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Libraries
Index
Inserts.
Ligation of vector and insert.
Genomic and cDNA libraries.
Library screening strategies
Labelin g of nucleic acids screening strategies (hybridization, expression,
functional expression...).
El clonaje utilizacin de una unidad replicativa procariota para obtener grandes cantidades de un
fragmento de DNA eucaritico. La unidad replicativa constituye el vector y el fragmento amplificado el
inserto. Todo proceso de clonaje incluye:
1.
Generation of the DNA fragments to clone (inserts). Lo primero que hay que hacer es una pool de
fragmentos de DNA.
2.
Introduction of the recombinant DNA into a host cell where it can replicate, ya que sino se
perdera.
4.
Selection of clones of interest amongst cells which contain recombinant DNA. Buscar,
seleccionar el clon de interes.
Tipos de clonaje:
-
Se enriquece la secuencia a clonar en la mezcla de partida (por ejemplo mRNA), de manera que
ser mas fcil identificar el recombinante deseado. Podemos aislar inicialmente un cDNA
concreto a travs de su mRNA pero una vez aislado se puede procerder a la caracterizacin
completa del gen, analizndole con una librera genmica.
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Una librera de cDNA es el conjunto de clones obtenidos a partir de los mensajeros de un tejdo
determinado o de un organismo completo. El anlisis secuencial y regulado de las poblaciones
de mensajeros que se suceden durante el desarrollo de un organismo puede ser tambin
estudiado con libreras de cDNA.
El cDNA se sintetiza a partir de mRNA y transcriptasa reversa.
Los clones de cDNA no tienen intrones , de manera que podr ser expresado en un organismo
procariota, ya que estos no tienen intrones.
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Aislamiento de mRNA
El cDNA debe ser perviamente tratado con una metilasa del mismo sistema de
restriccin para evitar cortes inoportunos en los cDNA. As se proteje el DNA.
A partir de aqu se introducirn los fragmentos del vector derivado de fago lambda
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Se han desarrollado variantes que permiten la obtencin del cDNA de extremo a extremo:
Consiste en aadir trasferasa terminal y deoxicitosina a continuacin de la sntesis de la
primera banda del cDNA con lo q se formaran colas de oligo C solo en las molculas que se
hayan sintetizado de extremos a extremos.
El mantenimiento del mRNA molde impide la formacin de gancho en el extremo 3 y hace
innecesaria la utilizacin enzima S1.
Los cDNA que no han llegado a final del mensajero presentaran gancho con un grupo 3OH
poco accesible a la transferasa terminal y por tanto no sern un buen substrato.
Un gradiente alcalino de sacarosahidrolizara el RNA y permitir aislar el cDNA de hebra simole
y tamao completo. La segunda banda del cDNA se inicia por adicion de colas de oligo dG y la
encima DNA pol I.
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Al hacer esto conseguimos extremos diferentes y por tanto notendremos problemas con la orientacin
del inserto.
Add XhoI primer and medCTP to fix insert orientation
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A partir de una libreria genmica el primer paso es hacer recer las colonias o calvas para poder tener el
mayor numero posible de unidades por placa de petri.
A continuacin se transfieren a un papel de nitrocelulosa.
El papel es tratado para lisar los fagos o bacterias y desnaturalizar el DNA.
Se incuba con protena K para degradar protenas y dejar solo unido el DNA al papel.
Se desnaturaliza la sonsa (si es ds) y se hibrida en los filtros.
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Esto representa un WB donde extractos de diferentes clones han sido usados para ver si la
proteina es expresda o no.
Tenemos la libreria de cDNAs, hacemos una placa que tiene diferentes clones que contienen
colonias de la libreria.
Cada libreria contienen un cDNA diferentes.
Tenemos una placa, donde tal vez una de las cavas contiene el clon q buscamos. No podemos
analizar clon por clon, porque hay muchos, lo que hacemos pues son pools of clones.
Hacemos crecer toda la placa en un erlenmayer, obtenemos los plsmidos y transfectamos
clulas 293 con estos. Incubamos durante 48h para que se de la expresin proteica. Lisamos
las clulas y separamos las protenas en un gel PAGE, transferimos las protenas a una
membrana y hacemos deteccin con anticuerpo.
As pues podemos ver en que placas iniciales tenamos el clon de inters. En este caso vemos
que el 2 i el 6 son donde ms hay.
Cogemos la placa INICIAL y la dividimos y hacemos lo mismo
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Son cromosomas en metafase, podemos saber qu cromosoma es cada uno, asi sabemos
dnde est el gen. Por ejemplo si transfectamos con un vector retrovirico podemos saber
dnde se ha integrado.
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In situ hibridazation
Con in situ hibridizacin podemos saber dnde est exactamente nuestro label.
La tcnica de hibridacin in situ est basada en la capacidad que poseen los cidos nucleicos para
hibridarse entre s, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta
complementaria con otra secuencia.
Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediante la utilizacin de una sonda (formada
por una secuencia de ADN previamente conocida) marcada con un istopo radiactivo, la presencia de
determinada secuencia de ADN o ARN complementaria, en la muestra a estudiar.
Lo que se produce mediante la utilizacin de esta tcnica es: La hibridacin (unin), de la sonda
marcada, con la secuencia a buscar (en el caso de estar presente en la muestra) y posteriormente
mediante tcnicas especficas (autoradiografa o inmunohistoqumica), la transformacin de la
secuencia en algo visible.
Normalmente se usan RNA probes, se usan tambin dos muestras de nuestro tejido con una probe
antisentido y una sentido, para evitar falsos positivos. Si la unin no es especifica tambin pasara en la
sense probe.
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Inmunohistoqumica En vez de usar probes para detectar RNA, se usan anticuerpos. Como control se
usa un control isotipo. utilizacin de un anticuerpo especfico, previamente marcado mediante un
enlace qumico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad
del anticuerpo para formar un complejo con el antgeno, aplicado a una muestra de tejido orgnico,
correctamente fijada e incluida en parafina.
Un framento del CDNA clonado en la orientacin mala delante de T7 polimerase promoter. (lila). As
que cuando ponemos los nucletidos y T7RNAse empezara a a sintetizar la nonsense strand
(antisentido). Esta marcada con biotina.
Hacemos lo mismo con el segundo fragmento, que es un poco mas corto. Los mezclamos seguidament
con el RNA de nuestro tejido, asi que se complementaran (porque son las antisentidos) cn las que ya
estn en el tejido.
La molculas que han sido hibridadas no se degredaran (con RNA digestin) porque son bicatenarias. Las
otras si que sedegradaran.
Al final de esta reaccin solo tenemos las moelculas de RNA protejidas por la la sprobes marcadas con
biotina.
The RNase protection assay is a sensitive method for transcription start-site localization. It begins with
an RNA probe that is uniformly labeled by incorporation of one [-(32)P]NTP, usually [-(32)P]UTP. The
RNA probe is synthesized by bacteriophage RNA polymerase (SP6, T7, or T3), which initiates
transcription from specific phage promoters that have been engineered into a number of common
plasmid vectors. The plasmid template contains a genomic DNA fragment spanning the region thought
to contain the transcription start site for the gene of interest. This genomic fragment is subcloned into
the plasmid downstream of the phage promoter in the antisense orientation, so that a portion of the 5'
end of the resulting RNA probe will be complementary to the mRNA of interest. The radiolabeled probe
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is annealed to cytoplasmic or total cellular mRNA purified from the cells of interest, with the
hybridization reaction proceeding for several hours or overnight. RNase A and/or RNase T1 is then
added to the hybridization reactions. These nucleases digest the single-stranded overhang regions of
RNA molecules, but RNA-RNA hybrids are resistant to cleavage. This resistance forms the conceptual
basis for the procedure; the region of the probe that anneals to the specific mRNA will be resistant to
digestion. The length of the resistant region of the probe will correspond to the distance from the 5' end
of the probe to the transcription start site. The size of the resistant fragment can be determined by
electrophoresis on a high-resolution, denaturing polyacrylamide gel.
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