UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS

ESCUELA DE

FORMACIN

PROFESIONAL DE

INGENIERAS Y
ARQUITECTURA

FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL

PRCTICA DE LABORATORIO

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

CURSO

Microbiologa Ambiental

ALUMNA

QUISPE HUAMAN, Johana

RUIZ ARESTEGUI, Yordi

PROFESOR

Gilmer Joyo Zaga

CICLO

AYACUCHO PER
2014
I.
II.
III.

INTRODUCCIN
OBJETIVOS:
FUNDAMENTO TERICO:
III.1. COLIFORMES TOTALES Y FECALES
III.2. CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES
III.3. CARACTERISCTICAS BIOQUIMICAS
III.4. HABITAD DEL GRUPO COLIFORME

1
2
2

IV.

V.

III.5. COLIFORMES COMO INDICADORES

III.6. BACTERIAS QUE INTEGRAN EL GRUPO
III.7. COLIFORMES FECALES
ESCHERICHIA COLI
5
IV.1. FUNCION NORMAL
IV.2. PATOGENIA
4.2.1 VIRULENCIA
4.2.2 INFECCIONES URINARIAS
IV.3. TRATAMIENTO
IV.4. CALSIFICACION
IV.4.1. Escherichia coli enteropatognica (ECEP)
IV.4.2. Escherichia coli enterotoxignica (ECET)
IV.4.3. Escherichia coli enteroinvasiva (ECEI)
IV.4.4. Escherichia coli enterohemorragica (ECEH)
IV.4.5. Escherichia coli enteroagregativa (ECEA)
IV.4.6. Escrerichia coli adherencia difusa (ECAD)
MATERIALES A UTILIZARSE EN LA TCNICA O MTODO ESTANDAR

FILTRO DE MEMBRANA
V.1.
MEDIOS DE CULTIVO
V.1.1.
Agar M ENDO LES
V.1.2.
Agar MFC
VI.
PROCEDIMIENTO EN EL LABORATORIO:
1. PREPARACION DE LA MUESTRA
2. PREPARACION DEL MEDIO
3.
BACIADO DE LOS MEDIOS EN LAS PLACAS
4.
SOLIDIFICACION DE LOS MEDIOS
5. FILTRACON DE MEMBRANA
6. COLOCADO DEL FILTRO EN LA PLACA
7. INCUBACION DE LAS MUESTRAS
8. RECUENTO
VII.
CONCLUSIONES

VIII.

10

14

23

INTRODUCCIN

El aislamientos de cultivos puros ha sido el fundamento de la prctica microbiolgica

----------para examinar y cultivar muestras en busca de microorganismos ya sea en
agua, suelos, alimentos, ambiente y en el hombre. Identificar con certeza las especies
involucradas y llevar a cabo la prueba.
Gracias el metabolismo bacteriano pudieron entenderse mejor que requerimientos
nutricionales de las bacterias, obtenindose medios de cultivo que permitan el
crecimiento rpido y abundante de las bacterias.

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es

observar su crecimiento en aguas residuales. La muestra de agua en el que crecen los
microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el
Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las
bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una
serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno
adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo
debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento
de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas
requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del
cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de
extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un
elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se
licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a
40grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las
bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.

IX.

X.

OBJETIVOS:
- Deterinacion de coliformes totales y fecales en la planta de tratamiento de
-

EPSASA.
Describir el mtodo de ensayo para la numeracin de Coliformes totales por

tcnica de Filtracin de membrana

Identificar el uso de medios de cultivo de acuerdo al microorganismo a

estudiar.
Interiorizar en el reconocimiento de los materiales empleados en la siembra

de microorganismos.
- Determinar si en las aguas se encuentran coliformes totales o fecales.
FUNDAMENTO TERICO:
X.1.

COLIFORMES TOTALES Y FECALES

La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies
bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e
importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y
los alimentos.
Coliforme significa con forma de coli, refirindose a la bacteria
principal del grupo, la Escherichia coli, descubierta por el bacterilogo
alemn Theodor von Escherich en 1860. Von Escherich la bautiz como
bacterium coli ("bacteria del intestino", del griego , kolon,
"intestino"). Con posterioridad, la microbiologa sistemtica nombrara el
gnero Escherichia en honor a su descubridor
Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosapositivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por
las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonmicos.
Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su
capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms
o menos rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una
temperatura de incubacin comprendida entre 30-37C. Son bacilos
gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados.
Del grupo coliforme
forman parte de varios gneros:
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en
el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros
ambientes: agua, suelo, plantas, cscara de huevo, etc.
Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el
de los Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales
que adems fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 2448 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45C en presencia de

sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente

Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella.
Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran
ndices de contaminacin fecal. Pero el verdadero ndice de
contaminacin fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es
seguro.
X.2.

CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES
Las bacterias coliformes son clulas procariotas. A diferencia de las
clulas de organismos ms complejos, las clulas procariticas carecen
de un ncleo verdadero y otros orgnulos unidos a la membrana. A nivel
interno, los coliformes consisten en el citoplasma, ADN, ARN y usa
ribosomas para fabricar protenas. Una envoltura celular rodea a las
estructuras internas y consta de una membrana celular interna, una
pared celular y una cpsula exterior. Los coliformes tienen flagelos que
utilizan para desplazarse. Algunas cepas tienen una superficie con
cerdas llamadas fimbrias que les permiten adherirse a las clulas y las
superficies de otros.

X.3.

CARACTERISCTICAS BIOQUIMICAS
Las coliformes fermentan la lactosa y producen gas durante el proceso.
Son organismos anaerobios facultativos, lo que significa que tienen la
capacidad de prosperar con ejercicios aerbicos o de respiracin
anaerobia. Cuando el ambiente carece del oxgeno necesario para la
respiracin aerbica, obtienen energa mediante la transicin a la
respiracin anaerobia. Todos los coliformes producen sustancias
txicas, llamadas endotoxinas, que se liberan cuando se desintegra el
organismo
El grupo contempla a todas las bacterias entricas que se caracterizan
por tener las siguientes propiedades bioqumicas:

X.4.

Ser aerobias o anaerobias facultativas.

Ser bacilos Gram negativos.
No ser esporgenas
Fermentadoras de lactosa
Productoras de gas
HABITAD DEL GRUPO COLIFORME
Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el
intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir,
homeotermos, pero tambin ampliamente distribuidas en la naturaleza,
especialmente en suelos, semillas y vegetales.

Los coliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por las

heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse la
mayora de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de
origen fecal. Sin embargo, an existen muchos coliformes de vida libre.
X.5.

COLIFORMES COMO INDICADORES

Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de
contaminacin fecal en el control de calidad del agua destinada al
consumo humano en razn de que, en los medios acuticos, los
coliformes son ms resistentes que las bacterias patgenas intestinales
y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia
indica que el agua es bacteriolgicamente segura.
Asimismo, su nmero en el agua es directamente e inversamente
proporcional al grado de contaminacin fecal; mientras ms coliformes
se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces.

X.6.

BACTERIAS QUE INTEGRAN EL GRUPO

El grupo de los coliformes incluye bacterias en forma de bacilo, gram
negativos, con las siguientes propiedades bioqumicas: oxidasa
negativo y capacidad de fermentar lactosa, con produccin de gas en
48 horas a una temperatura de 37 C.
El grupo coliforme est formado por los siguientes gneros:

X.7.

Escherichia
Klebsiella
Enterobacter

COLIFORMES FECALES
Las bacterias coliformes fecales forman parte del total del grupo
coliforme. Son definidas como bacilos gram-negativos, no esporulados
que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a 44 C dentro
de las 24 Y 48 horas. La mayor especie en el grupo de coliforme fecal
es el Escherichia coli.
La presencia de coliformes en el suministro de agua es un indicio de
que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u
otro tipo de desechos en descomposicin. Generalmente, las bacterias
coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial
del agua o en los sedimentos del fondo.
Los niveles recomendados de bacterias coliformes fecales son:

Agua potable: 0 colonias por 100 ml de la muestra de agua.

Natacin: menos de 200 colonias por 100 ml de la muestra de agua.
Navegar/Pescar: menos de 1,000 colonias por 100 ml de la muestra
de agua.

XI.

ESCHERICHIA COLI
La Escherichia coli, tambin conocida por la abreviacin de su nombre, E. coli,
es quizs el organismo procariota ms estudiado por el ser humano. Se trata
de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos
animales, y por ende en las aguas negras, pero se puede encontrar en todos
lados, dado que es un organismo ubicuo. Fue descrita por primera vez en 1885
por Theodore von Escherich, bacterilogo alemn, quien la denomin
Bacterium coli. Posteriormente la taxonoma le adjudic el nombre de
Escherichia coli, en honor a su descubridor.
Esta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del
proceso digestivo, adems de producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que
reacciona negativamente a la tincin de Gram es anaerobio facultativo, mvil
por flagelos peritricos no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la
lactosa y su prueba de IMVIC es ++--.
Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de gentica y
biologa molecular.

XI.1.

FUNCION
La

NORMAL
Escherichia

coli, en

su

natural,

vive en los

hbitat

intestinos de
la
de

mayor
los

sanos.

parte

mamferos
Es

el

principal organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo. En

individuos sanos, es decir, si la bacteria no adquiere elementos
genticos que codifican factores virulentos, la bacteria acta como un
comensal formando parte de la flora intestinal y ayudando as a la
absorcin de nutrientes. En humanos, la Escherichia coli coloniza el
tracto gastrointestinal de un neonato adhirindose a las mucosidades

del intestino grueso en el plazo de 48 horas despus de la primera

comida. Tiene un ancho variable.
XI.2.

PATOGENIA
La Escherichia coli puede causar infecciones intestinales y extra
intestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato
excretor, vas urinarias, cistitis, Uretritis, meningitis, peritonitis, mastitis,
septicemia y neumona Gram-negativa.
4.2.3

VIRULENCIA
La Escherichia coli est dividida por sus propiedades virulentas,
pudiendo causar diarrea en humanos y otros animales. Otras
cepas

causan

diarreas

hemorrgicas

por

virtud

de

su

agresividad, patogenicidad y toxicidad. En muchos pases ya

hubo casos de muerte por esta bacteria. Generalmente pasa en
nios entre 1 ao y 8 aos. Causado generalmente por la
contaminacin de alimentos, y posterior mala coccin de los
mismos, es decir, a temperaturas internas y externas menores
de 70 C.
4.2.4

INFECCIONES URINARIAS
Son ms comunes en mujeres por la corta longitud de la uretra
(25 a 50 mm), en comparacin con los hombres (unos 15 cm).
Entre los ancianos, las infecciones urinarias tienden a ser de la
misma proporcin entre hombres y mujeres. Debido a que la
bacteria invariablemente entra al tracto urinario por la uretra los
malos hbitos sanitarios pueden predisponer a una infeccin, sin
embargo, otros factores cobran importancia, como el embarazo,
hipertrofia benigna o maligna de prstata, y en muchos casos el
evento iniciante de la infeccin es desconocido. Aunque las
infecciones ascendentes son las causantes de infecciones del
tracto urinario bajo y cistitis, no es necesariamente esta la causa
de infecciones superiores como la pielonefritis, que puede tener
origen hematgeno.

XI.3.

TRATAMIENTO
El uso de antibiticos es poco eficaz y casi no se prescribe. Para la
diarrea se sugiere el consumo de abundante lquido y evitar la
deshidratacin. Cuando una persona presenta diarrea no debe ir a
trabajar o asistir a lugares pblicos para evitar el contagio masivo.

En algunas patologas como la pielonefritis hay que considerar el uso de

alguna cefalosporina endovenosa.
XI.4.

CALSIFICACION
Se distinguen seis cepas segn su capacidad patgena, -tambin se les
puede llamar virotipos-: Escherichia coli enteropatognica (ECEP),
enterotoxignica (ECET), enteroinvasiva (ECEI), enterohemorrgica
(ECEH), enteroagregativa (ECEA) y de adherencia difusa (ECAD).
XI.4.1. Escherichia coli enteropatognica (ECEP) Esta cepa causa
diarrea en humanos, conejos, perros y caballos, al igual que la
enterotoxignica, pero la etiologa y los mecanismos moleculares
de colonizacin son diferentes. Carece de fimbrias y no produce
las toxinas ST y LT, pero utilizan la protena intimina, una
adhesina, para adherirse a las clulas intestinales. Este virotipo
posee una serie de factores de virulencia que son similares a los
que se encuentran en Shigella, como la toxina shiga. La
adherencia a la mucosa intestinal causa una reordenacin de la
actina en la clula hospedante, que induce una deformacin
significativa. Estas bacterias son moderadamente invasivas:
penetran

en

las

clulas

hospedadoras

provocando

una

respuesta inflamatoria. La causa principal de diarrea en los

afectados por esta cepa son seguramente los cambios
provocados en la estructura de las clulas intestinales.
XI.4.2. Escherichia coli enterotoxignica (ECET) Se parece mucho a
Vibrio cholerae, se adhiere a la mucosa del intestino delgado, no
la invade, y elabora toxinas que producen diarrea. No hay
cambios histolgicos en las clulas de la mucosa y muy poca
inflamacin. Produce diarrea no sanguinolenta en nios y
adultos, sobre todo en pases en vas de desarrollo, aunque los
desarrollados tambin se ven afectados. Emplea varias toxinas,
incluyendo la enterotoxina resistente al calor y la enterotoxina
termolbil.
XI.4.3. Escherichia coli enteroinvasiva (ECEI) Es inmvil, no fermenta
la lactosa. Invade el epitelio intestinal causando diarrea
sanguinolenta en nios y adultos. Libera el calcio en grandes
cantidades impidiendo la solidificacin sea, produciendo artritis
y en algunos casos arterioesclerosis. Es una de las E. coli que
causa ms dao debido a la invasin que produce en el epitelio
intestinal.

XI.4.4. Escherichia coli enterohemorragica (ECEH) La convencin

internacional de nomenclatura de patgenos ha recomendado el
uso de STEC (Shiga Toxin Escherichia coli) para este grupo,
debido a que estas bacterias producen una toxina citotxica para
clulas Vero de cultivo de similaridad estructural a la toxina
producida por Shigella dysenteriae. Las STEC producen
verotoxinas que actan en el colon. Sus sntomas son: primero
colitis hemorrgica, luego sndrome urmico hemoltico (lo
anterior ms afeccin del rin, posible entrada en coma y
muerte), y por ltimo, prpura trombocitopnica trombtica (lo de
antes ms afeccin del sistema nervioso central). Esta cepa no
fermenta el sorbitol y posee un fago, donde se encuentran
codificadas las verotoxinas, tambin llamadas "Toxinas Shiga",
no posee una fimbria formadora de mechones, en vez de esto
posee una fimbria polar larga que usa para adherencia.
XI.4.5. Escherichia coli enteroagregativa (ECEA) Slo encontrada en
humanos.

Son llamadas enteroagregativas porque tienen

fimbrias con las que aglutinan clulas en los cultivos de tejidos.

Se unen a la mucosa intestinal causando diarrea acuosa sin
fiebre.

No

son

invasivas.

Producen

hemolisina

una

enterotoxina ST similar a la de las enterotoxignicas. se le

asocian dos toxinas:

toxina termoestable enteroagregante (EAST)
toxina codificada por plasmidos (PET)
XI.4.6. Escrerichia coli adherencia difusa (ECAD) Se adhiere a la
totalidad

de

la

superficie

de

las

clulas

epiteliales

habitualmente causa enfermedad en nios inmunolgicamente

no desarrollados o malnutridos. No se ha demostrado que pueda
causar diarrea en nios mayores de un ao de edad, ni en
adultos y ancianos.

XII.

MATERIALES A UTILIZARSE EN LA TCNICA O MTODO ESTANDAR

FILTRO DE MEMBRANA

MUESTRA

MICROPIPETA

PLACAS PETRI

UNIDAD DE FILTRACION

FILTROS MEMBRANA

ALMOHADILLAS ABSORBENTES

PINZAS DE PUNTA PLANA

MEDIO M ENDO

MEDIO MFC

XII.1. MEDIOS DE CULTIVO

XII.1.1.

Agar M ENDO LES

Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad,

est dada por las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los
coliformes y el desarrollo invasor de proteus spp.
Es diferencial debido a la fermentacin de lactosa, y a la
formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio.
Pocos organismos fermentadores de lactosa capaces de
desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador
de PH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo
rojizo.
Salmonella shigella y otros microorganismos no fermentadores
de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen
colonias transparentes la produccin de cido sulfhdrico se
evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin
XII.1.2.

de sulfuro de hierro.
Agar MFC
El agar mFC contiene agentes selectivos y diferenciales. cido
roslico inhibe el crecimiento bacteriano en general, excepto
para coliformes fecales. Las sales biliares inhiben las bacterias
no entricas. Azul de anilina indica la capacidad de coliformes
fecales de fermentar la lactosa a cido que causa un cambio de
pH en el medio.
La utilizacin de lactosa (color azul) es la base para la

XIII.

identificacin de coliformes fecales.

PROCEDIMIENTO EN EL LABORATORIO:
9. PREPARACION DE LA MUESTRA
Seleccionar el tamao (volumen) de la muestra, el cual
depender de la densidad bacteriana que se desee esperar, en
el caso de las muestras de agua potable, estar limitada por el
grado de turbidez o por el crecimiento de no Coliformes en el
medio.
El volumen ideal de muestra, es aquel que nos proporciona un
recuento de 20 a 80 colonias de Coliformes y no ms de 200
colonias de todos los tipos. En el caso de agua potable se
recomienda filtrar volmenes de 100 - 500 mL o muestras
duplicadas de volmenes pequeos (50 25 mL). Para otros
tipos de agua se procede a realizar las respectivas diluciones.
Las muestras deben recolectarse en frascos estriles de 500
mL, de boca ancha con tapa rosca. En el caso que es agua

tratada y tiene cloro residual, los frascos deben contener to

sulfato de sodio al 3% (0,25 mL por cada 250 mL de muestra).
En el caso que se filtre volmenes de 20 mL se debe aadir 10
mL de agua de dilucin estril al embudo antes de la filtracin,
permitiendo de esta manera aumentar el volumen de la muestra
y una mejor dispersin uniforme de la muestra en la superficie
de la membrana.
Las placas de agar Endo Les, deben atemperarse (colocar las
placas a 35C), antes de iniciar el proceso de anlisis, as
mismo, marcar cada placa con el cdigo de la muestra, fecha y
dilucin.
Preparar las diluciones correspondientes de la muestra, se debe
agitar vigorosamente aproximadamente 25 veces, para asegurar
una buena homogenizacin, transferir con una pipeta estril un
volumen de 10 mL de la muestra a un frasco con 90 2 mL de
agua de dilucin. De esta manera se tiene la primera dilucin
(10-1).
Homogenizar el frasco que contiene la dilucin (10-1), con una
nueva pipeta estril transferir 10 mL a un nuevo frasco de
dilucin, teniendo as la segunda dilucin (10-2). Continuar con
este proceso hasta realizar todas las diluciones del caso,
dependiendo del grado de contaminacin de la muestra.
Ordenar los frascos conteniendo las diluciones, en secuencia
decreciente de concentracin (de mayor a menor dilucin),
cuando se trabaja con diluciones se empieza con la mas diluida.

10. PREPARACION DEL MEDIO

 Agar M ENDO LES (coliformes totales) Suspender 45.5g de

del polvo deshidratado en un litro de agua destilada, mezclar
vigorosamente. Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir
durante 1 minuto para disolver completamente los ingredientes.
Esterilizar a 121c durante 15 min.

AGAR

MFC

(coliformes
fecales) Disolver 37
gr del medio deshidratado (dependiendo de la marca) en un litro
de agua destilada (estril), que contiene 10 mL de cido roslico
al 1% en solucin 0,2N de NaOH. Calentar evitando la ebullicin
y el sobrecalentamiento. El pH final debe ser de 7,4 0,2. No
autoclavar el medio. Si se usa agar, distribuir de 5 a 7 mL en las
placas petri y dejar solidificar. Guardar el medio de lquido a 4 C
dentro de bolsa plstica o dentro de un envase para reducir la
prdida de humedad, descartar despus de 4 das, en el caso
del agar, despus de 2 semanas.
ACIDOROSOLICO: Disolver 1,0 g de cido roslico en 100 mL
de solucin de NaOH 0,2 N. El cido roslico se descompone
con la esterilizacin. Guardar la solucin en oscuridad y entre 2
C y 10 C, descartar despus de 2 semanas o antes si se
observa que el color cambia de rojo a marrn.

11.

BACIADO DE LOS MEDIOS EN LAS PLACAS

Dejar enfriar y suspender el precipitado por agitacin antes de su uso.

12.

SOLIDIFICACION DE LOS MEDIOS

13. FILTRACON DE MEMBRANA

Al comienzo de cada serie de filtraciones, utilzar unidades de
filtracin estriles (UV, autoclave). considerar una interrupcin de
una serie de filtracin cuando transcurre un intervalo de 30 o
ms minutos entre la filtracin de dos muestras. Debe tratarse

como una nueva serie y esterilizar los soportes de los filtros de

membrana que estn utilizando.
Descontaminar los filtros entre filtraciones sucesivas, mediante
rayos ultravioleta (UV), se exponen unos 2 minutos. Se
recomienda

llevar

proteccin

ocular.

Debe

limpiarse

regularmente los tubos UV y comprobar en forma peridica, si se

produce una eliminacin bacteriana del 99% en una exposicin
de 2 minutos.
Colocar con pinzas estriles un filtro de membrana estril (con la
trama hacia arriba) sobre la placa porosa del receptculo. Situar
con cuidado la unidad del embudo correspondiente sobre el
receptculo y fijar.
Llevar a cabo la filtracin bajo un vaci parcial. Terminado el
proceso, se procede a retirar el embudo y la membrana con
unas pinzas estriles, colocndola en el medio seleccionado
Agar Endo Les, evitando que quede aire atrapado debajo de la
membrana.

14. COLOCADO DEL FILTRO EN LA PLACA Una vez filtrada la muestra

se retira se retira con una pinza el filtro membrana y se coloca en las
placas tipo Petri con el medio

15. INCUBACION DE LAS MUESTRAS

En caso del medio M ENDO, La placa se lleva a la incubadora en
forma invertida, por un tiempo de 22 a 24 hrs. A una temperatura de
35 0,5C.
En caso del medio MFC, las placas de cultivo sembradas, deben
sellarse o envolverse, para luego ser colocas en bolsas de plstico
impermeables, para sumergirlas en un bao de agua, donde se
incuban a 44,5 0,2 C durante 24 2 hrs.

16. RECUENTO
EN EL MEDIO M ENDO LES Observacin en el medio M-Endo,
los coliformes fermentadores de lactosa producen colonias
rosadas

rojas,

mientras

que

las

colonias

de

los

microorganismos que no pueden fermentar este carbohidrato

son incoloras. Las colonias tpicas de E. coli son rosadas con un
brillo verde metlico caracterstico, debido a la elevada
produccin de cidos y aldehdos como producto de la
fermentacin de la lactosa

 EN
Las

EL

MEDIO

MFC

colonias tpicas de
Coliformes fecales,
tienen

las

siguientes
caractersticas,
presentan distintos matices del color azul.
Contar todas las colonias de diferentes matices de color azul con
ayuda de una lupa estereoscpica de 10 a 15 aumentos, o
simplemente otro instrumento ptico.
Las colonias de Coliformes no fecales son de tonos grises a
cremosas. En condiciones normales, se observan pocas colonias
de Coliformes no fecales en el medio M-FC, debido a la accin
selectiva de la elevada temperatura y a la adicin de la sal del
cido roslico.

Recuento de colonias.
Inmediatamente despus de la incubacin, contar todas las colonias de las
placas seleccionadas haciendo uso del contador de colonias. Cuando no se
disponga de este tipo de instrumento, utilizar cualquier otro contador,
siempre que proporcione aumento e iluminacin equivalente.
Registrar en el reporte de los resultados los controles realizados por cada
lote de muestra.
Considerar solo las placas que tienen entre 30 y 300 colonias. Calcular el
recuento bacteriano por mililitro, multiplicando el nmero promedio de
colonias de las dos placas seleccionadas Perteneciente a la misma dilucin
por el inverso de la dilucin utilizada. Reportar en UFC/ mL.
Si ninguna de las placas de una muestra tiene colonias, reportar un
recuento inferior a una vez elrecproco de la dilucin mas baja (<1).
Cuando el nmero de colonias por placa supere ampliamente las 300, no
reportar resultados del tipo Demasiados numerosas para el recuento
(DNPR). Para menos de 10 colonias /cm2, contar las que existen en 13
cuadrados (del contador de colonias) representativos de la distribucin de
las colonias. Si es posible seleccionar 7 cuadrados consecutivos
horizontales a travs de la placa y 6 cuadrados consecutivos verticales, con
la precaucin de no contar ms de una vez un mismo cuadrante. Multiplicar
la suma del nmero de colonias de los 13 cm2 representativos por 5, para
Calcular el nmero de colonias por placa, cuando el rea de esta sea de 65
cm2.
Si hay ms de 10 colonias/ cm2, contar 4 cuadrados significativos, calcular
el promedio por cm2 y multiplicar por el factor adecuado para obtener el
nmero de colonias por placa. El factor es de 57 para las placas
desechables de plstico y de 65 para las de vidrio. Cuando los recuentos
bacterianos superen las 100 colonias reporte el resultado mayor de (>)
6500 veces el inverso de la dilucin ms alta, en el caso de placas de
vidrio, y mayor de 5,700 veces el recproco, en el de las placas de plstico.
Reportar como recuento estimado de UFC/mL.
Cuando aparezcan colonias expansivas en la placa seleccionada, contar
como una unidad cada uno de los siguientes tipos: cadenas de colonias

que parezcan ser consecuencia de la desintegracin de un grupo de

bacterias al mezclar el agar y la muestra; expansiones que se desarrollen
como placas de crecimiento entre el agar y la base de la placa petri. Contar
como colonias individuales aquellas que posean aspecto de colonias y
crezcan muy cerca unas de otras, aunque sin tocarse, siempre que la
distancia entre ellas sea al menos igual al dimetro de la colonia ms
pequea. Tambin se contaran como colonias individuales las adyacentes
con aspecto distinto en lo que se refiere a forma color etc.
Si hay exceso de crecimiento expansivo en una placa, considerar como
diseminantes. En caso de que las placas resulten incontables por que se
haya perdido el factor de dilucin, se hayan cado accidentalmente; estn
contaminadas o las placas de control indiquen que el medio, otros
Materiales o el instrumental estn contaminados, se referirn en el reporte
como accidente de Laboratorio

XIV.

CONCLUSIONES

Con este trabajo se logr tener el conocimiento de que si las aguas de las cuales
nosotros adquirimos puedan estar contaminadas o libres de coliformes para el
consumo humano.
Estos estudios que se realizaron fueron en la planta de tratamiento de EPSASA.

Las muestras que se tomaron para la determinacin de coliformes fueron de dos

puntos la zona de almacenamiento de agua de Quicapata y las aguas ya tratadas en la
planta de EPSASA. Se logr determinar en que en la zona de almacenamiento de
aguas se encuentran con coliformes y mientras en las aguas ya tratadas no hubo
crecimiento de estos coliformes de las cuales se deduce que estn siendo muy bien
tratadas.