al., 1976);
y al menos IGF-1 es dependiente de la hormona del crecimiento (GH) (Daughaday et
al., 1972).
La concentracin en suero vara a lo largo de la vida, existiendo un pico en la
pubertad y disminuyendo progresivamente con la edad (Figura 15) (Lamberts et al.,
1997).
44
INTRODUCCIN
Figura 15. Evolucin de las concentraciones plasmticas de IGF-1 con la edad. Se pueden observar que
los niveles de IGF-1 aumentan durante la infancia hasta alcanzar un pico justo antes de la pubertad.
Despus de la pubertad la concentracin de IGF-1 va disminuyendo paulatinamente.
No obstante, como todas las hormonas, la produccin de IGF-1 est muy

regulada, en especial por eje hipotmo-hipfisis, y por otros mecanismos que todava
hoy en da no se conocen en profundidad (Clemmons, 1998).
1.5.2 REGULACIN DE LA PRODUCCIN DE IGF-1.
La sntesis de IGF-1 comienza cuando el hipotlamo produce hormona liberadora

de hormona del crecimiento o GHRH, la cual estimula a la produccin de GH por parte
de la hipfisis. La GH es la responsable de ms del 75% del IGF-1 circulante de la
(Daughaday et al., 1989; Clemmons, 1991), el cual se sintetiza en prcticamente todos
los rganos, aunque principalmente en el hgado.
No obstante, en otros tejidos, la sntesis de IGF-1 parece ser regulada por factores
trficos especficos, como por ejemplo los estrgenos en el tero (Murphy et al., 1988),
o la hormona estimulante del folculo (FSH) en el ovario (Adashi et al., 1991).
El estado nutricional tambin juega un papel principal en la regulacin de la
sntesis de este factor de crecimiento, ya que en situaciones de ayuno se produce
Ghrelina, la cual estimula la secrecin de GH (Figura 16).
45
INTRODUCCIN
El aumento de los niveles de IGF-1 en suero inicia una serie de mecanismos de

retroalimentacin negativa o feedback negativo, ya que inhibe de manera directa la
sntesis de GH por parte de la hipfisis y adems estimula la produccin por parte del
hipotlamo de somatostatina, la cual tambin inhibe la produccin de GH (Figura 16)
(Ceda et al., 1985; Castilla-Cortazar et al., 2001).
Figura 16. Eje GH/IGF-1. La GHRH producida por el hipotlamo estimula la secrecin por parte de la
hipfisis de GH, que a su vez estimula la sntesis de IGF-1. Este factor promueve el crecimiento de
diversos rganos. Adems, IGF-1 inhibe su propia sntesis, ya que inhibe la produccin de GH de manera
directa y tambin de manera indirecta, estimulando la secrecin de somatostatina por parte del
hipotlamo. Las lneas continuas indican estimulacin y las lneas a trazos indican inhibicin. Modificado
de Rees et al. Nature Reviews Nephrology (Rees et al., 2011).
A diferencia de la GH, IGF-1 no muestra variaciones en la concentracin a lo

largo del da. Esto es debido a que cuando es liberado a sangre se une a protenas
transportadoras, que tienen entre otras funciones, la de actuar como reservorio de esta
hormona.
46
INTRODUCCIN
1.5.3. PROTENAS TRANSPORTADORAS DE IGF-1 (IGFBPS).
Las protenas de unin a IGF-1 (IGFBPs) son pptidos con un tamao

comprendido entre 200 y 300 aminocidos, con puentes disulfuro y carbohidratos en su
interior que resultan de vital importancia para poderse unir a IGF-1 y a la superficie
celular, respectivamente (Cohick et al., 1993b), hasta tal punto que, aproximadamente,
el 90% de IGF-1 en sangre se encuentra ligado a las IGFBPs (Yamamoto et al., 1995),
lo que determinar su posterior biodisponibilidad.
Las IGFBPs se encuentran presentes en prcticamente todos los fluidos
biolgicos: lquido folicular, lquido amnitico, humor vtreo, linfa, plasma, lquido
seminal, lquido cefalorraqudeo y en todas las secreciones gastrointestinales. Se
expresan prcticamente en todos los tejidos, sugiriendo un papel modulador de IGF-1 en
las acciones locales y sistmicas (Zapf, 1995; Duan et al., 2005).
No obstante, la principal fuente de IGFBPs es el hgado (Nedic et al., 2004). Las
protenas de unin a IGF-1 de alta afinidad son las denominadas IGFBP-1, 2, 3, 4, 5, 6,
las cuales se representan en la figura 17.
Figura 17. Estructura terciaria de las principales protenas de unin a IGF-1 (IGFBPs).
De todas ellas, IGFBP-3 es la protena de unin ms importante, la de mayor

afinidad y de mayor concentracin plasmtica (Langford et al., 1993). IGFBP-3 forma
un complejo ternario con una glicoprotena (ALS, Acid-labile subunit) que le da
estabilidad.
Las IGFBPs no slo son protenas transportadoras tambin actan como
reservorio de IGF-1, prolongando la vida media de ste en la circulacin (Clemmons,
1992; Thissen et al., 1994; Smith et al., 1995). Adems, sirven para regular las acciones
47
INTRODUCCIN
tanto endocrinas como paracrinas o autocrinas ya que modulan la disponibilidad de esta

hormona para unirse a sus receptores (Gu et al., 2010; Contois et al., 2012; Roghani et
al., 1989; Martin et al., 1990; Bach et al., 2013).
1.5.4. RECEPTORES DE MEMBRANA Y VAS DE SEALIZACIN.
Como ocurre con las dems hormonas, la accin fisiolgica de IFG-1 depende de
la unin a su receptor.
El receptor de IGF-1R es un receptor tipo tirosin-kinasa (Tk) que activa a las vas
de sealizacin Akt y ras, implicadas ambas en la supervivencia proliferacin celular
(LeRoith et al., 1995; Chitnis et al., 2008; Annenkov, 2009).
Adems, IGF-1 puede unirse con menor afinidad al receptor caracterstico de la
insulina (IR), motivo por el cual puede mediar alguna de las funciones metablicas de
esta hormona (Sara et al., 1990; Cohick et al., 1993b; Rubin et al., 1995).
Tambin se puede unir a un tercer tipo de receptor, el IRR, hbrido entre el IGF1R y el IR, ya que est constituido por dos heterodmeros de cada uno de ellos. Los
niveles de IRR en los distintos tejidos son muy variables (Soos et al., 1993; Bailyes et
al., 1997).
A su vez, la insulina tambin puede unirse al receptor de IGF-1 y al receptor
hbrido con menor afinidad que al suyo propio (Figura 18).
48
INTRODUCCIN
Figura 18. Representacin esquemtica de los receptores de IGF-1, IGF-2 e insulina. Se puede observar
que IGF-1, IGF-2 e insulina se unen a sus receptores especficos y tambin, con menor afinidad, a los
receptores caractersticos de las otras hormonas.
1.5.5. FUNCIONES FISIOLGICAS DE IGF-1.
Como IGF-1 activa genes relacionados con la sntesis de protenas y proliferacin

celular, esta hormona tiene principalmente una accin anabolizante y estimuladora del
crecimiento tisular. Adems, debido a su semejanza estructural con la insulina, es
hipoglucemiante. Estas y otras funciones fisiolgicas se describen en detalle a
continuacin.
1.5.5.1. Crecimiento y desarrollo corporales.
IGF-1 y principalmente, IGF-2 juegan un papel esencial durante la etapa postnatal

pero tambin durante el desarrollo fetal (Daughaday et al., 1989; Adamo et al., 1989;
Cohick et al., 1993a).
49
INTRODUCCIN
De hecho, se cree que IGF-1 es la principal responsable del desarrollo fetal, ya

que diversos estudios han demostrado que la deficiencia de GH no se asocia a una
disminucin significativa de la talla corporal al nacimiento (Wit et al., 1992; Savage et
al., 1993; Laron et al., 1999; Savage et al., 2001b). Por el contrario, mutaciones que
inactivan el gen de IGF-1 o su receptor, s que se asocian a una disminucin de la talla
corporal al nacimiento (Leal et al., 2011; Abuzzahab et al., 2003; Lupu et al., 2001;
Woods et al., 1996; Liu et al., 1993). Adems, estos hallazgos sugieren que durante el
desarrollo intrauterino IGF-1 tiene una regulacin y actividad fisiolgica independiente
de GH.
Sin embargo, durante la edad adulta, la GH s presenta acciones directas sobre el
crecimiento seo (Backeljauw et al., 2001; Savage et al., 2006). Por otra parte, la GH
hipofisaria es capaz de inducir la sntesis en hgado y en otros tejidos de IGF-1, el cual
acta de forma endocrina, paracrina y autocrina promoviendo el crecimiento de los
huesos (Ohlsson et al., 2009). En base a estos estudios, se puede concluir que tanto GH
como IGF-1 tienen efectos independientes y sinrgicos en cuanto a la promocin del
crecimiento corporal postnatal se refiere (Figura 19).
Figura 19. Hiptesis de la regulacin del crecimiento seo mediado por la GH e IGF-1. Hasta hace uno
aos se pensaba que las acciones de la GH estaban mediadas por la hormona IGF-1. Sin embargo, segn
la hiptesis actual, la hormona GH tiene acciones directas sobre el hueso y tambin promueve de manera
indirecta el crecimiento sea mediante la produccin endocrina de IGF-1 por el hgado y estimulando la
produccin por parte del hueso de IGF-1, que acta de forma paracrina. Modificado de Ohlsson et al.
Endocr.Rev. 2009. (Ohlsson et al., 2009).
50
INTRODUCCIN
1.5.5.2. Funciones metablicas de IGF-1.
En condiciones fisiolgicas el IGF-1 circulante no muestra un efecto

hipoglucemiante. Sin embargo, la administracin intravenosa de IGF-1 s que
disminuye la concentracin de glucosa en sangre, tanto en animales de experimentacin
como en humanos, siempre y cuando la dosis supere la capacidad de unin de las
protenas transportadoras (IGFBPs). Este dato indica que el efecto hipoglucemiante de
IGF-1 es debido a la presencia de IGF-1 libre, mientras que el unido a IGFBPs no
produce tal efecto (Bondy et al., 1994; Binoux, 1995; Bang et al., 2001).
Tambin se ha observado que la administracin por va subcutnea amortigua el
efecto hipoglucemiante, ya que el paso gradual de IGF-1 al torrente circulatorio permite
una unin progresiva a sus protenas transportadoras (Bondy et al., 1994; Binoux, 1995;
Tomas et al., 1996). En este sentido, tambin puede evitarse la hipoglucemia con
tratamientos a largo plazo, puesto que al parecer el propio IGF-1 induce la sntesis de
IGFBP-3 (Cohick et al., 1993a).
No obstante, existen diferencias en cuanto a la regulacin del metabolismo por
parte de IGF-1 e insulina. La insulina disminuye en mayor medida que IGF-1 las
concentraciones de glicerol y cidos grasos libres en sangre, lo que sugiere que ni el
hgado ni el tejido adiposo son los principales rganos diana de IGF-1. Por el contrario,
IGF-1 parece tener un mayor efecto sobre el msculo, ya que induce una mayor
utilizacin de glucosa y lactato que la insulina (Bang et al., 2001).
Esto ltimo podra explicar que despus de la administracin de IGF-1 no se
observe una relacin entre los niveles de glucosa en sangre y la secrecin de insulina.
Esta supresin de la secrecin podra ser debida a un aumento de la utilizacin de
glucosa y tambin a aumento de la sensibilidad a la insulina (Binoux, 1995).
1.5.5.3. Modulacin inmunolgica.
Existen numerosos trabajos que avalan el importante papel de IGF-1 en el

desarrollo y la funcin del timo y la constitucin del sistema inmunitario en general
(Murphy et al., 1992a; Murphy et al., 1992b; Postel-Vinay et al., 1997).
De hecho, trabajos realizados en modelos animales, han demostrado que IGF-1
promueve la proliferacin de linfocitos T CD4+ CD8+ en timo y bazo (Hinton et al.,
1998). Tambin existen datos que avalan que este factor estimula la maduracin y
51
INTRODUCCIN
supervivencia de estas clulas (Walsh et al., 2002), de macrfagos y de granulocitos,

posiblemente porque inhibe los mecanismos de muerte celular (Tu et al., 2000; Walsh et
al., 2002; Rom et al., 1991; Smith et al., 2012).
El factor de crecimiento tisular tambin estimula la respuesta inmune humoral ya
que promueve la diferenciacin de las clulas B (Landreth et al., 1992), y media la
sntesis y el cambio de clase de las inmunoglobulinas (Robbins et al., 1994).
1.5.5.4. Desarrollo del Sistema Nervioso Central (SNC).
Clsicamente los efectos de la familia de IGF sobre el sistema nervioso central se

han atribuido a IGF-2 (Kan et al., 2014). No obstante, IGF-1 es producido de manera
local y adems el IGF-1 sistmico pude cruzar la barrera hemato-enceflica (BEH),
(Reinhardt et al., 1994), lo que avala que este factor de crecimiento tambin juega un
papel muy importante en la fisiologa del SNC. En este sentido, los picos de produccin
de IGF-1 coinciden con los periodos de proliferacin y diferenciacin de progenitores
neuronales y tambin con las fases de desarrollo neural, incrementando el nmero de
dendritas, y el nmero de sinapsis (D'Ercole et al., 1996).
1.5.5.5. Desarrollo y proteccin cardiovascular.
Los efectos concretos de IGF-1 sobre el sistema cardiovascular no se conocen en

profundidad. No obstante, diversos trabajos han demostrado que el miocardio, el
msculo liso artico y las clulas endoteliales producen IGF-1 y tambin que expresan
el receptor (D'Ercole et al., 1984; Guler et al., 1988; Delafontaine et al., 1991b;
Delafontaine et al., 1991a; Wickman et al., 1997), el cual muestra ms afinidad por este
factor de crecimiento que por la insulina (Johansson et al., 2008; Chisalita et al., 2009).
Tambin se ha observado que la produccin de IGF-1 cardaco aumenta en
respuesta a la GH (D'Ercole et al., 1984). Por consiguiente, hay diferentes posibilidades
tanto de acciones directas de GH, as como de efectos endocrinos, paracrinos y
autocrinos de IGF-1 sobre el sistema cardiovascular.
52
INTRODUCCIN
1.5.5.6. Gametognesis
El factor de crecimiento tisular ha sido relacionado tanto con la foliculognesis

ovrica como con la espermatognesis y funcin testiculares.
En los primates, los patrones de expresin de ARNm de IGF-1 y su receptor se
han estudiado a fondo durante la foliculognesis. IGF-1 se expresa en los oocitos y teca
de los folculos primordiales, folculos primarios, secundarios y folculos antrales en
crecimiento, pero no en los folculos preovulatorios (Silva et al., 2009). En la mayora
de las especies de mamferos estudiadas, ni GH ni IGF-1 parecen ser necesarios para la
transicin de folculos primordiales a folculos primarios, pero s son responsables de
promover el crecimiento del folculo secundario y la formacin de antro (Silva et al.,
2009).
Al igual que ocurre con la funcin ovrica, la funcin testicular es controlada
principalmente por las gonadotropinas LH y FSH (Rouiller-Fabre et al., 1998b;
Rouiller-Fabre et al., 1998a). No obstante, existen datos que indican que factores
producidos localmente son importantes reguladores de la funcin testicular (Lejeune et
al., 1996). En este sentido, IGF-1 est presente en testculos de humanos adultos
(Vannelli et al., 1988), posiblemente secretado por las clulas de Sertoli y de Leydig,
segn se ha deducido de estudios realizados in vitro (Cailleau et al., 1990; Naville et
al., 1990).
1.5.5.7. Desarrollo y funcin renales.
IGF-1 y el IGF-1R parecen tener un importante papel en el desarrollo glomerular,

ya que estudios realizados con animales transgnicos han demostrado que la deficiencia
de este factor o de su receptor se relacionan con alteraciones renales (Bridgewater et al.,
2008). En este sentido, ratones a los que se les haba inactivado el gen IGF-1, mostraban
un tamao renal reducido, que se deba a un menor tamao glomerular y una
disminucin del nmero de nefronas (Rogers et al., 1999). Trabajos realizados por otros
grupos tambin han observado que la inhibicin de la sealizacin a travs de IGF-1R
se manifiesta con alteraciones estructurales de los capilares glomerulares, y de los
podocitos (Bridgewater et al., 2008).
Adems, el IGF-1 parece estar implicado en la fisiologa renal, ya que la
administracin de IGF-1 a roedores fomenta el flujo sanguneo renal y la tasa de
53
INTRODUCCIN
filtracin glomerular (TFG) (Martin et al., 1991; Hirschberg, 1996; Bach, 2012;
Hirschberg et al., 1998). En los seres humanos la GH y el IGF-1 tambin aumentan el
flujo sanguneo renal y la tasa de filtracin glomerular en aproximadamente un 25%
(Kumar et al., 2011). Igualmente, promueve la reabsorcin de sodio por parte de los
tbulos renales mediante una accin directa e indirecta, estimulando la liberacin de
renina y la supresin de la secrecin del pptido natriurtico auricular (Flyvbjerg, 2000).
1.6. CONDICIONES DE DEFICIENCIA DE IGF-1.

Como se ha describo en los apartados anteriores IGF-1 presenta actividad en
numerosos rganos, por lo que su deficiencia est asociada a diversas patologas, como
el
crecimiento
intrauterino
retardado,
enfermedades
neurodegenerativas
cardiovasculares, pero en esta memoria nos vamos a centrar en los ejemplos ms tpicos
como son el sndrome de Laron, la cirrosis heptica y una situacin fisiolgica normal
como es el envejecimiento.
1.6.1. SNDROME DE LARON (SL).
En 1966, el grupo de Zvi Laron (Laron, 1966) describi la primera condicin de

deficiencia de IGF-1. Estos pacientes mostraban un fenotipo similar al enanismo
causado por deficiencia de GH, pero a diferencia de este, los niveles de esta hormona en
suero eran altos (Laron, 1966; Laron, 2004a; Laron, 2004b). A este nuevo tipo de
enanismo se le denomin sndrome de Laron o insensibilidad primaria a la hormona
de crecimiento (GHI).
Esta nueva patologa se caracterizaba por la incapacidad para sintetizar IGF-1 y
otras molculas relacionadas con este factor de crecimiento, como IGFBP-3 (Laron,
1999; Savage et al., 2001a; Laron, 1993).
La causa ms comn de esta enfermedad es la deficiencia del receptor de GH,
aunque tambin se han descrito alteraciones en la transduccin de seal mediada por
esta hormona, en la sntesis de IGF-1, en los receptores de IGF-1 y en la transduccin
de seal mediada por este ltimo.
En cuanto a su epidemiologa, esta patologa est estrechamente relacionada con
un origen tnico (> 90% de los casos) (Rosenbloom et al., 1994; Rosenfeld et al., 1994).
54
INTRODUCCIN
Clnicamente, el sndrome de Laron se caracteriza porque los neonatos muestran

una menor talla al nacimiento que los bebes sanos. Esto se puede explicar por los
resultados obtenidos en diversos estudios in vivo, que avalan que IGF-1 tiene una
mayor relevancia en el crecimiento fetal que la GH (Wit et al., 1992; Savage et al.,
1993; Laron, 1999; Savage et al., 2001a; Baker et al., 1993; Liu et al., 1993; Woods et
al., 1996; Lupu et al., 2001; Abuzzahab et al., 2003).
El retraso en el crecimiento se acenta durante la infancia, siendo su tasa de
crecimiento promedio aproximadamente la mitad de lo esperado para nios de la misma
edad (Rosenbloom et al., 1994; Rosenfeld et al., 1994). Este retraso en el desarrollo
hace que los pacientes muestren un fenotipo caracterstico, con frente prominente,
dimensin vertical de la cara reducida e hipoplasia del puente nasal (Figura 20).
Tambin se presentan otros problemas en el sistema seo, como son la osteopenia,
la mayor incidencia de la necrosis avascular de la cabeza femoral (Laron, 1984) y
retraso en la maduracin de la denticin (Laron, 1984)
Dado que IGF-1 tiene una accin pleiotrpica, tambin se ven afectados otros
rganos, como el corazn (Feinberg et al., 2000), el sistema muscular, lo que retrasa el
inicio de caminar en la mayora de los pacientes (Guevara-Aguirre et al., 1991; Brat et
al., 1997) y el sistema tegumentario (Lurie et al., 2004; Guevara-Aguirre et al., 1991).
Sin embargo, aunque alcanzan la pubertad de 3 a 7 ms tarde (Laron, 1984), las
funciones reproductivas no se ven alteradas (Rosenbloom et al., 1999).
Figura 20. Paciente de 2 aos con Sndrome de Laron. Se pueden observar las
alteraciones fenotpicas caractersticas como prominencia frontal e hipoplasia del
puente nasal. (Laron Z, 2011).
55
INTRODUCCIN
1.6.2. ENFERMEDAD HEPTICA CRNICA.
La enfermedad heptica crnica, tambin llamada cirrosis, es el resultado de un

dao del hgado, que se caracteriza por el reemplazo del tejido heptico, presencia de
ndulos de regeneracin, fibrosis y necrosis, lo que conduce a la prdida de la masa
heptica funcional.
Esta patologa es causada principalmente por el alcoholismo, los virus de tropismo
heptico (especialmente hepatitis B y C) y la esteatohepatitis (Quiroga et al., 1992).
Desde el punto de vista clnico esta patologa presenta numerosos sntomas entre
los que se encuentran el aumento de la presin arterial, ascitis, desnutricin, prdida de
masa muscular y de tejido graso, ginecomastia y atrofia testicular (Figura 21). En
Estados Unidos la cirrosis heptica representa la duodcima causa de muerte.
Figura 21. Paciente con cirrosis heptica asctica y grave desnutricin. Se puede observar
el abdomen hinchado as como la prdida de masa muscular y de tejido graso y la
marcada ginecomastia.
56
INTRODUCCIN
La cirrosis heptica se asoci por primera vez con una disminucin de los niveles
de IGF-1 a mediados de los aos 70 (Wu et al., 1974). Trabajos posteriores demostraron
que esta disminucin no se debe nicamente a la muerte de los hepatocitos, sino
tambin a la disminucin de los receptores de GH en estas clulas (Chang et al., 1990).
Todos estos datos han hecho que esta patologa se considere una condicin de
deficiencia de IGF-1.
Adems, la determinacin de IGF-1 en plasma tiene un gran inters clnico. En
primer lugar, existe una disminucin variable de este factor desde las primeras etapas de
la enfermedad (Caregaro et al., 1997), que est relacionada con la funcionalidad
heptica (Sheppard et al., 1987; Caufriez et al., 1991; Assy et al., 1997). En segundo
lugar, los niveles de IGF-1 se asocian al ndice de supervivencia de estos pacientes. Por
ltimo, una marcada disminucin de las concentraciones de este factor de crecimiento
tambin se asocia a una mayor probabilidad de aparicin de hepatocarcinoma (Inaba et
al., 1999). Todos estos hallazgos hacen que IGF-1 sea considerado un marcador
pronstico en esta patologa (Moller et al., 1996; Caregaro et al., 1997).
Los modelos animales de cirrosis heptica experimental (por tetracloruro de
carbono, tioacetamida, ligadura del conducto biliar, D-galactosamina, etc.) tambin han
aportado datos de gran relevancia sobre el papel de IGF-1 en la fisiopatologa de esta
enfermedad.
En concreto, diversos grupos de investigacin, entre ellos el nuestro, han
demostrado que el tratamiento con IGF-1 en la cirrosis experimental induca una mejora
de la funcin intestinal, ya que se ha observado una mayor absorcin de nitrgeno
(Picardi et al., 1997), de aminocidos y de azcares (Castilla-Cortazar et al., 1997b;
Castilla-Cortazar et al., 1999; Pascual et al., 2000; Castilla-Cortazar et al., 2004b),
adems de la recuperacin de la barrera intestinal (Lorenzo-Zuniga et al., 2006).
Tambin se observ una mejora de la actividad heptica, reflejada en el aumento
del metabolismo de la glucosa (Castilla-Cortazar et al., 1997b; Castilla-Cortazar et al.,
1997a), de la albuminemia y de los factores de coagulacin, adems de una disminucin
de la hipertensin portal, de la fibrosis heptica, y del dao oxidativo (Castilla-Cortazar
et al., 1997a; Muguerza et al., 2001).
Por ltimo, tambin se han descrito mejoras en otros rganos afectados por esta
patologa como los huesos (Cemborain et al., 2000; Cemborain et al., 1998), testculos
(Castilla-Cortazar et al., 2004a; Castilla-Cortazar et al., 2000), y sistema endocrino
(Castilla-Cortazar et al., 2001).
57
INTRODUCCIN
Esta mejora de la funcin heptica mediada por IGF-1 se asoci con efectos
hepatoprotectores, anti-apoptticos y con una recuperacin de la disfuncin
mitocondrial (Muguerza et al., 2001; Mirpuri et al., 2002; Garcia-Fernandez et al.,
2005; Perez et al., 2008; Tutau et al., 2009).
Posiblemente, los resultados obtenidos de estos modelos in vivo expliquen los
mecanismos por los cuales los pacientes incluidos en un ensayo clnico que consista en
la administracin de este factor de crecimiento mostraban una mejora de su estado.
1.6.3. ENVEJECIMIENTO Y ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA

EDAD.
El envejecimiento es un proceso intrnseco, heterogneo y multidimensional que

se caracteriza por una paulatina prdida de las funciones fisiolgicas, aumentando la
probabilidad de muerte. Aunque relacionada, la longevidad se diferencia del
envejecimiento, ya que la primera resulta de la simple consideracin de la duracin de
la vida independientemente del proceso de envejecimiento biolgico.
Los sntomas del envejecimiento, incluyen prdida de masa muscular, aumento de
la adiposidad, reduccin de la densidad mineral sea, disminucin de los niveles
energticos, junto con alteraciones en los indicadores psicolgicos de la calidad de vida
(Bartke et al., 2003).
En lo referente a las causas del envejecimiento, se han propuesto muchos
mecanismos responsables de este proceso (Weinert et al., 2003). Hoy en da existen dos
grandes teoras, (Goldstein et al., 1989), las que afirman que el proceso de
envejecimiento sera el resultado de la suma de alteraciones que ocurren en forma
aleatoria y se acumulan a lo largo del tiempo y las que suponen que el envejecimiento
estara predeterminado.
Seguramente en el proceso de envejecimiento hay una accin conjunta de ambos
mecanismos, pero la importancia relativa puede ser diferente en funcin del tipo celular.
As, las alteraciones en la metilacin de ADN, el agotamiento telomrico y la falta de
respuesta a factores de crecimiento (Kim et al., 2002) tendran gran importancia en
aquellos tejidos con una alta tasa de mitosis, como la mdula sea, piel y mucosa
gastrointestinal. De hecho, la longitud de los telmeros est asociado al riesgo de
desarrollo enfermedades asociadas a la edad como patologas vasculares y trastornos
metablicos (Fitzpatrick et al., 2007; Vasan et al., 2008).
58
INTRODUCCIN
Sin embargo, el dao causado por radicales libres podra ser la principal causa en
clulas con una baja tasa de replicacin como las neuronas o las fibras musculares. De
hecho, se ha observado que las especies con mayores tasas metablicas tienen una vida
media ms corta (Van Raamsdonk et al., 2010). Este fenmeno es posiblemente debido
a la mayor produccin de anin radical superxido por parte de las mitocondrias, lo que
aboca al dao celular y a un envejecimiento acelerado (Van Raamsdonk et al., 2010).
En este sentido, nuestro grupo ha realizado recientemente interesantes hallazgos
que podran establecer la relacin entre ambos mecanismos. En un modelo animal de
envejecimiento, que al igual que ocurre con el humano presentaba bajos niveles de IGF1, observamos que existan alteraciones en la funcin mitocondrial. En concreto, estos
orgnulos presentaban un menor potencial de membrana y un menor aprovechamiento
del consumo de oxgeno que se traduca en una disminucin de la sntesis de ATP.
Tambin observamos una activacin de las vas apoptticas mitocondriales.
Por el contrario, al inocular a los animales dosis fisiolgicas de IGF-1 se
recuperaban los niveles normales de IGF-1 en suero y se revertan los efectos adversos
derivados de los bajos niveles de esta hormona (Garcia-Fernandez et al., 2008; Puche et
al., 2008).
Debido a la mejora de la funcin mitocondrial o bien por mecanismos
independientes, la administracin de dosis bajas de este factor de crecimiento a
animales de edad avanzada tambin consigui disminuir el dao oxidativo y mejor la
actividad de las principales enzimas antioxidantes (Garcia-Fernandez et al., 2008; Puche
et al., 2008; Garcia-Fernandez et al., 2011; Castilla-Cortazar et al., 2011).
Los efectos beneficiosos de IGF-1 en el envejecimiento no slo se limitan a la
accin mitocondrial, otros grupos han descrito que en edades avanzadas existe una
relacin entre la concentracin de esta hormona en suero y la longitud de los telmeros
de los leucocitos (Moverare-Skrtic et al., 2009; Barbieri et al., 2009).
En relacin a estos mecanismos, o como va independiente, una de las principales
consecuencias que aparece con mucha frecuencia durante el proceso del envejecimiento
es la alteracin de los procesos metablicos, como por ejemplo el desarrollo de
resistencia a la insulina. Esta deficiencia representa adems un factor de riesgo para el
desarrollo de una gran variedad de enfermedades que afectan a la morbilidad y la
mortalidad en la ancianidad, como la hipertensin, la aterosclerosis, la obesidad, la
diabetes y las enfermedades neurodegenerativas (Reaven et al., 1988; DeFronzo et al.,
1991; Facchini et al., 2001; Umegaki et al., 2013; Bosco et al., 2012). En este sentido,
59
INTRODUCCIN
nuestro grupo ha demostrado que la administracin subcutnea de dosis bajas de IGF-1

mejora la resistencia a la insulina y el metabolismo de los lpidos en ratas de edad
avanzada (Garcia-Fernandez et al., 2008). Estos resultados sugieren que IGF-1 tambin
podra jugar un papel importante en el retraso de los sntomas del envejecimiento a
travs de sus funciones metablicas (Le et al., 1999).
En resumen, IGF-1 juega un papel trascendente en el correcto desarrollo y
funcionamiento de prcticamente todos los rganos. Adems, su deficiencia se asocia a
numerosas patologas, por lo que es de gran importancia conocer en profundidad sus
funciones fisiolgicas y en concreto sus mecanismos de accin celular.
En este sentido, trabajos previos de nuestro grupo realizados en modelos
animales de cirrosis heptica y de envejecimiento, ambos asociados a niveles bajos de
IGF-1, avalan que este factor puede estar implicado en la funcin mitocondrial y en la
regulacin el estrs oxidativo. En relacin a estos trabajos, posteriormente pudimos
desarrollar un nuevo modelo murino, basado en ratones transgnicos que tenan
truncado uno de los genes igf-1, y que como consecuencia mostraban menor
concentracin de IGF-1 en suero que los ratones con los dos genes funcionales.
En base a estos precedentes, pensbamos que estos animales constituan un
modelo ptimo para estudiar el papel que esta hormona juega en la funcionalidad
mitocondrial y el estrs oxidativo.
Adems, considerbamos que este estudio podra tener gran relevancia clnica,
ya que los ratones con deficiencia parcial de IGF-1 mostraban alteraciones similares a
las observadas en las patologas humanas asociadas a bajos niveles de esta hormona.
Por todo ello, nos planteamos los objetivos que se describen en el siguiente
apartado de esta memoria.
60
61
2.1. ANTECEDENTES E HIPTESIS DE TRABAJO

Desde hace aos, nuestro grupo viene investigando Condiciones de deficiencia
de IGF-1 como son la cierrosis heptica y el envejecimiento (Garcia-Fernandez et al.,
2005; Garcia-Fernandez et al., 2008; Puche et al., 2008) y ms recientemente, el
crecimiento intrauterino retardado y el sndrome metablico. En todos los estudios
realizados, en los correspondientes modelos experimentales hemos podido concluir que,
adems del ncleo, la principal diana celular de los efectos beneficiosos, que induce
IGF-1 cuando es administrado como terapia sustitutiva, es la mitocondria ((GarciaFernandez et al., 2008; Puche et al., 2008)).
Tras la inflamacin y el consiguiente dao oxidativo, la mitocondria puede
daarse, por peroxidacin de los lpidos de sus membranas o por carboxilacin de sus
protenas, convirtindose en la ms potente fuente de especies reactivas de oxgeno
(EROs) y radicales libres (O2., OH.) y perpetrando el dao oxidativo aunque haya
cesado la agresin inicial.
Con el fin de discutir hasta qu punto es la propia deficiencia de IGF-1 la que
hace ms vulnerable a este poderoso orgnulo celular, hemos recurrido a un modelo
experimental de deficiencia parcial de IGF-1 recientemente caracterizado (CastillaCortazar et al., 2014).
Con los antecedentes expuestos, la hiptesis del presente estudio fue dilucidar si
la mera deficiencia de IGF-1 se asocia con disfuncin o vulnerabilidad mitocondrial
reversible a la terapia sustitutiva con esta hormona a dosis bajas, similares a las
utilizadas en trabajos previos.
2.2. OBJETIVOS
Con esta finalidad los objetivos del presente trabajo fueron realizar en los tres
grupos experimentales: A) en ratones con deficiencia parcial de IGF-1 (Hz), de 62
meses de edad B) comparados con los Controles sanos (Co); y C) Ratones deficientes
en IGF-1 tratados con esta hormona durante 10 das; los siguientes estudios:
1. Concentraciones circulantes de IGF-1 a lo largo de la vida en este modelo

experimental
62
2. Estudio histolgico convencional.

3. Estimacin del dao oxidativo en homogeneizados hepticos con la
determinacin de Malondialdehdo (MDA), marcador de peroxidacin
lipdica, y de Proten Carbonil Content (PPC), como marcador de
carboxilacin proteica.
4. Determinacin de la actividad de las principales enzimas antioxidantes en
homogeneizados hepticos.
5. Estudio de la funcin mitocondrial en mitocondrias hepticas aisladas
5.1. Determinacin del potencial de membrana mitocondrial y el consumo de
oxgeno.
5.2. Estimacin del escape de protones a la matriz mitocondrial (Proton
Leak).
5.3. La vulnerabilidad a la apertura de poro en el ANT, mediante la
insensibilidad al Atractidxido.
5.4. Estudio de la produccin intramitocondrial de Especies Reactivas del
Oxgeno (EROs).
5.5. Estudio de la expresin de la succinato deshidrogenasa (Complejo II) y de
la subunidad IV de la citocromo oxidasa (complejo IV).
6. Anlisis de la expresin de genes que codifican para protenas relacionadas
con la proteccin mitocondrial, mediante microarray, completando trabajos
simultneos.
63
MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES Y MTODOS
64
MATERIALES Y MTODOS
3.1. MATERIALES, ANIMALES DE EXPERIMENTACIN

Y MUESTRAS BIOLGICAS.
3.1.1. MATERIALES.
3.1.1.1. Obtencin de muestras biolgicas tisulares.

-
Criotubos Fisherbrand (Fisher Scientific)
Casettes para inclusines histolgicas (Nirco)
Placas petri (Nunc)
Material de diseccin: tijeras, bistur, pinzas romas y con punta (Quirumet).
Plancha de diseccin (IBD Ciencia)
Spray de desinfeccin Phagosept (Phagogene DEC)
Paraformaldehdo (PanReac AppliChem)
Nitrgeno lquido (Carburos Metlica S.A)
Solucin salina Tamponada PBS (Sigma)
Alcohol (PanReac AppliChem)
RnaLater solution (Life Technologies)
3.1.1.2. Extraccin de muestras de sangre

-
Tubos para extraccin de sangre capilar microvette CB 300 (Sarstedt).
Agujas hipodrmicas 25G (Nipro)
3.1.1.3. Genotipado de ratones.

-
Kit comercial Extract- N- Amp TM Tissue PCR KIT, (Sigma Aldrich)
Kit Mastercycler epgradient eppendorf realplex (Eppendorf)
Primers (GrupoTaper):
IGF1 sense 5'-GAC TCG ATT TCA CCC ACT CGA TCG-3'
IGF1 ANTISENSE 5'- GTC TAA CAC CAG CCC ATT CTG ATT-3'
NEOMICINA SENSE: 5'-CCA GCT CTT CAG CAA TAT CAC GGG-3'
NEOMICINA ANTI SENSE: 5'-CCT GTC CGG TGC CCT GAA TGA
ACT-3'
Agarosa (Sigma Aldrich).

65
MATERIALES Y MTODOS
Solucin TBE 10x (Tris 0,1 M, cido brico 0,09 M y EDTA 0,001 M; pH
8,4) (Sigma Aldrich).
TrackitTM Cyan/Orange Buffer (Invitrogen)
Marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Invitrogen)
Equipo de electroforesis Bio Rad Power Pac 200 (Bio Rad)
Gel Red Nucleic Acid Gel Stain (BIOGEN)
Equipo GelDoc XR Molecular Imager (BioRad)
Programa informtico Quantity One 1-D analysis Software y PDQvest 2-D

Analysis Software ( BioRad)
3.1.1.4. Tratamiento de ratones con la solucin correspondiente.

-
Jeringuillas Omnican, 0,5 mL, 0,3 x 8 mm (Biotech)
Campana de flujo laminar, utilizando un filtro de 0,22 m (Millex).
cido succinico (Sigma Aldrich)
Succinato Sdico (Sigma Aldrich)
Cloruro Sdico (Sigma Aldrich)
IGF-1 (Chiron Corporation Emeryville).
3.1.1.5. Determinaciones analticas.

-
Analizador bioqumico Cobas Integra Plus 400 (Roche).
Reactivos de calibrado: PN y PT (Roche).
Cassette para la determinacin de Glucosa (Roche)
Cassette para la determinacin de Triglicridos (Roche)
Cassette para la determinacin de Albmina (Roche)
Cassette para la determinacin de Colesterol (Roche)
3.1.1.6. Cuantificacin de IGF-1

-
ELISA IGF-1 mouse (IMediagnos, Reutlingen, Alemania)
3.1.1.7. Reactivos y soluciones a varias tcnicas.

-
Fosfato monosdico. NaH2PO4 (Sigma Aldrich)
Fosfato disdico. Na2HPO4 (Sigma Aldrich)
PBS 50 mM: Na Cl 150 mM, tampn fosfato 50 mM, pH=7,4

66
MATERIALES Y MTODOS
PBS: NaCl 150 mM, tampn fosfato 10 mM, pH=7,4
HCl (Panreac)
NaOH (Sigma Aldrich
3.1.1.8. Aislamiento de mitocondrias.

-
Solucin para el aislamiento de mitocondrias 1

Sacarosa 0,25 M (Sigma Aldrich)
BSA 0,1 % (Sigma Aldrich)
EGTA 0,5 mM (Sigma Aldrich)
Tris/HCl 10 mM pH= 7,4 (Sigma Aldlrich)
Solucin para el aislamiento de mitocondrias 2

Sacarosa 0,25 M (Sigma Aldlrich)
Tris/HCl 10 mM (Sigma Aldlrich)
Medio respiratorio: pH 7,4:

MgCl2 20 mM (Sigma Aldrich)
NaCl 100 mM (Sigma Aldrich)
Tris ClH 10 mM (Sigma Aldrich
PBS
3.1.1.9. Determinacin de la concentracin de mitocondrias

-
Deoxycolato sdico al 0,5% (Sigma-Aldrich)
Albmina (BSA) (Sigma-Aldrich)
Bradfford (PanReac AppliChem)
3.1.1.10. Determinacin del potencial de membrana, produccin de radicales libres

y estudio del proton leak mediante citometra de flujo
-
Attune Acoustic Focusing Cytometer (Attune) (Applied Biosystem)
Attune Cytometric Software (Applied Biosystem)
Tracking Beads (Applied Biosystem)
Focushing Fluid (Applied Biosystem)
Shut Down solution (Applied Biosystem)

67
MATERIALES Y MTODOS
Bao termorregulado (Thermo Fisher Scientific)
Medio Respiratorio (de igual composicin que el descrito en el apartado

3.1.1.8)
Rotenona 1,6 M (Sigma Aldrich)
Succinato 1M, 5 M y 10 M (Sigma Aldrich)
Adenosn Difosfato (ADP) 100M (Sigma Aldrich)
m-clorocarbonilcianuro fenilhidrazona (CCCP) 0,2M (Sigma Aldrich)
Rhodamina-123 100 g/ml (Sigma Aldrich)
Oligomicina 2mg/ml (Sigma Aldrich)
Malonato 60 mM (Sigma Aldrich)
Azida 1M (Sigma Aldrich)
DihidroRhodamina-123 (DHRh-123) 8,2 nM (Sigma Aldrich)
Agua Oxigenada (H2O2) 1 mM (Sigma Aldrich)
Peroxidase from horseradish, Type VI-A, 7 Unidades/ml (Sigma Aldrich)
3.1.1.11. Cuantificacin del consumo de oxgeno mediante electrodo de Clark.

-
Oxygraph Plus (Hansatech)
Programa informtico Oxygraph Plus (Hansatech)
Cloruro potsico (KCl) (Sigma Aldrich)
Papel de celulosa 25 gr/m2 (Rizla)
Membrana de politetrafluoroetileno en cuadrado de 2,5 cm de lado

(Hansatech)
Medio Respiratorio (de igual composicin que el descrito en el apartado

3.1.1.8)
Disulfito sdico en polvo (Na2S2O5) (Sigma Aldrich)
Agujas tipo Hamilton (100l, 50l) (VWR)
Piruvato 5 mM (Sigma Aldrich)
Glutamato 5 mM (Sigma Aldrich)
Malonato 60 mM (Sigma Aldrich)
Malato 2,5 mM (Sigma Aldrich)
Rotenona 5 M y 2,5 M (Sigma Aldrich)
Succinato 5 mM (Sigma Aldrich)
ADP 100 M (Sigma Aldrich)

68
MATERIALES Y MTODOS
CCCP 0,2 M (Sigma Aldrich)
Antimicina 3 g/ml (Sigma Aldrich)
Ascorbato 5 mM (Sigma Aldrich)
N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD) 2,5 mM (Sigma

Aldrich)
Medianona 300 M (Sigma Aldrich)
Azida 200 M (Sigma Aldrich)
2,4-Dinitrofenol (DNP) 20 M (Sigma Aldrich)
Oligomicina 8 g/ml (Sigma Aldrich)
Cianuro Potsico (KCN) 1 mM (Sigma Aldrich)
Atractilsido 10 pmol/ml (Sigma Aldrich)
3.1.1.12. Cuantificacin de oxidacin lipdica mediante la determinacin

Malndialdehdo (MDA).
-
PBS 50 mM
Butilhidroxitolueno (BHT) 5 mM (PanReac AppliChem)
cido Clorhdrico (HCl) 12 N (PanReac AppliChem)
Probucol 1mM (PanReac AppliChem)
1-metil-2-fenil indol 7,6 mM (PanReac AppliChem)
Tetremetoxipropano (TMOP) 10mM (PanReac AppliChem)
3.1.1.13. Cuantificacin de los niveles de Protein Carbonyl Content (PCC)

-
PBS 50 mM
EDTA 1mM (Sigma Aldrich)
Sulfato de estreptomicina 1% (Sigma Aldrich)
cido Tricloroactico (TCA) 20% (Sigma)
DNPH 10mM (Sigma Aldrich)
Etanol/acetato de etilo (1:1, v/v) (PanReac AppliChem)
Guanidine Hydrochloride (GuHCl) 8M (Sigma Aldrich)
69
MATERIALES Y MTODOS
3.1.1.14. Determinacin de la actividad de la enzima Catalasa

-
Catalase Assay Kit, Cat 100 1KT (Sigma Aldrich).
3.1.1.15. Determinacin de la actividad de la enzima Superxido Dismutasa

-
Kit SOD Assay Kit-WST (Sigma Aldrich).
PBS 50 mM
Placa de poliestireno 96 pocillos (Nunc)
3.1.1.16. Determinacin de la actividad de la enzima Glutation Peroxidasa

-
PBS 50mM
EDTA 1mM (Sigma Aldrich)
Solucin PBS-EDTA (PBS 50 mM, EDTA 0,5 mM)
Reactivo NADPH: NADPH 5 mM (Sigma Aldrich) + Glutation reducido

42mM (Sigma Aldrich)
Enzima: Glutation Reductasa 10 Unidades/ml (Sigma Aldrich)
Agua Oxigenada 0,20 mM (Sigma Aldrich)
3.1.1.17. Estudios histolgicos.

-
Paraformaldehdo (Sigma Aldrich)
Etanol (PanReac AppliChem)
Xileno (PanReac AppliChem)
Parafina (VWR)
Procesador automtico de tejidos (Leica TP 1020, Suiza)
Estacin automtica de parafina (Leica EG 1150C)
Micrtomo Reichert-Jung 2030 Biocut (Leica, Suiza),
Portaobjetos con poly-L-lisina (Sigma Aldrich.).
Estufa UF110 SingleDISPLAY (Thermo Fisher)
Bao de agua serie VWB (VWR)
Microondas Daewoo Kor-6L35
Hematoxilina (Cristales de Hervi) (Merck, Espaa)
Alumbre Amnico (Merck, Espaa)
Eosina (Merck, Espaa)
Floxina (Merck, Espaa)

70
MATERIALES Y MTODOS
Hemo-De (Meridian Bioscience)
DPX (Merck)
Cubreobjetos Menzel-Glser (VWR)
Escarlata de Biebrich (Merck, Espaa)
Fucsina cida (Merck, Espaa)
Ponceau de Xilidina (PanReac AppliChem)
cido Fosfomolibdico (PanReac AppliChem)
Azul de anilina (Merck, Espaa)
cido Actico glaciar (PanReac AppliChem)
Perxido de Hidrgeno (Sigma Aldrich)
Solucin TRIS 50 mM /EDTA 2 mM pH=9
Suero Fetal Bovino (FBS) 10% diludo en PBS 10mM (Gibco)
Kit Dako EnVision+Dual Link System-HRP (DAB+) Code K4065 (Dako).
DAPI (4, 6- Diamine -2-phenylindole dihidrochloride) (Rioche

Diagnostics)
Anti-SDHB antibody produced in rabbit (Sigma Aldrich)
Anti-COX IV antibody Mitochondrial Loanding Control ab16056 (Abcam)
Tyramide Signal Amplification Kit T20924 (Life Tecnologies)
Procesador de imgenes LEICA SCN400 (Leica, Suiza)
Microscopio Leica DM5500 B (Leica)
Escaner Leica SCN 400
Cmara digital Leica DFC345 FX (Leica).
Programa informtico ScnViewer (Leica).
Software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda,)
3.1.1.18. Genmica
-
TissueLyser LT (Qiagen-Izasa, Espaa)
Buffer de extraccin QIAzol (Qiagen-Izasa, Espaa)
Kit de extraccin de RNA de Qiagen-Izasa RNeasy (Qiagen-Izasa, Espaa)
QIAcube (Qiagen-Izasa, Espaa)
Experion (Automated Electrophoresis Station, Bio-Rad, Espaa).
High Capacity ARN to ADNc Kit (Applied Biosystems, Espaa)
Termocicladores Mastercycler (Eppendorf-Durviz, Espaa).

71
MATERIALES Y MTODOS
H2O-DEPC
GeneChip HT MG-430 PM Array Plate (Affymetrix)
GeneAtlas Personal Microarray System (Affymetrix)
Termociclador Thermal cycler 2720 (Bio Rad).
3.1.1.19. Aparataje usado comnmente en diversas tcnicas como: cuantificacin

proteica, determinaciones colorimtricas, homogeneizacin de muestras,
separacin de fracciones, agitacin, incubacin y medicin de pH.
-
Agitador magntico (Selecta)
Agitador Vortex Reax 2000 (Heidolph)
Balanza de precisin (Denver Instruments)
Balanza de precisin Kern PFB 3000 (Kern PFB)
Centrfuga 5415R (Eppendorf)
Centrfuga 5810 (Eppendorf)
Espectofotmetro Eppendorf biophotometer plus (Eppendorf)
Espectofotmetro Nanodrop 2000 (Fisher)
Espectofotmetro VarioskanTM Flash Multimode Reader (Thermo Scientific)
Homogenizador RW 16 basic IKA (Labortechnik)
Medidor de pH (Crison) y Disolucines tampn pH 4.01, 7,00 (Crison)
NANODROP 2000 (Thermo-Fisher Scientific, Espaa).
Potter de vidrio con pistilo Potter-Elvehjem (Sigma Aldrich)
Termobloque Thermomixer confort (Eppendorf)
3.1.2. ANIMALES DE EXPERIMENTACIN.
3.1.2.1. Procedencia y Generalidades
El trabajo experimental de este estudio se realiz con ratones (Mus musculus)

modificados genticamente, ratones Knock out denominados igf1tm1Arge, con una edad
comprendida entre los cuatro y los seis meses de edad. Los animales fueron donados por
el Prof. Dr. Argiris Efstratiadis (Columbia University, New York, EE.UU.).
Estos ratones presentan un fondo gentico mixto MF1 y 129sv y constan de una
deleccin selectiva del exn 4 del gen que para IGF-1 a nivel sistmico. Esta
72
MATERIALES Y MTODOS
modificacin gentica se logr mediante un sistema Cre-lox con Neomicina (Liu J.P., et
al., 1993), de tal manera que la insercin de neomicina se traduce en la prdida de los
cuatro ltimos residuos del dominio B, que son esenciales para la interaccin de IGF-1
con su receptor (Jones et al., 1995) (Figura 22) .
Neomicina
C
Neomicina
Figura 22. Representacin esquemtica de la modificacin gentica de los ratones igf1tm1Arge. El gen
que codifica para IGF-1 est compuesto por 6 exones (A) y codifica para un pptido de aproximadamente
70 aa (B). Los ratones igf1tm1Arge tienen una modificacin gentica que consiste en la insercin de
neomicina en el exn 4 (A) y el producto resultante es un pptido de mayor peso molecular y con uno de
los dominios truncado (C).
Esto conlleva, la prdida de la funcionalidad de IGF-1 y adems, la eliminacin

de los residuos 51-70 implica la prdida de dos puentes disulfuro, siendo estos ltimos
fundamentales para el mantenimiento de la estructura terciaria de IGF-1 (Jones et al.,
1995) (Figura 23).
Figura 23. Representacin esquemtica de la estructura terciaria del factor de crecimiento IGF-1
normal y mutado. El IGF-1 producido por el gen codificante normal presenta tres puentes disulfuro
(A), sin embargo el IGF-1 producido por el gen truncado presenta slo un puente disulfuro (B).
73
MATERIALES Y MTODOS
3.1.2.2. Obtencin de las colonias
Las condiciones de mantenimiento y la realizacin de los ensayos en los animales

se desarrollaron segn la normativa nacional y europea (RD 1201/2005, ley 32/2007 y
la directiva europea 86/609/CEE). Adems, se obtuvo el consentimiento del Comit de
Biotica de la Universidad CEU-San Pablo.
Las condiciones de estabulacin fueron: temperatura de 222C, humedad relativa
de 5510 % y ciclos lumnicos de 12 horas de luz artificial y 12 horas de oscuridad. Los
animales fueron alimentados ad libitum con agua y dieta habitual (Teklad Global 18 %
Protein Rodent Diet, Harlan Laboratories, Espaa).
El mantenimiento de las colonias y el desarrollo de los ensayos se realizaron en el
Animalario de la Universidad CEU San Pablo, cuyo nmero de registro por la
Comunidad de Madrid es EX029-UC.
Para el mantenimiento de la colonia y obtencin de animales de experimentacin
se realizaron cruces de hembras y machos heterocigotos no consanguneos. En base a
estos cruces, se obtuvieron machos y hembras control (dos alelos de IGF-1 normales),
heterocigotos (un alelo normal y otro truncado) y KO (los dos alelos truncados). Estos
genotipos mostraban la frecuencia mendeliana esperada, tal como se indica en la figura
24.
Figura 24. Representacin en un rbol genealgico de los cruces y de los ratones obtenidos. Los crculos
representan a las hembras, los cuadrados a los machos. Los smbolos blancos representan ratones control,
los smbolos con media parte sombreada representan a ratones heterocigotos y los smbolos totalmente
sombreados a los ratones KO. Las camadas mostraron los siguientes porcentajes, 25% de ratones control
y 50% de ratones heterocigotos y 25% de ratones KO.
74
MATERIALES Y MTODOS
3.1.2.3. Diseo y procedimiento experimental.
En este diseo experimental se utilizaron ratones machos, de una edad

comprendida entre 4 y 8 meses. Los ratones fueron pesados antes del inicio del
protocolo experimental y despus de la realizacin del protocolo experimental.
Se establecieron tres grupos experimentales constituido cada uno de ellos por diez
animales.
1. Grupo Wild type o grupo control (Co, IGF-1 +/+). Ratones que presentaban los
dos allelos que codifican para IGF-1. A este grupo se le administr por va subcutnea
succinato a una concentracin de 10 mM, ya que es el excipiente en el que se diluye
IGF-1.
2. Grupo de ratones heterocigotos (Hz, IGF-1 +/-). Ratones que tenan uno de los
alelos que codifican para IGF-1 truncado. A este grupo se le administr por va
subcutnea la solucin de succinato anteriormente descrita.
3. Grupo de ratones heterocigotos a los que se les administr IGF-1 (Hz+IGF-1).
Ratones que presentaban uno de los alelos truncados a los que se les administr
subcutneamente IGF-1 a una concentracin de 2 g por cada 100 gramos de peso
corporal.
El IGF-1 utilizado en el tratamiento fue proporcionado por el laboratorio
farmacutico Chiron Corporation. Para diluir este factor de crecimiento se emple una
solucin que estaba compuesta por tampn succinato 10 mM y cloruro sdico 140 mM
de pH=6,0. La pauta de administracin fue de dos veces al da, en turnos de maana y
tarde, durante diez das. El volumen administrado fue de 10 l por cada gramo de peso
corporal, por lo que antes de la administracin de la solucin correspondiente se les
pesaba y se registraba los datos obtenidos. En la figura 25 mostramos un esquema del
protocolo experimental.
75
MATERIALES Y MTODOS
Figura 25. Representacin esquemtica del diseo experimental desarrollado. Los ratones controles se
trataron con succinato y los ratones heterocigotos se trataron con succinato o con IGF-1.
3.1.3. MUESTRAS BIOLGICAS.
3.1.3.1. Obtencin de muestra de cola de ratn.
Diez das despus del nacimiento de los ratones se les cort el extremo de la cola,
obtenindose una muestra de aproximadamente 5 mm. Esta muestra se utiliz para la
caracterizacin del genotipo de los animales, lo que se describir a continuacin en el
apartado 3.2.1.
3.1.3.2. Obtencin de suero sanguneo.
A los animales de experimentacin se les extrajo una muestra de sangre antes del
comienzo del procedimiento y a la finalizacin del procedimiento. Previamente a la
extraccin de sangre, los animales estuvieron doce horas en ayunas.
Para la extraccin de sangre se tuvo en cuenta el peso del ratn y el volumen de
sangre circulante (7,2% de su peso), con el objetivo de cumplir con la normativa vigente
sobre manejo de animales de experimentacin.
La obtencin de la muestra se realiz mediante un mtodo clsico que consiste en
una puncin a nivel posterior de la mandbula, donde convergen la vena facial y
submandibular.
76
MATERIALES Y MTODOS
La sangre fue recogida en tubos y centrifugada a 1.800 rpm durante 20 minutos a

4 C. El suero fue alicuotado y almacenado a -20 C hasta su utilizacin.
3.1.3.3. Obtencin de muestras tisulares.
Finalizado el tratamiento, y tras 24 horas en ayunas, los animales fueron

sacrificados por dislocacin cervical, segn la normativa sobre el manejo de animales
de experimentacin. A continuacin se procedi a la extraccin del hgado que se lav
en una solucin salina tamponada (PBS) para eliminar hemates.
Este rgano se diseccion y almacen de la manera que se indica a continuacin
con el objetivo de ser empleado para su estudio genmico, bioqumico, histolgicos y
de funcionalidad mitocondrial.
1. Estudios genmicos: Para estos estudios, se almacen a -80 C una muestra de
100 mg de tejido heptico en criotubos que contenan RNA later hasta el posterior
anlisis de la expresin gnica.
2. Estudios de estrs oxidativo tisular: Con el fin de llevar a cabo estas
determinaciones se almacen 100 mg de tejido en tubos eppendorf a -80 C hasta su
utilizacin.
3. Estudios de la actividad enzimtica antioxidante. Para estos estudios, se
determinaciones, se almacen 100 mg de tejido en tubos eppendorf a -80 C hasta su
utilizacin. Adems, para el estudio de la enzima superxido dismutasa mitocondrial se
almacenaron a -80C las mitocondrias sobrantes de los estudios de funcionalidad
mitocondrial.
4. Estudios histolgicos: Para estos anlisis se obtuvo una seccin de 2 mm de
espesor del lbulo caudal heptico. Posteriormente se analiz la estructura tisular y la
expresin de protenas de la cadena de transporte electrnico tal y como se describen en
el apartado 3.2.13. de materiales y mtodos.
5. Estudios de funcionalidad mitocondrial: El tejido heptico sobrante se utiliz
para el aislamiento de mitocondrias y analizar el funcionamiento de la cadena
respiratoria.
77
MATERIALES Y MTODOS
3.2. MTODOS.
3.2.1. CARACTERIZACIN DEL GENOTIPO DE LOS ANIMALES.
3.2.1.2. Obtencin de ADN genmico a partir de muestras de cola de ratn.
Para la realizacin de este trabajo, el primer paso fue la caracterizacin genotpica

de los ratones. Para ello, se purific el ADN a partir muestras procedentes de cola de
ratn mediante el kit comercial Extract- N- Amp TM Tissue PCR KIT. Se sigui las
instrucciones indicadas por el fabricante, que brevemente se describen a continuacin:
En primer lugar, la muestra procedente de cola de ratn, obtenida segn se ha
descrito en el apartado 3.1.3.1. de materiales y mtodos, se mezcl con 100l de la
solucin Extraction solution y 25 l de la solucin Tissue preparation solution. La
mezcla se incub 10 minutos a temperatura ambiente.
Seguidamente, las muestras se incubaron durante 3 minutos a 95C en el
termobloque.
Tras este paso, a cada uno de los tubos se les aadi 100 l de la solucin
Neutralization solution B y despus de agitar se mantuvieron 10 minutos a temperatura
ambiente.
Finalmente, se separ el sobrenadante, y se determin la concentracin y la pureza
del ADN obtenido mediante el especrofotmetro Nanodrop. Para ello se midi la
absorbancia de las muestras a 260 nm y a 280 nm, considerando que exista una buena
pureza cuando la relacin entre la absorbancia a 260 nm y a 280 nm era superior a 1,5.
3.2.1.3. Genotipado de los ratones mediante PCR convencional.
Una vez purificado el ADN de los animales y conocida su pureza, se amplific el

gen del IGF-1 normal y truncado mediante PCR convencional.
Para ello se utiliz el Kit Mastercycler epgradient eppendorf realplex y los
primers indicados en el apartado 3.1.1.3. de materiales y mtodos.
78
MATERIALES Y MTODOS
Se prepar para cada muestra y control positivo un Eppendorf que contena la

siguiente solucin de trabajo:
-
Master Mix10l
Igf1s0,3l
IGF1a0,3 l
NEOs0,5 l
NEOa0,5 l
Agua4,4 l
4 l de muestra o control positivo
Una vez hecha la mezcla de reaccin se colocaron los tubos en el termociclador y

se estableci el programa indicado en la tabla 1. El nmero de ciclos de amplificacin
fue de 30.
Tabla 1. Protocolo de amplificacin del gen igf-1 y del gen truncado igf-1.
ETAPA
TIEMPO
Temperatura
6 min
95C
1 min
94C
0:32 min
60C
1 min
72C
7 min
72C
-----
4C
Para determinar el genotipo de los ratones, se procedi al anlisis del producto

resultante de la PCR mediante electroforesis. Para ello, se us un gel de agarosa al 2% y
una solucin tamponada compuesta por Tris 0,1 M, cido brico 0,09 M y EDTA 1 mM
a pH 8,4. La electroforesis se realiz a 10-11 vatios/cm. Como colorante trazador se
utiliz Orange G al 1% y como marcador de peso molecular se utiliz una mezcla de
fragmentos de ADN comercial, que contena un rango de 100 a 2072 pares de bases
(pb).
Para visualizar las bandas de DNA, se us Gel Red, que se excita con la luz
ultravioleta. La imagen fue capturada mediante el equipo GelDoc XR Molecular
79
MATERIALES Y MTODOS
Imager, y analizada con el programa informtico Quantity One 1-D analysis Software y
PDQvest 2-D Analysis Software.
Los ratones control mostraban una nica banda con un peso molecular de
aproximadamente 250 pb, ya que tenan los dos alelos codificantes para IGF-1
funcionales. Sin embargo, los ratones heterocigotos mostraban dos bandas una de un
peso molecular idntico a los ratones control y otra de un peso molecular de
aproximadamente 600 pb, debido a que uno de los dos alelos que codifican para IGF-1
tenan la insercin con neomicina (Figura 26).
Figura 26. Imagen representativa de la amplificacin por PCR del gen igf-1. En el primer
carril se observan los marcadores de peso molecular, en el segundo carril el producto resultante
de un ratn wild type y en el tercer carril el producto resultante de un ratn heterocigoto.
3.2.2. DETERMINACIONES ANALTICAS EN MUESTRAS PROCEDENTES

DE SUERO DE RATN.
Las cuantificaciones bioqumicas en muestras de suero de ratn se realizaron

mediante el analizador bioqumico Cobas Integra Plus 400. Se determinaron las
concentraciones de glucosa, triglicicridos, colesterol y albmina.
3.2.2.1. Cuantificacin de Glucosa.
La concentracin de glucosa en sangre fue determinada mediante el mtodo

enzimtico GOD/PAP.
El mtodo se fundamenta en la siguiente reaccin: en presencia de peroxidasa, el
perxido de hidrgeno que se ha formado, provoca el acoplamiento oxidativo del cido
hidroxibenzoico y la 4-amino-antipirina, dando lugar a un derivado de quinoneimina de
80
MATERIALES Y MTODOS
color rojo. La concentracin de glucosa es proporcional a la intensidad de color, que se

determin a 500 nm.
3.2.2.2. Triglicridos.
La concentracin de triglicridos se determin segn el Test TRIGL. Brevemente,

el mtodo se basa en el trabajo de Wahlefeld (Wahlefeld AW, 1983), que utiliza una
lipasa lipoproteica obtenida del microorganismos Rhizopus arrhizus, para hidrolizar los
triglicridos a glicerol, con la oxidacin posterior a dihidroxiacetonafosfato y perxido
de hidrgeno. El perxido de hidrgeno formado reacciona bajo la accin cataltica de
la peroxidasa con la 4-aminofenazona y el 4-clorofenol para formar un colorante rojo.
La intensidad cromtica del colorante rojo formado es directamente proporcional a la
concentracin de triglicridos, lo que se puede medir mediante espectofotometra.
3.2.2.3. Albmina.
La concentracin de albmina en suero se determin mediante el test ALBU2. En

esta prueba se le aade al suero un anticuerpo especfico de albmina, y al producirse la
unin antgeno anticuerpo se forma un inmunocomplejo que precipita y se puede
cuantificar determinando la turbidez generada.
3.2.2.4. Colesterol.
Los niveles de colesterol se analizaron mediante el mtodo colorimtrico

enzimtico Coloesteroloxidasa-p-aminofenazona (CHOD-PAP) (Siedel et al., 1983),
que consiste en una serie de reacciones en las que los steres son hidrolizados y como
consecuencia se produce la oxidacin del grupo 3-OH del colesterol. El Agua oxigenada
(H2O2) generada permite la unin oxidativa del fenol con la 4-aminoantipirina mediante
una reaccin catalizada por la peroxidasa (POD). Esto da lugar a un compuesto
coloreado que se puede cuantificar observando la lectura a 505 nm.
81
MATERIALES Y MTODOS
3.2.3. DETERMINACIN DE LAS CONCENTRACIONES CIRCULANTES DE

IGF-1.
Para la determinacin de las concentraciones plasmticas de IGF-1 en suero se

utiliz un ELISA comercial. Se llev a cabo el protocolo indicado por la casa comercial,
que se describe brevemente a continuacin:
En primer lugar, se reconstituyeron los reactivos control (viales con distinta
concentracin de IGF-1 para la elaboracin de la curva patrn) y standard (controles
positivos), y se aadieron por duplicado en las primeras columnas de la placa de 96
pocillos. Seguidamente se aadieron las muestras diluidas a 1/100 en la solucin
Sample Buffer y se incub la placa durante 1 hora temperatura ambiente.
A continuacin, se lav la placa 5 veces con 250 l de la solucin de lavado Wash
Buffer y se aadieron 50l del anticuerpo conjugado AK.
Despus de incubar 1h a temperatura ambiente y lavar la placa segn se ha
descrito anteriormente, se aadi 100 l de Enzima Conjugada EK en cada pocillo y se
incub media hora a temperatura ambiente.
Tras lavar la placa con la solucin de lavado Wash Buffer se aadi 100l del
sustrato TMB en cada pocillo y se incub media hora en oscuridad.
Finalmente, se par la reaccin aadiendo 100 l de la solucin Stopping
Solution.
La concentracin de IGF-1 se determin midiendo la absorbancia de los
pocillos a 450 nm con el espectofotmetro Varioskan Flash.
Para la obtencin de la curva de calibrado y la cuantificacin de IGF-1 de las
muestras de suero de los animales se utiliz el programa informtico SkanIt Software.
3.2.4. AISLAMIENTO DE LAS MITOCONDRIAS.
El aislamiento de mitocondrias a partir de hgado fresco de ratn se llev a cabo

mediante un protocolo basado en la tcnica descrita por Hogeboom en 1950 (Hogeboom
et al., 1950). Dicho protocolo constaba de los pasos que se describen a continuacin.
En primer lugar, para eliminar los hemates presentes en la muestra, el hgado se
deposit en una placa petri que contena la solucin de aislamiento mitocondrial
denominada Medio 1 a 4C. La composicin de la solucin de aislamiento mitocondrial
Medio 1 se describe en el apartado 3.1.1.8 de materiales y mtodos.
82
MATERIALES Y MTODOS
A continuacin, la muestra se mezcl con la solucin de aislamiento mitocondrial

Medio 1 en un Potter de vidrio. Este constituye uno de los pasos claves de la extraccin
mitocondrial ya que la relacin entre el volumen de dicha solucin de aislamiento y el
peso del rgano debe de estar comprendida entre 5 y 8.
Seguidamente se disgreg el tejido con el homogeneizador RW 16 basic IKA a
5.000 r.p.m, manteniendo la muestra a 4 C.
El producto resultante se centrifug a 800g durante 10 minutos y a 4C. Tras este
paso se separ el sobrenadante del precipitado.
A continuacin, el sobrenadante fue sometido a una nueva centrifugacin a 800g
durante 10 minutos y a 4 C.
El sobrenadante obtenido en esta segunda centrifugacin se volvi a centrifugar,
esta vez a 8.000g durante 10 minutos y a 4C.
Tras este paso, se obtuvo un pellet que contena la fraccin mitocondrial. Las
mitocondrias fueron resuspendidas en la solucin de aislamiento mitocondrial Medio 2,
aadiendo la mitad del volumen empleado para su homogenizacin. La composicin de
la solucin de aislamiento mitocondrial Medio 2 se describe en el apartado 3.1.1.8. de
materiales y mtodos.
La fraccin mitocondrial se centrifug de nuevo a 8.000g durante 10 minutos y a
4C.
Finalmente, tras separar el pellet del sobrenadante, se resuspendi el pellet con la
solucin de aislamiento mitocondrial Medio 2, siendo el volumen empleado la mitad del
usado en el paso anterior.
3.2.5. DETERMINACIN DE LA DENSIDAD DE MITOCONDRIAS AISLADAS

A PARTIR DE TEJIDO HEPTICO FRESCO.
Una vez purificadas las mitocondrias se procedi a determinar el nmero de

mitocondrias aisladas ya que los resultados obtenidos en los ensayos funcionales
dependen de este parmetro.
Las mitocondrias son orgnulos celulares por lo que no se pueden observar a
microscopa ptica y por lo tanto no se puede hacer un contaje. Por ello, el nmero de
mitocondrias se determin mediante un mtodo indirecto, que consista en la
cuantificacin de la concentracin de protena. Dicha cuantificacin se realiz mediante
el mtodo Bradford, segn se describe a continuacin.
83
MATERIALES Y MTODOS
En primer lugar, se mezclaron 10 l de mitocondrias aisladas con 10l de

solucin de deoxycolato sdico al 0,5% y 180 l de agua destilada.
Seguidamente, se prepar una curva patrn de albmina a las siguientes
concentraciones: 100g/ml, 250g/ml, 500g/ml, 750g/ml, 1000g/ml, 1500g/ml.
Por ltimo, en un tubo Eppendorf, se mezclan 25 l de la solucin lisada de
mitocondrias y 750 l de Bradfford. Se repite este proceso con las distintas soluciones
de la curva patrn.
Para calcular de la concentracin de protena se ley la absorbancia a 280 nm de
los tubos de la curva patrn y de las mitocondrias aisladas en un espectofotmetro.
3.2.6.
ESTUDIO
DE
LA
FUNCIN
MITOCONDRIAL
MEDIANTE
CITOMETRA DE FLUJO.
3.2.6.1. Caracterizacin de la poblacin mitocondrial.
Para la caracterizacin de la poblacin mitocondrial se disolvieron las

mitocondrias en medio respiratorio a una concentracin de 50 gr/ml de protena y se
analizaron al menos 20.000 eventos mediante citometra de flujo con un citmetro
Attune.
Una vez establecidos los parmetros de adquisicin, se seleccion la poblacin
mitocondrial en base a su tamao y su complejidad. Para ello, se dibuj una ventana que
inclua el rea de mayor densidad de los eventos observados en un histograma
biparamtrico en el que se representaba estos dos parmetros (Figura 27).
84
SSC (Complejidad)
MATERIALES Y MTODOS
FSC
(Tamao)
Figura 27. Caracterizacin de la poblacin mitocondrial en base a su tamao y

complejidad. La ventana dibujada (R1) representa la poblacin mitocondrial ms
homognea, y por lo tanto con un estado funcional ptimo.
Todos los anlisis posteriores se realizaron adquiriendo los eventos que se

localizaban en el rea de mayor densidad.
3.2.6.1. Determinacin del potencial mitocondrial mediante citometra de flujo.
La citometra de flujo es uno de los mtodos de referencia para analizar el estado

funcional de las mitocondrias aisladas (O'Connor et al., 1988b; Almeida et al., 1994;
Lopez-Mediavilla et al., 1995). Para ello, se usan fluorocromos catinicos y lipoflicos
como la rodamina 123 (Rh-123). La rodamina-123 se excita a una longitud de onda de
488 nm, y emite a una longitud de onda de entre 515-575 nm. Al ser una molcula
lipoflica, atraviesa la membrana mitocondrial y se acumula en la matriz en funcin del
potencial de membrana. Al aumentar el potencial de membrana, pasa ms rodamina al
interior de la mitocondria y por lo tanto la intensidad de fluorescencia aumenta. El
potencial de membrana depende del estado energtico de la misma, siendo de
aproximadamente -180 mV en situacin de reposo, y aumentando hasta -220 mV
cuando las mitocondrias disponen de un sustrato metablico. La magnitud de este
cambio refleja la funcionalidad de la mitocondria (Lopez-Mediavilla et al., 1995)
(Cossarizza et al., 1996).
85
MATERIALES Y MTODOS
Por ello, se establecieron cuatro condiciones metablicas y se analiz la

intensidad de fluorescencia de la poblacin mitocondrial mediante citometra de flujo.
Para que las mitocondrias desarrollasen cada uno de los estados metablicos, se
emplearon los medios que se indican en la tabla 2. Tras aadir 50 g/ml de
mitocondrias aisladas, los tubos fueron incubados a 37 C durante un minuto.
Tabla 2. Soluciones empleadas para el desarrollo de los distintos estados metablicos

mitocondriales.
Estado 1
Estado 2
Estado 3
Estado de desacoplamiento
M.R.
M.R.
M.R.
M.R.
Rotenona 1,6 M
Rotenona 1,6 M
Rotenona 1,6 M
Rotenona 1,6 M
Rh-123 100g/ml
Rh-123 100g/ml
Rh-123 100g/ml
Rh-123 100g/ml
Succinato 5 M
Succinato 5 M
Succinato 5 M
ADP 100M.
ADP 100M.
CCCP 0,2M
M.R: Medio respiratorio. Rh-123: Rodamina-123
Estado 1 o Estado basal. La rotenona inhibe el complejo I, por lo que la

mitocondria no puede usar el NADH residual. Al no disponer de ningn sustrato
metablico, no se produce flujo de protones al espacio intermembrana con lo que el
potencial de membrana existente es el basal (Lopez-Mediavilla et al., 1995) (Petit et al.,
1990).
Estado 2. La adicin de un sustrato tpico de mitocondrias como succinato o
glutamato permite valorar el estado 2. El succinato es un sustrato del ciclo de Krebs, en
concreto de la succinato deshidrogenasa, que forma parte del complejo II de la cadena
de transporte de electrones. Al aadir succinato se produce un flujo de protones al
espacio intermembrana y por lo tanto, se alcanza el mximo potencial de membrana.
Estado 3. Al aadir ADP el gradiente de protones generado por el succinato, o lo
que es lo mismo, el potencial de membrana mitocondrial, es utilizado por la ATPsintasa
para transformar el ADP en ATP. Como consecuencia el potencial de membrana
86
MATERIALES Y MTODOS
disminuye a unos valores intermedios entre el potencial de reposo y el potencial

alcanzado al aadir un sustrato metablico.
Estado de desacoplamiento mitocondrial. Al aadir CCCP se provoca la
alteracin de la permeabilidad de la membrana interna mitocondrial, lo que ocasiona la
apertura de poros y la interrupcin de la cadena transportadora de electrones. Esto
provoca la prdida del gradiente electroqumico y del potencial de membrana, adems
de un gran incremento en el consumo de oxgeno (Nieminen et al., 1994; Zamzami et
al., 1995; Pfeiffer et al., 2001; Gunter et al., 2004; Lopez-Mediavilla et al., 1995)
En la figura 28 se puede observar un ejemplo representativo de los cambios del
potencial de membrana, medido en unidades arbitrarias de fluorescencia, en funcin del
estado metablico mitocondrial.
Figura 28. Estudio del potencial de membrana en funcin del estado metablico mitocondrial. Se puede
observar que el potencial de membrana (medido en unidades arbitrarias de fluorescencia UAF) aumenta
al aadir succinato en comparacin al estado basal (Rotenona). Sin embargo, al aadir ADP el potencial
de membrana tiene unos valores intermedios entre el estadio basal y el estado II. Finalmente, cuando se
aade un desacoplante como el CCCP el potencial de membrana disminuye hasta unos valores inferiores
al estado basal.
87
MATERIALES Y MTODOS
3.2.7. ESTUDIO DEL CONSUMO DE OXGENO POR MITOCONDRIAS

AISLADAS DE TEJIDO HEPTICO.
El oxgeno que se consume durante la respiracin mitocondrial se puede detectar

mediante el electrodo tipo Clark. La versin Oxigraph del tpico electrodo de Clark
consiste en un ctodo de platino y un nodo de Ag-AgCl. En presencia de un electrolito
como el KCl hay un voltaje continuo entre ambos electrodos. Adems, este electrodo
est en contacto con el medio en el que se incuban las mitocondrias, de tal forma, que la
intensidad del voltaje depende de la concentracin de oxgeno disuelto en la solucin de
trabajo.
Antes de comenzar el calibrado del aparato y el desarrollo de los experimentos se
midi la presin atmosfrica y se ajust la temperatura de la cmara de incubacin a
27 C, dado que la cantidad de oxgeno disuelta en el medio depende de estos factores.
La recogida de los datos obtenidos por el Electrodo tipo Clark y el clculo de los
ratios de consumo de oxgeno se realiz mediante el programa informtico Oxygraph
Plus.
Para determinar el consumo de oxigeno mitocondrial, en primer lugar se aadi a
la cmara de incubacin 1 mililitro de una solucin compuesta de la solucin medio
respiratorio y rotenona a una concentracin de 5 M.
A continuacin se fueron aadiendo las mitocondrias y los diferentes reactivos de
manera secuencial, con el fin de estudiar los mismos estados metablicos
mitocondriales descritos en el apartado 3.2.6., segn se describe a continuacin.
Estado I. Se aadieron las mitocondrias a una concentracin final de 1 mg/ml de
protena y se registr el consumo de oxgeno durante 1 minuto. Como se ha descrito en
el apartado anterior, al incubar las mitocondrias con rotenona se inhibe el complejo I de
la cadena respiratoria y por lo tanto la mitocondria se encuentra en unas condiciones
basales. En esta situacin metablica el consumo de oxgeno es muy bajo.
Estado II. Se aadi succinato a una concentracin final de 5mM y se grab el
consumo de oxgeno durante 2 minutos. Como se ha indicado anteriormente el
succinato es un sustrato mitocondrial y al entrar en el circo de Krebs se generan
electrones y protones. Segn la teora quimiosmtica de Mitchell los electrones son
usados por la cadena de transporte de electrones para bombear los protones y como
consecuencia se produce un aumento del consumo de oxgeno.
88
MATERIALES Y MTODOS
Estado III. Se aadi ADP a una concentracin final de 100 M y se registr el

consumo de oxgeno hasta que las mitocondrias entran en Estado IV. Como se ha
descrito en apartado 3.2.6., en estas condiciones metablicas la ATP sintasa utiliza el
gradiente generado para transformar el ADP en ATP. La disponibilidad de ADP es el
nico factor limitante de la velocidad de transporte de electrones. En presencia de ADP
la velocidad de transporte es mxima y como consecuencia el consumo de oxgeno es
ms elevado que en los dos estados anteriores.
Estado IV. Una vez las mitocondrias han consumido el ADP, la velocidad de
transporte de electrones disminuye y por lo tanto el consumo de oxgeno vuelve a
valores similares al Estado II. Durante esta fase el consumo de oxigeno se grab durante
un minuto.
Fase desacoplante. Por ltimo, se aadi el reactivo CCCP a una concentracin
final de 0,2 M y se registr el consumo de oxgeno durante 1 minuto. Durante esta fase
el consumo de oxgeno alcanz su mxima velocidad.
En la figura 29 se muestra una imagen obtenida tras el anlisis de todos los
estados metablicos.
Figura 29. Representacin del consumo de oxgeno de mitocondrias extradas de tejido heptico medido
mediante electrodo de tipo Clark. En la figura se puede observar la concentracin de oxgeno al aadir en
primer lugar las mitocondrias, en segundo lugar succinato (Estado II), en tercer lugar ADP (Estado III),
en cuarto lugar al acabarse las molelculas de ADP (Estado IV) y por ultimo al aadir un desacoplante
(CCCP).
89
MATERIALES Y MTODOS
Se puede observar que al aadir las mitocondrias la velocidad de consumo de

oxgeno es muy lenta, siendo la pendiente muy poco pronunciada. Al aadir succinato
(Estado II) la velocidad de consumo de oxgeno aumenta de una manera muy limitada,
siendo la pendiente ligeramente ms pronunciada que en el estado anterior. Sin
embargo, al aadir ADP (Estado III) la velocidad de consumo de oxgeno aumenta en
ms de 3 veces observndose una pendiente muy pronunciada. A continuacin se puede
observar que la velocidad de consumo de oxigeno disminuye, siendo la pendiente muy
similar al Estado II. Esto es debido a que las molculas de ADP. Finalmente al aadir
un desacoplante (CCCP) la velocidad la pendiente de consumo de oxgeno se hace muy
pronunciada, debido al gran consumo de oxgeno.
3.2.8. MEDIDA DE LA RELACIN ENTRE EL CONSUMO DE OXGENO Y

EL POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL: CUANTIFICACIN DE
LA FUGA DE PROTONES (PROTON LEAK).
Segn la teora quimiosmtica de Mitchell la energa liberada por el transporte de

electrones se utiliza para generar un gradiente de protones, que se usa para producir
ATP. Por lo tanto, una medida de la funcin mitocondrial es la relacin entre el
consumo de oxgeno y el potencial de membrana generado.
Para analizar esta relacin, se midi el consumo de oxgeno mediante Oxygraph y
el potencial de membrana generado durante el Estado II en presencia de un competidor
del succinato como es el malonato.
3.2.8.1. Determinacin del consumo de oxgeno en el Estado II en presencia de

Este mtodo se basa en el protocolo que se ha descrito en el apartado anterior de

materiales y mtodos, con las modificaciones que se describen a continuacin.
En primer lugar se aade a la cmara de incubacin del Oxigraph un mililitro de
una solucin compuesta de medio respiratorio, rotenona a una concentracin de 2,5 M
y oligomicina a una concentracin de 8 g/ml.
Seguidamente se aaden las mitocondrias objeto de estudio a una concentracin
de 1mg/ml de protena.
90
MATERIALES Y MTODOS
Tras este paso, y una vez estabilizado el consumo de oxgeno, se aadi succinato
a una concentracin final de 5 mM y se registr el consumo de oxgeno durante un
minuto.
A continuacin se aadi 5l de una solucin de malonato a una concentracin de
60 mM. Este proceso se repiti cada 30 segundos un total de 10 veces.
Por ltimo se introdujo en la cmara un txico del complejo IV, KCN a una
concentracin final de 1 mM para completar el bloqueo de la cadena respiratoria y
finalizar as el anlisis.
3.2.8.2. Determinacin del potencial de membrana en el Estado II en presencia de

El protocolo para determinar el potencial de membrana en el Estado II en

presencia de malonato, basado en el protocolo descrito en el apartado 3.2.6. de
materiales y mtodos, constaba de los siguientes pasos.
En primer lugar en un tubo de citometra se aadi 1 ml de una solucin
compuesta por medio respiratorio, rotenona, y oligomicina a una concentracin final de
2 mg/ml.
A continuacin se aadieron las mitocondrias a una concentracin final de
50g/ml.
Tras aadir la Rh-123 e incubar 1 minuto a 37C se midi mediante citometra de
flujo la intensidad de fluorescencia de ms de 20.000 eventos.
Seguidamente, se retir el tubo del citmetro y se le aadi succinato a una
concentracin final de 1 M y se volvi a analizar el mismo nmero de eventos.
A este mismo tubo se aadi 5 l de malonato a una concentracin final de 60
mM y de nuevo se volvi a analizar la intensidad de fluorescencia. Este paso se repiti 7
veces.
Por ltimo se aadi azida a una concentracin final de 1 M y se analiz el
potencial de membrana mitocondrial.
91
MATERIALES Y MTODOS
3.2.9.
ESTUDIO
DE
LA
SENSIBILIDAD
AL
ATRACTILSIDO:
VULNERABILIDAD A LA APERTURA DE PORO (ANT).
Otra medida de la funcionalidad mitocondrial es el estudio de la vulnerabilidad a

la apertura del poro.
Para este estudio, se utiliza atractilsido, un inhibidor potente y especfico del
ANT e inductor de la permeabilidad en la apertura del poro de transicin. El
atractilsido estabiliza el sitio de unin al nucletido del ANT y bloquea el intercambio
entre el
ATP de la matriz y ADP citoslico. En situaciones normales, al aadir
atractilsido la mitocondria no dispone de ADP y por lo tanto el flujo de electrones es

menor, y como consecuencia el consumo de oxgeno. Sin embargo, en las mitocondrias
daadas el atractilsido no bloquea dicho intercambio, con lo que el ADP entra en la
mitocondria y no disminuye el consumo de oxgeno.
La sensibilidad al atractilsido se determin cuantificando el consumo de oxgeno
por mitocondrias aisladas de tejido heptico, mediante un protocolo que constaba de los
siguientes pasos.
En primer lugar, se aadieron los reactivos necesarios para que las mitocondrias
alcanzasen el Estado metablico III, tal y como se ha descrito en el apartado 3.2.7. de
Una vez que las mitocondrias se encontraban en dicho estado, se aadieron 5 l
de atractilsido a una concentracin de 10 pmol/ml, y se registr el consumo de oxgeno
durante 30 segundos.
Este paso se repiti 5 veces, de tal manera que se midi el consumo de oxgeno a
concentraciones crecientes de atractilsido.
3.2.10. ESTUDIO DE LA PRODUCCIN DE RADICALES LIBRES POR

PARTE DE MITOCONDRIAS AISLADAS.
La tasa de generacin de EROs de las mitocondrias aisladas de tejido heptico

fresco fue medida mediante citometra de flujo, modificando el mtodo desarrollado por
OConnor (O'Connor et al., 1988a; O'Connor et al., 1988b). Este mtodo se basa en la
oxidacin de la Dihidrorodamina-123 (DHRh-123) por el perxido de hidrgeno que va
a dar lugar a la Rh-123. Por lo tanto, si incubamos mitocondrias aisladas con DHRh92
MATERIALES Y MTODOS
123, cuanto mayor sea la produccin de radicales libres, mayor ser la produccin de
Rh-123 y mayor ser la intensidad de fluorescencia registrada.
La produccin de radicales libres por parte de la mitocondrial depende entre otros
factores de la velocidad del consumo de oxgeno, o lo que es lo mismo del estado
metablico. Por este motivo, se incubaron 100 g/ml de mitocondrias en las mismas
condiciones que se describen en el apartado 3.2.6. de materiales y mtodos con dos
nicas diferencias, que se aadi DHRh-123 en lugar de Rh-123 y tambin la enzima
peroxidasa. Esta enzima es necesaria, ya que cataliza la degradacin del H2O2 producido
por las mitocondrias.
Adems de las condiciones descritas, tambin se prepar un control positivo, que
consista en un tubo con mitocondrias a las que se les haba aadido H2O2 de forma
exgena. Las soluciones empleadas para el desarrollo de los distintos estados
metablicos y como control positivo se describen en la siguiente tabla.
Tabla 3. Soluciones empleadas para el estudio de la produccin mitocondrial de

radicales libres.
Control +
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
M.R
M.R
M.R
M.R
M.R
Rotenona 1,6 M
Rotenona 1,6 M
Rotenona 1,6 M
Rotenona 1,6 M
Rotenona 1,6 M
DHRh-123 100 g/ml
DHRh-123 100 g/ml
DHRh-123 100 g/ml
DHRh-123 100g/ml
DHRh-123 100 g/ml
Succinato 10 Mm
Peroxidasa 7 U/ml
Succinato 10 mM
Succinato 10 mM
Succinato 10 mM
Peroxidasa 7 U/ml
Peroxidasa 7 U/ml
Peroxidasa 7 U/ml
ADP 100M.
ADP 100 M.
Peroxidasa 7 U/ml
H2O2 1 Mm
CCCP 0,2 M
M.R: Medio Respiratorio. DHRh-123: Dihidrorodamina-123
En la figura 30 se muestra un ejemplo representativo de los resultados obtenidos

con estas condiciones metablicas.
93
MATERIALES Y MTODOS
Figura 30. Estudio de la produccin de radicales libres por mitocondrias aisladas de

tejido heptico mediante citometra de flujo. Se puede observar la produccin de
radicales libres por las mitocondrias en estado basal (Rotenona), al aadir un sustrato
metablico (Succinato), al aadir ADP y finalmente al aadir un desacoplante (CCCP).
Como se puede observar, en el Estado I se producen poca cantidad de radicales

libres porque al no existir un sustrato metablico se producen pocos electrones y por lo
tanto se consume poco O2.
Durante en el Estado II se produce una gran cantidad de radicales libres porque al
aadir succinato se producen electrones que se van a unir al O2, pero como la
mitocondria no dispone de ADP, la velocidad de transporte electrnico es muy baja y da
tiempo a que se formen ROS.
De hecho, en el Estado III, al aadir ADP, la velocidad de transporte de electrones
es tan elevada que se forman menos radicales libres que en el estadio II.
Como ya se ha descrito anteriormente, al incubar las mitocondrias con CCCP la
velocidad del transporte de electrones es mxima, lo que se refleja en una baja
produccin de radicales libres.
94
MATERIALES Y MTODOS
3.2.11. ESTUDIO DEL DAO TISULAR DEBIDO AL ESTRS OXIDATIVO.
3.2.11.1. Determinacin en tejido heptico de la peroxidacin lipdica mediante la

cuantificacin de los niveles de Malondialdehdo (MDA).
Uno de los efectos perjudiciales del dao oxidativo en las clulas y los tejidos es
la peroxidacin lipdica, dando lugar a la formacin de productos como el
Malondialdehdo (MDA), por lo que la cuantificacin de este ltimo es un mtodo de
referencia para evaluar los niveles de estrs oxidativo.
Para la determinacin de MDA en tejido heptico se utiliz una modificacin del
mtodo descrito por Gerard-Monnier (Gerard-Monnier et al., 1998), el cual se detalla a
continuacin.
En primer lugar, para evitar la oxidacin del tejido, se mezclaron 50 mg de tejido
heptico con 1 ml de una solucin de PBS que contena BHT a una concentracin de
500 mM.
A continuacin, se homogeneiz el tejido, tal y como se ha descrito en el apartado
3.2.4. de materiales y mtodos, y el producto resultante se incub a 60 C durante 80
minutos.
Tras centrifugar los tubos a 4000 g durante 10 minutos a 4 C, se recogi el
sobrenadante, y se procedi a la cuantificacin proteica de cada una de las muestras
mediante la tcnica de Bradford, segn se ha descrito en el apartado 3.2.5. de materiales
y mtodos.
Seguidamente, se mezclaron 200 l del sobrenadante con 800l de una solucin
compuesta por probucol 1 mM, 1-metil-2-fenil indol 7,6 mM y 150 l de HCl al 37%.
Para cuantificar el MDA, se dise una curva de calibrado con concentraciones
conocidas de MDA. Dado que el MDA es inestable, se parti de un precursor estable,
el TMOP (Tetrametoxi Propano), que tras incubacin en medio cido se hidroliza a
MDA. El TMOP se diluy en la misma solucin en la que se haban diluido los
sobrenadantes de las muestras de tejido heptico, de tal manera que las concentraciones
finales de MDA fueron: 4 M, 3 M, 2 M, 1 M, 0,5 M, 0,25 M, 0,0625 M,
0,03125 M, 0,0156 M, y 0,0078 M.
A continuacin, las muestras y la curva de calibrado se incubaron en el
Thermomixer confort a 45C durante 60 minutos en agitacin.
95
MATERIALES Y MTODOS
Tras este paso, los tubos se centrifugaron a 10.000g durante 10 minutos con el
objetivo de obtener los sobrenadantes.
Finalmente
se
calcul
la
concentracin
de
MDA,
midiendo
en
el
espectrofotmetro la absorbancia a 580 nm de la curva y de las muestras.

los niveles de Protein Carbonyl Content (PCC).
El estrs oxidativo induce diversas modificaciones de las protenas. Una de las

alteraciones ms comunes es la incorporacin de grupos carbonilos en residuos de
aminocidos de las protenas. La carbonilacin producida se puede medir empleando el
reactivo dinitrofenilhidrazina (DNPH) segn el protocolo que se describe seguidamente.
En primer lugar, se mezclaron 50 mg de tejido heptico con 1 ml de una solucin
a pH=6,7 que contena PBS y EDTA 1mM.
Tras la homogeneizacin del tejido, segn se ha descrito en el apartado 3.2.4. de
materiales y mtodos, las muestras se centrifugaron a 10.000g durante 15 minutos a
4C, obtenendose el sobrenadante de cada una de ellas.
Previamente a la cuantificacin del PCC se determin la relacin entre la
concentracin proteica y la concentracin de ADN, ya que este ltimo interfiere con la
cuantificacin de PCC. Para ello, se determin mediante espectrofotometra la
concentracin proteica, midiendo absorbancia de las muestras a 280 nm, y tambin la
concentracin de ADN, midiendo su absorbancia a 260 nm. Ratios de 280/260
inferiores a 1 indicaban contaminacin de ADN.
Las muestras contaminadas con cidos nucleicos fueron incubadas con sulfato de
estreptomicina al 1% durante 30 minutos a temperatura ambiente, se sometieron a una
centrifugacin a 6000g durante 10 minutos a 4C, y finalmente se obtuvo el
sobrenadante libre de cidos nucleicos.
Una vez eliminados los cidos nucleicos, a 250 l del sobrenadante de cada una
de las muestras se les aadi 1 ml de DNPH 10mM. Esta mezcla se incub durante 45
minutos a temperatura ambiente en oscuridad.
A continuacin, a las muestras se les aadi 1,25 ml de una solucin de TCA al
20% y se incub 10 minutos a 4 C.
96
MATERIALES Y MTODOS
Tras centrifugar las muestras a 10.000g durante 10 minutos a 4C, se elimin el

sobrenadante y el precipitado se lav 5 veces con una solucin de etanol/acetato de etilo
(1:1, v/v).
Estos extractos puros de protenas se resuspendieron con 250 l de una solucin
compuesta por Guanidine Hydrochloride (GuHCl) durante 10 minutos a 37C.
A continuacin, los tubos fueron centrifugados a 10.000 g y a 4 C durante 10
minutos y el sobrenadante obtenido se separ en dos alcuotas.
Una se utiliz para determinar la concentracin de protena de cada muestra
mediante espectofotometra, utilizando el mtodo de Bradford tal y como se ha descrito
anteriormente en el apartado 3.2.5 de materiales y mtodos.
La segunda alcuota se utiliz para determinar los niveles del grupo carbonilo en
la muestra. Para ello, se ley la absorbancia de la misma a 375 nm y se transform en
concentracin de grupos carbonilos (nm/ml) multiplicando el valor obtenido por el
factor 45,45 (nmol/ml).
3.2.12. ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA ANTIOXIDANTE.
El dao oxidativo puede ser debido a un aumento de la produccin de radicales

libres o bien a una disminucin de la actividad de los mecanismos antioxidantes o
reparadores.
Por lo que el siguiente objetivo que nos planteamos fue el anlisis de los
mecanismos antioxidantes. En concreto, de las enzimas antioxidantes como la catalasa,
la superxido dismutasa o la glutatin peroxidasa.
3.2.12.1. Determinacin de la actividad de la enzima Catalasa.
La catalasa, enzima antioxidante presente en todas las clulas aerbicas, cataliza

la descomposicin del H2O2 a agua y oxgeno.
Para cuantificar la actividad de esta enzima en tejido heptico se emple el Kit
Catalase Assay Kit. El protocolo empleado se describe brevemente a continuacin.
En primer lugar se prepar la curva patrn de H 2O2 segn el protocolo indicado
por el fabricante.
97
MATERIALES Y MTODOS
A continuacin, se mezclaron 200 mg de tejido heptico con una solucin de PBS

50 mM y se homogeneiz el tejido segn se ha descrito en el apartado 3.2.4. de
El producto resultante se centrifug a 10.000 g durante 10 minutos a 4 C, tras lo
cual se separ el sobrenadante del precipitado.
En el paso siguiente se mezclaron 5 l del sobrenadante con los reactivos
correspondientes.
Finalmente, se ley la absorbancia a 520 nm de las muestras y de la curva de
calibrado.
3.2.12.2. Determinacin de la actividad de la enzima Superxido Dismutasa (SOD).
Para determinar la actividad de la enzima superxido dismutasa, se emple el Kit

SOD Assay Kit-WST.
La enzima SOD tiene varias isoformas, la SOD1 se encuentra en el citoplasma
celular, a diferencia de la SOD2 que se localiza en el interior de la mitocondrial. Por
ello, se analiz por separado la actividad de la SOD citoplasmtica y mitocondrial.
3.2.12.2.1. Determinacin de la actividad de la enzima Superxido Dismutasa

(SOD) citoplasmtica.
Para determinar la actividad de la enzima superxido dismutasa se siguieron las

indicaciones del Kit comercial, las cuales se describen brevemente a continuacin.
En primer lugar se mezclaron 200 mg de tejido heptico con 1 ml de PBS 50 mM.
Una vez homogeneizado el tejido, segn se ha descrito en el apartado 3.2.4. de
materiales y mtodos, el producto resultante se centrifug a 10.000g durante 10 minutos
a 4 C.
A continuacin, se separ el sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf y se
cuantific la concentracin de protena mediante mtodo de Bradford segn se ha
descrito en apartados anteriores.
Para la determinacin de la actividad de la superxido dismutasa, se aadieron las
muestras y los diferentes reactivos del Kit en una placa de poliestireno de 96 pocillos,
98
MATERIALES Y MTODOS
segn las indicaciones de la casa comercial. Cada una de las muestras se ensay sin
diluir y a diferentes diluciones (1/10, 1/100 y 1/1000).
Finalmente, despus de una incubacin a 37C durante 20 minutos, se ley la
absorbancia a 450 nm mediante el lector de placas Varioskan.
Para el clculo de la actividad enzimtica de la catalasa se utiliz la frmula
indicada por la casa comercial.
3.2.12.2.2. Determinacin de la actividad de la enzima Superxido Dismutasa en

mitocondrias aisladas de tejido heptico (SOD).
La actividad de la enzima SOD en mitocondrias aisladas se realiz siguiendo el

protocolo descrito en el apartado anterior, con la nica diferencia del tipo de muestra
analizada.
En este caso se analiz la actividad enzimtica de la superxido dismutasa de las
mitocondrias aisladas a partir de tejido heptico, procedimiento descrito anteriormente.
Una vez aisladas, las mitocondrias se congelaron a -80 C hasta su uso para el
anlisis de la actividad de esta enzima.
Se descongelaron las mitocondrias y se diluyeron a una concentracin final de
5mg/ml y 10 mg/ml en 1 ml de tampn Fosfato 10 mM.
Para romper las mitocondrias y extraer la enzima, las muestras se sonicaron
durante 5 minutos a la mxima potencia y seguidamente se centrifugaron a 10.000g
durante 10 minutos a 4 C.
A continuacin, se separ el sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf y se
cuantific la concentracin de protena mediante mtodo de Bradford segn se ha
descrito en el apartado 3.2.5.
Una vez obtenida la muestra se procedi a cuantificar la actividad de la enzima,
siguiendo el mismo procedimiento descrito en el apartado anterior.
3.2.12.3. Determinacin de la actividad de la enzima Glutation Peroxidasa (GPX)

de tejido heptico.
La actividad de la enzima glutatin peroxidasa se cuantific mediante el mtodo

colorimtrico que se describe a continuacin.
99
MATERIALES Y MTODOS
En primer lugar, tras mezclar 50 mg de tejido heptico con 250 l de una solucin
compuesta por PBS y EDTA, se procedi a la homogeneizacin del tejido, segn se ha
descrito en el apartado 3.2.4. de materiales y mtodos.
A continuacin, se centrifug el homogenizado a 4000 g. durante 10 minutos a
4C.
Tras este paso se separ el sobrenadante del precipitado, el cual se desech.
En una placa de 96 pocillos se aadieron los reactivos necesarios para cuantificar
la actividad de la GPX, segn el esquema que se describe en la tabla 4.
Tabla 4. Protocolo para la cuantificacin de la actividad de la enzima GPX.

Buffer (l) Reactivo
Enzima
NADPH (l)
Muestra (l)
H2O2 (l)
(0,25units/ml)
(l)
Blanco
940
50
----
----
10
Control
920
50
20
----
10
920
50
----
20
10
Positivo
Muestras
Cada una de las muestras se ensay a las siguientes diluciones: 1/10, 1/100 y
1/500.
Despus de incubar la placa 15 segundos, se procedi a leer la absorbancia a una
longitud de onda de 340 nm en el espectofotmetro Varioskan. En total se realizaron
seis lecturas con un intervalo de 10 segundos.
Para el clculo de la actividad de la enzima GPX. Se us la siguiente frmula:
Actividad por extracto (mmol/min/ml= Units/ml)= A340 X FD / 6,22 x V
A340 = A340 /min (blanco)- A340 /min (muestra)
6, 22= mM para NADPH
FD= factor de dilucin de la muestra antes de aadirla a la reaccin
V= volumen de muestra en militros.
100
MATERIALES Y MTODOS
3.2.13. ESTUDIOS HISTOLGICOS DE MUESTRAS DE TEJIDO HEPTICO

PROCEDENTE
DE
RATONES
CONTROL,
HETEROCIGOTOS
HETEROCIGOTOS TRATADOS.
Con el objetivo de estudiar el efecto del IGF-1 sobre la estructura heptica y

analizar el mecanismo o mecanismos mediante los cuales IGF-1 regula la funcin
mitocondrial, en primer lugar se procesaron muestras de tejido heptico para su estudio
histolgico.
Posteriormente
se
realizaron
las
tinciones,
inmunohistoqumicas
inmunofluorescencias correspondientes.
Todas las tcnicas empleadas para estos estudios se describen a continuacin.
3.2.13.1. Procesado de las muestras.
Las muestras de tejido heptico se procesaron segn protocolo estndar, que

brevemente se describe a continuacin.
En primer lugar, las muestras se fijaron en paraformaldehdo al 4 % durante 24
horas en agitacin y a temperatura ambiente.
Seguidamente, se procedi a la deshidratacin de las muestras en un gradiente
creciente de alcoholes y a la infiltracin de las mismas con parafina lquida. Este
protocolo se realiz mediante el procesador automtico de tejidos (Leica TP 1020,
Suiza) y const de los siguientes pasos: 1 hora y 30 minutos en etanol al 70%; 1 hora
en etanol al 70%; 1hora en etanol al 80%; 1 hora en etanol al 80%; 1 hora en etanol al
96%; 1 hora en etanol al 96%; 1 hora en etanol al 100%; 1 hora en etanol al 100%; 1
hora en xileno; 1:30 minutos en xileno y 1 hora en parafina.
Por ltimo, para una correcta conservacin de las muestras, se procedi a la
inclusin del tejido heptico en bloques de parafina. Este proceso se realiz mediante la
estacin automtica de parafina.
Los bloques de parafina se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso para
los anlisis histolgicos correspondientes.
101
MATERIALES Y MTODOS
3.2.13.2. Anlisis de la estructura tisular heptica de ratones control, heterocigotos

y heterocigotos tratados mediante tinciones de Hematoxilina-eosina y Tricrmico
de Masson.
Para analizar el efecto de IGF-1 sobre la estructura tisular heptica se obtuvieron

mediante micrtomo secciones de 4 m de las muestras en parafina y los cortes se
recogieron con porta objetos de poli-L-lisina.
3.2.13.2.1. Tincin Hematoxilina-Eosina.
Las muestras de tejido heptico procedentes de ratones control, heterocigotos y

heterocigotos tratados se tieron con hematoxilina-eosina mediante protocolo estndar,
que se describe brevemente a continuacin.
En primer lugar se procedi a desparafinar las muestras. Para ello se incubaron a
60C durante 30 minutos y seguidamente se sumergieron en una solucin de Hemo-De
durante 10 minutos.
A continuacin se procedi a la hidratacin de las muestras, para lo que se
incubaron las muestras durante 5 minutos en un gradiente de alcoholes (100, 96, 70),
y seguidamente sumergiendo las muestras durante 5 minutos en agua destilada.
Una vez hidratado el tejido, se incubaron las muestras durante 20 segundos con
Hematoxilina de Harris y seguidamente se lavaron durante 5 minutos con agua
corriente.
Posteriormente, se incubaron las muestras con solucin de Eosina alcohlica
durante 2 minutos. Tras este paso, las muestras se lavaron con agua corriente durante 5
minutos y seguidamente con una solucin de alcohol cido durante 30 segundos.
A continuacin, se procedi a la deshidratacin de la muestra mediante gradiente
de alcoholes (70, 90,100), incubando las muestras durante 5 minutos con cada uno de
ellos, y finalmente incubando las mismas durante 5 minutos con la solucin Hemo-De.
Finalmente, se procedi al montaje de las muestras para su anlisis microscpico
aadiendo medio de montaje DPX y colando un cubreobjetos.
102
MATERIALES Y MTODOS
3.2.13.2.2. Tincin de Tricrmico de Masson.
Como en trabajos previos de nuestro grupo habamos observado que situaciones

de deficiencia de IGF-1 se asociaban a presencia de fibrosis tisular, se analizaron las
muestras de tejido heptico de los grupos establecidos mediante tincin de tricrmico de
Masson, tcnica que tie las fibras colgenas y elsticas, resumidamente consta de los
siguientes pasos.
En primer lugar, las muestras se desparafinaron y se hidrataron tal y como se ha
descrito en el apartado anterior.
A continuacin, se procedi a teir las muestras con una solucin de
Hematoxilina Frrica durante 2 minutos.
Tras lavar las muestras durante 5 minutos con agua corriente, se tieron las
muestras con una solucin de escarlata de Briebrich-Fucsina cida durante 5 minutos.
Despus de lavar las muestras durante 5 minutos con agua corriente, se incubaron
las muestras con una solucin de cido Fosfomolbdico durante 5 minutos,
Seguidamente, las muestras se tieron con una solucin de Azul de Anilina
durante 5 minutos, tras lo cual se incubaron con una solucin de cido actico durante
cinco minutos.
A continuacin, las muestras se lavaron con agua corriente durante cinco minutos
y finalmente se deshidrataron y se montaron tal y como se ha descrito en el apartado
anterior.
3.2.14. ESTUDIO DE LA EXPRESIN DE PROTENAS PRESENTES EN EL

COMPLEJO II Y EN EL COMPLEJO IV DE LA CADENA RESPIRATORIA
MITOCONDRIAL
MEDIANTE
INMUNOHISTOQUMICA
INMUNOFLUORESCENCIA.
Para estudiar el efecto de IGF-1 sobre la cadena de transporte de electrones, se

procedi al estudio mediante inmunohitoqumica e inmunofluorescencia de la expresin
de la succinato deshidrogenasa (SDHB), presente en el complejo II de la cadena
respiratoria, y de la subunidad IV de la enzima citocromo C oxidasa (COXIV), la cual
constituye el complejo IV de la cadena respiratoria.
103
MATERIALES Y MTODOS

inmunohistoqumica.
Para la realizacin de las inmunohistoqumicas se sigui un protocolo estndar,

con las modificaciones necesarias para la realizacin de este estudio, tal y como se
describe a continuacin.
En primer lugar, los cortes obtenidos de 4 micras se desparafinaron e hidrataron
segn se ha descrito en el apartado 3.2.13.1. de materiales y mtodos.
A continuacin, se incubaron las muestras con perxido de hidrgeno al 10%
durante 30 minutos en oscuridad.
Seguidamente, se lavaron en agua corriente durante 5 minutos y se procedi al
desenmascaramiento antignico mediante una solucin a de EDTA 2 mM y Tris-Cl 50
mM, pH=9, incubando las muestras a 100 C durante 10 minutos.
Despus del desenmascaramiento antignico, se dej enfriar las muestras durante
20 minutos a 4C y a continuacin se lavaron durante 5 minutos con PBS.
Posteriormente, las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura
ambiente con 100 l de Suero Fetal Bovino diluido al 10% en PBS (PBS-FBS).
Seguidamente, se aadieron en cortes consecutivos 100 l de los anticuerpos antiSDH a una dilucin 1/00 y anti-COXIV a una dilucin 1/1800, ambas en PBS-FBS.
Las muestras a las que se les haba aadido el anticuerpo anti-SDH se incubaron
durante una hora a temperatura ambiente y las muestras con el anticuerpo anti-COXIV
durante toda la noche a 4 C.
Tras lavar las muestras 3 veces durante cinco minutos con PBS se procedi al
revelado de las mismas mediante el Kit comercial Envision KIT, siguiendo las
instrucciones del fabricante, que se describen brevemente a continuacin. En primer
lugar se aadi a todas las muestras 100 l del reactivo que contena el anticuerpo
secundario y se incubaron durante 40 minutos a temperatura ambiente. Despus de lavar
las muestras 3 veces durante cinco minutos con PBS se aadi 100 l del cromgeno
diaminobencidina.
Despus de cinco minutos la reaccin se cort, lavando las muestras tal y como se
ha descrito anteriormente.
Finalmente se procedi a contrastar las muestras con Hematoxilina, y a la
deshidratacin y montaje de las mismas, segn se ha descrito en el apartado 3.2.13.2.1.
de materiales y mtodos.
104
MATERIALES Y MTODOS

inmunofluorescencia.
Para la realizacin de las inmunofluorescencias se sigui el mismo protocolo

descrito en el apartado anterior de materiales y mtodos, con las nicas diferencias que
se describen a continuacin.
Los cortes consecutivos de muestras de tejido hepticos fueron incubados con los
anticuerpos anti-SDHB diluido a 1/100 y el anti-COXIV diluido a 1/450.
Las muestras a las que se les haba aadido el anticuerpo anti-SDHB se incubaron
1 hora a temperatura ambiente y las muestras con el anticuerpo anti-COXIV durante
toda la noche a 4 C.
Las muestras incubadas con el anticuerpo anti-COXIV se revelaron con el
anticuerpo secundario goat anti-rabbit IgG conjugado con rodamina.
Las muestras incubadas con el anticuerpo anti-SDHB fueron reveladas con el KIT
comercial TSATM T20924 siguiendo las instrucciones de la casa comercial, que
brevemente se describen a continuacin. En primer lugar, y tras lavar las muestras, las
mismas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 l del reactivo que
contena en anticuerpo secundario goat anti-rabbit IgG. Tras lavar las muestras 3 veces
con PBS, se procedi a la tincin de las muestras, incubndolas con 100 l del reactivo
Tyramida-Alexa Fluor 568 durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Seguidamente las muestras se lavaron tres veces en PBS y se incubaron durante 5
minutos a temperatura ambiente con 100 l del marcador nuclear DAPI, a una
concentracin final de 1 g/ml.
Finalmente, las muestras se lavaron y se montaron para su estudio microscpico,
con una solucin comercial especfica de microscopa de fluorescencia, Fluorescent
mounting medium.
3.2.15. ADQUISICIN DE IMGENES.
Se obtuvieron imgenes de las tinciones y de las inmunohistoqumicas realizadas

mediante el procesador de imgenes LEICA SCN400. Las imgenes adquiridas fueron
analizadas mediante el programa informtico ScnViewer.
Para la adquisicin de imgenes de las inmunofluorescencias realizadas se utiliz
el microscopio de fluorescencia Leica DM5500.
105
MATERIALES Y MTODOS
Los niveles de expresin de COXIV y succinato deshidrogenasa se determinaron

analizando la intensidad de fluorescencia mostrada por ambas subunidades de la cadena
respiratoria. Con este objetivo se analizaron al menos cinco campos de cada una de las
muestras estudiadas. Dichas cuantificaciones se obtuvieron mediante el programa
informtico de anlisis de imgenes ImageJ.
3.2.16. ESTUDIO DE LA EXPRESIN GNICA MEDIANTE ANLISIS DE

MICROARRAYS.
Otro de los objetivos que nos planteamos fue el estudio de la expresin de genes
relacionados con la funcin y el dao mitocondrial.
Para el cumplimiento de este objetivo procedimos en primer lugar a la extraccin
del ARN mensajero de tejido heptico y posteriormente a realizar el anlisis de
expresin gnica mediante el anlisis de microarrays.
3.2.16.1. Extraccin de ARN mensajero procedente de tejido heptico.
Para la extraccin de ARN mensajero de tejido heptico se utiliz el siguiente

protocolo.
En primer se mezclaron 50 mg de tejido con 500 ml de la solucin comercial
QIAzol, y se aadieron las bolas de acero.
A esta mezcla se le aadieron las bolas de acero y se procedi a lisar el tejido
mediante el homogeneizador automtico TissueLyser LT.
El lisado obtenido se centrifug a 12,000 x g durante 10 min a 4C.
El sobrenadante obtenido se utiliz para la extraccin del ARN mensajero
mediante la estacin de trabajo robtica Quiacube.
3.2.16.2. Determinacin de la integridad del arn purificado a partir de tejido

heptico.
Una vez obtenido el ARN de las muestras de hgado se determin la

concentracin del mismo mediante el espectrofotmetro Nanodrop.
106
MATERIALES Y MTODOS
Adems, tambin se analiz la integridad del ARN obtenido. Para este anlisis se
utiliz el KIT ExperionTM RNA StdSens y se sigui el protocolo descrito por la casa
comercial, que brevemente se describe a continuacin.
Tras filtrar 600 l de la solucin G, se mezclan 65 l de la solucin filtrada con
un 1 l de la solucin ST, obteniendo una nueva solucin (GS).
A continuacin se desnaturaliz la solucin L y la muestra a analizar, incubando
las muestras 2 minutos a 70 C y 5 minutos en hielo.
Seguidamente, se cargaron los pocillos correspondientes del chip con 9 l de la
solucin G filtrada, 9 l de la solucin GS, 1 l de la solucin L, 1 l de la solucin L
desnaturalizada y 1 l de la muestra a analizar.
3.2.16.3. Anlisis del transcriptoma mediante microarrays.
Las tcnicas para la realizacin y anlisis de los microarrays, incluyendo el

control de calidad del ARN, marcaje, hibridacin y escaneo de los arrays fueron
desarrolladas de acuerdo con el protocolo establecido por la casa comercial, el cual se
describe brevemente a continuacin.
En primer lugar se prepararon dos mezclas de reaccin; una compuesta por el
ARN purificado y la solucin de Poly-A RNA y la otra por RNA Control y la solucin
de Poly-A RNA (control positivo de reaccin). La solucin de Poly-A RNA y el RNA
Control se prepararon siguiendo las indicaciones de la casa comercial.
Seguidamente, se procedi a la sntesis de la primera cadena de ADN
complementario. Para ello, se mezcl la solucin First-Strand Master Mix con la
solucin de ARN y esta nueva mezcla se incub segn protocolo establecido.
Una vez centrifugado el producto resultante, se continu con la sntesis de la
segunda cadena de ADN complementario. Con este objetivo, se elabor una mezcla
constituida por 20 l de la solucin Second-Strand Master Mix y 10 l del producto
resultante de la fase anterior.
Tras las incubaciones correspondientes, se procedi a la sntesis y el marcaje del
ARN complementario mediante transcripcin in vitro. Para ello, se elabor la
solucin IVT Master Mix, que se mezcl con el producto obtenido del paso anterior.
A continuacin, se procedi a la purificacin del ARN complementario marcado
mediante seleccin magntica, tras lo cual se midi la concentracin del mismo.
107
MATERIALES Y MTODOS
Seguidamente, se procedi a la fragmentacin del ARN complementario marcado

mediante la incubacin de este producto a 94 C con una solucin que contena una alta
concentracin de cationes divalentes.
Una vez realizado este proceso, se realiz la hibridacin del ARN complementario
marcado y fraccionado con el GeneChip Probe Array. Con este objetivo, primero se
prepar la solucin Hybridization Master Mix, que se utiliz para hidratar el chip de
microarrays. En segundo lugar, se procedi a preparar la solucin Hybridization
Cocktail, (ARN diluido en la solucin Hybridization Master Mix) que se aadi al chip.
Tras realizar las incubaciones y lavados establecidos se procedi al escaneo del
chip mediante el GeneAtlas Personal Microarray System. El protocolo completo, se
representa de forma esquemtica en la figura 31.
108
MATERIALES Y MTODOS
Figura 31. Resumen del protocolo seguido para el anlisis del transcriptoma mediante microarrays.
Finalmente, los niveles de fluorescencia de los diversos genes fueron

normalizadas usando el programa informtico Robust Multichip Average (Irizarry et al.,
2003) y los posibles efectos debidos a la diferencia entre lotes fueron corregidos
mediante el programa informtico ComBat (Johnson et al., 2007). Los datos obtenidos
fueron analizados con el paquete Limma, que emplea modelos logartmicos lineares
(Smyth, 2004).
109
MATERIALES Y MTODOS
3.3. ANLISIS ESTADSTICO.

En primer lugar, se estudi la distribucin normal de las muestras estudiadas con
la prueba de Kolmogorof-Smirnov. No se observ distribucin normal en los grupos
estudiados, por lo que se desarrollaron anlisis estadsticos no paramtricos.
Para analizar las diferentes cuantificaciones realizadas (peso de los animales,
concentracin de IGF-1, determinaciones bioqumicas, consumo de oxgeno, potencial
de membrana, produccin de radicales libres, MDA, PCC, actividad enzimtica
antioxidante, niveles de expresin proteica) en los tres grupos experimentales (CO, HZ
y HZ+IGF) se utiliz el test estadstico de Kruskal-Wallis. Cuando se detectaron
diferencias significativas se procedi a la realizacin de test a post-hoc Bonferroni y
Dunn para comparar los grupos de dos en dos. Los resultados se expresaron como
media error estndar de la media (X EEM).
En los estudios de los niveles de proton leak y de la sensibilidad al
atractilsido o vulnerabilidad a la apertura de poro (ANT) se us el anlisis de
covarianza (ANCOVA).
Estos anlisis se realizaron con los paquetes estadsticos IBM SPSS Statistics 20
y GraphPad Prisma 5.0.
En todos los casos, se consider que existan diferencias estadsticamente
significativas cuando la probabilidad asociada era inferior al 5% (p<0,05).
110
RESULTADOS
RESULTADOS
111
RESULTADOS
4.1. ESTUDIO DE LA CONCENTRACIN PLASMTICA

DE IGF-1 EN FUNCIN DE LA EDAD DE LOS
ANIMALES.
En primer lugar, se analiz si la inactivacin de solo uno de los alelos que
codifican para IGF-1 (IGF-1 +/-) se reflejaba en las concentraciones circulantes de esta
hormona a lo largo de la vida. Para la realizacin de este estudio, se analizaron los
niveles circulantes de IGF-1 en ratones control (Co), que presentaban los dos alelos
funcionales (IGF-1 +/+), y en ratones heterocigotos (Hz), los cuales tenan uno de los
alelos truncados (IGF-1 +/-), a 0.5, 1, 3, 6, 10, 13, 16, 19 y 23 meses de edad. Los
resultados obtenidos se muestran en la figura 32.
Figura 32. Estudio de las niveles de IGF-1 en sangre en funcin de la edad, en ratones control y heterocigotos.
En el eje de las X se representa la edad de los ratones y en el eje de las Y las concentraciones de IGF-1. Co=
ratones Control; Hz= ratones Heterocigoto.
Como se puede observar, tanto en los ratones control como heterocigotos, la

concentracin de IGF-1 en sangre aumentan hasta el hasta el mes de edad, observndose
112
RESULTADOS
una disminucin desde este punto hasta el tercer mes de edad. Desde el tercer mes de
edad hasta los ocho meses los niveles de IGF-1 permanecen sin variacin, pero a partir
del noveno mes los niveles disminuyen progresivamente hasta la muerte de los
animales.
Por otra parte, al analizar los niveles de IGF-1 en sangre en ratones adultos de
entre 3 y 8 meses de edad, se observaron concentraciones menores de IGF-1 en los
ratones HZ (865,322 64,492 ng/mL) que en los animales control (1239,194 78,137
ng/mL), siendo las diferencias estadsticamente significativa (p= 0,004).
4.2. EFECTO DE LA DEFICIENCIA DE IGF-1 SOBRE EL

PESO CORPORAL.
Una vez observado que al truncar uno de los alelos se produca una disminucin
significativa de las concentraciones de IGF-1 circulantes, procedimos a analizar si este
hecho se reflejaba fenotpicamente. Como IGF-1 es una hormona anabolizante, en
primer lugar estudiamos el peso de los animales.
Se observ que los animales Control mostraban un mayor peso corporal (34,974
1,377 g) que los ratones con deficiencia parcial de IGF-1(Hz) (29,395 0,809 g), siendo
las diferencias estadsticamente significativas (p=0,02).
Dado que los ratones Hz mostraban niveles ms bajos de IGF-1 y tambin un
menor peso corporal, tambin estudiamos si la administracin exgena con dosis bajas
de IGF-1 podra revertir el efecto de la deficiencia del IGF-1. Para ello, se determin el
peso de los ratones al inicio y final del tratamiento, que dur 10 das. Los ratones de los
grupos Co y Hz fueron inoculados con el excipiente succinato, vehculo en el que va
disuelto dicha hormona
No se observaron diferencias significativas, entre los animales heterocigotos
tratados con IGF-1 (Hz+IGF-1; 31,550 0,450 g) y los ratones Co. Al comparar el
grupo Hz+IGF-1 y el grupo HZ las diferencias tampoco fueron estadsticamente
significativas (Figura 33).
113
RESULTADOS
Figura 33. Estudio de la relacin entre el peso corporal (g) y los niveles de IGF-1. Las barras representan
la media del peso de los ratones. Co= ratones control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1= ratones
En base a los resultados anteriores, el siguiente objetivo que nos planteamos fue
determinar si el simple hecho de tratar a los ratones podra provocar una disminucin
del peso corporal. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Estudio del peso corporal tras el tratamiento con IGF-1 o succinato en los tres
grupos de animales.
Prdida de peso(g)
Co (n=10)
Hz (n=10)
Hz+IGF-1 (n=10)
- 4,250 0,775
-3,824 0,5730
-5,390 0,966
Los resultados muestran la diferencia entre el peso corporal antes y despus del tratamiento. Co = ratones
control tratados con succinato. Hz= ratones Heterocigotos tratados con succinato. Hz+IGF-1= ratones
Heterocigotos tratados con IGF-1
Como se aprecia en la tabla anterior, el grupo Co (-4,250 0,775 g) y los Hz (3,824 0,5730 g) perdieron peso tras la inoculacin del vehculo, no siendo
114
RESULTADOS
significativas las diferencias entre ambos grupos. El grupo de ratones Hz+IGF-1 (-5,390
0,966 g) tambin
perdi peso, no encontrndose diferencias estadsticamente
significativas al comparar esta prdida de peso con la del grupo Co o la del grupo HZ.
4.3. RELACIN ENTRE LA DEFICIENCIA DE IGF-1 Y

LOS PARMETROS ANALTICOS EN SUERO DE
RATN.
Dado el importante papel de IGF-1 en el metabolismo celular, tambin se
determinaron diversos parmetros bioqumicos en los tres grupos experimentales, Co,
Hz y Hz + IGF-1. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 6.
Tabla 6. Cuantificacin mediante analizador Cobas de parmetros bioqumicos en suero

de ratn.
Control
Heterozigotos
Hz+IGF-1
(n=10)
(n=10)
(n=10)
88,25 5,38
96,41 14,83
90,97 5,86
235,69 11,51
290,96 21,47
254,12 12,21
Albmina (g/dl)
3,35 0,083
2,92 0,39
3,20 0,14
Colesterol (mg/dl)
236,80 8,95
232,97 34,17
235,52 12,07
Glucosa (mg/dl)
Triglicridos
(mg/dl)
Co= ratones Control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1= ratones Heterocigotos tratados con IGF-1.
: Co vs Hz. p=0,037. : Hz vs Hz+IGF-1.p=0,011.
Como se observa en la tabla, al comparar los tres grupos experimentales solo se

hallaron diferencias significativas en los niveles triglicridos. Los ratones Hz (290,962
21,469 mg/dl) mostraron concentraciones superiores de triglicridos que los ratones
Co (235,693 11,512 mg/dl) siendo las diferencias estadsticamente significativas
(p=0,037). La terapia sustitutiva con IGF-1 en los ratones deficientes en esta hormona,
disminuy las concentraciones sricas de triglicridos, observndose diferencias
115
RESULTADOS
significativas (p=0,011) entre los ratones Hz y los ratones Hz + IGF-1 (254,116

12,214). Los niveles disminuyeron tanto que se asemejaron a los niveles de los ratones
Co, no encontrndose diferencias significativas (Figura 34).
Figura 34. Representacin de los valores medios de triglicridos en los animales control,
Hz y Hz+IGF-1. Co= ratones Control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1= ratones
4.4. ESTUDIO DE LA FUNCIN MITOCONDRIAL EN

MITOCONDRIAS AISLADAS: EFECTO DE LA TERAPIA
SUSTITUTIVA.
4.4.1.
DETERMINACIN
DEL
POTENCIAL
DE
MEMBRANA
POR
CITOMETRA DE FLUJO.
Estudios previos de nuestro grupo avalaban que el factor IGF-1 podra tener un
papel muy relevante en la funcin mitocondrial. Por otra parte, como se muestra en el
apartado 4.1, los ratones Hz tenan niveles inferiores de IGF-1, por lo que estos
animales suponan un modelo ptimo para estudiar la relacin entre los niveles de IGF1 y la actividad mitocondrial.
116
RESULTADOS
Para determinar la actividad mitocondrial, se estudi entre otros parmetros el

potencial de membrana mitocondrial mediante citometra de flujo.
Al aadir el sustrato tpico mitocondrial (succinato) las mitocondrias de los
ratones Co desarrollaron un potencial de membrana mayor (43.226,33 258,56 U.A.F)
que los ratones Hz (36.111,33 357,38 U.A.F) siendo las diferencias significativas (p=
0,002). Al tratar los ratones con IGF-1 (43.048 838,31 U.A.F), las mitocondrias
mostraron un potencial de membrana similar a los ratones control y mayor que los
ratones Hz siendo las diferencias estadsticamente significativas (p= 0,002) (Figura 35).
Figura 35. Estudio del potencial de membrana en mitocondrias aisladas hepticas. Las barras representan
la media del potencial de membrana medido en U.A.F de mitocondrias aisladas de tejido heptico fresco
tras aadir el sustrato mitocondrial succinato. Co= ratones Control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF1= ratones Heterocigotos tratados con IGF-1.
4.4.2. ESTIMACIN DEL CONSUMO DE OXGENO Y DEL NDICE RCR

POR PARTE DE MITOCONDRIAS AISLADAS DE TEJIDO HEPTICO.
Segn la teora quimiosmtica de Mitchell, el potencial de membrana depende del

transporte de electrones y por tanto existe una relacin directa entre el consumo de
oxgeno y el potencial de membrana generado. Por este motivo, el siguiente objetivo fue
estudiar el consumo de oxgeno de mitocondrias aisladas procedentes de ratones Co, Hz
y Hz+IGF-1.
117
RESULTADOS
Como se observa en la figura 36, no se observaron diferencias significativas en el

consumo de oxgeno entre los ratones Co, Hz y Hz+IGF-1 en ninguno de los estados
metablicos estudiados. Los valores obtenidos por cada uno de los grupos
experimentales en cada uno de los estados metablicos se resumen en la tabla 7.
Figura 36. Representacin grfica del consumo de oxgeno. Se puede observar la diferente tasa de
consumo de oxgeno en Estado 2 (succinato), Estado 3 (ADP) y Estado IV (cuando se han gastado las
molculas de ADP. El mximo ratio se obtiene al aadir el descoplante mitocondrial CCCP.
Tampoco se encontraron diferencias significativas al analizar ndice RCR, o

relacin entre estado 2 y 3, otro parmetro de la eficacia respiratoria mitocondrial
(Tabla 7)
118
RESULTADOS
Tabla 7. Estudio del consumo de oxgeno y clculo del ndice de control respiratorio
(RCR) en mitocondrias aisladas de tejido heptico
Control
Heterozigotos
Hz+IGF-1
(n=10)
(n=10)
(n=10)
Estado 4 (nAgO/mg/min)
13,05 1,48
14,70 0,06
16,54 1,30
Estado 3 (nAgO/mg/min)
46,54 5,93
48,21 0,91
50,30 4,58
RCR
3,55 0,15
3,28 0,056
3,04 0,038
Sin embargo, cuando se analiz el nmero de molculas de ATP producidas por

molcula de oxgeno consumido medido mediante el ratio ADP/O, se observ que los
ratones Co (2,710 0,183) producen mayor cantidad de ATP por molcula de oxgeno
consumido que los ratones Hz (1,733 0,0504), siendo la diferencia estadsticamente
significativa (p=0,016). Sin embargo, tras el tratamiento se observ en los ratones
Hz+IGF mostraron un ratio ADP/O (2,313 0,0959) superior a los ratones Hz (p=
0,006). Este incremento fue tan significativo que no se encontraron diferencias cuando
se compararon con los ratones Co, y tal y como se observa en la figura 37.
Figura 37. Estudio de la relacin entre la produccin de ATP y el nmero de molculas de Oxgeno
consumidas en mitocondrias aisladas de tejido heptico fresco. Las barras representan la media de los
ratios ADP/O en los tres grupos experimentales. Co= ratones Control, Hz= ratones Heterocigotos y
Hz+IGF-1= ratones Heterocigotos tratados con IGF-I.
119
RESULTADOS
4.4.3. ESTIMACIN DEL ESCAPE DE PROTONES (PROTON LEAK) EN

MITOCONDRIAS AISLADAS DE LOS TRES GRUPOS EXPERIMENTALES.
Los resultados obtenidos en el apartado interior indicaban que parte del oxgeno
consumido por las mitocondrias de los ratones Hz no se empleaba en la produccin de
ATP.
Por ello nos planteamos estudiar la relacin entre el potencial de membrana
mitocondrial (Estado IV) y el consumo de oxgeno. Esto nos permiti estimar si el
oxgeno consumido que no ha sido empleado en la formacin de ATP ha sido utilizado
para mantener el potencial de membrana, ya que en condiciones fisiopatolgica se
produce una fuga o escape de protones hacia la matriz mitocondrial, la cual se refleja
en la disminucin del potencial de membrana.
Como se observa en la figura 38, para generar el mismo potencial de membrana
los ratones Hz necesitan consumir mayor cantidad de oxgeno que los ratones Co siendo
la diferencia significativa (p=0,024). Los ratones Hz+IGF-1 no presentan diferencias
con el grupo Co, pero si se comparan con los ratones Hz necesitan consumir menos
oxgeno para generar el mismo potencial, mostrando diferencias significativas
(p<0,0001).
Figura 38. Estudio de la relacin entre el consumo de oxgeno y la generacin del potencial de
membrana. En el eje de las X se representa los nmoles de oxgeno consumido por mg de protena en un
minuto y en eje de las y el potencial de membrana medido en U.A.F. Co= ratones Control, Hz= ratones
120
RESULTADOS
Estos datos indican que en las mitocondrias aisladas de ratones con niveles bajos
de IGF-1 se produce una prdida del gradiente de protones o aumento del proton leak.
4.4.4. SENSIBILIDAD AL ATRACTILSIDO COMO EXPRESIN DE LA

MENOR VULNERABILIDAD A LA APERTURA DEL PORO EN EL ANT.
En base a estos resultados previos, se quiso dilucidar si esto podra ser debido a
una alteracin del Complejo V o ATPsintasa, para ello se estudi la funcionalidad del
ANT aadiendo al medio un competidor del ADP por este transportador como es el
atractilsido. Las mitocondrias que presentan daos alteraciones en este transportador,
no responden a este inhibidor.
Como se observa en la figura 39, en los tres grupos experimentales (ratones Co,
Hz y Hz+IGF-1) se produjo una disminucin del consumo de oxgeno proporcional a la
concentracin de atractilsido en el medio. Adems, los ratios de consumo de O2 son
muy similares en los tres grupos experimentales, no observndose diferencias
significativas entre ratones Co, Hz y Hz+ IGF-1.
Figura 39. Estudio de la funcionalidad del ANT. En el eje de las X se muestran los pmoles/ml de
atractilsido aadido al medio. En el eje de las Y se refleja el consumo de oxgeno por mg de protena en
un minuto. Co= ratones Control, Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1= ratones Heterocigotos tratados
con IGF-1.
121
RESULTADOS
4.5. ESTUDIO DE LA RELACIN ENTRE LOS NIVELES

DE IGF-1 Y DE ESTRS OXIDATIVO.
En situaciones de normalidad parte del oxgeno consumido por la mitocondria no
se utiliza para la generacin de ATP, si no que va a dar lugar a la generacin de
radicales libres. En este sentido, en los apartados anteriores se ha mostrado que los
ratones con niveles inferiores de IGF-1 utilizan con menos eficacia el Oxgeno
consumido. Esto podra dar lugar a una mayor generacin de radicales libres, por lo que
nos planteamos como otro de los objetivos fundamentales de este trabajo el estudiar la
relacin entre los niveles de IGF-1 y el estrs oxidativo.
Para el cumplimiento de este objetivo, en primer lugar estudiamos la produccin
de radicales libres por mitocondrias aisladas mediante citometra de flujo.
Se determin la produccin de EROs en los distintos estados metablicos en las
mitocondrias mediante citometra de flujo.
Los ratones Co (18.892,80 158,48) presentan una menor produccin de radicales
libres, que los animales Hz (22.535,71 871,37) siendo la diferencia estadsticamente
significativa (p=0,003). Estos ltimos tambin presentaban niveles superiores de
radicales libres que los ratones Hz+IGF-1 (18.386,60 607,21) encontrndose
diferencias significativas (p0,0001). Los ratones tratados reducen la formacin de
EROS no encontrndose as diferencias significativas con el grupo de ratones Co
(Figura 40).
122
RESULTADOS
Figura 40. Anlisis de los niveles de radicales libres en mitocondrias aisladas de tejido heptico de los
animales control, heterocigotos y heterocigotos tratados con IGF-1. Representacin de la produccin de
EROS, medido en U.A.F. las barras representan la intensidad media de fluorescencia.
4.5.2. RELACIN ENTRE LA DISFUNCIN MITOCONDRIAL Y EL DAO

OXIDATIVO EN EL HGADO DE RATONES CON DEFICIENCIA PARCIAL
DE IGF-1, SIN DAO EXGENO ALGUNO

niveles de malondialdehdo en homogeneizados hepticos.
Dado que los ratones con niveles inferiores de IGF-1 presentan mayor produccin
de radicales libres, se propuso como siguiente objetivo estudiar si este aumento se
asociaba con un mayor dao oxidativo. Uno de los efectos perjudiciales del dao
oxidativo es la peroxidacin lipdica, que se estudi mediante la cuantificacin de
Malondialdehdo (MDA).
Al determinar el MDA en homogenizado de tejido heptico se observ que los
ratones Hz (0,153 0,0173 M/mg protena/ml) presentaban mayores niveles de MDA
(p=0,013) que los animales Co (0,123 0,0207 M/mg protena/ml). Sin embargo
cuando los ratones eran tratados con dosis bajas de IGF-1 disminuan los niveles de
123
RESULTADOS
dicho marcador (0,0682 0,00405 M/mg protena/ml), mostrando valores inferiores

al grupo Co (p=0,019) y tambin al grupo Hz (p=0,001) (Figura 41).
Figura 41. Cuantificacin de MDA en homogenizado de tejido heptico.
El grfico
representa los valores medios de MDA por mg de protena en un ml. Co= ratones Control,
Hz= ratones Heterocigotos y Hz+IGF-1= ratones Heterocigotos tratados con IGF-1.

proten carbonil content.
Otro de los efectos no menos perjudiciales del estrs oxidativo es la oxidacin de

protenas, para analizar este fenmeno se determin el contenido de PCC (Protein
Carbonyl Content), obteniendo los siguientes resultados.
Los ratones del grupo Co (0,221 0,0406) presentaban menor cantidad de PCC
que los Hz (0,390 0,0355) encontrndose diferencias significativas (p=0,034). Sin
embargo, al tratar los ratones Hz con IGF-1 los niveles de PCC (0,306 0,199)
disminuyeron algo, aunque no se encontraron diferencias significativas con respecto al
grupo Hz. No obstante, disminuyeron los suficiente para no encontrar diferencias
significativas entre el grupo Hz+IGF-1 y el Co (Figura 42).
124
RESULTADOS
Figura 42. Determinacin de PCC en homogenizado de tejido heptico en ratones Control,

heterocigotos y Heterocigotos tratados con IGF-1. La grfica muestra las medias de PCC en
mmoles por mg de protena en un ml.
4.5.3. ESTUDIO DE LA RELACIN ENTRE LOS MECANISMOS OXIDANTES

Y LOS NIVELES DE IGF-1.
El estrs oxidativo es el resultado de tres elementos como son, produccin de

radicales libres y mecanismos antioxidantes y mecanismos reparadores. Ya hemos
mostrado en los apartados anteriores que los ratones con niveles inferiores de IGF-1
presentaban mayor produccin de radicales libres y como consecuencia una mayor dao
oxidativo. No obstante, tambin nos planteamos si este aumento del dao oxidativo en
los ratones Hz era tambin debido a un fallo en los mecanismos reparadores.
Con este objetivo, se determin la actividad de las principales enzimas
antioxidantes; Catalasa (enzima que adems de detoxificar el H2O2, participa en el
metabolismo de las grasas), Superxido Dismutasa mitocondrial (SODmit), superxido
dismutasa citoplasmtica (SODcit) y Glutation Peroxidasa (GPX). Los resultados
obtenidos se muestran en la tabla 8.
125
RESULTADOS
Tabla 8. Estudio de la actividad antioxidante de las enzimas catalasa, Superxido

Dismutasa y glutatin peroxidasa.
Control (n=10)
Heterozigotos
Hz+IGF-1 (n=10)
(n=10)
34,42 1,13
33,40 1,21
SODcit (U/mgprot) 2,19 0,54
2,27 0,93
1,94 2,90
SODmit
1,02 0,22
1,26 0,19
1,33 0,19
125,80 35,22
152,40 18,25
208,10 24,35
Catalasa (U/mg
24,25 1,88
prot)
(U/mgprot)
GPX(U/mgprot)
: Co vs Hz, Co vs Hz+IGF-1. p=0,004.
Como se puede observar no se encontraron diferencias significativas entre los tres

grupos de ratones al analizar la actividad de la enzima GPX, ni de la SOD
citoplasmtica o mitocondrial. Sin embargo, al analizar la enzima catalasa observamos
que la actividad de esta enzima en los ratones Hz (34,423 1,130) era mayor que en los
ratones Co (24,254 1,884), siendo las diferencias estadsticamente significativas
(p=0,004). La actividad de la enzima no variaba en los ratones Hz+IGF-1 (33,401
1,206), detectndose valores similares a los ratones Hz, y significativamente mayores
(p=0,004) que los ratones Co (Figura 43).
126
RESULTADOS
Figura 43. Estudio de la actividad de la enzima Catalasa en homogenizado de tejido heptico. Las ratones
control (Co) se representan en verde, los ratones heterocigotos (Hz) en naranja y los ratones tratados
(Hz+IGF-1) en azul. Las barras representan la media de la actividad de la enzima (Unidades/mg protena).

DE IGF-1 Y LA ESTRUCTURA HEPATOCITARIA.
Para determinar si la deficiencia de IGF-1 se asociaba con alteraciones de la
estructura heptica se realizaron tinciones con Hamatoxilina-Eosina y Tricrmico de
Masson.
Tras el anlisis de las tinciones de Hematoxilina-Eosina se pudo comprobar que
los ratones HZ y ratones HZ+IGF-1 mostraban una arquitectura heptica similar a la
mostrada por el grupo control, y que se corresponde con una estructura hepatocelular
tpica (figura 44).
127
RESULTADOS
Co
Hz
Hz+IGF-1
Figura 44. Anlisis mediante tincin con Hematoxilina-Eosina de la estructura heptica. Como se puede
observar, en los tres grupos experimentales el tejido heptico muestra una arquitectura tpica, en la que se
puede observar la triada portal de morfologa caracterstica, arquitectura hexagonal hepatocelular y
canalculos biliares conservados. Imgenes capturadas a 400 aumentos.
Dado que en las situaciones de dao tisular heptico aparece fibrosis, uno de
cuyos componentes principales es el colgeno, procedimos a realizar tinciones con
Tricrmico de Masson, ya que esta tcnica tie de azul estas fibras.
En ninguno de los tres grupos experimentales (figura 45) existan indicios de fibrosis
tisular, ya que no se apreciaba la presencia de septos fibrosos, que estaran teidos de azul,
entre las hileras de hepatocitos.
Co
Hz
Hz+IGF-1
Figura 45. Anlisis de la estructura tisular mediante la tincin de Tricrmico de Masson en ratones control,
ratones heterocigotos y ratones heterocigotos tratados con IGF-1. Los ncleos se tien de negro debido a la
hematoxilina frrica. No se observan septos fibrosos (azul) entre las hileras de hepatocitos. Las imgenes fueron
capturadas a 400 aumentos.
128
RESULTADOS
4.7. ANLISIS DE LOS COMPLEJOS DE LA CADENA

RESPIRATORIA
MEDIANTE
ESTUDIO
Como se ha descrito anteriormente (apartado 4.4.1. de resultados) cuando se usa
succinato como sustrato los ratones Hz muestran una disminucin del potencial de
membrana y de la generacin de ATP, en comparacin a los ratones control. Adems,
los ratones Hz mostraban una mayor produccin de radicales (apartado 4.5.1 de
resultados). En base a estos resultados, pensamos que poda existir una alteracin en los
complejos II y IV de la cadena de transporte de electrones. Para llevar a cabo este
estudio, nos propusimos determinar los niveles de la enzima succinato deshidrogenasa
del complejo II y de la subunidad IV del complejo citocromo c oxidasa mediante la
realizacin de inmunohstiqumicas e inmunofluorescencias
4.7.1. ESTUDIO DE LOS NIVELES DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

(COMPLEJO II).
Al analizar las inmunohistoqumicas realizadas en tejido heptico, no se

observaron diferencias en los niveles de la enzima succinato deshidrogenasa cuando se
compararon los ratones Co, Hz y Hz+IGF-1 (figura 46.A-C). Tampoco se observaron
diferencias significativas al analizar las inmunofluorescencias mediante microscopa de
fluorescencia (figura 46.D-F), ni al cuantificar esta enzima mediante determinacin de
los niveles de intensidad de fluorescencia (datos no mostrados).
129
RESULTADOS
Co
Hz
Hz+IGF-1
Figura 46. Estudio de los niveles de la enzima succinato deshidrogenasa mediante inmunohistoqumica e
inmunofluorescencia. Para la realizacin de las inmunohistoqumicas (A, B y C) las muestras fueron
reveladas con diaminobenzidina (marrn) y fueron contrastadas con hematoxilina. Los tres grupos
muestran el patrn tpico punteado citoplasmtico, debido a la localizacin mitocondrial de la enzima
succinato deshidrogenasa. Las inmunofluorescencias (D, E y F) se tieron con el fluorocromo rodamina
(rojo). Co: ratones control. Hz: ratones heterocitogotos. Hz+IGF-1: ratones tratados. Las imgenes
fueron tomadas a 400 aumentos.
4.7.2. ESTUDIO DE LA SUBUNIDAD IV DE LA CITOCROMO OXIDASA

(COMPLEJO IV).
Sin embargo, cuando se analizaron mediante inmunohistoqumica los niveles

de la subunidad IV de la citocromo oxidasa, mediante microscopa ptica se puedo
observar que los ratones Co mostraban una tincin ms intensa que los ratones Hz
(figura 47.A-C). Los ratones Hz+IGF-1 tambin mostraban una seal ms intensa que el
grupo Hz, de hecho los niveles eran muy similares a los ratones Co. Para confirmar
estos resultados procedimos a la realizacin de inmunofluorescencias, observando los
mismos resultados (Figura 47. D-F).
130
RESULTADOS
Co
Hz
Hz+IGF-1
Figura 47. Estudio de los niveles de la subunidad IV de la citocromo oxidasa mediante

inmunohistoqumica e inmunofluorescencia. Para la realizacin de las inmunohistoqumicas (A, B y C)
las muestras fueron reveladas con diaminobenzidina (marrn) y contrastadas con hematoxilina, que tie
los ncleos de azul. Los tres grupos mostraban el patrn tpico punteado citoplasmtico, debido a la
distribucin mitocondrial de la subunidad B del complejo IV. Las inmunofluorescencias (D, E y F) se
tieron con el fluorocromo rodamina (rojo) Al igual que ocurre con las inmunohistoqumicas, se observa
un patrn punteado citoplasmtico. Co: ratones control. Hz: ratones heterocigotos. Hz+IGF-1: ratones
tratados. Las imgenes fueron tomadas a 400 aumentos.
Finalmente, determinamos de manera semicuantitativa los niveles de la subunidad

IV de la citocromo oxidasa determinando los niveles de fluorescencia en los tres grupos
experimentales. Como se puede observar en la tabla 9, los ratones control mostraban
una intensidad media de fluorescencia (63,89 3,01) ms alta que los ratones Hz (33,28
1,12), siendo las diferencias estadsticamente significativas (p<0,0001). Los ratones
Hz+IGF-1 (56,95 5,65) tambin mostraban niveles significativamente mayores
(p<0,0001) de la subunidad IV de la citocromo oxidasa, que los ratones heterocigotos.
Sin embargo, no se encontraron diferencias estadsticamente significativas al comparar
los ratones Hz+IGF-1 con el grupo control (Figura 48).
131
RESULTADOS
Figura 48. Anlisis de los niveles de la subunidad IV del complejo citocromo oxidasa en hepatocitos. Las
ratones control (Co) se representan en verde, los ratones heterocigotos (Hz) en naranja y los ratones
tratados (Hz+IGF-1) en azul. Las barras representan la media de intensidad media de fluorescencia.
4.8. DEFICIENCIA DE IGF-1 Y EXPRESIN HEPTICA

DE
GENES
QUE
CODIFICAN
PARA
PROTENAS
PROTECTORAS DE LA MITOCONDRIA
Se analiz la expresin gnica de los genes que se muestran en la tabla 9, los
cuales estn relacionados con la funcin mitocondrial. Para ello se emple la tcnica de
Microarrays.
132
RESULTADOS
Tabla 9. Estudio de la expresin gnica de genes relacionados con la funcin

mitocondrial.
Hz+IGF-1
Nombre del gen
Hz vs Co
Hz
(Fold change)
(Fold change)
serine (or cysteine) peptidase inhibitor,

clade F, member 2
serpinf2
1.08
1.08
mitofusin 2
mfn2
-1.33
1.20
pten induced putative kinase 1
pink1
-1.60
1.27
leucine-rich repeat kinase 2
lrrk2
1.01
-1.03
ucp1
1.13
-1.16
ucp2
1.07
1.03
(mitochondrial, proton carrier)
ucp3
1.00
1.03
bcl2 binding component 3
bbc3
-1.55
-1.02
myeloid cell leukemia sequence 1
mcl1
1.12
1.29
bcl2-associated x protein
bax
1.05
1.04
containing 1
tmbim1
-1.02
-1.07
bcl2-associated agonist of cell death
bad
1.16
1.04
glycogen synthase kinase 3 beta
gsk3b
-1.36
1.30
uncoupling protein 1
transmembrane
bax
inhibitor
motif
Se observ que la expresin del gen pink1, el cual est implicado en la

degradacin de mitocondrias daadas, se encontraba disminuida en los animales Hz en
relacin a los animales control. Por el contrario, no se encontraron diferencias en la
expresin de este gen al comparar el grupo Hz con el grupo Hz+IGF-1.
Tambin disminuida la expresin del gen bcl2, el cual est implicado en
mecanismos anti apoptticos, en el grupo Hz en comparacin al grupo control. Sin
embargo, no se encontraron diferencias significativas en la expresin de este gen al
comparar el grupo Hz+IGF-1 con el grupo control.
133
vs
DISCUSIN
DISCUSIN
134
DISCUSIN
IGF-1 es una hormona implicada en numerosas funciones fisiolgicas, como por

ejemplo divisin celular (Leal et al., 2011), crecimiento tisular (Backeljauw et al., 2001)
y numerosas funciones metablicas (Bondy et al., 1994).
Lamentablemente todava hoy en da no se conocen en profundidad ni los
mecanismos moleculares mediante los cuales esta hormona induce las acciones
conocidas, ni tampoco todas sus implicaciones biolgicas.
Los modelos animales son de gran utilidad para el estudio de la funcin
fisiolgica de genes y de las molculas codificadas por estos, ya que en muchos casos
aportan datos que son en gran medida extrapolables al ser humano.
En este sentido, nuestro grupo de investigacin ha realizado numerosos estudios
en modelos animales de envejecimiento (Garca-Fernndez et al., 2008; GarcaFernndez et al., 2011) y de cirrosis heptica (Castilla-Cortazar et al., 2011). En estos
trabajos se pudo observar que los bajos niveles de IGF-1 se asociaban con una
disminucin de la funcin mitocondrial y con un aumento del estrs oxidativo (Puche et
al., 2008). Estas manifestaciones eran resueltas tras la administracin de este factor de
crecimiento. No obstante, estos modelos eran una de gran complejidad e intervenan
numerosas variables.
Por esta razn, nos planteamos como prioridad disponer de un modelo
experimental de deficiencia parcial de IGF-1 que pudiera ser ms adecuado para
investigar los mecanismos de accin especficos de esta hormona. Es decir, discernir si
el dficit de IGF-1 era per se un factor causal en la fisiopatologa del sndrome
estudiado, y que pudiera ser revertidos por la terapia sustitutiva con este factor de
crecimiento.
Este nuevo modelo murino, creado por el Prof. Efstratiadis (Liu et al., 1993),
consista en una modificacin gentica que haca no funcional el alelo codificante de
IGF-1. En base a la gentica mendeliana se obtenan ratones control (WT: ambos alelos
funcionales, igf-1+/+), ratones HZ (uno de los dos alelos funcionales: igf-1+/-) y ratones
KO (ninguno de los alelos funcionales (igf-1+/+). Inicialmente pensamos que los ratones
KO eran el mejor modelo para estudiar el efecto fisiolgico de IGF-1. Sin embargo, en
un estudio realizado con animales de tan slo 10 das de edad nosotros pudimos
comprobar que ratones KO prcticamente no producan esta hormona y que los
animales Hz mostraban concentraciones sricas de IGF-1 significativamente inferiores a
los ratones CO. Esta ltima situacin es similar a lo observado en diversas patologas
humanas (Laron, 1966; Wu et al., 1974). Adems, los ratones HZ mostraban una serie
135
DISCUSIN
de alteraciones fenotpicas, como un menor peso corporal, disminucin de la longitud

sea y menor peso de los rganos internos (Castilla-Cortazar et al., 2014), similares a
las observadas en sndromes relacionados con la deficiencia de IGF-1 (Sheppard et al.,
1987; Caufriez et al., 1991; Assy et al., 1997).
Por todos estos datos, considerbamos que los ratones HZ constituan un modelo
ptimo para el estudio de la funcin fisiolgica de IGF-1, ya que se podan establecer
grupos experimentales que presentaban como nica diferencia la concentracin srica
de este factor de crecimiento. Adems, los datos obtenidos podran ser muy tiles para
poder comprender la fisiopatologa de enfermedades que presentan esta deficiencia.
Dado que los pacientes que presentan patologas que se asocian a bajos niveles de
IGF-1 podran beneficiarse de la terapia con esta hormona, es de gran inters el
establecimiento de estudios preclnicos para determinar las dosis y farmacocintica del
frmaco. Este es un punto ampliamente estudiado por nuestro grupo como se describe a
continuacin.
En modelos animales cirrosis heptica experimental (Castilla-Cortazar et al.,
1997a; Castilla-Cortazar et al., 1997b; Castilla-Cortazar et al., 2001; Picardi et al.,
1997) (Muguerza et al., 2001; Mirpuri et al., 2002), pudimos comprobar que la
administracin de dosis bajas de IGF-1 (2g100g-1da-1) mostraban efectos
beneficiosos en estadios incipientes o avanzados de la enfermedad. Al administrar esta
dosis, mejoraba la absorcin intestinal de azcares y aminocidos, la osteopenia, la
atrofia testicular, la funcin y fibrosis heptica y la funcin mitocondrial (Picardi et al.,
1997; Castilla-Cortazar et al., 1999; Castilla-Cortazar et al., 2004a; Castilla-Cortazar et
al., 1997a; Castilla-Cortazar et al., 1997b; Cemborain et al., 1998; Pascual et al., 2000;
Muguerza et al., 2001). No menos interesante, el tratamiento tambin indujo efectos
anabolizantes y antioxidantes, y en ningn caso estas pautas de tratamiento provocaron
hipoglucemia. Posiblemente esto estaba en relacin con que estas dosis eran capaces de
elevar las concentraciones circulantes de la hormona hasta valores similares a los del
grupo control (Picardi et al., 1997; Castilla-Cortazar et al., 2000; Castilla-Cortazar et al.,
2004b; Tutau et al., 2009).
En otros trabajos realizados en modelos de envejecimiento, otra condicin de
deficiencia de IGF-1, tambin decidimos utilizar dosis similares (2,25g100g-1da-1).
Los efectos observados fueron similares al caso anterior, aumento de la concentracin
136
DISCUSIN
srica de IGF-1 sin que se observara hipoglucemia, y acciones anabolizantes y

antioxidantes (Garca-Fernndez et al., 2011).
Adems, otros grupos han descrito que dosis mayores de 2600 g/kg pc/da son
letales por su efecto hipoglucemiante (Bagi et al., 1994).
En cuanto a las dosis empleadas en humanos, en un ensayo clnico desarrollado
por nuestro grupo con pacientes cirrticos, pudimos observar que dosis s de 20 g/kg
pc/da (con escalada de dosis hasta 50 100 g/kg pc/da), durante un mes (Conchillo et
al., 2005) resultaron insuficientes para normalizar las concentraciones circulantes. No
obstante, tambin se obtuvieron efectos beneficiosos, como el incremento de la
albuminemia y la disponibilidad energtica, lo que probablemente estuviese relacionado
con la proteccin mitocondrial.
Estos datos estn en concordancia con otros estudios realizados en mujeres
postmenopusicas con osteopenia, en los que se demostr que dosis de 30 g/kg pc/da)
estimularon la renovacin sea sin provocar efectos adversos (Ebeling et al., 1993),
pero dosis superiores a 60-80g/kg pc/da producan efectos secundarios.
Sin embargo, en estudios relativamente recientes se ha descrito la seguridad y
eficacia de dosis individuales de 80-120 g/kg pc/da y de 240 g/kg pc/da en dos
dosis diarias, para el tratamiento de la deficiencia primaria de IGF-1 (Midyett et al.,
2010). Estos datos pueden indicar que la dosis adecuada dependa del tipo de patologa.
Adems, de estos existen nmeros trabajos que han analizado los efectos tanto
beneficiosos como secundarios de la terapia sustitutiva con IGF-1, los cuales se
resumen en la tabla 10.
137
DISCUSIN
Tabla 10. Efectos secundarios de la terapia con IGF-1 en dosis superiores a 60,g/kg/da
(modificado de (Puche et al., 2012) ).
Dosis
Efectos adversos
IGF-1
Referencias
(g/kg/da)
Taquicardia
150-200
Kinger B, Laron Z,1995
120-180
Ebeling P et al 1993
Backeljauw PF et al, 1996; Laron Z
Hipoglicemia
60-120
et al, 1992
80-120
Ranke MB et al, 1995; Midyett LK

et al, 2010.
Backeljauw PF et al, 1996; Laron Z
Incremento de la
presin intracraneal
et al, 1992
80-120
Ranke MB et al, 1995; Midyett LK

et al 2010.
Lipohipertrofia
Hipertrofia
amigdalina y tonsilar
Cefalea, vmito
Edema facial
Astenia,
hipotensin ortosttica
Artralgia, mialgia
Hipoglucemia
letal
Edema, Cefalea,
Artralgia
Parlisis de Bell
Backeljauw PF et al, 1996, Midyett
60-120
LK et al, 2010.
Backeljauw PF et al, 1996; Midyett
60-120
LK et al, 2010.
80-120
Midyett LK et al, 2010.
120-180
120
Ebeling PR et al, 1993; Ketelslegers

JM et al, 1995.
Jabri N et al, 1994.
120
Ketelslegers JM et al, 1995.

Ketelslegers JM et al, 1995.
120
Jabri N et al, 1994.
2600
Bagi et al, 1994.
240-360
Moses AC et al. 1996.
240
Schwartz SL et al, 1997
138
DISCUSIN
En conclusin, tal y como fue establecido por Zvi Laron en 2008, dosis menores a
60 g/kg pc/da no producen efectos secundarios ni en humanos (Conchillo et al., 2005;
Ebeling et al., 1993) ni en animales (Castilla-Cortazar et al., 1997a; Castilla-Cortazar et
al., 1997b; Castilla-Cortazar et al., 2000) (Muguerza et al., 2001; Pascual et al., 2000;
Garca-Fernndez et al., 2008; Picardi et al., 1997; Perez et al., 2008; Puche et al., 2008)
y muestran efectos beneficiosos. No obstante, hay que seguir indagando, ya que en
algn caso aislado se ha descrito que dosis de 24 a 32 g/kg pc/da provocaban
artralgias, mialgias, astenia, dolor mandibular y edema en cara y manos (Bondy et al.,
1994).
Este fue uno de los motivos por los que en un estudio previo desarrollado con este
nuevo modelo de ratones transgnicos para el gen igf-1 analizamos el efecto de la
administracin exgena de dosis bajas este factor de crecimiento en animales de 10 das
de edad. Pudimos observar que tras el tratamiento los ratones deficientes mostraban
niveles de esta hormona eran similares a los ratones control. Adems, se observaron
efectos beneficiosos sin observarse efectos secundarios. Por lo tanto, estos resultados
eran congruentes con todos lo publicado anteriormente, y confirman una vez ms la
eficacia de esta hormona a dosis bajas, que se comporta como una verdadera terapia
sustitutiva.
Una vez establecido el modelo de estudio y la dosis del tratamiento a administrar,
nos planteamos en primer lugar determinar los niveles de IGF-1 en las diferentes etapas
de la vida de los animales.
5.1. ESTUDIO DE LA CONCENTRACIN PLASMTICA

DE IGF-1 EN FUNCIN DE LA EDAD DE LOS
ANIMALES.
Numerosos datos indican que IGF-1 juega el papel fundamental en el desarrollo
intrauterino (Daughaday et al., 1989; Adamo et al., 1989; Cohick et al., 1993a), mayor
incluso que la GH. De hecho, la baja concentracin srica de este factor de crecimiento
se asocia con una disminucin del tamao fetal tanto en modelos animales (CastillaCortazar et al., 2014) como en humanos (Savage et al., 2001b). Tambin se cree que
durante la infancia y la edad prepuberal tanto GH como IGF-1 tienen una accin
sinrgica en cuanto al crecimiento corporal (Savage et al., 1993). De hecho, como se ha
139
DISCUSIN
comentado anteriormente, en nuestro modelo animal, los ratones HZ de diez das de

mostraban un menor tamao que los ratones control.
Sin embargo, poco se sabe del papel de IGF-1 en la edad adulta, una vez se ha
detenido el crecimiento corporal.
Por todo ello, nos propusimos analizar en primer lugar si la inactivacin de uno de
los alelos que codifican para IGF-1 se reflejaba en las concentraciones circulantes de
esta hormona a lo largo de la vida de los animales. Con este objetivo, se analizaron los
niveles plasmticos de IGF-1 en ratones control y en ratones heterocigotos a diferentes
edades.
Pudimos comprobar que, tanto en los ratones control como heterocigotos, la
concentracin de IGF-1 en sangre aumentaba progresivamente durante la etapa
postnatal, observndose un pico al mes de edad, lo que coincide con el paso de la etapa
postnatal a la adulta. Posteriormente, los niveles disminuan ligeramente en ambos
grupos, aunque desde el tercer mes de edad hasta los ocho meses la concentracin de
IGF-1 permaneca sin variaciones. A partir de los trece meses de edad, los niveles de
IGF-1 disminuan de manera progresiva hasta el momento del punto final (Figura 32).
Por otra parte, al comparar los niveles de IGF-1 plasmticos de ratones Co y ratones HZ
observamos que los primeros mostraban niveles superiores de IGF-1 en cualquier fase
de la vida. Estos resultados corroboraban nuestros datos previos, que indicaban que los
ratones Hz postnatales tenan niveles ms bajos de IGF-1 que los ratones Co de la
misma edad, y avalaban que la deficiencia se mantena lo largo de la vida de los
animales.
Estos hallazgos son de gran importancia para la validacin de este modelo animal
por varios motivos.
En primer lugar porque los niveles de IGF-1 mostraban una variacin a lo largo de
la vida de los ratones similares a lo que se ha observado en humanos, que muestran un
mximo de las concentraciones circulantes alrededor de los 17 aos y un progresivo
declive alrededor de los 40 aos de edad (Figura 32) (Lamberts et al., 1997). Esta
semejanza indica que el estudio de las funciones fisiolgicas de IGF-1 en este modelo,
es en gran medida extrapolable a humanos. Esto es de gran inters ya que actualmente
todava no se conocen en detalle todos los mecanismos de accin de esta hormona. De
hecho, hay procesos fisiolgicos, como por ejemplo el envejecimiento, que pueden estar
relacionados con la disminucin de los niveles de esta hormona (Moverare-Skrtic et al.,
2009; Barbieri et al., 2009).
140
DISCUSIN
En segundo lugar, la disminucin de los niveles de IGF-1 en los ratones Hz

adultos guarda equivalencia con la disminucin de la concentracin de IGF-1 observado
en numerosas patologas que se desarrollan durante la edad adulta. Por esta razn,
conocer los mecanismos implicados en las alteraciones consecuentes a la deficiencia de
este factor es de gran inters para para establecer nuevas dianas teraputicas.
5.2. EFECTO DE LA DEFICIENCIA DE IGF-1 SOBRE EL

PESO CORPORAL.
Una vez observado que al truncar uno de los alelos se produca una disminucin
significativa de la concentracin plasmtica de IGF-1 en animales adultos, procedimos a
analizar si este hecho se reflejaba fenotpicamente. Para la realizacin de este estudio
procedimos a analizar ratones machos de entre 4 y 8 meses de edad porque en esta edad
no se observaron fluctuaciones en la concentracin srica de IGF-1 y porque al ser
animales adultos ya no hay fluctuaciones de las hormonas sexuales. Por este mismo
motivo se eligi a machos y no a hembras.
Dado que IGF-1 es una hormona anabolizante (Bang et al., 2001), nos propusimos
como primera aproximacin estudiar el efecto de este factor de crecimiento sobre el
peso de los animales.
Se observ que los animales Co mostraban un mayor peso corporal que los
ratones con deficiencia parcial de IGF-1.
Una vez habamos detectado que los bajos niveles de IGF-1 tambin tenan una
consecuencia fenotpica en los ratones adultos, nos planteamos como siguiente objetivo
estudiar si la administracin exgena de IGF-1 podra revertir las consecuencias
derivadas de la deficiencia de este factor.
Pudimos comprobar, que los ratones HZ a los que se les haba inoculado IGF-1 de
manera subcutnea no mostraban un mayor peso corporal que los ratones Hz a los que
se les haba administrado el excipiente succinato. No obstante, los ratones Hz tratados
con IGF-1 aumentaban algo de peso, ya que tampoco se observaban diferencias
estadsticamente significativas al compararlos con el grupo Co tratado con el excipiente
anteriormente mencionado.
Estos resultados, ciertamente inesperados, posiblemente eran debidos a tres
motivos. En primer lugar, que el nmero de ratones empleado fuese demasiado bajo
141
DISCUSIN
para la potencia estadstica del test empleado. En segundo lugar, tal y como se describe
en la tabla 5, a que tambin pudimos observar que todos los ratones perdan peso al ser
tratados tanto con IGF-1 como con el excipiente. Aunque realmente desconocemos el
motivo de este hallazgo, posiblemente sea debido al estrs ocasionado durante el
procedimiento de inoculacin. En cualquier caso, parece plausible pensar que este
hecho pudo enmascarar la ganancia de peso al inocular IGF-1. Por ltimo, tambin hay
que tener en cuenta que se trataba de ratones adultos, por lo que aunque este factor de
crecimiento tenga un efecto anabolizante, no se da el crecimiento longitudinal seo ni
de rganos que si ocurre durante la etapa fetal y prepuberal de estos animales (Liu et al.,
1993). De hecho, se ha descrito que en el Sindrome de Laron las principales
consecuencias del dficit de este factor de crecimiento se da en la infancia (Wit et al.,
1992; Savage et al., 1993; Laron, 1999; Baker et al., 1993).
En conclusin, pensamos que si bien los ratones adultos con bajos niveles de
IGF-1 tienen menor peso corporal, esto es debido a un menor desarrollo durante la etapa
fetal y postnatal
5.3. RELACIN ENTRE LA DEFICIENCIA DE IGF-1 Y

LOS PARMETROS ANALTICOS EN SUERO DE
RATN.
Adems de su importante funcin anabolizante, IGF-1 tambin regula el
metabolismo de la glucosa (Binoux, 1995). Efectivamente, se conoce desde hace aos
que IGF-1 tiene un efecto hipoglucemiante tanto en humanos como en animales (Bondy
et al., 1994; Binoux, 1995). Pero es que adems, trabajos realizados en modelos
animales han demostrado que IGF-1 y GH influyen en la sensibilidad a la insulina
(Yakar et al., 2004). El proceso inverso tambin se produce, ya que al regular los
niveles de glucosa, la insulina tambin interviene en cierta medida en la produccin de
GH y como consecuencia en la de IGF-1 2009 (Bang et al., 2001).
Este factor de crecimiento tambin parece regular el metabolismo lipdico a varios
niveles. En un estudio realizado en personal adultas se pudo comprobar que los niveles
de IGF-1 se relacionaban de manera positiva con la concentracin de HDL (Succurro et
al., 2010). Adems, se ha observado en modelos animales que los niveles de expresin
del gen igf-1 son superiores en el tejido adiposo que en otro tipo de rganos (Yakar et
142
DISCUSIN
al., 1999). Esto est en concordancia con que este factor de crecimiento tenga una
accin paracrina lipoltica sobre los adipocitos (Boucher et al., 2012).
No obstante, todava no estn esclarecidos los mecanismos implicados en la
regulacin metablica de IGF-1, por lo que nos propusimos analizar la relacin entre los
niveles de esta hormona y el metabolismo de glcidos y lpidos.
En este modelo experimental no observamos diferencias significativas en los
niveles de glucosa entre los ratones con niveles normales de IGF-1 y ratones con bajos
niveles de esta hormona. Este dato es relativamente sorprendente, ya que al tratarse el
IGF-1 de un factor hipoglucemiante hubiese cabido esperar un aumento de los niveles
de glucosa en los ratones heterocigotos. No obstante, existen numerosos trabajos que
han observado que en las etapas iniciales del Sndrome de Laron, un porcentaje
considerable de los pacientes muestran hipoglucemia, y niveles altos de insulina (Laron
et al., 1995). En base a este conjunto de datos, nosotros pensamos que en nuestro
modelo animal la disminucin de IGF-1 se puede compensar con una mayor eficacia de
la accin de la insulina. De hecho, esta es la hiptesis que tambin explica hallazgos
recientes en el sndrome metablico y las enfermedades cardiovasculares (Akanji et al.,
2012).
Tampoco existan variaciones en los niveles de glucosa despus del tratamiento
con IGF-1. Teniendo en cuenta el hallazgo anterior, este dato s que era esperable ya
que se eligi la inoculacin subcutnea porque ya haba sido descrita por otros grupos
como la mejor va para no provocar un choque hipoglucmico (Bondy et al., 1994;
Binoux, 1995; Tomas et al., 1996). Esto es debido a que este tipo de administracin
hace que IGF-1 pase de manera gradual al torrente circulatorio, lo que permite una
unin progresiva a las protenas transportadoras (Bondy et al., 1994; Binoux, 1995;
Tomas et al., 1996).
En cualquier caso pensamos que hay que realizar ms anlisis al respecto, porque
en un estudio posterior de expresin gnica en muestras hepticas hemos observado que
la deficiencia de IGF-1 se asocia con hipoexpresin de genes implicados en rutas
metablicas de la glucosa, que justificaran el establecimiento del sndrome metablico
en adultos con deficiencia de IGF-1.
En cuanto al metabolismo lipdico, no pudimos detectar diferencias significativas
en las concentraciones sricas de colesterol al comparar los tres grupos estudiados.
Estos datos difieren de nuestros estudios previos, realizados en un modelo de
envejecimiento, que avalaban que IGF-1 y colesterol tienen una relacin inversa
143
DISCUSIN
(Garca-Fernndez et al., 2008). No obstante, s que estn en concordancia con otros

estudios realizados en personas adultas (Succurro et al., 2010), por lo que todo hace
indicar que IGF-1 no tiene gran relevancia en el metabolismo del colesterol, aunque
estudios ms exhaustivos seran necesarios para confirmar este hecho.
Por el contrario, los ratones heterocigotos mostraban niveles de triglicridos
superiores que los ratones control. Las concentraciones de triglicridos volvan a la
normalidad despus del tratamiento con IGF-1. Estos datos corroboran los resultados
obtenidos por nuestro grupo en un modelo de envejecimiento, los cuales avalaban que
niveles bajos de IGF-1 se correlacionaban con altos niveles de triglicridos (GarcaFernndez et al., 2008; Puche et al., 2008; Garca-Fernndez et al., 2011). Ms
interesante an, se correlacionan con estudios realizados en humanos que sugeran que
los niveles de IGF-1 y triglicridos estaban inversamente relacionados (Succurro et al.,
2010). Posiblemente esta pueda ser la causa de que los bajos niveles de esta hormona
sea un marcador pronstico en infarto de miocardio y enfermedades coronarias (Colao
et al., 2005; Spallarossa et al., 1996; Conti et al., 2001). En definitiva, nuestros
resultados demuestran en gran medida que IGF-1 tiene un papel en la regulacin del
metabolismo de los triglicridos mayor del que hasta ahora se le atribua (Bang et al.,
2001).
Como todos los ratones reciban la misma alimentacin, la explicacin ms
probable del aumento de los niveles de triglicridos es el fallo del metabolismo lipdico
en los ratones con deficiencia en esta hormona. Parte de estas rutas metablicas, como
por ejemplo la -oxidacin de los lpidos, que tienen lugar en la mitocondria. De hecho,
publicaciones recientes avalan que alteraciones mitocondriales pueden ser la causa del
aumento de la concentracin de triglicridos y del desarrollo de patologas (Roden,
2005; Vankoningsloo et al., 2005).
En este sentido, datos previos publicados por nuestro grupo nos inducan a pesar
que el factor IGF-1 podra tener un papel muy relevante en la funcin mitocondrial
(Garcia-Fernandez et al., 2008; Puche et al., 2008; Garcia-Fernandez et al., 2011).
144
DISCUSIN
5.4. ESTUDIO DE LA FUNCIN MITOCONDRIAL EN

MITOCONDRIAS AISLADAS: EFECTO DE LA TERAPIA
SUSTITUTIVA.
En base a los antecedentes anteriormente descritos, nos planteamos como
siguiente objetivo analizar la funcin mitocondrial en relacin a los niveles de IGF-1.
Este estudio se realiz en mitocondrias aisladas a partir de tejido heptico, ya que
est descrito que esta tcnica presenta una serie de ventajas, como por ejemplo, su
relativa sencillez en comparacin a estudios realizados en clulas. Adems, no existe
interferencia de factores citoslicos, por lo que se pueden establecer de manera precisa
las distintas condiciones metablicas y los controles necesarios para cada una de ellas.
No menos importante, los protocolos estn estandarizados por lo que los valores
obtenidos son comparables con otros estudios (Brand et al., 2011).
5.4.1.
DETERMINACIN
DEL
POTENCIAL
DE
MEMBRANA
POR
CITOMETRA DE FLUJO.
Para el cumplimiento de este objetivo se estudi en primer lugar, mediante

citometra de flujo, el potencial de membrana mitocondrial, o lo que es lo mismo, el
bombeo de protones al espacio intermembrana, el cual es uno de los mejores
indicadores de la eficiencia de la fosforilacin oxidativa (O'Connor et al., 1988b). Esto
es as porque segn la teora quimiosmtica de Mitchell (Mitchell, 1961; Mitchell et al.,
1969; Mitchell et al., 1965), los electrones generados en los procesos metablicos son
utilizados por la cadena respiratoria para bombear protones al espacio intermembranoso.
Finalmente, los electrones sern captados por el oxgeno y el gradiente de protones, que
supone un acmulo de energa, es utilizado como fuerza motriz para producir ATP. Por
este motivo, en condiciones normales existe una relacin estequiomtrica bastante fija
entre consumo de oxgeno, potencial de membrana y generacin de ATP, lo que
significa que la mitocondria est acoplada. Sin embargo, si se altera esta relacin se dice
que este orgnulo est desacoplado.
Como hemos mostrado en la Figura 35, los ratones con deficiencia de IGF-1
tenan, cuando se les aada un sustrato metablico tpico de mitocondrias como el
succinato, un potencial de membrana inferior al de los ratones con concentraciones
145
DISCUSIN
normales de IGF-1. Adems, al tratar a los animales con dicha hormona el potencial de
membrana volva a la normalidad, lo mismo que las concentraciones de IGF-1. Estos
resultados muestran que la deficiencia de IGF-1 per se se asocia con disfuncin
mitocondrial. .
5.4.2. ESTIMACIN DEL CONSUMO DE OXGENO Y DEL NDICE RCR

POR PARTE DE MITOCONDRIAS AISLADAS DE TEJIDO HEPTICO.
Se estim tambin el consumo de oxgeno por parte de las mitocondrias, ya que

como se ha comentado anteriormente el flujo de protones, depende del transporte de
electrones, los cuales son captados finalmente por el oxgeno (Chance et al., 1955; Wu
et al., 2007; Gerencser et al., 2009). Como se ha comentado anteriormente, durante todo
el proceso de fosforilacin oxidativa se producen reacciones estequiomtricas y cuando
se usa succinato como sustrato la relacin el ratio H/O es de 6 (Hafner et al., 1991;
Brand et al., 1994; Porter et al., 1995).
Para evaluar el consumo de oxgeno, el electrodo de tipo Clark representa uno de
los mtodos ms sensibles y precisos, por lo que fue la tcnica empleada en este estudio
(Lanza et al., 2009).
Al estimar el consumo de oxgeno en los diferentes estados metablicos (Estado 2
y 3), no se observaron diferencias significativas entre los tres grupos experimentales.
Tambin se analiz uno de los indicadores ms sensibles de la funcin respiratoria
mitocondrial, el ndice RCR o relacin entre Estado 2 y 3. Un alto RCR indica, en
primer lugar, una alta capacidad para la oxidacin de sustratos y en segundo lugar una
buena relacin entre la energa generada en dichos procesos y la formacin de ATP
(Brand et al., 2011). Nosotros no observamos diferencias significativas en el ndice
RCR al comparar los tres grupos experimentales.
Estos datos indicaban que no pareca existir relacin entre los niveles de IGF-1 y
el consumo de oxgeno, ni tampoco con el aprovechamiento de la energa generada para
producir ATP en el metabolismo. Este hallazgo fue en principio inesperado, porque en
base a la relacin H/O era de suponer que si los ratones con valores normales de IGF-1
tenan un potencial de membrana mayor que los que mostraban concentraciones bajas
de IGF-1, estos primeros deberan mostrar un mayor consumo de oxgeno.
Finalmente se calcul otro de los parmetros indicativos de la funcionalidad de la
cadena respiratoria, el ratio ADP/O, que representa el nmero molculas de oxgeno
146
DISCUSIN
necesarias para producir una molcula ATP. Este ndice tambin sigue una relacin
estequiomtrica y cuando se utiliza succinato como sustrato se consumen 2 molculas
de oxgeno por cada molcula de ATP generada.
Pudimos observar que las mitocondrias procedentes de ratones controles
producen mayor cantidad de ATP por molcula de oxgeno consumido que los ratones
Hz. Tras el tratamiento, los ratones Hz+IGF mostraron un ratio ADP/O superior a los
ratones Hz. El incremento del este ndice tras el tratamiento fue tan notable que las
mitocondrias procedentes de animales Hz+IGF-1 tenan valores similares al grupo
control.
Todos estos resultados sugeran como conclusin que los ratones con deficiencia
de IGF-1 consumen la misma cantidad de oxgeno que los que presentan
concentraciones normales de esta hormona porque necesitan ms molculas de oxgeno
para producir el mismo nmero de molculas de ATP. En otras palabras, que los ratones
deficientes en IGF-1 mostraban descoplamiento mitocondrial. Como consecuencia,
aprovechaban peor la energa generada durante los procesos metablicos y por lo tanto
producan menos ATP.
Cuando, el ratio ADP/O est alterado puede indicar alteraciones en el
acoplamiento del proceso de fosforilacin oxidativa, como por ejemplo cuando la
cadena respiratoria bombea menos protones por oxgeno consumido (Brand et al.,
2011). Este podra ser el caso de nuestro modelo animal ya que, como hemos descrito
anteriormente, los ratones con bajos niveles de IGF-1 presentaban un menor potencial
de membrana.
Otra explicacin para este bajo gradiente de protones, es un fenmeno conocido
desde hace tiempo por los grupos dedicados a la fisiologa mitocondrial, el proton
leak o fuga de protones (Brand et al., 2011). El proton leak consiste en la difusin de
los protones bombeados desde el espacio intermembrana hacia la matriz mitocondrial
sin generar ATP. Como consecuencia parte de la energa generada durante el
metabolismo o tambin llamada energa proton motriz es desaprovechada (Brand et
al., 1993).
Para discernir cul de los dos mecanismos mencionados es el responsable de la
disfuncin mitocondrial observada en los ratones deficientes en IGF-1 nos propusimos
como siguiente objetivo determinar la fuga de protones.
147
DISCUSIN
5.4.3. ESTIMACIN DEL ESCAPE DE PROTONES (PROTON LEAK) EN

MITOCONDRIAS AISLADAS DE LOS TRES GRUPOS EXPERIMENTALES.
La estimacin del escape de protones se hace comparando el potencial de

membrana generado y el oxgeno consumido para generarlo en presencia de inhibidores
de la cadena respiratoria. Como el sustrato usado fue el succinato se us el competidor
malonato.
Pudimos comprobar que para generar el mismo potencial de membrana los
ratones HZ consuman ms oxgeno que los ratones control. Sin embargo, cuando los
ratones deficientes eran tratados necesitaban menos oxgeno para producir el mismo
potencial de membrana, siendo los valores similares a los ratones controles.
En resumen, las mitocondrias procedentes de ratones con deficiencia parcial de
de IGF-1 parecan tener mayor fuga de protones que los ratones con concentraciones
normales de este factor de crecimiento. Este dato es de gran inters porque la regulacin
del proton leak puede suponer una diana teraputica en enfermedades que hay un
desequilibrio metablico o de produccin de radicales libres. Por ejemplo, en la
obesidad se ha puesto histricamente mucho nfasis en la reduccin de la ingesta de
caloras, pero recientemente se prestando especial atencin al aumento del gasto
energtico como diana teraputica (Divakaruni et al., 2011). La ingesta calrica tambin
es un factor clave en el desarrollo de la Diabetes tipo II, ya que la energa generada por
la glucosa induce la secrecin excesiva de insulina, lo que finalmente conduce a la
resistencia a la misma. El desaprovechamiento de esa energa generada mediante un
aumento de la fuga de protones tambin se est estudiando como diana en esta
enfermedad (Affourtit et al., 2008; Chan et al., 2006; Lowell et al., 2005). Uno de los
principales causas del aumento del proton leak es aumento de la permeabilidad de las
protenas ANT (Thomas M.Devlin, 2004). Por este motivo, nuestro siguiente objetivo
fue estudiar la funcionalidad de dichos transportadores, fundamentales para la actividad
mitocondrial ya que realizan el intercambio ADP/ATP.
5.4.4. SENSIBILIDAD AL ATRACTILSIDO COMO EXPRESIN DE LA

MENOR VULNERABILIDAD A LA APERTURA DEL PORO EN EL ANT.
El estudio de la fuga de protones hacia la matriz mitocondrial, a travs de las

protenas ANT, se realiz de manera indirecta estudiando el consumo de oxgeno y
148
DISCUSIN
refirindolo al PMM obtenido. Este procedimiento para determinar la vulnerabilidad a

la apertura del poro en el ANT es similar a lo descrito en apartados anteriores, con la
nica diferencia de que se aade a las mitocondrias atractilsido, En condiciones
normales, este heteroglucsido compite con el ADP impidiendo que las protenas ANT
internalicen a la matriz mitocondrial el ADP (Jastroch et al., 2010b). Como este
nucletido es el factor limitante del consumo de oxgeno, si durante el proceso de
fosforilacin oxidativa no se dispone del mismo, el consumo de oxgeno disminuye,
llegndose a bloquear la respiracin mitocondrial a dosis altas de atractilsido. Sin
embargo, si las ANT estn alteradas (peroxidados sus grupos tioles, por ejemplo), el
atractilsido no impide la unin del ADP al ANT, y al haber disponibilidad de este
nucletido no cambia el ratio del consumo de oxgeno.
En los tres grupos experimentales se detect una disminucin del consumo de
oxgeno proporcional a la concentracin de atractilsido en el medio. Adems, tampoco
se observaron diferencias en el ratio del consumo de oxgeno entre los tres grupos
experimentales. Estos hallazgos indicaban que la funcionalidad de las protenas ANT
estaba conservada a pesar de la deficiencia de IGF-1.
Dado que no se observaron alteraciones en las ANT, caba pensar que el aumento
de la fuga de protones observado en los ratones con bajas concentraciones circulantes de
IGF-1 era debido a otros mecanismos, como por ejemplo un aumento de la
permeabilidad de la membrana mitocondrial o a travs de las UCPs. Tampoco se poda
descartar otra deficiencia, el desacoplamiento entre la cadena de transporte de electrones
y el bombeo de protones (Wrigglesworth et al., 1990). Este interrogante ser discutido
en apartados posteriores.

DE IGF-1 Y LA ESTRUCTURA HEPATOCITARIA.
Dadas las alteraciones mitocondriales y el aumento del dao oxidativo que
mostraban los ratones con deficiencia en IGF-1 nos planteamos analizar si estas
secuelas se traducan en un dao tisular heptico.
Con este objetivo se realizaron en primer lugar tinciones con HematoxilinaEosina.
149
DISCUSIN
Tras el anlisis de las tinciones de Hematoxilina-Eosina se pudo comprobar que

los ratones HZ y ratones HZ+IGF-1 mostraban una arquitectura heptica similar a la
mostrada por el grupo control, y que se corresponde con una estructura hepatocelular
tpica.
Dado lo negativo de este resultado, y que en trabajos previos habamos
observado una relacin inversa entre los niveles de IGF-1 y el dao tisular (GarcaFernndez et al., 2008) procedimos a un anlisis ms exhaustivo mediante Tricrmico
de Masson. Esta tincin tie de azul las fibras de colgeno que se depositan en la
fibrosis, uno de los primeros cambios anatomopatolgicos observables en el dao
heptico.
En ninguno de los tres grupos experimentales existan indicios de fibrosis tisular,
ya que no se apreciaba la presencia de septos fibrosos entre las hileras de hepatocitos.
Posiblemente esto sea debido a que si bien se ha descrito que IGF-1 puede tener una
funcin muy relevante en la proliferacin y regeneracin heptica (Desbois-Mouthon et
al., 2006), existen otros mecanismos crticos en este proceso como por ejemplo la GH
(Pennisi et al., 2004).
5.6. ANLISIS DE LOS COMPLEJOS DE LA CADENA

RESPIRATORIA
MEDIANTE
ESTUDIO
Aunque no se detectasen daos histolgicos apreciables en los ratones con bajos
niveles de IGF-1, el hecho de que este grupo experimental mostrase desacoplamiento
mitocondrial y mayor produccin de radicales libres sugera que podran tener una
alteracin en la cadena de transporte.
Como se ha descrito en apartados anteriores, los animales con deficiencia de
IGF-1 mostraron un desacoplamiento mitocondrial, que podra estar relacionado con
una alteracin en la cadena de transporte. En estos estudios de la funcin mitocondrial
se emple como substrato el succinato, que es oxidado por el complejo II. Teniendo en
cuenta este hecho, nos propusimos determinar mediante inmunohistoqumica e
inmunofluorescencia los niveles de la enzima succinato deshidrogenasa del complejo II
y de la subunidad IV del complejo citocromo c oxidasa en los tres grupos
experimentales.
150
DISCUSIN
5.6.1. ESTUDIO DE LOS NIVELES DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

(COMPLEJO II).
Al analizar las inmunohistoqumicas realizadas en muestras de tejido heptico

mediante microscopa ptica, no se observaron diferencias en los niveles de la enzima
succinato deshidrogenasa cuando se compararon los ratones Control y los animales
deficientes de IGF-1 sin tratamiento (Hz) y tratados con dosis bajas de IGF-1
(Hz+IGF-1). Tampoco se observaron diferencias significativas en los tres grupos
experimentales al analizar las inmunofluorescencias realizadas mediante microscopa de
fluorescencia, ni al realizar las determinaciones semicuantitativas de esta enzima. Estos
resultados sugeran que el IGF-1 no regulaba la sntesis de protenas que constituan el
complejo II.
5.6.2. ESTUDIO DE LA SUBUNIDAD IV DE LA CITOCROMO OXIDASA

(COMPLEJO IV).
Por el contrario, al examinar las inmunohistoqumicas realizadas para estudiar los

niveles de la subunidad IV de la citocromo c oxidasa, se pudo comprobar que las
muestras de los ratones con bajos niveles de IGF-1 mostraban una tincin menos intensa
para esta enzima que las de los ratones control. Sin embargo, despus del tratamiento
los ratones presentaban una tincin ms intensa para la COX IV que los ratones Hz,
siendo esta similar a la que presentaban los ratones control.
Para confirmar estos resultados se desarrollaron las inmunofluorescencias
correspondientes para posteriormente poder determinar de manera semicuantitativa los
niveles de la subunidad IV de la enzima citocromo c oxidasa. Los ratones deficientes en
IGF-1 mostraban niveles inferiores de esta protena que los controles. Sin embargo,
despus del tratamiento (grupo Hz+IGF-1) incrementaban los niveles de la COX IV,
alcanzando niveles similares al grupo control (Figura 48).
Hemos demostrado por tanto que IGF-1 interviene en la funcin mitocondrial
tambin porque regula la expresin de protenas de la cadena respiratoria como
COX IV. Este puede constituir uno de los motivos fundamentales por el que los ratones
deficientes en este factor de crecimiento presentan desacoplamiento de la fosforilacin
oxidativa.
151
DISCUSIN
No obstante, no caba descartar que ste fuese el nico mecanismo por el que
IGF-1 juega un papel clave en la fisiologa de este orgnulo intracelular. En este
sentido, nuestro grupo de investigacin demostr la relacin entre los niveles de IGF-1
y la produccin de radicales libres por parte de las mitocondrias (Garca-Fernndez et
al., 2008)

DE IGF-1 Y DE ESTRS OXIDATIVO.
La formacin de radicales libres (RL) y especies reactivas del oxgeno (EROS)
puede ser debida al efecto de agresiones externas (txicos, virus, frmacos, etc). En
condiciones fisiolgicas la fuente principal de ROS y RL es la fosforilacin oxidativa
mitocondrial (Boveris et al., 1972). Durante este proceso, los electrones generados
durante el metabolismo viajan a travs de la cadena de transporte y finalmente son
captados por el oxgeno para formar agua. No obstante, aproximadamente el 0,15%
(Serviddio et al., 2010; St-Pierre et al., 2002) del oxgeno consumido se transforma en
el in superxido, que es reducido por la SOD a perxido de hidrgeno, una especie
reactiva del oxgeno que va a dar origen a otros radicales libres altamente oxidantes,
especialmente el radical hidroxilo (Nohl, 1994; Kowaltowski et al., 1999; Lu et al.,
2002). Este fenmeno sucede principalmente en los complejos mitocondriales I y III,
aunque tambin en los complejos II y IV (Aroor et al., 2012; Ji, 1999; Kowaltowski et
al., 2009). Como consecuencia de este proceso, la fosforilacin oxidativa es la principal
fuente de especies reactivas del oxgeno (EROS) (Boveris et al., 1972; Chance et al.,
1979).
La produccin de RL y ROS es un hecho fisiolgico, necesario para muchas
funciones como la fagocitosis o la metabolizacin de frmacos, pero puede aumentar en
situaciones de hipoxia o, por el contrario, en situaciones de una alta tasa metablica.
Tambin se puede incrementar la produccin de radicales libres cuando la mitocondria
no funciona correctamente, por ejemplo, cuando existe desacoplamiento de la
fosforilacin oxidativa y el oxgeno consumido, en lugar de ser utilizado para generar el
gradiente de protones con el consiguiente incremento del PMM, es desaprovechado en
la produccin de RL y EROS.
152
DISCUSIN
En los apartados precedentes hemos demostrado que precisamente este fenmeno

tiene lugar en este modelo de deficiencia parcial de IGF-1, puesto que los ratones
deficientes en IGF-1 necesitan un mayor consumo de oxgeno para producir ATP.
Adems, hemos encontrado un desacoplamiento de la cadena transportadora de
electrones a nivel del complejo IV. No obstante, no se poda descartar que la
disminucin del ratio ADP/O detectado en ratones deficientes para IGF-1 fuese debido
adems a que el oxgeno se malgaste en la formacin de radicales libres, por la menor
eficiencia de la cadena de transporte de electrones.
En base a los hallazgos obtenidos, nos planteamos como otro de los objetivos
fundamentales de este trabajo el estudiar la relacin entre los niveles de IGF-1 y el
estrs oxidativo.
5.7.1. PRODUCCIN DE ESPECIES REACTIVAS DEL OXGENO (EROS)

POR MITOCONDRIAS HEPTICAS.
Para el cumplimiento de este objetivo, se estim mediante citometra de flujo, la

produccin de radicales libres por parte de mitocondrias aisladas de hgado en cada uno
de los estados metablicos descritos en los estudios anteriores.
Pudimos observar que las mitocondrias procedentes de ratones deficientes de
IGF-1 presentaron una mayor produccin de EROS, en concreto de perxido de
hidrgeno, que los grupos con concentraciones normales de esta hormona (Controles y
Hz+IGF-1).
Estos datos muestran que existe una asociacin inversa entre las concentraciones
de IGF-1 y la produccin de radicales libres, lo que correlaciona con lo publicado
recientemente por varios grupos (Sukhanov et al., 2015; Bailey-Downs et al., 2012). No
obstante, existen datos contradictorios en la literatura y otros grupos han observado que
cuando se disminuye la expresin del receptor de IGF-1 se produce una disminucin de
especies reactivas del oxgeno (Holzenberger et al., 2003).
Determinar de una manera inequvoca la relacin entre IGF-1 y la produccin de
radicales libres no es una cuestin menor, puesto que existen numerosas patologas
asociadas a un aumento del estrs oxidativo (Liu et al., 1999; Knott et al., 2008; Mahad
et al., 2008; Gupta-Elera et al., 2012), por lo que conocer en profundidad los
mecanismos implicados en el dao tisular puede abrir nuevas estrategias teraputicas.
Por ejemplo, estos hallazgos permiten vislumbrar relevantes aplicaciones clnicas ya
153
DISCUSIN
que se ha descrito que existe relacin entre la disfuncin mitocondrial y diversas

patologas. Por ejemplo, en la esclerosis mltiple (Mahad et al., 2008; Mahad et al.,
2009), enfermedad de Alzheimer y Parkinson (Knott et al., 2008) se han encontrado
defectos en la cadena respiratoria que podran ocasionar un dficit energtico y como
consecuencia la degeneracin neuronal. Otro mecanismo adicional por el que las
mitocondrias pueden estar implicadas en estas enfermedades es porque una vez daadas
o desacopladas se convierte en la fuente intracelular ms potente incrementando y
perpetuando el estrs oxidativo.
En este sentido, en base a los datos que ya hemos mostrado y a los que
discutiremos en apartados posteriores, pensamos que este trabajo en un modelo de mera
deficiencia parcial de IGF-1, sin agresin exgena alguna, ni ninguna otra patologa,
demuestra de una manera clara la relacin entre la deficiencia de este factor de
crecimiento y la produccin de especies reactivas del oxgeno por parte de las
mitocondrias.
Asimismo, y dado que se analizaron mitocondrias aisladas, podemos concluir que
la produccin de EROS dependera mayoritariamente en nuestro modelo de la
funcionalidad de la cadena de transporte de electrones. No obstante, no cabe descartar
que IGF-1 controle la produccin de molculas altamente reactivas mediante otros
mecanismos. En este sentido, un trabajo relativamente reciente ha descrito que IGF-1
regula a la enzima lipooxigenasa (Wikiel et al., 1994).
El desequilibrio en la produccin de radicales libres puede provocar un aumento
del estrs oxidativo y el consiguiente dao celular. En concreto, estas molculas pueden
producir la oxidacin de lpidos, carboxilacin de protenas, y fragmentacin del ADN
(Smith et al., 2013). Dado que los ratones con deficiencia en IGF-1 mostraban un
aumento de la produccin intramitocondrial de RL, nos planteamos otro de los objetivos
fundamentales de este trabajo el estudio de la relacin entre las concentraciones
circulantes de IGF-1, la disfuncin mitocondrial y el dao oxidativo en hgado de los
tres grupos experimentales.
154
DISCUSIN
5.7.2. RELACIN ENTRE LA DISFUNCIN MITOCONDRIAL Y EL DAO

OXIDATIVO EN EL HGADO DE RATONES CON DEFICIENCIA PARCIAL
DE IGF-1, SIN DAO EXGENO ALGUNO

niveles de malondialdehdo (MDA) en homogeneizados hepticos
Se comprob, que los ratones (Hz) con deficiencia parcial de IGF-1 y

consiguientemente, con disfuncin mitocondrial e incrementada produccin de RL y
EROS intramitocondriales presentaban niveles de MDA significativamente ms altos
que los animales controles (CO) con concentraciones circulantes de IGF-1 en el rango
normal, y tambin en los del grupo Hz+IGF1 en los que el descenso de MDA fue tan
relevante, que los ratones Hz tratados con IGF-1 incluso mostraban valores de MDA
inferiores al grupo control.

protein carbonil content.
Otro de los efectos no menos perjudiciales del estrs oxidativo es la oxidacin de

protenas, para analizar este fenmeno se determin el contenido de PCC (protein
carbonyl content), desactivndolas. Los ratones deficientes en IGF-1 presentaban
niveles superiores de PCC en comparacin al grupo control. Sin embargo, al tratar los
ratones Hz con IGF-1 los niveles de PCC disminuyeron algo, aunque no de manera
significativa en comparacin a los ratones deficientes sin tratamiento (Hz). No obstante,
disminuyeron lo suficiente para que los valores no alcanzaran significacin estadstica
con los controles.
En sntesis, el aumento de la peroxidacin lipdica (MDA) y de carboxilacin
proteica (PCC) observada en los ratones deficientes en IGF-1 demuestra que estos
animales tienen un aumento de especies reactivas del oxgeno y como consecuencia un
incremento del dao tisular por estrs oxidativo. Estos daos fueron revertidos tras
administracin de este factor de crecimiento (Figuras 41 y 42).
Este resultado es congruente con trabajos previos realizados por nuestro en
modelos de cirrosis heptica y envejecimiento (Castilla-Cortazar et al., 2011; GarcaFernndez et al., 2005), en los que adems se haba observado el efecto
155
DISCUSIN
hepatopreotector de esta hormona (Castilla-Cortazar et al., 1997a; Castilla-Cortazar et

al., 1997b; Muguerza et al., 2001; Mirpuri et al., 2002; Garca-Fernndez et al., 2005;
Perez et al., 2008; Tutau et al., 2009). Adems, en un estudio prcticamente paralelo
realizado con este mismo modelo, pudimos observar que los animales Hz (Igf+/-)
mostraron una hiperexpresin de genes relacionados con las protenas de fase aguda,
factores del complemento, citoquinas proinflamatorias y factores proapoptticos, en
unos animales que no haban recibido agresin exgena algna (artculo en revisin).
Estos datos son de gran inters traslacional, ya que en numerosas patologas se ha
observado incremento del estrs oxidativo. Por ejemplo, en enfermedades inflamatorias
que pudieran cursar con deficiencia local o sistmica de IGF-1 (Lee et al., 2015) y
neurodegenerativas (Toescu, 2005). De hecho, en la esclerosis mltiple se ha observado
peroxidacin lipdica (Mahad et al., 2008; Mahad et al., 2009), pero adems en esta
enfermedad se han realizado estudios preclnicos con IGF-1, obtenindose efectos
beneficiosos (Yao et al., 1995). Esta accin teraputica puede ser debida a que este
factor de crecimiento tiene un efecto protector de neuronas y oligodedrocitos (Chesik et
al., 2007), y tambin, en base a nuestros datos, a que pueda mejorar la condicin de
estrs oxidativo. Los resultados de nuestro grupo en este mismo modelo experimental
demuestran que la deficiencia de IGF-1 se acompaa dao oxidativo cerebral, sensible a
la terapia sustitutiva con esta hormona a dosis bajas.
En cualquier caso, hay que tener en cuenta que el estrs oxidativo es el resultado
de tres elementos como son, produccin de radicales libres, mecanismos antioxidantes y
mecanismos reparadores. De hecho, se ha descrito que puede existir una relacin entre
las enzimas antioxidantes y diversas enfermedades neurodegenerativas (Maier et al.,
2002; Liu et al., 1999).
En la literatura existan muy pocos datos que hiciesen referencia a la relacin
entre IGF-1 y las enzimas antioxidantes, por lo que nos planteamos analizar si IGF-1
estaba implicado en la regulacin de los mecanismos antioxidante.
5.7.3. ESTUDIO
DE
LA
RELACIN
ENTRE
LOS
MECANISMOS
ANTIOXIDANTES Y LOS NIVELES DE IGF-1.
Para dilucidar esta cuestin, se determin la actividad de las principales enzimas

antioxidantes; catalasa (enzima que adems de eliminar el H2O2, participa en el
156
DISCUSIN
metabolismo de las grasas), superxido dismutasa mitocondrial (SODmit), superxido

dismutasa citoplasmtica (SODcit) y glutation peroxidasa (GPX).
No se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de ratones al
analizar la actividad de la enzima GPX, ni de la SOD citoplasmtica o mitocondrial, con
excepcin de la catalasa cuya actividad estaba incrementada en los Hz sin tratamiento,
como una clara respuesta defensiva al incremento de estrs oxidativo.
En relacin a la enzima catalasa, nuestros hallazgos corroboran las observaciones
de Hauck et al. (Hauck et al., 2000) Sin embargo, en cuanto a las enzimas SOD y
glutation peroxidase, nuestros resultados difieren de lo referido por Higashi et al.
(Higashi et al., 2013). Esta discrepancia puede ser debida a que el estudio de este grupo
se realiz en un modelo in vitro por lo cual puede ocurrir que los resultados no se
correspondan con lo que ocurre in vivo. En cualquier caso, no se puede descartar por
completo otro tipo de conclusiones, por lo que son necesarios estudios adicionales para
aclarar el papel de IGF-1 en relacin a las enzimas antioxidantes.
5.8. DEFICIENCIA DE IGF-1 Y EXPRESIN HEPTICA

DE
GENES
QUE
CODIFICAN
PARA
PROTENAS
PROTECTORAS DE LA MITOCONDRIA
Para dilucidar si existan vas adicionales que pudiesen estar mediadas por esta
hormona en relacin a la funcin mitocondrial, se estudi mediante microarrays la
expresin de
genes que codifican para protenas implicadas en la proteccin
mitocondrial.
No encontramos diferencias significativas entre los tres grupos experimentales en
la expresin de genes relacionados con la funcionalidad mitocondrial, como por ejemplo
los que codifican para las protenas UCPs. Este dato, junto con lo expuesto en los
apartados anteriores, avalan que la disminucin del potencial de accin mostrado por los
ratones Hz es causado por un dficit del bombeo de protones debido a la disminucin de
los niveles del complejo IV de la cadena respiratoria, ms que a un aumento de la
permeabilidad de la membrana.
Como ya se ha mencionado anterioremente, tambin hemos podido observar en un
estudio posterior, que los animales Hz (Igf+/-) mostraron una hipoexpresin de genes
relacionados con protenas inhibidoras de la apoptosis, como con gadd45a y las
protenas de choque trmico (Heat Shoch Proteins, HSPs) HSP relacionadas en distintos
157
DISCUSIN
niveles con la proteccin mitocondrial. La expresin gnica fue normalizada por la

terapia sustitutiva con IGF-1.
Por el contrario, s que se detectaron diferencias en los niveles de expresin del
gen pink1 entre los ratones deficientes de IGF-1 y el grupo control. Sin embargo, no se
encontraron diferencias en la expresin de este gen al comparar el grupo Hz con el
grupo Hz+IGF-1. El gen pink1 codifica una protena implicada en mantener la
integridad y funcin mitocondrial, al menos en neuronas y clulas musculares (Park et
al., 2006).
Tambin pudimos observar que los ratones Hz tenan disminuida la expresin
del gen bcl-2 en comparacin al grupo control. Sin embargo, despus del tratamiento los
ratones tenan una expresin del este gen similar al grupo control. BCL-2 pertenece a
una familia de protenas que tienen actividades pro y anti apoptticas. En concreto
BCL-2 se inserta en la membrana mitocondrial externa, inhibiendo la permeabilidad de
la membrana mitocondrial, y por lo tanto impide la liberacin del citocromo c desde la
mitocondria al citoplasma (Kluck et al., 1997). Adems, tambin regula la liberacin de
Ca2+ por el retculo endoplsmico. Debido a todas estas funciones, BCL-2 es una
protena antiapopttica clave en la conexin de las vas extrnseca y mitocondrial de
muerte celular (Galluzzi et al., 2009). Nuestro grupo pudo observar en trabajos previos
que los animales que presentaban bajos niveles de IGF-1 mostraban activacin de la va
extrnseca y como consecuencia un aumento de la apoptosis (Prez et al., 2008) (GarcaFernndez et al., 2005), por lo que pensamos que este factor de crecimiento puede ser
clave en la regulacin de los mecanismos de apoptosis. Adems, en un trabajo posterior,
hemos podido observar que se hipoexpresaron genes relacionados con protenas
inhibidoras de la apoptosis, como con gadd45a y las protenas de choque trmico (Heat
Shoch Proteins, HSPs). La administracin exgena de IGF-1 a dosis bajas, en solo 10
das de tratamiento, normaliz estos genes.
Todos estos datos avalan que esta hormona tiene una funcin antiapopttica.
En resumen, podemos concluir diciendo que IGF-1 regula la funcin mitocondrial
al menos a tres niveles: regulando la sntesis de protenas de la cadena respiratoria,
manteniendo la integridad mitocondrial e interviniendo en mecanismos antiapoptticos.
158
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
159
CONCLUSIONES
1- La inactivacin de uno de los genes que controla la sntesis de IGF-1 se reflejaba en

una disminucin de las concentraciones de IGF-1 plasmticas en ratones adultos.
Adems, los niveles de IGF-1 varan con la edad de los animales, mostrando un
patrn muy similar a lo observado en los humanos.
2- La deficiencia de IGF-1 se correlacionaba con alteraciones fenotpicas en los

ratones adultos como un menor peso corporal.
3- Las diferencias en las concentraciones de IGF-1 entre los ratones control y

heterocigotos implicaban diferencias en el metabolismo lipdico. En concreto los
ratones heterocigotos mostraban niveles superiores de triglicridos que los ratones
control.
4- La baja concentracin plasmtica de IGF-1 se asociaba con disfuncin

mitocondrial, ya que los ratones heterocigotos mostraban un menor potencial de
membrana y menor produccin de ATP por molcula de oxgeno consumido que
los ratones control.
5- La disminucin de la funcin mitocondrial observada en los ratones heterocigotos

tena como consecuencia que las mitocondrias aisladas de tejido heptico
procedente de estos ratones produjesen mayor cantidad de radicales libres que los
ratones control.
6- El aumento de especies reactivas del oxgeno provocaba que los ratones con bajos
niveles de IGF-1 tuviesen un aumento del dao oxidativo en comparacin a los
ratones controles, que se reflejaba en un aumento de los niveles de peroxidacin
lipdica, y de carboxilacin proteica.
7- Los resultados anteriores posiblemente son debidos a que IGF-1 regula la sntesis
de protenas de la cadena respiratoria como COXIV, ya que los ratones
heterocigotos mostraban niveles inferiores de esta protena que los ratones control.
160
CONCLUSIONES
8- IGF-1 regula adems la expresin de genes como bcl-2 y pink-1 relacionados

respectivamente con la inhibicin de la va de apoptosis mitocondrial y la regulacin
de la integridad de estos orgnulos.
9- Todas las deficiencias observadas en relacin a los bajos niveles de IGF-1, aumento
de los niveles de triglicridos en plasma, disminucin de la funcin mitocondrial,
aumento de produccin de radicales libres y del dao tisular ocasionado por estos
ltimos, disminucin de la sntesis de COX IV, baja expresin de genes
antiapoptticos y de mantenimiento de la integridad mitocondrial, eran solventadas
tras la administracin de dosis bajas de este factor de crecimiento.
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192

Tesis Santos Ruiz, 2015 Funcio Ü Mitocondrial Hepatocitos

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ESTUDIO COMPARATIVO DE LA

FUNCIN MITOCONDRIAL, COMO

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MDICAS BSICAS.

Inma Castilla de Cortzar Larrea, Dra. en Medicina, Catedrtico de Fisiologa

En Madrid a 23 de Junio de dos mil quince

Fdo. Dra. Inma Castilla de Cortazar Larrea

Fdo. Dra. Mara Cruz Sdaba

1.2. ESTRUCTURA MITOCONDRIAL

1.2.1. MEMBRANA EXTERNA.

1.2.2. ESPACIO INTERMEMBRANA.

1.2.3. MEMBRANA INTERNA.

1.2.4. PROTENAS TRANSPORTADORAS MITOCONDRIALES.

1.2.5. CADENA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES Y COMPLEJO ATP SINTASA.

1.3. FOSFORILACIN OXIDATIVA.

1.3.1. FOSFORILACIN OXIDATIVA Y CONSUMO DE OXGENO

1.3.2. FOSFORILACIN OXIDATIVA Y POTENCIAL DE MEMBRANA.

1.4. MITOCONDRIA Y ESTRES OXIDATIVO.

1.5. INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR 1 (IGF-1) O FACTOR DE CRECIMIENTO TISULAR 1.

1.5.1. ESTRUCTURA Y EXPRESIN GNICA DE IGF-1.

1.5.2 REGULACIN DE LA PRODUCCIN DE IGF-1.

1.5.3. PROTENAS TRANSPORTADORAS DE IGF-1 (IGFBPS).

1.5.4. RECEPTORES DE MEMBRANA Y VAS DE SEALIZACIN.

1.5.5. FUNCIONES FISIOLGICAS DE IGF-1.

1.5.5.1. Crecimiento y desarrollo corporales.

1.5.5.2. Funciones metablicas de IGF-1.

1.5.5.3. Modulacin inmunolgica.

1.5.5.4. Desarrollo del Sistema Nervioso Central (SNC).

1.5.5.5. Desarrollo y proteccin cardiovascular.

1.5.5.7. Desarrollo y funcin renales.

1.6. CONDICIONES DE DEFICIENCIA DE IGF-1.

1.6.1. SNDROME DE LARON (SL).

1.6.2. ENFERMEDAD HEPTICA CRNICA.

1.6.3. ENVEJECIMIENTO Y ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA EDAD.

HIPTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS

2.1. ANTECEDENTES E HIPTESIS DE TRABAJO

3.1. MATERIALES, ANIMALES DE EXPERIMENTACIN Y MUESTRAS BIOLGICAS.

3.1.1.1. Obtencin de muestras biolgicas tisulares.

3.1.1.2. Extraccin de muestras de sangre

3.1.1.3. Genotipado de ratones.

3.1.1.4. Tratamiento de ratones con la solucin correspondiente.

3.1.1.5. Determinaciones analticas.

3.1.1.6. Cuantificacin de IGF-1

3.1.1.7. Reactivos y soluciones a varias tcnicas.

3.1.1.8. Aislamiento de mitocondrias.

3.1.1.9. Determinacin de la concentracin de mitocondrias

3.1.1.10. Determinacin del potencial de membrana, produccin de radicales libres y

3.1.1.11. Cuantificacin del consumo de oxgeno mediante electrodo de Clark.

3.1.1.12. Cuantificacin de oxidacin lipdica mediante la determinacin

3.1.1.13. Cuantificacin de los niveles de Protein Carbonyl Content (PCC)

3.1.1.14. Determinacin de la actividad de la enzima Catalasa

3.1.1.15. Determinacin de la actividad de la enzima Superxido Dismutasa

3.1.1.16. Determinacin de la actividad de la enzima Glutation Peroxidasa

3.1.1.17. Estudios histolgicos.

3.1.1.19. Aparataje usado comnmente en diversas tcnicas como: cuantificacin

3.1.2.1. Procedencia y Generalidades

3.1.2.2. Obtencin de las colonias

3.1.2.3. Diseo y procedimiento experimental.

3.1.3. MUESTRAS BIOLGICAS.

3.1.3.1. Obtencin de muestra de cola de ratn.

3.1.3.2. Obtencin de suero sanguneo.

3.1.3.3. Obtencin de muestras tisulares.

3.2.1.2. Obtencin de ADN genmico a partir de muestras de cola de ratn.

3.2.1.3. Genotipado de los ratones mediante PCR convencional.