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UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA

MANUAL DE LABORATORIO INTEGRAL DE


MICROBIOLOGA

PROGRAMA EDUCATIVO: LICENCIATURA DE QUMICO


ELABORARON:
M. en A. P. Guadalupe Santamara Gonzlez
M. en E. Q. Macario Morales Rodrguez
M. en S. P. Sergio H. Pavn Romero
Actualizacin
Agosto 2010

FECHA DE APROBACIN DE LOS H. H. CONSEJO ACADMICO Y DE GOBIERNO:

ndice
Presentacin

Introduccin

Objetivos generales

Reglamento del laboratorio

Prctica No. 1. Uso y manejo del microscopio

Practica No. 2 Observacin microscpica de clula humana, vegetal y microbiana

16

Practica No. 3 Propiedades de carbohidratos

22

Prctica No. 4 Propiedades de protenas

28

Practica No. 5 Esterilizacin y sanitizacin

33

Prctica No. 6 Preparacin de medios de cultivo

42

Prctica No. 7 Aislamiento de microorganismos en cultivo puro

48

Prctica no 8 Tcnicas de coloracin de microorganismos

57

Prctica No. 9 Proyecto de investigacin integral

65

Referencia bibliogrfica

66

Pictogramas:
Evaluacin

Anlisis y
discusin de
resultados

Conclusiones
y sugerencias

Cuestionarios

Actividades
de sntesis

Referencias
bibliogrficas

Presentacin

El trabajo de laboratorio debe ser un componente fundamental del proceso de enseanza


-aprendizaje de las ciencias, especialmente en unidades de aprendizaje terico prctica
donde los alumnos de manera palpable entran en contacto con el material biolgico,
equipos y las metodologas, que les permiten experimentar y desarrollar su potencial para
abordar de mejor manera el conocimiento conceptual y procedimental.
Las actividades que se llevarn a cabo son experimentales, iniciando con los
conocimientos adquiridos en biologa, bioqumica y de manera simultanea la microbiologa,
tomando en consideracin la normativa y la importancia de la aplicacin de las ciencias
biolgicas en beneficio del hombre.
Las sesiones estn programadas para que los alumnos puedan desarrollar diversas
competencias caractersticas del mtodo cientfico, tales como: la observacin y
comprensin de fenmenos, desarrollo de procedimientos y tcnicas experimentales. As
como la integracin de diversos aspectos cientficos con la elaboracin de un protocolo de
investigacin que integre los conocimientos para contribuir a cumplimiento de los atributos
relacionados con el perfil de egreso.
Este manual cuenta con ocho prcticas de laboratorio y un proyecto de investigacin que
integrar los conocimientos adquiridos en biologa, bioqumica y microbiologa,
considerando que los alumnos desarrollarn las competencias para el manejo de
instrumentos, equipo y procedimientos metodolgicos para comprender a los
microorganismos y relacionar la actividad metablica de estos que facilite el conocimiento
de los procesos bioqumicos y desarrolle la capacidad de utilizar a los microorganismos en
diferentes procesos industriales en beneficio del hombre.

Introduccin

La problemtica ecolgica actual es debida a la contaminacin del medio ambiente, por el


ingreso a los diferentes sustratos como el agua, suelo y aire de todo tipo de residuos tales
como; hidrocarburos, plaguicidas, metales pesados, productos farmacuticos de diferente
ndole y materiales radioactivos entre otras.
En la naturaleza existe una gran diversidad de seres vivos constituidos por una o varias
clulas denominados microorganismos stos en especial las bacterias y los hongos, son
los principales transformadores de la materia orgnica, participan en diferentes procesos
biotecnolgicos, entendindose esto como toda aplicacin tecnolgica que utiliza sistemas
biolgicos y organismos vivos o sus derivados para la creacin o modificacin de
productos o procesos para usos especficos
Esto obliga a tener el conocimiento fundamental de las ciencias bsicas, comprender
todas las formas biolgicas desde los virus hasta las plantas y animales ms
evolucionados los cuales estn constituidos por elementos qumicos que obedecen a las
leyes de la qumica y la fsica.
Por lo tanto, el estudiante al contar con los conocimientos de biologa, bioqumica y
microbiologa en este curso prctico de laboratorio les permitir integrar y crear nuevos
conocimientos para aplicarlos en las reas correspondientes.
El hombre desde hace miles de aos ha utilizado a los microorganismos en diversos
procesos, por ejemplo, la elaboracin de pan, produccin de bebidas alcohlicas y
elaboracin de medicamentos entre otros, utilizando y perfeccionando paulatinamente el
conocimiento. El avance cientfico tecnolgico ha favorecido la utilizacin de diferentes
tcnicas en las reas de biologa molecular, ingeniera gentica, bioqumica y
bioinformtica y microbiologa para beneficiar a los diferentes sectores como: el
agropecuario, industrial, ambiental y en el rea de la salud; la participacin
multidisciplinaria contribuir a mejorar los procesos biolgicos de una forma integral y de
esta manera poder resolver la problemtica que se presenta en estas reas.
El propsito del manual es proporcionar la informacin y procedimientos necesarios en el
laboratorio para comprender la relacin que existe entre las unidades bsicas de las
clulas hasta el uso de los microorganismos en diverso proceso.

Objetivos generales:
a. Integrar los conocimientos de la biologa, bioqumica y microbiologa para
comprender la importancia de los microorganismos en todo ser vivo.
b. Conocer y utilizar adecuadamente el equipo y el material usado en Biologa,
Bioqumica y Microbiologa para aplicarlas en diversos procesos biolgicos.
c. Interpretar y discutir los resultados de los experimentos biolgicos para comprender
las variables que intervienen en un proceso.

Reglamento de laboratorio

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.

Para el acceso al laboratorio el alumno deber tener puesta la bata blanca y limpia.
Se les permitir entrar al laboratorio solo a los alumnos que cuenten con el material
y equipo solicitado en cada prctica.
La tolerancia para ingresar al laboratorio ser diez minutos despus de la hora
referida en los horarios.
Los objetos personales de los alumnos deben ser guardados en los cajones de las
mesas de trabajo
Antes de iniciar la prctica debern limpiar la mesa de trabajo con solucin de benzal
al 5 % y al trmino de la practica realizar el mismo procedimiento.
No est permitido: comer, beber y en general se recomienda tener cuidado personal
en el manejo del material biolgico
Es importante mantener orden, respeto y compaerismo dentro del laboratorio.
El material contaminado debe ser tratado de acuerdo a las normas establecidos en el
manual de higiene y seguridad de la Facultad de Qumica
Todo el material como: algodones, papeles, sellos, etc. Deber ser depositado en los
botes destinados para este uso. Mantener escrupulosamente limpio todas las
reas de trabajo.
Cualquier contingencia que se presente durante la prctica se deber avisar al
profesor inmediatamente.
El material biolgico (cultivo de microorganismos y material contaminado) debe
esterilizarse y ser depositado en el lugar indicado.
Despus de su uso los colorantes deben ser evaporados y los residuos depositarlos
en contenedores especficos.
Es importante mantener los microscopios limpios (limpiar las lentes con papel seda), e
informar al profesor si observa alguna descompostura o desajuste al iniciar, durante o
al finalizar la prctica.
Al concluir las actividades en el laboratorio es importante lavarse las manos con
abundante agua y jabn.
Todo material que se rompa o extravi deber ser recuperado por el grupo.

Prctica No. 1
USO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

Objetivo: Identificar las partes fundamentales del microscopio, para que los alumnos
aprendan a manipularlo adecuadamente empleando preparaciones fijas de
microorganismos.
Duracin de la prctica: 3 hr.
Introduccin:
Un microscopio puede definirse como un instrumento ptico formado por una o varias
lentes cuyo propsito es amplificar y resolver la imagen de objetos pequeos. Existen dos
tipos de microscopios:

Simple: Es una sola lente biconvexa con la cual se permite observar multitud de
objetos microscpicos.

Compuesto: Un microscopio compuesto posee dos sistemas de cristales, uno


conocido por objetivo y otro llamado ocular, ambos montados en un tubo o cuerpo
del microscopio. El sistema de lentes objetivos se localiza cerca del espcimen y
forma una imagen real de la misma, amplificada. Los oculares amplan an ms el
tamao. La imagen que es apreciada con los ojos tiene un aumento igual al producto
de la amplificacin de los dos sistemas.

Las partes fundamentales de un microscopio compuesto son:


a. La parte mecnica del microscopio comprende: el pie, el tubo, el revlver, el asa,
la platina, el carro, el tornillo macromtrico y el tornillo micromtrico. Estos
elementos sostienen la parte ptica y de iluminacin, adems permiten los
desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.

El pie: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo


general forma de Y, o bien es rectangular
El tubo: Tiene forma cilndrica y est ennegrecido internamente para evitar las
molestias que ocasionan los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan
los oculares.
El revlver: Es una pieza giratoria provista de orificios en los cuales se enroscan
los objetivos. Al girar el revlver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan
en posicin de trabajo, la cual se nota por el ruido de un pin que lo fija.
La columna: Llamada tambin asa o brazo, es una pieza colocada en la parte
posterior del aparato. Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo
inferior se adapta al pie.
La platina: Es una pieza metlica plana en la que se coloca la preparacin u objeto
que se va a observar. Presenta un orificio en el eje ptico del tubo que permite el
paso de los rayos luminosos a la preparacin. La platina puede ser fija, en cuyo
caso permanece inmvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir, mediante
tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.
Carro: Es un dispositivo colocado sobre la platina que permite deslizar la
preparacin con movimiento ortogonal de adelante hacia atrs y de derecha a
izquierda.
El tornillo macromtrico: Girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del
microscopio, deslizndose en sentido vertical gracias a una cremallera. Estos
movimientos largos permiten el enfoque rpido de la preparacin.
El tornillo micromtrico: Mediante el movimiento casi imperceptible que produce
al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nitido de la preparacin.
Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm que se utiliza para
precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos.

b. El sistema ptico: Es el encargado de reproducir y aumentar las imgenes


mediante el conjunto de lentes que lo componen. Est formado por los oculares y
los objetivos.
1. Los oculares: Los oculares estn constituidos generalmente por dos lentes,
dispuestas sobre un tubo corto. Los oculares generalmente ms utilizados son los
de: 8X, 1OX, 12.5X, 15X. La X se utiliza para expresar en forma abreviada los
aumentos.
2. Los objetivos: Producen aumento de las imgenes de los objetos y organismos y,
por tanto, se hallan cerca de la preparacin que se examina. Los ms utilizados
ordinariamente son de dos tipos: secos y de inmersin.

Los secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la
preparacin. En la cara externa llevan una serie de ndices que indican el aumento
que producen, la abertura numrica y otros datos. El nmero de objetivos vara con
el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos ms frecuentemente
utilizados son: 6X, 1OX, 20X, 45X y 60X.
El de inmersin est compuesto por un complicado sistema de lentes. Para
observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro
entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en contacto
con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 1OOX y se distingue
por uno o dos crculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.
Los objetivos se disponen en una pieza giratoria denominada revlver.

c. El sistema de iluminacin: Comprende las partes del microscopio que reflejan,


transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observacin a
travs del microscopio, comprende los siguientes elementos:

Condensador: Est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar


los rayos luminosos sobre el plano de la preparacin. Se localiza por debajo de la
platina, puede deslizarse sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo que
determina su movimiento ascendente o descendente.
Diafragma: Generalmente, el condensador est provisto de un diafragma-iris, que
regula su abertura y controla la calidad de luz que debe pasar a travs de esta.

Partes fundamentales del microscopio ptico de campo claro

Existen algunas variantes del microscopio compuesto como son.


1.
2.
3.
4.
5.

Microscopio de contraste de fases


Microscopio de florescencia
Microscopio de luz polarizada
Microscopio de campo obscuro
Microscopio electrnico
8

1.- Microscopio de contraste de fases.


Es un microscopio ptico modificado que permite contrastar sustancias de diferente grosor
o densidad. Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminacin de
tal manera que vaya en diferentes rutas a travs de las distintas partes de una clula. El
resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. Con este mtodo, el
material denso aparece brillante, mientras que las partes de la clula que tienen una
densidad cercana al H2O (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar
estructuras celulares vivas y sin necesidad de usar colorantes.

Candida albicans

Contraste de fases, X 400

2.- Microscopio de fluorescencia.


La muestra se tie con una sustancia fluorescente que absorbe la energa de las ondas
cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas ms largas (verde). Se utiliza
en inmunofluorescencia, tcnica en la cual una sustancia luminiscente se une a un
anticuerpo especfico de ciertas clulas. Si el anticuerpo fluorescente se une al
microorganismo, ste emite fluorescencia y se puede identificar. Esta tcnica se usa en
clnica.

Microscopio de fluorescencia
X 1000

Micelio de Candida albicans


teidos con calcofluor

3.- Microscopio de luz polarizada


El material birrefringente, tambin llamado anisotrpico, tiene dos diferentes ndices de
refraccin de dos direcciones perpendiculares, este material puede ser observado con el
microscopio de luz polarizada que cambia esa birrefringencia en diferencias de claridad.
Puede utilizarse para la observacin de fibras biolgicas como las de cido nucleico.

Sustancias amiloides en Rin

4.- Microscopio de campo obscuro


Tambin es llamado ultramicroscopio, usa un microscopio ptico equipado con un
condensador y objetivo especial que iluminan los microorganismos en la muestra frente a
un fondo oscuro. Este mtodo se utiliza para observar la estructura celular de
microorganismos vivos sin teir.

Leptospira spp.

5.- Microscopio electrnico


El microscopio electrnico utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta
fundamentalmente de un tubo de rayos catdicos, en el cual debe mantenerse el vaci. El
ctodo est constituido por un filamento de tungsteno, que al calentarse elctricamente
emite los electrones, los cuales son atrados hacia el nodo por una diferencia de
potencial de 50.000 a 100.000 voltios. La lente del condensador enfoca este haz y lo dirige
hacia el objeto que se observa, cuya preparacin exige tcnicas especiales. Los
electrones chocan contra la preparacin, sobre la cual se desvan de manera desigual.
10

Con el objetivo se enfoca la imagen, que es ampliada por la lente de proyeccin. Para
variar los aumentos en el microscopio electrnico basta variar la distancia focal de la lente
proyectora.
Como los electrones no impresionan la retina del ojo humano, debe recogerse la imagen
del microscopio electrnico en una pantalla fluorescente, la cual posee una superficie
impregnada con fsforo o sulfuro de zinc. La imagen obtenida en esta pantalla puede
fotografiarse

Microfotografia de un linfocito T vista en el Microscopio Electrnico de Barrido.

Cuidados especiales en el uso y manejo del microscopio

El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran
daarlo. Mientras no est en uso debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien
cubrirlo con una bolsa plstica o campana de vidrio.
Las partes mecnicas deben limpiarse con un pao suave; en algunos casos, ste se
puede humedecer con xilol para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de cedro,
parafina, etc. Que hayan cado sobre las citadas partes.
La limpieza de las partes pticas requiere precauciones especiales. Para ello debe
emplearse papel "limpiante" que expiden las casas distribuidoras de material de
laboratorio. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los
dedos; las huellas digitales perjudican la visibilidad, y cuando se secan resulta
trabajoso eliminarlas.
11

Para una buena limpieza de las lentes puede humedecerse el papel "limpiante" con ter y
luego pasarlo por la superficie cuantas veces sea necesario. El aceite de cedro que queda
sobre la lente frontal del objetivo de inmersin debe quitarse inmediatamente despus de
finalizada la observacin. Para ello se puede pasar el papel "limpia lentes" impregnado
con una gota de xilol.
Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y
bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posicin ms baja, para evitar que
tropiece con alguno de los de mayos aumento. Gurdese en lugares secos, para evitar
que la humedad favorezca la formacin de hongos. Ciertos cidos y otras sustancias
qumicas que producen emanaciones fuertes, deben mantenerse alejados del microscopio.
Material:
Microscopio compuesto de campo claro ordinario.
Aceite de inmersin.
Preparaciones teidas de microorganismos.
Papel para limpieza de lentes.
Lpices de colores
Manejo del microscopio:

Si el material a observar es relativamente grande (100 micras) quizs baste con el objetivo
10X o seco dbil para observarse. En cambio si es ms pequeo se usar el lente objetivo
40X o seco fuerte o el objetivo 100X o de inmersin.
1. Encienda la lmpara del microscopio y cierre el diafragma de iris.
2. Coloque la preparacin sobre la platina centrndolo sobre el orifico de la misma.
3. Empleando el tornillo macromtrico eleve la platina hasta el tope, si el microscopio
no cuenta con este, observe lentamente para evitar que la lente entre en contacto
directo con la preparacin.
4. Usando el objetivo 10X localice al objetivo por ver con el tornillo macromtrico.
Cuando sea parcialmente visible enfoque con el micromtrico.
5. Ajuste la fuente de luz y mueva el tornillo del condensador hasta que el aillo del
diafragma se observe con la mayor nitidez posible.
6. Girando el revlver coloque el objetivo 40X, enfoque ligeramente con el tornillo
micromtrico.
7. Dando un semigiro con el revlver coloque una gota de aceite de inmersin sobre la
preparacin. Enseguida gira el revlver hasta que el objetivo 100X quede en su
lugar.
8. Incremente la iluminacin abriendo el diafragma o elevando el condensador, al
mismo tiempo enfoque con el tornillo micromtrico.
12

9. Dibuje los esquemas de las observaciones en su manual de la prctica detallando


las caractersticas de cada uno de los microorganismos observados.
Evaluacin de la prctica:

Examen escrito sobre la temtica de la prctica


Habilidades durante el desarrollo de la prctica

Resultados:

13

Anlisis y discusin:

Conclusiones y sugerencias:

14

Cuestionario:

1.

Por qu se utiliza aceite de inmersin con el objetivo 100X?

2.

Qu significa las cuatro inscripciones que tiene cada uno de los objetivos?

3.

Cul es el aumento total que se logra al utilizar un microscopio compuesto de campo


claro y como se determina ste?

Actividades de sntesis:

El alumno presentar un resumen de los conceptos de ptica, propiedades fsicas


de la luz y los fundamentos de las variantes del microscopio compuesto.
Referencias bibliogrficas:

1.
2.
3.
4.

Alberts, B. y cols. 2006. Introduccin a la Biologa Celular. 2 ed. Edicin Mdica


panamericana. Pgs. 8-10
Bohinski, R. C. 1998. Bioqumica. 5 ed. Editorial Pearson Educacin. Pgs. 13 15
Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Methods. 4 th. Ed. Boston:
Butterwortths Collins, C. H. Lyne, P. 1976. Microbiological Methods.
Rawlins, D. J. 1992. Light Microscopy. Philadelphia: Coronel Books

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Prctica No. 2
OBSERVACIN MICROSCPICA DE CLULA HUMANA, VEGETAL Y MICROBIANA

Objetivo: Identificar los diferentes tipos de clulas.


Duracin de la prctica: 3 hr.
Introduccin:
Todos los organismos vivos estn, formados por clulas, las cuales son unidades
pequeas rodeadas de una membrana que contiene una solucin acuosa concentrada de
sustancias qumicas y dotadas de una extraordinaria capacidad para crear copias de s
mismas mediante el crecimiento y la divisin en dos clulas (fisin). Las clulas aisladas
son las formas de vida ms simples. Los organismos superiores, como el hombre, las
plantas, los animales y los microorganismos son comunidades de clulas que derivan del
crecimiento y la divisin de una clula fundadora nica, cada hombre, animal, vegetal y
microorganismo es una colonia extensa de clulas individuales que efecta funciones
especializadas coordinadas por sistemas muy complejos.
Las clulas, por lo tanto, son consideradas unidades fundamentales de la vida y mediante
la biologa celular se puede entender cmo es la vida y como funciona.

Clula animal
Clula vegetal
Clula microbiana
Las figuras muestran un ejemplo de la morfologa celular

La clula animal se diferencia de las vegetales principalmente, porque carece de pared


celular, cloroplastos, y vacuolas (los vegetales si tienen). Debido a la ausencia de una
pared celular rgida, las animales pueden adoptar una gran variedad de formas, pueden
ser geomtricas, como las clulas planas del epitelio; esfricas, como los glbulos rojos;
estrelladas, como las nerviosas, o alargadas, como las musculares. La diversidad tambin
se extiende a los tamaos: varan entre los 7,5 micrmetros de un glbulo rojo humano,
hasta unos 50 centmetros, como ocurre con las musculares.

16

Con relacin a vegetal son tres las caractersticas que marcan una diferencia con respecto
a la animal: la presencia de cloroplastos, de grandes vacuolas y de una pared celular que
protege la membrana. La pared celular de las vegetales es rgida, lo que determina las
formas geomtricas que se encuentran en los tejidos vegetales, como el hexagonal
observado en las clulas de la cubierta de las cebollas.
Para el caso de las clulas microbianas dependiendo del grupo de que se trate esta
conformado para algunos por una red de microfibrilla de N Acetil murmico, N Acetil
glucosalina y un tetrapptido, Qutina, alginatos, Glucanas entre otros y algunos presentan
estructuras especializadas como los flagelos, cilios y fimbrias.
Material
Microscopio
Pipetas
Hisopo de algodn
Abatelenguas
Gotero con cristal violeta
Cuchilla
Portaobjetos y cubreobjetos

Lanceta y aguja de diseccin


Pinzas
Gotero con solucin de Lugol
Cebolla
Pulpa de tomate
Tubrculo de papa
gua estancada

Descripcin de la prctica:
Observacin de clulas animales y clulas microbianas
Con un abatelenguas empujar la lengua y con el hisopo de algodn estril se hace un
raspado en un rea determinada de la boca.
Realizar una extensin de la muestra sobre un portaobjetos
Teir con cristal violeta durante un minuto, dejar secar y observar al microscopio con el
objetivo 10X, 40X y 100X
Observacin de clulas vegetales
Con el uso de una cuchilla y unas pinzas, aislar una parte de la epidermis correspondiente
a la zona cncava de la tercera o cuarta escama de la cebolla y colocarla extendida en un
portaobjetos, colocar un cubreobjetos y observar al microscopio ptico con el objetivo 10X
y 40X.
Con el objetivo de menor aumento (10X), se examinar la preparacin entera, observando
que est formada por clulas alargadas que encierran el ncleo.
Cloroplastos
En un portaobjetos colocar una gota de agua estancada, colocar un cubreobjetos. Observa
al microscopio con el objetivo 10X y 40X. Identificar la forma y tamao de los cloroplastos
estos pueden ser variables, pudiendo ser acintados, estrellados, etc.
17

Cromoplastos
Colocar sobre un portaobjetos una pequea porcin de la parte pulposa del tomate, cubrir
con un cubreobjetos. Observa al microscopio con el objetivo 10X y 40X. Identificar las
clulas separadas unas de otras, aprecindose en el citoplasma una serie de grnulos
rojizos-anaranjados que son los cromoplastos. Tambin se puede ver el ncleo
redondeado, y en las zonas poco alteradas grandes vacuolas incoloras.
Leucoplastos
Se toma una porcin de tubrculo de papa y se raspa con la punta de la lanceta. Se
deposita el raspado sobre un portaobjeto y se aade una gota de agua y otra de lugol. Se
coloca un cubreobjetos y se observa al microscopio con los objetivos de 10X y 40X.
El reactivo lugol, acta como fijador y le proporciona contraste (agente qumico que
destruye las clulas sin modificar su estructura) y colorea algunos tejidos vegetales
(celulsicos, lignificados y suberificados).
Los grnulos de almidn se tien de color azul-violeta intenso por el yodo. Se pueden
observar las capas de crecimiento excntricas, que presentan los grnulos de almidn
alrededor de un punto central o "hilo".
Evaluacin:

Examen escrito sobre la temtica de la prctica


Habilidades durante el desarrollo de la prctica

18

Resultados:

Anlisis y discusin:

19

Conclusiones y sugerencias:

Cuestionario:
1.

Cules son las principales diferencias estructurales entre la clula animal, vegetal y
microbiana?

2.

Mediante esquemas represente una clula anima, vegetal y microbiana identificando


sus principales estructuras

3.

Cual es la diferencia entre una preparacin en fresco y una tincin simple?

Actividades de sntesis:
20

El alumno elaborar un mapa conceptual de la clula de acuerdo a su organizacin


(Procariotes y Eucariotes)
Elaborar el reporte de la prctica
Referencias bibliogrficas:

1.
2.
3.
4.
5.

Alberts, B. y cols. 2006. Introduccin a la Biologa Celular. 2 ed. Edicin Mdica


panamericana. Pgs. 2-6, 25
Becker, W. M., Reece, J. B. and Poenie, M. F. 1996. The world of The Cell. 3d. ed.
Rewood City, California. Benjamin Cummings
Beveridge, T. J. 1989. The Structure of bacteria. In Bacteria in Nature, Vol. 3.J. S.
Poindexter and E. R. Leadbetter editors. New York: Plenim. Pp 1 65
Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Methods. 4 th. Ed. Boston:
Butterwortths
Rawlins, D. J. 1992. Light Microscopy. Philadelphia: Coronel Books

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Prctica No. 3
PROPIEDADES DE CARBOHIDRATOS

Objetivo: Identificar las principales propiedades de los carbohidratos


Duracin de la prctica: 3 hr.
Introduccin:
Los hidratos de carbono, son tambin llamados carbohidratos o glcidos, son importantes
componentes de los seres vivos. Abundan en los tejidos vegetales, en los cuales forman
compuestos fibrosos o leosos en su estructura y son compuestos de reserva energtica
de tubrculos, semillas y frutos. Se encuentran ampliamente distribuidos en tejidos
animales, realizando diversas funciones.
Los glcidos son compuestos con un grupo aldehdo o cetona y varios alcohles, de
acuerdo a su clasificacin son: Monosacridos, oligosacridos y polisacridos los cuales
tienen diferentes propiedades fisicoqumicas debido a su estructura molecular
En los seres vivos las funciones de los carbohidratos se pueden generalizar en:
a)energticas
La glucosa es un de los carbohidratos ms sencillos comunes y abundantes; representa a
la molcula combustible que satisface las demandas energticas de la mayora de los
organismos, se encuentra como glucgeno en los animales y almidn en vegetales,
bacterias y hongos
b)de reserva
Los carbohidratos se almacenan en forma de almidn en los vegetales (gramineas,
leguminosas y tubrculos) y de glucgeno en los animales. Ambos polisacridos pueden
ser degradados a glucosa.
a)compuestos estructurales
Los carbohidratos estructurales forman parte de las paredes celulares en los vegetales y
les permiten soportar cambios en la presin osmtica entre los espacios intra y
extracelulares. Esta, es una de las sustancias naturales ms abundantes en el planeta. En
22

las grandes plantas y en los rboles, la celulosa, estructura fibrosa construida de glucosa,
cumple la doble funcin de carga y soporte. La celulosa es de origen vegetal
principalmente, sin embargo algunos invertebrados tienen celulosa en sus cubiertas
protectoras. El polisacrido estructural ms abundante en los animales es la quitina.
b)precursores
Los carbohidratos son precursores de ciertos lpidos, protenas y dos factores vitamnicos,
el cido ascrbico (vitamina C) y el inositol.
c) seales de reconocimiento (como la matriz extracelular)
Los carbohidratos intervienen en complejos procesos de reconocimiento celular, en la
aglutinacin, coagulacin y reconocimiento de hormonas.
Materiales:
Agua destilada
Miel
Piloncillo
Azucar de mesa
NaCl
Almidn
Solucin de Yodo
Vaso precipitado de 100mL
Mechero.
Agitadores

1L
200 g
1 pieza
200 g
40 g
100 g
un gotero
5

Descripcin de la prctica:

Propiedades a identificar de los diferentes carbohidratos.


a)

Solubilidad.

Etiquetar tres vasos de precipitado: azcar, piloncillo y almidn


Adicionar aproximadamente 2.5 g. de cada uno de los carbohidratos y aadir 10.0 mL de
agua. Dejar reposar. Agitar vigorosamente tomando el tiempo en el cual cada uno de los
azucares se solubiliza.
Repetir el mismo procedimiento pero el agua debe estar a una temperatura de ebullicin.
Anotar todas las observaciones.
23

b)

Saturacin de una solucin de carbohidratos.

En un vaso de precipitado preparar una solucin con cuatro cucharadas de sal de mesa.
Etiquetar tres vasos de precipitado. Azcar sal, Piloncillo Sal y Almidn sal. Colocar a
cada vaso la solucin salina.
c)

Hidrlisis de polisacridos

Reaccin del lugol.


Este mtodo se usa para la identificacin de polisacrido.
El almidn en contacto con el reactivo de lugol (disolucin de yodo y yoduro de potasio)
toma un color azul violeta caracterstico.
Colocar en un tubo de ensaye tres mL del glucido a investigar.
Aadir unas gotas de lugol.
Si la solucin del tubo vira a un color azul violeta la reaccin es positiva.
Una vez que tengas el tubo de ensaye con el lugol con la coloracin azul violeta, calienta
el tubo a la llama y djalo enfriar Explica que ha ocurrido?
Fundamento:
La coloracin producida por el lugol se debe a que el Yodo se introduce entre las espirales
de la molcula de almidn. No es por tanto una verdadera reaccin qumica, sino que se
forma un compuesto de inclusin que modifica las o propiedades fsicas de esta molcula,
apareciendo la coloracin azul violeta.
Evaluacin:

Examen escrito sobre la temtica de la prctica (Cinco reactivos)


Habilidades durante el desarrollo de la prctica

24

Resultados:

25

Anlisis y discusin:

Conclusiones y sugerencias:

26

Cuestionario:

1.- Describe tres caractersticas fisicoqumicas de los carbohidratos.

2.-Por qu los carbohidratos tienen diferentes propiedades?, por ejemplo, solubilidad,


poder edulcorante y poder reductor. Justifica cada una de tus respuestas.

3.- El lugol es un reactivo para identificar la presencia de almidn, su reaccin es positiva


cuando aparece un color azul. Escriba la estructura del almidn e indique a que se debe la
coloracin.

Actividades de sntesis:

Elaborar una tabla resumiendo propiedades fisicoqumicas de los carbohidratos


Cuales son los polisacridos de uso industrial y qu productos se obtienen
Referencias bibliogrficas:

1.
2.
3.
4.

Blanco A. (2006). Qumica biolgica. 8 Ed. Editorial el Ateneo. Pag. 57 70


Lehninger, A. L.2001. Principios de Bioqumica. Ed. Omega
Murria, Granner, Mayer, Rodwell. 1996. Bioquimica de Hrpe. Ed. Manual Moderno.
Strayer, L. 2004).Bioqumica. 5 ed. Editorial Revert, S. A. pgs. 299 300

27

Prctica No. 4
PROPIEDADES DE PROTENAS

Objetivo: Identificar la presencia de protenas en tejidos animales y vegetales.


Duracin de la prctica: 3 hr.
Introduccin:
Las protenas son las macromolculas orgnicas ms abundantes en la clula por su
participacin imprescindible y trascendental en casi la totalidad de los procesos biolgicos.
La importancia de stas estriba tanto en la enorme cantidad de funciones que
desempean (de ah su gran diversidad). Entre las funciones que llevan a cabo estas
macromolculas destacan:
Funciones enzimticas o catalticas. Las enzimas son protenas que regulan el
metabolismo celular, aumentan la velocidad de las reacciones y permanecen
inalteradas en el transcurso de stas.
Funciones reguladoras u hormonales. Algunas hormonas son tambin protenas.
Las hormonas son fabricadas por las clulas glandulares y son transportadas por la
sangre para que puedan actuar sobre otras clulas del organismo. Por ejemplo la
insulina, la tiroxina, la hormona del crecimiento, etc.
Funciones defensivas e inmunolgicas. Varias de estas macromolculas
desempean funciones protectoras en el organismo. Las ms importantes son las
inmunoglobulinas de la sangre. Estas protenas son anticuerpos, se forman como
respuesta del organismo a la presencia de sustancias extraas o antgenas, a los
que aglutinan o precipitan.
Funciones de transporte. Entre ellas destaca la hemoglobina, que transporta el
oxgeno por la sangre de los vertebrados.
Funciones estructurales. Algunas glucoprotenas forman parte de las membranas
celulares. El colgeno y la elastina son protenas que en el tejido conjuntivo forman
las fibras colgenas y elsticas, respectivamente la queratina es un constituyente de
las uas, los pelos, las escamas de los reptiles, las plumas de las aves, etc.
Funciones homeostticas. Las protenas son capaces de mantener el equilibrio
del medio interno. Adems, dado su carcter anftero (capaz de disociarse como
cido y como base) pueden actuar como tampn y ayudar a mantener constante el
pH.
Funciones contrctiles. Los msculos deben su capacidad de contraerse a la
existencia de dos protenas contrctiles, la actina y la miosina.
28

Funciones de reserva. Como la ovoalbmina en el huevo, o la casena de la leche.


Materiales:
Leche

Matraces de 150 ml

Huevo crudo

Frascos Gerber

Blanqueador

Papel filtro para cafetera

cido actico

Agitadores

cido ctrico

Lupa

Pierna de pollo crudo


Descripcin de la prctica
a) Identificacin de queratina
Rotular un frasco Gerber, adicionarle 50 mL de blanqueador. Adicionar un mechn de
cabello y observar la formacin de burbujas. Tapar el frasco y esperar de 5 a 10 minutos.
Registrar los resultados.
b) Identificacin de Casena
Rotular dos frascos Gerber, adicionar 50 mL de leche a cada una.
Adicionar 10 mL de cido ctrico a uno de los frascos
Adicionar 10 mL de cido actico a otro de los frascos
Mezclar con un agitador el contenido de cada frasco
Observar las primeras reacciones y dejar reposar 30 minutos
Colocar en otro frasco un papel filtro y hacer pasar la mezcla de cido actico
Registrar los resultados
c) Identificacin de colgena
Pelar una pierna de pollo hasta que quede lo ms limpio posible dejando el hueso con un
poco de cartlago
Colocar el hueso en un frasco Gerber y aadir cido actico hasta cubrir perfectamente el
hueso
Observar la formacin de burbujas
Dejar en reposo durante diez das, cambiando el cido actico cada dos das.
Retirar el hueso del frasco y suavemente probar la elasticidad tratando de doblar.
Con la ayuda de una lupa observar sus caractersticas
Registrar los resultados
d) Identificacin de ovoalbmina
Separar y obtener con cuidado la clara de un huevo
Colocar la clara en partes iguales en dos matraces
29

Adicionar 10 mL de alcohol al 70 % a uno de los matraces y al otro 10 mL de cido actico


Observar las reacciones que se lleva a cabo en cada uno de los matraces
Dejar en reposo durante diez minutos y volver a observar inclinando ligeramente ambos
matraces
Registrar los resultados
Despus de haber probado los experimentos c y d cambiar el hueso por cartlago o bien a
la clara de huevo adicionarle sal de mesa, otra opcin en lugar de la sal es calentar
ligeramente.
Registrar los resultados
Evaluacin:

Examen escrito sobre la temtica de la prctica (Cinco reactivos)


Habilidades durante el desarrollo de la prctica
Primera evaluacin Parcial (Cuatro prcticas)

30

Resultados:

Anlisis y discusin:

31

Conclusiones y sugerencias:

Cuestionario:

1.

Cul es la importancia que tienen las protenas y describa los factores que las
alteran?

2.

Investiga dos mtodos para identificar protenas. Justifica tu respuesta

3.

Cules son los usos que se le dan a las protenas en la industria?

Actividad de sntesis:

32

Elaborar un cuadro sinptico describiendo las propiedades fisicoqumicas de las


protenas
Elaborar el reporte de la prctica
Referencias bibliogrficas:

1.
2.
3.
4.

Blanco A. (2006). Qumica biolgica. 8 Ed. Editorial el ateneo. Pag. 21 - 55


Lehninger, A. L.2001. Principios de Bioqumica. Ed. Omega
Murria, Granner, Mayer, Rodwell. 1996. Bioquimica de Harper. Ed. Manual Moderno.
Strayer, L. 2004).Bioqumica. 5 ed. Editorial Revert, S. A. pgs. 41 53

33

Prctica No. 5
ESTERILIZACIN Y SANITIZACIN

Objetivo: Manejar el equipo de esterilizacin por calor hmedo, y el material


microbiolgico estril y observar la diferencia entre esterilizacin y desinfeccin.
Duracin de la Prctica: 6 hr.
Introduccin:
Esterilizacin: Es la destruccin o eliminacin completa de toda forma de vida
microbiana. Puede llevarse a cabo por procesos fsicos o qumicos (vapor a presin, calor
seco, xido de etileno, lquidos qumicos).
Desinfeccin: Es un proceso que elimina la mayora o todos los microorganismos sobre
los objetos inanimados con la excepcin de esporas bacterianas. Se efecta por medio de
agentes qumicos, clasificados en tres categoras: alta, intermedia y baja, segn la
intensidad de su accin.
Mtodos de Esterilizacin:
1. Agentes Fsicos

Calor Seco

Los mtodos ms importantes son:


a. Flameado: es un procedimiento simple y eficaz, consiste en la exposicin de un
objeto a efecto de la llama hasta la incandescencia. Se esteriliza de esta forma, por
ejemplo asas de cultivo de siembra.
b. Incineracin: es el mejor sistema para esterilizar todas aquellos productos en los
que no importe su destruccin, por ejemplo material biolgico
c. Estufa: calor seco a alta temperatura, 20 minutos a 180, 60 minutos a 160, siendo
suficiente la esterilizacin durante 60 minutos a 100-140, se lo utiliza para
esterilizar material de vidrio debidamente envuelto en papel, metal. etc.

Calor Hmedo.

La esterilizacin con calor hmedo (vapor de agua) es mucho ms rpida y eficaz que el
calor seco debido a que las molculas de agua desnaturalizan las protenas de forma
34

irreversible mediante rotura de las uniones H entre los grupos peptdicos a temperaturas
relativamente bajas.
a. Autoclave: horno a presin, consiste en una cmara en la que el aire puede ser
sustituido por vapor de agua sometida a presin. Se opera a 121 C y 1 atm. de
presin durante 20 minutos. De esta forma se consigue destruir todas las formas
vegetativas y esporas. Se utiliza para esterilizar todo material resistente a esa
temperatura y es muy utilizado para la esterilizacin de medios de cultivos

b. Tindalizacin: (esterilizacin intermitente) consiste en someter el producto a


calentamientos intermitentes entre 56 y 100 C durante 30 minutos con lo que se
asegura destruir las formas vegetativas. En los intervalos se mantiene a
temperatura ambiente o a 37 C, las esporas germinan y las bacterias resultantes
se hacen ms sensibles al calentamiento posterior.

Radiaciones

a. Luz UV: es absorbida a una longitud de onda de 240 a 280 nm por cidos nucleicos
causando daos genticos alterando las bases. Se utiliza en la preparacin de
vacunas, cabinas de seguridad biolgica, lugares de trabajo como mesadas de
laboratorios, etc.
b. Radiaciones ionizantes: actan lesionando cidos nucleicos. Se utiliza sobre todo
en procesos industriales para esterilizar dispositivos quirrgicos, guantes, jeringas,
etc.
b. Agentes Qumicos.
Los agentes qumicos como el xido de etileno, formaldehdo o glutaraldehdo reaccionan
con gran facilidad con diferentes grupos funcionales de los cidos nucleicos y protenas
alquilando estos radicales esenciales.
a)

xido de etileno.

Es un gas inflamable y potencialmente explosivo, muy penetrante que inactiva


microorganismos sustituyendo tomos de hidrgeno lbiles por otros grupos como
hidroxilos, carboxilos, etc.
35

El material se expone a esterilizar a un 5-10% de xido de etileno en dixido de carbono a


50-60 en condiciones de humedad controlada durante 4 a 6 horas. Es necesario
someterlo despus a un perodo de aireacin debido a su carcter mutagnico. Es un
agente efectivo en la esterilizacin de material termolbil como prtesis, catteres, etc.
b)

Formol o formaldehdo.

Es un gas fcilmente soluble en agua que se utiliza al 40% (formalina). Usado en forma
gaseosa y en cmara cerrada se emplea en la esterilizacin hospitalaria y en la industria
farmacutica. Tambin es muy utilizado como desinfectante ambiental de salas altamente
contaminadas que una vez tratadas deben airearse.
Desinfectantes y antispticos.
1. Compuestos inorgnicos.
La actividad de los compuestos derivados de metales pesados (como plata, mercurio,
etc.,) se debe a la formacin de sales que se disocian con dificultad de los grupos
sulfidrilos de las protenas.
Se inactivan en presencia de materia orgnica. El cloro y derivados son agentes oxidantes
muy usados en la potabilizacin del agua en forma de cloro gaseoso en grandes
establecimientos, y en forma de hipoclorito es utilizado para descartar material biolgico
(sangre, suero, etc.)
La cloramina es un antisptico menos potente que el hipoclorito, de accin ms lenta pero
mejor tolerada en la aplicacin tpica.
2.

Compuestos orgnicos.
a. Alcoholes: Actan desnaturalizando protenas. Su accin es rpida pero se
evaporan con facilidad. El alcohol etlico se utiliza en antisepsia a una
concentracin del 70%, a esta concentracin se reduce ms la tensin superficial
de la clula bacteriana facilitando el proceso de desnaturalizacin.
b. Fenoles: Actan precipitando protenas. El hexaclorofeno y el fenol no se emplean
por su toxicidad. Otros derivados fenlicos son los cresoles, los que unidos a
jabones originan compuestos estables.
c. Clorohexidina: Es un derivado fenlico que acta alterando la permeabilidad de la
membrana celular bacteriana. Tiene inactivacin rpida y es bien tolerado por la
piel. Se emplea mucho en hospitales en el lavado de la superficie cutnea en forma
de solucin (acuosa o alcohlica) o asociada a detergentes no inicos.
d. Detergentes anionicos; Actan desorganizando las membranas citoplasmticas.
Tienen escaso poder bacteriosttico. Se pueden mejorar combinndolos con
desinfectantes u otras sustancias tensoactivas como laurilsulfato.
36

e. Detergentes cationicos: Tienen accin antisptica, se inactivan en contacto con


jabn, algodn y materia orgnica. Son poco usados.
f. Glicoles: propilenglicol y etilenglicol, se aplican por medio de unos aparatos
llamados glicosatos o en forma de aerosoles para desinfeccin ambiental.
Material:
Horno de esterilizacin
Autoclave
Mechero Fisher
Tubos de ensaye
Matraz Erlenmeyer de 250 ml.
Pipetas de 1.0 Y 5.0 ml.
Tijeras

Pinzas de diseccin de punta roma


Algodn
Papel estraza
Hilasa
Cajas Petri
Hisopos estriles

Medios de cultivo: agar nutritivo, caldo y gelosa simple


Cultivo microbiano: suspensin de E. coli

Descripcin de la prctica:
Esterilizacin calor seco
1.
2.
3.
4.
5.

Compruebe que el material que va a utilizar ha sido lavado previamente y seco.


De acuerdo con las instrucciones que le proporcionen proceda a la elaboracin
de tapones de algodn para cubrir matraces y tubos, elaborar cubiertas de papel
de estraza para los matraces y envolver las pipetas.
Proceda a cubrir la boca de los tubos, matraces, frascos y pipetas con un tapn
de algodn.
Del nmero total de tubos dejar dos sin esterilizar (testigos de esterilizacin) y el
resto colocarlos en una canastilla para su esterilizacin por calor seco cuya
temperatura debe encontrarse entre 170 y 180C.
Registre el tiempo transcurrido y retire el material de acuerdo a la tabla:
2 tubos
2 tubos
2 tubos

6.
7.
8.

20 minutos
40 minutos
60 minutos

Rotule una serie de cuatro tubos de la siguiente forma: 0, 20, 40, y 60 min. con
caldo nutritivo no estril, y otra serie con caldo nutritivo estril.
Adicionar una serie de tubos un volumen de 3.0 ml de caldo nutritivo sin
esterilizar e incubar a 37oC durante 24 48 hrs.
Adicionar a la otra serie de tubos un volumen de 3.0 ml de caldo nutritivo estril e
incubar a 37oC durante 24 48 Hrs.

37

Esterilizacin calor hmedo


1.
2.
3.
4.

5.
6.
7.

Coloque en el interior de la autoclave todo el material preparado para esterilizar.


Compruebe que el nivel del agua de la autoclave es el adecuado
Vigile la salida de la mezcla de aire y de vapor por la vlvula de escape.
Cuando observe por la vlvula de salida solo vapor, cirrela y contine
calentando hasta que la presin del manmetro sea de 15 lb/in 2, ajuste ahora la
fuente de calor para que la presin se mantenga constante, a partir de este
momento cuente 15 min.
Apague la fuente de calor y permita que el manmetro baje hasta indicar cero.
Abra entonces la vlvula de escape y poco despus retire la tapa de la autoclave.
Retire el material, tome el matraz con agar y virtalo en las cajas estriles, deje
melificar, etiqutelas e incube a 37oC durante 24 48 hrs.
Vierta el agar no estril en cajas estriles, etiqutelas e incube a 37 oC durante 24
48 hrs.

Por otro lado realice lo siguiente:


1. Solicite dos tubos de ensayo que contengan cada uno 1 ml. de suspensin de
Escherichia coli.
2. Junto a la zona de esterilidad del mechero, vierta el contenido de uno de los
tubos en el fondo de una caja de Petri estril; aada 15ml de medio agar
nutritivo fundido y enfriar a 45 C.
3. Mezclar la suspensin de bacterias con el agar, efectuando delicadamente
movimientos de rotacin de la caja Petri sobre la mesa de trabajo.
4. Deje reposar la caja para que solidifique al agar.
5. Una vez que el agar a solidificado, invierta la caja y sobre el fondo, con un
marcador identifique como control de esterilizacin.
6. El segundo tubo con suspensin de E. coli se pondr a esterilizar en
autoclave 15 lb por 15 min.
7. Despus del tiempo de esterilizacin el tubo se someter a los pasos del 1 al 5,
solo que la caja se marcar como problema de esterilizacin.
Desinfeccin:
1. Marque dos cajas Petri, que contenga agar nutritivo, de las siguientes
maneras:
Control de desinfeccin.
Problema de desinfeccin
2. Seleccione un rea del piso de 4 cm. aproximadamente, frote con un hisopo
estril que previamente se ha humedecido con solucin salina.
3. Transfiera el producto del frote hecho en el piso de 4 cm. a toda la superficie de
la caja Petri que marco como control de desinfeccin.

38

4. Seleccione una segunda rea del piso de 4 cm. frote con un algodn que
contenga fenol al 5%.
5. Despus de que la superficie del piso se haya secado, frtela con un hisopo
previamente humedecido con solucin salina.
6. Transfiera el producto del frote a toda la superficie de la caja Petri que marco
con problema de desinfeccin
Evaluacin:

Examen escrito sobre la temtica de la prctica (Cinco reactivos)


Habilidades durante el desarrollo de la prctica
Resultados:

Calor hmedo
Agar nutritivo estril

Agar nutritivo no estril

Calor seco
Tiempo de esterilizacin
Tiempo

Caldo nutritivo estril

Caldo nutritivo no estril

0
20
40
60

39

Anlisis y discusin:

40

Desinfeccin

Conclusiones y sugerencias:

Cuestionario:

1)

Cul es la diferencia entre esterilizacin y desinfeccin.

2)

Describe el mecanismo de accin de dos agentes esterilizantes fsicos y dos


qumicos.

3)

Por qu es importante cuidar la presin y la temperatura en el proceso de


esterilizacin? Justifique su repuesta.
41

Actividad de sntesis:

Elaborar un cuadro diferenciando las propiedades de los agentes qumicos como


antispticos y desinfectantes
Describir el mecanismo de accin de los agentes qumicos para eliminar a los
microorganismos
Referencias bibliogrficas:

1.
2.
3.
4.

Prescott, L. M. (1999). Microbiologa. 4 ed. Editorial McGraw Hill Interamericana.


Pgs. 137 151
Block, S. S. 1999. Disinfection, Sterilization and Preservation. 4 th. Ed. Philadelphia:
Lea and Febiger
Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Methods. 4 th. Ed. Boston:
Butterwortths
Marsik, F. J. and Denys, G. A. 1995. Sterilizatin, decontamination and disinfection.
Procedures for the Microbiology Laboratory. In Manual of Clinical Microbiology. 6 th.
Ed. P. R. Murray Editors, Washington, D. C. American Society for Microbiolog. P. 86
98

42

Prctica No. 6
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Objetivo: Preparar diferentes medios de cultivo e identificar sus funciones.


Duracin de la prctica: 6 hr.
Introduccin.
Un medio de cultivo est constituido por una mezcla de agua y sustancias orgnicas e
inorgnicas, los que en conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el
crecimiento de los microorganismos. La composicin de los medios de cultivo varan en
funcin de:

El grupo de microorganismos
Su complejidad qumica
El estado fsico
La aplicacin

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones ambientales como son: la temperatura, el grado de
humedad y la presin de oxgeno adecuado, as como, un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
Tipos de medios de cultivo

Por su estado:

a. Medios lquidos

43

b. Medios slidos: llevan un agente solidificante (agar) que es un polisacrido acdico


producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45 C. Se usa a una
concentracin del 1,5%.
c. Medios semislidos: agar a una concentracin del 0,7%.

Por su composicin:

a. Medios sintticos o qumicamente definidos. Llevan fuente de carbono y nitrgeno,


sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son
estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a
concentraciones conocidas.
b. Medios complejos o de composicin indefinida. Estos medios llevan ingredientes
como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que
contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin
cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

Por su funcin

a. Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos


adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos
(particularmente hetertrofos exigentes). Ejemplo: adicin de sangre, suero o
extractos de tejidos de animales y plantas.

Colonias de Streptococcus .hemoltico en


gelosa sangre

Colonias de Neisseria gonorrhoeae en gelosa


chocolate

b. Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento


especfico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de
gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin
microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para
autotrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los gram (+);
utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo crecern los que usen
maltosa.

44

Colonias de levaduras en el medio


Chromagar

Colonias de Escherichia coli en agar eosina azul de


metileno (EMB)

c. Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de


microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en
dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos;
McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).

Colonias de Staphylococus epidermidis y


Staphylococus aureus en agar de sal y
manitol

Colonias de Escherichia coli y Salmonella typhimurium


en agar Mac Conckey

d. Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que


el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas.
Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen cidos,
acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de
mantenimiento como es el caso del medio STABB.

Efecto del aire sobre el crecimiento


microbiano

Crecimiento microbiano sobre un medio de cultivo


solido inclinado

Material:
Matraces Erlenmeyer de 250 ml

Probeta

Tubos de ensaye con tapn de


rosca de 16 x 150

Pipeta de 10 ml estril

Mechero Fisher

Esptula

Gradilla

Balanza granataria

Autoclave

Tripie metlico
45

Cajas Petri desechable

Tela de asbesto

Medios de cultivo y reactivos:


Agar nutritivo
Agar de papa y dextrosa
Agar eosina azul de metileno
Descripcin de la prctica:

Agar Salmonella - Shigella


Benzal al 10%
Cloruro de sodio a 0.85%

1. Para la preparacin de los medios de cultivo es importante revisar la forma de


preparar de acuerdo a las especificaciones establecidas en la etiqueta del frasco.
2. Los medios de cultivo preparado debe incubarse a 37 C para prueba de esterilidad
durante 24 hrs.
3. Anotar observaciones, ilustrndolos con dibujos
Evaluacin:

Examen escrito sobre la temtica de la prctica (Cinco reactivos)


Habilidades durante el desarrollo de la prctica

46

Resultados:

Anlisis y discusin:

Conclusiones y sugerencias:

47

Cuestionario:

1.

Qu variables deben ser considerados para la preparacin de los medios de


cultivo?

2.

Describa las necesidades nutritivas que requieren: bacterias, hongos y algas

3.

Qu medio de cultivo requiere para la pregunta anterior?

Actividad de sntesis:

Elaborar un resumen que describa las caractersticas, usos, ventajas y


desventajas de los medios de cultivo
48

Describir la funcin de los indicadores en los medios de cultivo

Referencias bibliogrficas:

1.
2.
3.

Bridson , E. Y. 1990. Media in Microbiology. Rev. Med. Microbiol. 1:1 9


Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Methods. 4 th. Ed. Boston:
Butterwortths
Difco Laboratories. 1984. Difco Manual of dehydrated Culture Media and Reagents for
Microbiology. 10 th. Ed. Detroit: Difco

49

Prctica No. 7
TCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS EN CULTIVO PURO

Objetivo: Seleccionar las tcnicas especficas para aislar un microorganismo puro.


Duracin de la prctica: 6 hr.
Introduccin:
Un cultivo puro o axnico es aquel formado por clulas provenientes de una sola clula
inicial perteneciente a la misma especie y cepa. En la naturaleza los microorganismos se
encuentran formando poblaciones mixtas y heterogneas; no obstante en el laboratorio es
posible establecer las condiciones para obtener un microorganismo aislado, lo cual nos
permite estudiar sus caractersticas particulares.
Se conocen varios mtodos para lograr este propsito, a continuacin se describen alguno
de ellos.
1.- Mtodos para aislar cultivos puros

Tcnica de siembra por estras en placa.

50

Tcnica de las diluciones y vertido en placa.

51

Tcnica de enriquecimiento del cultivo: consiste en disear condiciones de cultivo


que favorezcan especficamente al microorganismo que se requiere aislar y que se
encuentra en pequeas cantidades.
Tcnica de las diluciones en serie: se utiliza para microorganismos cuya proporcin
es mayoritaria dentro de la poblacin mixta.

Tcnica de aislamiento de una sola clula mediante un micromanipulador.

Morfologa colonial
La morfologa bacteriana macroscpica, se basa en las caractersticas de crecimiento de
las colonias en un medio de cultivo determinado.
a. En medios slidos en placas (con agar)

Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, huso


Elevacin: lisa, elevada, convexa, pulvinada, abonetada
Borde: entero, ondulado, lobado, recortado, filamentoso, rizado.
Superficie: lisa o rugosa.
Cromognesis: color del pigmento.
Transparencia: transparente u opaca, con o sin brillo.

52

b. En medios slidos en tubos, agar inclinado

Forma: filiforme, equinulada, esparcida, globulada, difusa,


plumosa, arborescente, rizoide.

c. En medios slidos, agar (siembra por picadura)

Forma filiforme, equinulada, globulada, papilada, vellosa, plumosa, arborescente.

d. En gelatina

Siembra por picadura: filiforme, burbujeante, papilada, vellosa, arborescente.


Licuacin de la gelatina: crateriforme, napiforme, cnica, en forma de saco,
estratiforme.

e. En medios lquidos (sin agar)

Cantidad de crecimiento: ausente, escaso, moderado, abundante.


Distribucin del crecimiento: floculento, anillado, presencia de velo, membranoso,
granular, viscoso.

53

Material:
Tubos de 16 X 150 con tapn de rosca Mechero Fisher
Bao Mara a 45 C

Cajas Petri

Pipetas de 1 y 10 ml estril

asas bacteriolgicas y micolgicas

Medios de cultivo y reactivos:


Azu de algodn lactofenol
Agar de papa y dextrosa
Agar eosina y azul de metileno

Agar nutritivo
Agar de Salmonella - Shigella
Agar de sal y manitol

Muestras biolgicas:
Tierra
Agua de pozo
Agua de estanque
Tierra

Agua de canal
Agua de lluvia
Agua de estanque

Descripcin de la prctica:
Tomar 10 g o mL de muestra problema y preparar una serie de diluciones de la siguiente
manera: a 90ml de sol., salina estril aadir la muestra y agitar (dilucin 10 -1) de esta
dilucin transferir 1.0ml a otro tubo con 9.0 mL de sol., salina agitar y continuar de esta
manera hasta obtener una dilucin 10-4.
Aislamiento de bacterias.
1. Mtodo de dilucin y vaciado en placa.
a)

De las 2 ltimas diluciones transferir 1mL a una caja petri estril (realizar por
duplicado)
54

b) Agregar agar nutritivo y mezclar lentamente por rotacin


c) Dejar melificar e incubar a 37 C/ 24 hrs.
2. Mtodo de estra cruzada empleando medios de cultivo selectivo y diferencial.
a) Tomar una asada de la muestra original y descargar al asa en una de las orillas
de las placas de los medios de cultivo preparados.
b) Esterilizar la asa al rojo de la flama del mechero.
c) Enfriar el asa y hacer otra serie de estras
d) Esterilizar nuevamente el asa y dejarla enfriar
e) Realizar la misma tcnica realizado de 4 a 5 series de estras
f) Incubar las placas a 37 C/ 24 hrs.
3. Aislamiento de hongos.
a)
b)
c)

d)

Preparar una serie diluciones hasta 10-4


De las 2 ltimas diluciones transferir por duplicado 1.0mL a las cajas estriles
Agregar medio de Sabouraud o papa dextrosa agar fundido y a temperatura de
45 C mezclar por rotacin lentamente
Dejar gelificar e incubar a 28 C/48 72 hrs.

Despus de los tiempos de incubacin se determinaran el nmero de unidades


formadoras de colonia (u. f. c.) y se describirn las caractersticas de las mismas.
Morfologa colonial:
La descripcin de la morfologa colonial se realiza tomando en cuenta las siguientes
caractersticas.
1) Tamao
2) Color
3) Forma

Puntiforme

Circular

Irregular

4) Elevacin

Plana

Elevada

Convexa

Pulvinada

Umbonada

5) Superficie: lisa, rugosa


55

6) Aspecto: hmedo, seco


7) Bordes

Enteros

Filamentoso

Irregular

8) Luz reflejada: brillante, mate


9) Luz transmitida: opaca, translucida o transparente
10)Consistencia: suave (mucoide o friable) o dura
Evaluacin:

Examen escrito sobre la temtica de la prctica (Cinco reactivos)


Habilidades durante el desarrollo de la prctica

Resultados:
Colonia 1
( bacterias)

Colonia 2
( bacterias)

Colonia 3
( hongos)

Tamao
Color
Forma
Elevacin
Superficie
Aspecto
Bordes
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia

56

Anlisis y discusin:

Conclusiones y sugerencias:

Cuestionario:

1.

Cul de los dos mtodos utilizados en la prctica es cuantitativo?

2.

Cual es la razn del por qu se aslan los microorganismos en cultivo puro?

57

3.

Qu precauciones debe tomar al momento de realizar las diluciones para evitar


errores?

Actividad de sntesis:

Elaborar un mapa mental de de las tcnicas de aislamiento de microorganismos


Describir las ventajas y desventajas de las tcnicas de aislamiento
Referencias bibliogrficas:

1.
2.
3.

Bridson , E. Y. 1990. Media in Microbiology. Rev. Med. Microbiol. 1:1 9


Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Methods. 4 th. Ed. Boston:
Butterwortths
Gottschalll, J. C., Harder, W. and Prins, R. A. 1992. Principles of enrichment, Isolation,
Cultivation and Preservation of Bactiria. In Prokariotes. 2 th. Ed. A. Balows et al.
Editores, New York: Springer Verlag

58

Prctica No 8
TCNICAS DE COLORACIN DE MICROORGANISMOS

Tinciones diferenciales
Objetivo: Realizar las diferentes tcnicas de coloracin e identificar las estructuras y
morfologas bacterianas y diferenciar microscpicamente las bacterias Gram positivas de
las Gram negativas.
Duracin de la prctica: 6 hr.
Introduccin:
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares. Muchos de ellos son utilizados con frecuencia y
son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos. Ejemplos de los catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y
la safranina. Otros son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con
los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo congo. Otro grupo de ellos son
sustancias liposolubles; los representantes de este grupo se combinan con los materiales
lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o
depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.
Algunos pigmentos teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo, esta sustancia se le denomina
mordiente un ejemplo es el cido tnco, ste se combina con un constituyente celular y lo
altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante.
Preparacin de un frotis

Extensin: Sobre un portaobjeto limpio y seco se coloca una gota del cultivo y
realizar una extensin mediante giros circulares
Secado: dejar secar al aire
Fijacin: Pasar el portaobjetos sobre la flama del mechero
Tincin: Seguir la tcnica
59

Tincin Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la
misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
Tincin Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en
funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin
qumica.
Los ejemplos clsicos seran la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen
Tincin Gram.
Las bacterias Gram positivas y negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares, se habla de microorganismos
Gram-positivos cuando aparecen teidos de color azul-violeta y negativos cuando se
visualizan de color rojo-rosado.

Gram positivo

Gram negativo

La pared de la clula bacteriana sirve para dar tamao y forma al organismo as como
prevenir la lisis osmtica. El material que le confiere la rigidez es el peptidoglicano. Las
Gram-positivas es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano y
de cido teicoico (80%-90%). Con relacin a las clulas Gram-negativa su capa es
mucho ms delgada, adems est rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la
clula Gram-negativa es peptidoglicano.
Las paredes de las bacterias Gram-positivas contienen menos aminocidos que la Gramnegativa; el contenido graso es mucho ms elevado en la Gram-negativa que en las
Gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicacin del mecanismo de la
reaccin al gram.
60

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano


(mureina) y dos clases de cidos
teicoicos. cido Lipoteicoico que est
en la superficie, empotrado en la capa de
peptidoglicano y unido a la membrana
citoplsmica y cido teicoico de la pared
que est en la superficie y se une slo a
la capa de peptidoglicano. El cido
Teicoico
es
el
responsable
del
determinante
antignico
del
organismo.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano


(mureina) unida a una membrana exterior por
lipoprotenas. La membrana exterior est
hecha
de
protena,
fosfolpido
y
lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la
porcin de lpido est embebida en el
fosfolpido y el antgeno O polisacrido
est en la superficie. El lpido se llama
Lpido A y
es
txico, pero
el
lipopolisacrido
entero
se
llama
Endotoxina. La pared de la clula tiene
poros llamado Porinas para el transporte de
substancias de peso molecular bajo. Entre la
membrana citoplsmica y la pared celular
hay un espacio periplsmico con enzimas
hidrolticas, enzimas inactivadoras de
antibiticos y protenas de transporte.

Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin


GRAM:

Cocos

Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen


por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en
grupos irregulares, a veces de gran tamao

Forma esfrica: coco

Divisin a lo largo del mismo plano formando cadenas


cortas
Cadena de cuatro a 20
Dos cocos: Diplococos
cocos: Estreptococos

61

Divisin a lo largo de
dos planos: Ttradas

Divisin a lo largo de tres planos


Regularmente Sarcinas

Irregularmente Estafilococos

Bacilos

Grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma de
vara: Bacilos

Dos bacilos juntos:


Diplobacilos

Cadenas de bacilos:
Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con


lado o en figuras en X, V o Y

Espirales. (Treponemas, Borrelias ...)

Forma de espiral rgida: Espirilo

Espiral Flexible y ondulada: Espiroqueta

Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en


una misma especie.
Material:
Microscopio de campo claro

Pizeta con agua destilada

Asa de platino

Pizeta con solucin de benzal al 15 %

Mechero Fisher

Algodn

Portaobjetos

Bao mara

Cubreobjetos

Vaso de precipitado de 100 ml.

Charola y puente de tincin

Lpices de colores

Soluciones:
Tincin de Gram
Cristal violeta
Lugol
Etanol - Acetona
Safranina
62

Descripcin de la prctica:

Tincin simple

1.
2.
3.
4.

Con el cultivo de Bacillus subtilis haga un frote con forme le indique el profesor
Cubra el frote con colorante cristal violeta y dejar actuar un minuto
Lave con agua destilada y dejar secar al aire
Observar al microscopio y registrar sus resultados con ilustraciones

Mtodo de Gram
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.

Siguiendo las indicaciones del profesor, coloca una gota de agua destilada en el
porta objetos
Toma con el asa de platino los diferentes cultivos y suspenderlos en la gota de
agua extendindolos sobre una superficie de 1.5 a 2.0 cm.
Dejar secar el aire los diferentes frotes
Fijar los frotes al calor, pasando los portaobjetos tres veces sobre la flama del
mechero Fisher, por la cara contraria de aquella en que se encuentra el frote.
Tenga cuidado de no calentar en exceso.
Coloca la preparacin sobre el puente de tincin y cubrir el frote con solucin
colorante de cristal violeta
Dejar actuar el colorante por 1 minuto
Lavar con agua destilada y dejar escurrir los frotes
Cubrir con solucin de lugol y dejar actuar por 1 minuto
Lavar con agua destilada y dejar escurrir bien los frotis
dejarlo con etanol - acetona nicamente 0 segundos
Lavar rpidamente y suavemente con agua destilada y escurrir bien la
preparacin
Cubrir con solucin colorante de safranina y dejar actuar por 1minuto
Lavar rpidamente y suavemente con agua destilada y escurrir bien los frotes
Dejar secar al aire y observar al microscopio
Registrar los resultados obtenidos con ilustraciones

Evaluacin:

Examen escrito sobre la temtica de la prctica (Cinco reactivos)


Habilidades durante el desarrollo de la prctica

63

Resultados:
Tincin simple

Tincin de Gram

Anlisis y discusin

64

Conclusiones y sugerencias:

Cuestionario:

1.

Cul es la razn de emplear colorantes en microbiologa?

2.

Qu es un mordente? Cul es el que se emplea en la tincin de gram?

3.

Cul es la diferencia entre una tincin simple y una diferencial?

65

Actividad de sntesis:

Explique como interaccionan los colorantes y los componentes estructurales de los


microorganismos
Referencias bibliogrficas:

1.
2.
3.
4.

Beveridge, T. J. 1989. The Structure of bacteria. In Bacteria in Nature, Vol. 3.J. S.


Poindexter and E. R. Leadbetter editors. New York: Plenim. Pp 1 65
Clark, G. L. 1973. Staining Procedures used by the Biological Stains Comission.. 3 ed.
Baltimore: Williams & Wilkins.
Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Methods. 4 th. Ed. Boston:
Butterwortths
Scherrer, R. 1984. Gram`s Staining reaction, Gram Tyoes and Cell Walls of bacteria.
Trends Biochems Sci. 92: 242 45

66

Prctica No. 9
PROYECTO DE INVESTIGACIN

Objetivo: Desarrollar un proyecto de investigacin y valorar la factibilidad de llevar a cabo


la parte experimental.
Temas a investigar:

Biocombustibles
Biodegradacin de pesticidas
Biodegradacin de Hidrocarburos
Edulcorantes
Enzimas de origen microbiana
Hormonas
Lixiviacin

Registro y presentacin del protocolo

_________________________

Presentacin y evaluacin de proyectos

__________________________

67

Referencias bibliogrficas:

1. Alberts, B. y cols. 2006. Introduccin a la Biologa Celular. 2 ed. Edicin Mdica


panamericana. Mxico. Pg. 8-10
2. Becker, W. M., Reece, J. B. and Poenie, M. F. 1996. The world of The Cell. 3d. ed.
Rewood City, California. Benjamin Cummings. Pg.
3. Blanco A. (2006). Qumica biolgica. 8 Ed. Editorial el Ateneo. Pg. 57 70
4. Block, S. S. 1999. Disinfection, Sterilization and Preservation. 4 th. Ed. Philadelphia:
Lea and Febiger
5. Beveridge, T. J. 1989. The Structure of bacteria. In Bacteria in Nature, Vol. 3.J. S.
Poindexter and E. R. Leadbetter editors. New York: Plenim. Pp 1 65
6. Bohinski, R. C. 1998. Bioqumica. 5 ed. Editorial Pearson Educacin. Pgs. 13 15
7. Clark, G. L. 1973. Staining Procedures used by the Biological Stains Comission.. 3 ed.
Baltimore: Williams & Wilkins.
8. Collins, C. H. and Lyne, P. M. 1976. Microbiological Methods. 4 th. Ed. Boston:
Butterwortths
9. Bridson , E. Y. 1990. Media in Microbiology. Rev. Med. Microbiol. 1:1 9
10. Difco Laboratories. 1984. Difco Manual of dehydrated Culture Media and Reagents for
Microbiology. 10 th. Ed. Detroit: Difco
11. Gottschalll, J. C., Harder, W. and Prins, R. A. 1992. Principles of enrichment, Isolation,
Cultivation and Preservation of Bactiria. In Prokariotes. 2 th. Ed. A. Balows et al.
Editores, New York: Springer Verlag
12. Lehninger, A. L.2001. Principios de Bioqumica. Ed. Omega
13. Marsik, F. J. and Denys, G. A. 1995. Sterilizatin, decontamination and disinfection.
Procedures for the Microbiology Laboratory. In Manual of Clinical Microbiology. 6 th.
Ed. P. R. Murray Editors, Washington, D. C. American Society for Microbiolog. P. 86
98
14. Murria, Granner, Mayer, Rodwell. 1996. Bioquimica de Harper. Ed. Manual Moderno.
15. Prescott, L. M. (1999). Microbiologa. 4 ed. Editorial McGraw Hill Interamericana.
Pgs. 137 151
16. Rawlins, D. J. 1992. Light Microscopy. Philadelphia: Coronel Books
17. Scherrer, R. 1984. Gram`s Staining reaction, Gram Tyoes and Cell Walls of bacteria.
Trends Biochems Sci. 92: 242 45
18. Strayer, L. 2004).Bioqumica. 5 ed. Editorial Revert, S. A. pgs. 299 300

68