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TEMA 5.

Libraries
Index
Inserts.
Ligation of vector and insert.
Genomic and cDNA libraries.
Library screening strategies
Labelin g of nucleic acids screening strategies (hybridization, expression,
functional expression...).
El clonaje utilizacin de una unidad replicativa procariota para obtener grandes cantidades de un
fragmento de DNA eucaritico. La unidad replicativa constituye el vector y el fragmento amplificado el
inserto. Todo proceso de clonaje incluye:
1.

Generation of the DNA fragments to clone (inserts). Lo primero que hay que hacer es una pool de
fragmentos de DNA.

2.

Ligation of inserts to vector molecules (plasmids, l, cosmids, YACS)


3.

Introduction of the recombinant DNA into a host cell where it can replicate, ya que sino se
perdera.

4.

Selection of clones of interest amongst cells which contain recombinant DNA. Buscar,
seleccionar el clon de interes.

Tipos de clonaje:
-

Libreria genmica: se clona en multiples fragmentos todo el genoma de un organism y despus


de un rastreo se obtiene la secuencia de inters.

Se enriquece la secuencia a clonar en la mezcla de partida (por ejemplo mRNA), de manera que
ser mas fcil identificar el recombinante deseado. Podemos aislar inicialmente un cDNA
concreto a travs de su mRNA pero una vez aislado se puede procerder a la caracterizacin
completa del gen, analizndole con una librera genmica.

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Genomic DNA (genomic libraries)


Se clona el genoma entero , primero se rompe en fragmentos y luego se introduce en diferentes
vectores. Y esto se puede hacer mediante restriction fragments con:
total digestion Dara lugar a muchos fragmentos de diferentes tamaos.
partial digestion (random fragments) No se sabe exactamente qu son los
fragmentos, pero la ventaja es que si sabemos los finales de cada fragmento, ya que
conocemos la enzima con la que hemos cortado y por tanto conocemos los extremos
que deja.
Genoteca Conjunto de clones en el que est representado todo el genoma de un organismo.
Es necesario que el tamao medio del inserto sea homogneo. Por eso se hacen digestin enzimticas.
El DNA genmico y de alto peso molecular se trata con enzimas que puedan asegurar un tamao medio
de fragmento grande (Se comprobar con un gel).
Se prepara tambin DNA del fago lambda para ser usado como vector de substitucin.
El vector se corta con enzimas tambin.
Se substituye un fragmento del vector por uno de inserto.
Ligasa une los extremos.
El fago lamba se replica con el circulo rodante y empaqueta su DNA cortado en las regiones cos. (Las
regiones cos son cortadas por la proeina A que origina terminales cohesivos de 12 pb que cosntituiran
los extremos del profago.)

cDNA library construction


Pasos:
DNA copy of mRNA (cDNA) (cDNA library). Se coge el mRNA, se convierte a cDNA y se introduce
en un vector.
Synthetic DNA
PCR amplification

Una librera de cDNA es el conjunto de clones obtenidos a partir de los mensajeros de un tejdo
determinado o de un organismo completo. El anlisis secuencial y regulado de las poblaciones
de mensajeros que se suceden durante el desarrollo de un organismo puede ser tambin
estudiado con libreras de cDNA.
El cDNA se sintetiza a partir de mRNA y transcriptasa reversa.
Los clones de cDNA no tienen intrones , de manera que podr ser expresado en un organismo
procariota, ya que estos no tienen intrones.

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La librera de cDNA implica:

Aislamiento de mRNA

Necesitamos hacer una


cromatografa con columna de
afinidad con matriz de oligo dT,
esta se unir a las colas de A, ya
que T tiene afinidad por A.
El mRNA ser retenido en la
columna, mientras que el resto
ser eluido.

Tanscripcin reversa de todos a cDNA.


1. Se suelen usar colas oligo-dT como primer. Se hibrida la cola poli A con un primer oligo
dT.
2. Trascripcin de RNA a DNA con RT
3. Eliminacin de RNA con Alcalina phosfatasa y aadir cola poli-G (TT+dGT.
4. Hibridar la cola poli G con un primer oligo dC
5. Sintetizar la segunda cadena de Cdna con pol I

Adicin de conectores sintticos (dianas de restriccin sinticas) que se enlazan al


cDNA con ligasa y se cortan con la enzima para dejar terminales protuberantes.

El cDNA debe ser perviamente tratado con una metilasa del mismo sistema de
restriccin para evitar cortes inoportunos en los cDNA. As se proteje el DNA.
A partir de aqu se introducirn los fragmentos del vector derivado de fago lambda

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previamente tratado con la misma enzima de restriccin y se empaquetaran las


partculas recombinantes in vitro.
La tcnica del clonaje a travs de cDNA tiene limitaciones:
-

RT no tiene funcin correctora y puede introducir errores.


Mensajeros largos, la sntesis a mendo no incluye el extremo 5 ya que la polimerada a
veces se suelta antes y no forma gancho.

Se han desarrollado variantes que permiten la obtencin del cDNA de extremo a extremo:
Consiste en aadir trasferasa terminal y deoxicitosina a continuacin de la sntesis de la
primera banda del cDNA con lo q se formaran colas de oligo C solo en las molculas que se
hayan sintetizado de extremos a extremos.
El mantenimiento del mRNA molde impide la formacin de gancho en el extremo 3 y hace
innecesaria la utilizacin enzima S1.
Los cDNA que no han llegado a final del mensajero presentaran gancho con un grupo 3OH
poco accesible a la transferasa terminal y por tanto no sern un buen substrato.
Un gradiente alcalino de sacarosahidrolizara el RNA y permitir aislar el cDNA de hebra simole
y tamao completo. La segunda banda del cDNA se inicia por adicion de colas de oligo dG y la
encima DNA pol I.

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Haciendo esto tendremos un problema con la orientacin de nuestro inserto en el vector.


Una modificacin de este mtodo para lograr una correcta orientacin del inserto en el vector sera
usando el dMeCTP. De manera que cada C estar metilado. Es exactamente lo mismo que hemos hecho
anteriormente.

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Al hacer esto conseguimos extremos diferentes y por tanto notendremos problemas con la orientacin
del inserto.
Add XhoI primer and medCTP to fix insert orientation

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METODES DSCREENING DE LLIBRERIES


Los metodos de hibridacin son los ms comunes para la seleccin de un clon en particular de
una librera.
Estos mtodos requieren sondas: DNA o RNA complementario al gen que se desea aislar y que
podemos marcar radiactivamente, con fluorescencia o con biotina.

Labeling of nucleic acids


Probe labelling by random priming

5 end labelling (oligonucleotides, DNA fragments)

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Labeling just one strand

Labelled RNA probes

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Labeling of nucleic acids screening strategies (hybridization,


expression, functional expression...).
cDNA cloning teniendo una sonda

Tenemos plaques. Al poner un


filtro de nitrocelulosa se quedan
muchos de los fagos que estaban
en la placa se quedan en el filtro.
Incubamos este filtro con ina
solucin alcalina que rompre el
fago y desnaturaliza el ADN.
Marcamos con una sonda, y si hay
secuencias complementarias se
uniran.

Labeling of nucleic acid

Solo las sondas que se han


hibridado quedaran en la placa. Se
eliminan aquellas que no han
realizado una hibridacion
especifica (REMOVE NON
SPECIFIL BINDING)

A partir de una libreria genmica el primer paso es hacer recer las colonias o calvas para poder tener el
mayor numero posible de unidades por placa de petri.
A continuacin se transfieren a un papel de nitrocelulosa.
El papel es tratado para lisar los fagos o bacterias y desnaturalizar el DNA.
Se incuba con protena K para degradar protenas y dejar solo unido el DNA al papel.
Se desnaturaliza la sonsa (si es ds) y se hibrida en los filtros.

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cDNA cloning having limited sequence information

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cDNA cloning having an antibody to the encoded protein. (Vector requirements)

Esto representa un WB donde extractos de diferentes clones han sido usados para ver si la
proteina es expresda o no.
Tenemos la libreria de cDNAs, hacemos una placa que tiene diferentes clones que contienen
colonias de la libreria.
Cada libreria contienen un cDNA diferentes.
Tenemos una placa, donde tal vez una de las cavas contiene el clon q buscamos. No podemos
analizar clon por clon, porque hay muchos, lo que hacemos pues son pools of clones.
Hacemos crecer toda la placa en un erlenmayer, obtenemos los plsmidos y transfectamos
clulas 293 con estos. Incubamos durante 48h para que se de la expresin proteica. Lisamos
las clulas y separamos las protenas en un gel PAGE, transferimos las protenas a una
membrana y hacemos deteccin con anticuerpo.
As pues podemos ver en que placas iniciales tenamos el clon de inters. En este caso vemos
que el 2 i el 6 son donde ms hay.
Cogemos la placa INICIAL y la dividimos y hacemos lo mismo

cDNA cloning having a functional assay (Vector requirements)


Por si no sabemos qu anticuerpo hemos de usar.
una vez tenemos el cDNA,
hacemos lo mismo que antes.
Tenemos DNA plasmido -->
linearizamios DNA --> Para hacer
el mRNA necesitamos que el
promotor sea T7. T3 o SP6.

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TEMA 6. Caracterization of cloned genes.


1. DNA sequencing. (Sanger)
2. Identification of DNA in the genome (Southern, FISH).
3. Detection of transcripts (Northern blot, in situ hybridization, RNAse protection assay,
Microarrays, RT-PCR; real time PCR, PCR arrays).
4. Caracterization of the 5 end of mRNA: primer extension, RACE.
5. Site-directed mutagenesis.

1. DNA sequencing. (Sanger)


El mtodo de secuenciacin por dideoxinucletidos, mejor conocido como el mtodo Sanger
se basa en el proceso biolgico de la replicacin del DNA. El mtodo de secuenciacin ideado
por Sanger est basado en el empleo de dideoxinucletidos que carecen del grupo
hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucletidos se incorpora a una
cadena de DNA en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongndose. Esto es as ya
que la DNA polimerasa necesita un grupo terminal 3 OH para aadir el siguiente nucletido y
el dideoxinucletido incorporado carece de este grupo hidroxilo.
El mtodo comienza una vez se asla y se clona el DNA que se desea secuenciar. Este DNA se
desnaturaliza y se emplea una sola hebra para la secuenciacin. En la secuenciacin se utiliza
un cebador o primer que se encarga de suministrar el terminal 3OH que necesita la DNA
polimerasa para comenzar a elongar. Se preparan cuatro tubos de reaccin, cada uno con el
DNA molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, con DNA polimerasa, con el primer y
con los cuatro nucletidos trifosfatados.
A cada tubo se le aade una pequea proporcin de un dideoxinucletido trifosfato; un tubo
con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos
tubos se producen cadenas de DNA de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el
que se incorpor el dideoxinucletido correspondiente aadido al tubo. Los productos de las 4
reacciones, cada una conteniendo una pequea cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucletidos, son cargados en un gel y sometidos a electroforesis. As, obtendremos un
patrn de bandas en orden, del que deducir la secuencia del ADN introducido.

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http://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing (para ampliar informacion)

2. Identification of DNA in the genome (Southern, FISH).


FISH
Permite saber dnde, aproximadamente, nuestro DNA de inters esta en el genoma. En que
cromosoma.

Son cromosomas en metafase, podemos saber qu cromosoma es cada uno, asi sabemos
dnde est el gen. Por ejemplo si transfectamos con un vector retrovirico podemos saber
dnde se ha integrado.

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3. Detection of transcripts (Northern blot, in situ hybridization,


RNAse protection assay, Microarrays, RT-PCR; real time PCR,
PCR arrays).
Northern blot, macroarray, microarray

Secuencias de cada GEN representados. Cogemos el mRNA lo retrotranscribimos con


nucleotidos marcados, los pasamos a CDNA q estara oues marcada. Cogemos y los lanzamos
contra el macroaarray. Cada punto negro es donde se ha unido nuestro RNA que teniamos
inicialmente en el tejido.

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Tenemos un soporte solido donde hay fijadas en posiciones concretas secuencias.

In situ hibridazation

Con in situ hibridizacin podemos saber dnde est exactamente nuestro label.
La tcnica de hibridacin in situ est basada en la capacidad que poseen los cidos nucleicos para
hibridarse entre s, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta
complementaria con otra secuencia.
Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediante la utilizacin de una sonda (formada
por una secuencia de ADN previamente conocida) marcada con un istopo radiactivo, la presencia de
determinada secuencia de ADN o ARN complementaria, en la muestra a estudiar.
Lo que se produce mediante la utilizacin de esta tcnica es: La hibridacin (unin), de la sonda
marcada, con la secuencia a buscar (en el caso de estar presente en la muestra) y posteriormente
mediante tcnicas especficas (autoradiografa o inmunohistoqumica), la transformacin de la
secuencia en algo visible.

Normalmente se usan RNA probes, se usan tambin dos muestras de nuestro tejido con una probe
antisentido y una sentido, para evitar falsos positivos. Si la unin no es especifica tambin pasara en la
sense probe.

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Inmunohistoqumica En vez de usar probes para detectar RNA, se usan anticuerpos. Como control se
usa un control isotipo. utilizacin de un anticuerpo especfico, previamente marcado mediante un
enlace qumico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad
del anticuerpo para formar un complejo con el antgeno, aplicado a una muestra de tejido orgnico,
correctamente fijada e incluida en parafina.

RNAse protection assay

Un framento del CDNA clonado en la orientacin mala delante de T7 polimerase promoter. (lila). As
que cuando ponemos los nucletidos y T7RNAse empezara a a sintetizar la nonsense strand
(antisentido). Esta marcada con biotina.
Hacemos lo mismo con el segundo fragmento, que es un poco mas corto. Los mezclamos seguidament
con el RNA de nuestro tejido, asi que se complementaran (porque son las antisentidos) cn las que ya
estn en el tejido.
La molculas que han sido hibridadas no se degredaran (con RNA digestin) porque son bicatenarias. Las
otras si que sedegradaran.
Al final de esta reaccin solo tenemos las moelculas de RNA protejidas por la la sprobes marcadas con
biotina.

The RNase protection assay is a sensitive method for transcription start-site localization. It begins with
an RNA probe that is uniformly labeled by incorporation of one [-(32)P]NTP, usually [-(32)P]UTP. The
RNA probe is synthesized by bacteriophage RNA polymerase (SP6, T7, or T3), which initiates
transcription from specific phage promoters that have been engineered into a number of common
plasmid vectors. The plasmid template contains a genomic DNA fragment spanning the region thought
to contain the transcription start site for the gene of interest. This genomic fragment is subcloned into
the plasmid downstream of the phage promoter in the antisense orientation, so that a portion of the 5'
end of the resulting RNA probe will be complementary to the mRNA of interest. The radiolabeled probe

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is annealed to cytoplasmic or total cellular mRNA purified from the cells of interest, with the
hybridization reaction proceeding for several hours or overnight. RNase A and/or RNase T1 is then
added to the hybridization reactions. These nucleases digest the single-stranded overhang regions of
RNA molecules, but RNA-RNA hybrids are resistant to cleavage. This resistance forms the conceptual
basis for the procedure; the region of the probe that anneals to the specific mRNA will be resistant to
digestion. The length of the resistant region of the probe will correspond to the distance from the 5' end
of the probe to the transcription start site. The size of the resistant fragment can be determined by
electrophoresis on a high-resolution, denaturing polyacrylamide gel.

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