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FACULTAD DE BIOANALISIS
E
INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGIA
ESTUDIO
INMUNOFENOTlPICO COMPARAT1VO DE
DE
CORDON
C t L U L A S MOVILIZADAS
QUE
UMBILICAL
A LA
PARA OBTENER
UCENCIADO
VANIHAMIN
EN
HUMANO
(SCUH)
EL GRADO ACADEMICO DE
QUIMICA
DOMfNGUEZ
CLINICA
MEL&IDEZ
MEXICO, D.F.
COMITE TUTORAL:
PRESIDENTE:
Dr. RAFAEL GUERRERO GARCIA
SECRETARIO:
Q.C JORGE SIGFRIDO GONZALEZ HERNANDEZ.
VOCAL
Dra. MA. LUISA SOLANO GARCIA.
SUPLENTE:
M en C. MARIA LOPEZ HERNANDEZ
DIRECTOR DETESIS:
DR ALEJANDRO MARCHE COVA.
dichas metas, cada vez que uno logra una meta ya sea
profesional o personal quiere estar rodeado de los seres a los que mas ama o que de
alguna manera han dejado huella en el para compartir su felicidad. En este caso es
una meta profesional se que no me bastaria una o dos hojas para poder poner a
todas las personas que mi mente llegue a recordar y que
importantes para mi pero deben saber que aunque no lleguen a aparecer en estas
hojas, estan en mi corazon.
explicar
lo que significas para mi, pero debes saber que siempre estas en mi
corazon y me das fuerzas en mis momentos diffciles y creeme no son pocos. Se que
algun dfa, en algun momento o en algun lugar tendre la oportunidad de decfrtelo
personalmente pero por ahora sera de esta manera, nos vemos y t e quiero mucho.
A M I S HERMANOS
A mi querida hermana Ruth, gracias por todo t u apoyo y por hacerme sentir
protegido.
A mi hermano Daneskiu, a t i quiero agradecerte t u apoyo amistad, y gracias
por sor un ejemplo para mi, t e quiero mucho hermano.
A mi hermanita Ihulema, gracias por estar conmigo, y por ser mi compinche,
t u sabes en realidad cuanto vales para mi.(nooooo, mucho hermanita... mucho)
A mis pequenas hermanas Yharos y Ihoana, a ustedes por ocupar una gran
parte de mi corazon, y por ser mis pequenas.
A mis tios Isaac y mi super
tia
Celia, mi abuelita
Anita
ustedes
AGRADECIMIENTOS
I N S T I T U T O N A C I O N A L DE CANCEROLOGI-A.
Dr. Pedro Sobrevilla Calvo
J e f e del Departamento de Hematologia.
Dra. Rita Rivas Gonzales.
J e f a del Banco de Sangre.
Q.F.B. Alejandro Enrique Velasco Escobar.
J e f e de seccion del Laboratorio clinico
Q.F.B. Aurora Acosta Barreda.
Biol.. Rocio Susana Mendez Martinez.
Esp. M.E Maria del Pilar Ramos Godines.
Por su apoyo y colaboracion para la realizacion de esta tesis.
HOSPITAL GENERAL MANUEL GEA GONZALEZ
Dra. Ana Flisser.
Directora de investigacion.
Dr. Luis A l b e r t o Villanueva Egan
Subdirector de ginecologfa y obstetricia.
Por todo el apoyo brindado y su valiosa colaboracion para la realizacion de esta
tesis.
FACULTAD DE B I O A N A L I S I S .
Sobre todo a aquellos maestros que personalmente dejaron huella en mi me
ayudaron y me inspiraron a terminar mi carrera.
Q.C Jorge Sigfrido Gonzalez, Q.C Sandra Luz Gonzalez Herrera. Q.F.B Patricia
Silvia Rosales Pastrana, Q.C. Francisco Solis Paez., Dra. Ma Luisa Solano Garda.
Dr. Rafael Guerrero Garcia, M en C. Maria Lopez Hernandez.
CONACYT
Agradecimientos especiales a CONACYT por la beca N 4 8 8 0 otorgada para el
apoyo a esta tesis, la cual esta comprendida dentro del proyecto N 3 6 8 7 3 - M
"Estudio I n t e g r a l de la Enfermedad Minima Residual en pacientes con Leucemia
Mieliode Cronica Alotransplantados"
conocimien+o
conmigo, asi mismo por soportarme y por reafirmar mis valores eticos dentro de
este mundo cientifico, tambien por ensenarme a hacer las cosas bien (aunque a
veces me cueste mas). Gracias Doctor personalmente es un gran investigador.
"ESTUDIO
INMUNOFENOTIPICO
HEMATOPOYETICAS
COMPARATIVO
PROVENIENTES
DE SANGRE
DE
SUBPOBLACIONES
DE CORDON
UMBILICAL
INDICE
GENERAL
Pag.
ABREVIATURAS
RESUMEN
ii
1.- I N T R O D U C C I O N
1.1.-HEMATOPOYESIS
1
1
1.1.1.-Ontogenia Hematopoyetica
1.1.2.-Subpoblaciones Celulares
1.1.3.-Estroma Celular
7
11
1.3.-ANTICUERPOS MONOCLONALES
14
14
15
17
19
22
25
2.-OBJETIVOS
27
3.-HIPOTESIS
27
Pag.
4.-MATERIALES Y METODOS
4.1.- OBTENCION DE MUESTRAS
28
28
4.1.1.-Muestras de SCUH
28
28
4.2.-FASE DE ESTANDARIZACION
29
29
29
30
31
31
4.3.2.- Procedimiento
31
5.- R E S U L T A D O S
32
6.- D I S C U S I O N Y C O N C L U S I O N E S
50
7.- B I B L I O G R A F I A
54
...
INDICE
DE
FIG U R AS
TABLAS
Pag.
Figura 1. HEMATOPOYESIS
13
24
33
34
35
36
37
38
39
42
43
Pag.
Tabla 10. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS CELULAS
CD71+ TOTALES DE CMSP DE ALODONADORES
44
45
46
47
48
49
ABREVIATURAS
UFC, unidad formadora de colonias; UFC-E, unidad formadora de colonias eritrociticas;
UFC-GM , unidad formadora de colonias granulo-monociticas; UFC-GEMM, unidad
formadora de colonias mixtas (granulocitos, eritrocitos monocitos y megacariocitos);
UFC-Meg, unidad formadora de megacariocitos; UFC-L , unidad formadora de la serie
linfoide; CD, cluster of direntation; UFB-E, unidad formadora de bursas eritroides; MO,
medula osea; SCUH, sangre de cordon umbilical humano; CMSP, celulas movilizadas
a la sangre periferica; CHT = celula totipotencial hematopoyetica.;L,linfoide.; EG ,
eritrocitos y granulocitos; M , monocitos; G, granulocitos; Bas, basofilos; Eo, eosinofilos;
LB linfocitos B; LT , linfocitos T; LGG, linfocitos grandes granulares; FC, factores de
crecimiento; FEC, factor estimulante de colonias; IL, interleucina; AcMs, anticuerpos
monoclonales; FITC, isotiocianato de fluoresceina; rpm = revoluciones por minuto; nm,
nanometro; pL, microlitro.
RESUMEN
En la actualidad para poder obtener celulas CD34+ se hace a traves de su movilizacion
de la medula osea a la sangre periferica (CMSP) por medio de factores de crecimiento,
recientemente una fuente alternativa de gran impacto es la sangre de cordon umbilical
humano (SCUH). La SCUH esta aun bajo estudio para poder observar sus ventajas y
desventajas respecto a las CMSP. Existe una gran diversidad entre ambas muestras en
cuanto a los resultados reportados tanto en la cantidad de celulas CD34+ totales como
de las diferentes subpoblaciones celulares, como las CD34/CD45RA+, CD34+/CD71+ y
CD45RA+/CD71+.
nuestro pais existe muy poca informacion reportada sobre el tema, en el presente
trabajo, mediante el estudio comparativo de las subpoblaciones existentes en SCUH y
CMSP obtuvimos datos estadisticos que pueden servir como valores de referenda. De
tal forma, para la SCUH fueron: CD34+, 1.1- 2.3%, CD45RA+, 84.9-97.3%; CD71+, 1.31.7%; CD34/CD45RA+, 0.5-1.7%; CD34+/CD71+, 0.4-1.2%; CD45RA+/CD71+, 0.61.4%. Y para las de CMSP: CD34+, 0.5-1.3%; CD45RA+, 72.4-85.8%; CD71+, 0.71.1%; CD34/CD45RA+, 0.3-1.1%; CD34+/CD71+, 0.2-0.6%; CD45RA+/CD71+, 0.20.8%.
las diferentes subpoblaciones estudiadas tanto para muestras de SCUH como para
muestras de CMSP, que si bien fueron obtenidos por microscopia de epifluorescencia,
marcan la pauta para conocer datos estadisticamente significativos en futuros estudios
relacionados con el tema.
1.- I N T R O D U C C I O N
1.1.-HEMATOPOYESIS
La hematopoyesis es definida como el proceso mediante el cual las celulas
pluripotenciales se autoperpetuan y diferencian. Estas celulas pluripotenciales tambien
conocidas como celulas madre, tallo, progenitoras o "stem" son las que dan origen a las
distintas series celulares cuando se van diferenciando. Esto es, la celula pluripotente
puede dar origen a una celula similar o bien a otra celula mas diferenciada, a esta
celula se le conoce como precursora o unidad formadora de colonias (UFC), la cual
puede tener diferentes destinos: UFC-E que es la que da origen a la serie eritroide, la
UFC-GM que produce la granulo-monocitica, las UFC-GEMM que originan la mixta, las
UFC-Meg que producen la megacariocitica, y las UFC-L, que son las que dan origen a
la serie linfoide. La progenie derivada de cada una de estas UFC se le conoce como
subpoblacion celular. Estas subpoblaciones celulares continuan con su proceso de
diferenciacion, hasta llegar a una celula terminalmente diferenciada y por lo tanto
comprometida a una linea especifica (1- 3).
Las celulas hematopoyeticas tanto progenitoras como precursoras son incapaces
de distinguirse por medio de microscopia de campo claro. Estas celulas solo pueden
estudiarse mediante tecnicas de cultivo in vitro asi como mediante el marcaje de sus
antigenos de diferenciacion, conocidos como "cluster of diferentiation" (CD), por
anticuerpos monoclonales. Estos antigenos estan presentes en la superficie de la
membrana celular y conforman el inmunofenotipo especifico (4).
Hemangioblastos,
formando
grupos
cordones
aislados
(cumulos
La hematopoyesis
hematopoyeticos
son celulas
mononucleadas
pequenas,
conocida
como
celula
CD34+CD90+,
con
capacidad
de
proliferation,
diferenciacion y autorenovacion.
La celula pluripotente estimulada por su microambiente da lugar a otras celulas
que se iran diferenciacion paulatinamente hasta que se comprometeran a las diferentes
lineas celulares existentes en
yFC^GEfilM
x.
IS
UFC'I
/ UFC-GM
UFC-Eyeg
I
UFB-E
UFC-y
UFC^i
UFC-1
m
MtatoWasta Mitloblasio
I.
Eritrcdto
Mopoeito
Hsr
Basfiio Eosinfifilo
Neuttfftla iPiaqueta
Mastocito
Maaofago
Figura 1. HEMATOPOYESIS.
d e colonias.
eritrocitos,
UFB-E
monocitos,
= unidad
C T H = c e l u l a totipotencial h e m a t o p o y e t i c a . U F C = u n i d a d f o r m a d o r a
formadora
megacariocitos..
EG
de
b u r s a s eritroides.
L = linfoide.
= eritrocitos y granulocitos,
Meg
GEMM
granulocitos,
= megacariocitos.
esta
controlada
por
glucoproteinas
especificas
denominadas
factores
de
que este tenga efecto en la celula. En la Tabla 1 se muestran algunos de los factores
de crecimiento mas importantes y su funcion.
Las citocinas son proteinas solubles, polipeptidos o glicoproteinas con un peso
molecular entre 6000 y 60,000 Daltones, que trasmiten senales de una celula emisora
a otra celula receptora, la cual por lo general esta cercana de la primera, pero no
necesariamente unida a ella. Esta ultima caracteristica las hace diferentes a las
hormonas, las cuales pueden actuar en una forma sistemica porque se distribuyen por
todo el cuerpo a traves de la circulation sanguinea. En cambio, el efecto de las
citocinas generalmente es local, salvo el caso de IL-1, IL-6 y TNFa que pueden actuar a
distancia cuando son producidas en grandes cantidades por celulas no linfoides (11,12).
Los primeros estudios sobre estas proteinas comenzaron en los anos 50-70, la
etapa de los anos 70 se caracterizo por la purification parcial de muchas citocinas
individuales, se conocio que diferentes efectos estudiados eran provocados por la
misma molecula. La edad de oro de las citocinas la constituyo la decada de los 80 que
se caracterizo
individuales,
asi
como
la
sfntesis
de
anticuerpos
monoclonales
espetificos
(13).
15-20
14-30
15-19
21.5
21 - 2 8
25
JL-2
IL-3
IL-4
IL-5
IL-6
IL-7
IL-8
8q12-13
7p15
5q31
5q31
5q23-31
4q
2q
LOC.
CROM
PRODUCTORA
LT,
monocitos,
fibroblastos, hepatocitos,
celulas endoteliales y
neuronales.
Celulas del estroma de medula
osea, leucocitos.
CtLULA
BLANCO
LT, neutrofilos,
LB.
LT y B, U F C - G M , U F C - G E M M ,
UFB-E,
hepatocitos, celulas
neuronales.
LT y B, mastocitos.
LT
LT
CELULA
BIOL6GICA
ACCI6N
kDa, kilo Dalton; EPO, eritropoyetina; TPO, trombopoyetina; LOC C R O M , localization cromosomica ; FCH-G, factor de crecimiento hematopoyetico de granulocitos;
FCH-GM, factor de crecimiento hematopoyetico granulo-monocitico; FCH-M, factores de crecimiento de monocitos; LT, linfocitos T; LB , linfocitos B: U F C - E , unidades
formadoras de colonias eritroides; U F C - G E M M , unidad formadora de colonias mixtas; U F C - G M unidad formadora de colonias granulo-monciticas; UFB-E, unidad
formadora de bursas eritroides.
PESO
MOL. (kDa)
17.5
INTERLEUCINA
IL-1
23
35 - 40
15
53-54
14
22 kD
18-22
45-70
IL-11
IL-12
1L-13
IL-14
1L-15
FCH-GM
FCH-G
FCH-M
4
--
--
--
--
--
--
LOC.
CROM
5q31
--
LT
LT
Macrofagos, LB
Fibroblastos, trofoblastos,
macrbfagos.
LT.
LT, macrofagos, queratinocitos
CELULA P R O D U C T O R A
Cel progenitoras,
Basofilos, eosinofilos,
neutrofilos, cel endoteliales,
fibroblastos, blastos leucemicos
Monocitos
Eosinofilos, basofilos,
neutr6filos, eritrocitos, cel
progenitoras y leucemicas
LB, U F C - G E M M ,
U F C - G M , UFC-E, UFB-E,
megacariocitos, blastos leuc.
LT, NK.
UFB-E, U F C - G E M M
Lin B , monocitos
CELULA BLANCO
Activa Lth 1.
Estimula el crecimiento y la actividad de NK.
Inhibe la produccion de citocinas inflamatorias.
Induce el crecimiento y diferenciacion de Lb.
Induce la proliferacion y la activacion de LB en reposo.
Inhibe la secrecidn de Inmunoglobulinas
Estimula la proliferacion y diferenciacion de LT.
Favorece la action citolitica de cel NK y la producci6n
de cel. LAK
Favorece la hematopoyesis.
Inmunosupresor de la actividad del macrofago.
Promueve la proliferacion y la secretion de la Ig'G de
LB activados.
Favorece la megacariocitosis.
Estimula la sintesis de proteinas de fase aguda.
ACClON BIOL0GICA
c-KIT
ligando
IL-9
IL-10
PESO
MOL. (kDa)
32 - 39
19
INTERLEUCINA
Tabla 1 (CONTINUACION)
Es muy importante senalar que recientes estudios han demostrado que el destino
que
han
de
tomar
las
celulas
progenitoras
hematopoyeticas
depende
de
la
90
34*
w123
45 R A
33
GlyC
/
34
45 RA
w123
DR
DIFERENCIACION
PRECURSORAS.
DE
LAS
CELULAS
(balas magicas).
Los anticuerpos
monoclonales
(AcMo)
son Acs
producidos por una clona unica de celulas B, a diferencia de los Acs policlonales, los
AcMs son monoespecificos y homogeneos, siendo muy eficaces para el desarrollo de
nuevas terapias y metodos diagnosticos. En 1975, Kohler y Milstein (16) desarrollaron
la tecnica de los hibridomas, que permitio la obtencion de AcMs frente a un antigeno
(Ag) determinado en grandes cantidades. Demostraron que, aun siendo imposible
cultivar linfocitos productores de Acs (obtenidos del bazo de ratones previamente
inmunizados con el Ag) fuera del cuerpo humano, estos se podian inmortalizar
mediante la hibridacion con lineas celulares de mieloma, obteniendo los hibridomas. La
inmunizacion de ratones, primer paso en la via anteriormente descrita, actualmente ya
no es necesaria al disponer de tecnicas de inmunizacion de linfocitos o esplenocitos in
vitro, por lo cual se les concedio el Premio Nobel de Medicina y Fisiologia en 1984.
Actualmente los AcMs pueden obtenerse mediante tecnicas de ingenieria genetica (17).
1.4.1-Medula Osea
El tejido productor de la sangre localizado entre las trabeculas del hueso
esponjoso se conoce como medula osea. En el humano, este importante tejido ocupa
un volumen de 30 a 50 mL/Kg de peso corporal y esta compuesto por dos principals
compartimentos,
el
hematopoyetico
el
vascular,
donde
el
compartimiento
la cresta
iliaca
actividad de 'estas sustancias fue observada por primera vez en cultivos celulares.
Estos estimulan a la medula osea para que las celulas aun en estadio inmaduro salgan
a la sangre periferica (5).
Dado que la mayoria de las formas de fracaso de la medula osea o de los
trastornos neoplasicos son trastornos de celulas madre, existe un gran interes por los
mecanismos fisiologicos que regulan la proliferacion y diferenciacion de las celulas
progenitoras. En estos procesos participan tanto factores solubles como las celulas del
estroma de la medula osea. Entre los factores de crecimiento hematopoyetico, el factor
de las celulas madre, tambien conocido como c-kit ligando, actua sobre la celula madre
progenitora. Otros como el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos
actuan sobre la CFU-GM. Debido a que se han clonado los genes de la mayoria de los
factores
de
crecimiento,
pueden
generarse
grandes
cantidades
de
proteinas
Los concentrados de CMSP y SCUH son de gran utilidad clinica debido a que
estos contienen una gran cantidad de celulas progenitoras hematopoyeticas las cuales
tienen la capacidad para diferenciarse y autoperpetuarse,
suma importancia en el campo clinico ya que
incrementan la hematopoyesis en el
individuo que ha sido expuesto a una quimioterapia, asi mismo para curar desordenes
hematologicos de pacientes.
Las CMSP son obtenidas de pacientes normales mediante la aplicacion de un
factor de crecimiento el cual induce a una hematopoyesis acelerada dando como
resultado la salida de celulas en estadio inmaduro a sangre periferica, la recoleccion de
estas celulas se hace mediante aferesis de flujo continuo, obteniendo asi un paquete de
CMSP.
Los factores de crecimiento logran acelerar la estimulacion de la medula osea,
se ha utilizado la IL-3
nutrition para el desarrollo del feto durante el embarazo. Durante los ultimos dias de la
gestation un gran numero de celulas progenitoras hematopoyeticas estan presentes, no
solo en la medula osea sino en la circulation del feto (22, 23)
la
sangre
de
los
animates
recien
nacidos
contenia
altas
por la luz azul emite fluorescencia amarillo-verdosa intensa y la rodamina, que cuando
>
es excitada con luz verde-amarilla emite fluorescencia de color rojo intenso. Acoplando
la fluoresceina a un anticuerpo monoclonal y la rodamina a otro, puede determinarse la
distribution de dos antigenos diferentes en la misma celula, ya que las dos marcas son
detectadas separadamente en el microscopio, cambiando las dos series de filtros de
modo de hacerlos especificos para cada fluorocromo (31). En el presente trabajo los
fluoroforos utilizados fueron la rodamina y el isotiocianato de fluoresceina (FITC) estos
fluoroforos presentan diferentes niveles de excitation y de emision (Tabla 2).
Tabla 2. FLUOROFOROS
MAS
EPIFLUORESCENCIA.
COMUNES
EN
MICROSCOPIA
DE
Fluoroforo
Excitacion
(nm)
Emision
(nm)
Fluoroforo
Excitacion
(nm)
Emision
(nm)
Fluor de Alexa
346
442
Azulcascada
372
456
lndo-1
350
405/480
BFP
380
440
Amarillo
diabolico
430
535
GFP
488
507
CFP
433/455
475/501
FITC
490
520
Naranja de
acridina
490
530/640
TRITC
541
572
Calceina
495
520
Dil
550
565
Rodamina
500
540
Fluoresceina
500
520
Verde de calcio
506
526
Cy3
552
565
YFP
513
527
Rojo Texas
596
620
Azul de Evans
550
675
Cy5
650
667
nm, nanometres.
subpoblaciones
con
anticuerpos
especificos
por
citometna
de
flujo,
observando asi tres diferentes precursores: CD34+/ CD45RA low / CD71 low para la
serie mixta, CD34+/ CD45RA+/CD71 low para la serie mieloide y CD34+/ CD45RA low /
CD71+ para la eritroide.
Kinniburgh D et al (32) realizaron un estudio comparativo por citometna de flujo
entre SCHU y MO cuantificando la expresion de celulas CD34+ y CD34+/ CD45RA+,
encontrando un mayor porcentaje de ambas en las muestras de SCUH respecto a las
de MO.
G. Fritsch et al (33) efectuaron un estudio comparativo utilizando los marcadores
CD34+/ CD45RA+ entre las muestras de CMSP movilizadas con diferentes factores de
crecimiento, MO y SCUH, encontrando un mayor indice de estas celulas en la CMSP
versus MO y en contraste un menor numero de UFC-GM en CMSP versus SCUH.
Mayani y Lansdorp (34) realizan un estudio de celulas de SCUH en el cual
identifican diferentes antigenos para diferentes subpoblaciones hematopoyeticas y
posteriormente las expanden en un cultivo a largo plazo observando su capacidad de
expansion,
entre
las
principales
subpoblaciones
encontradas
fueron,
CD34+/
CD45RA+/ CD71 low, CD34+/CD45RA low / CD71 + y CD34+/ CD45RA low / CD71 low.
Fritsch et al (35) realizaron un estudio comparativo entre MO, CMSP y SCUH
mediante citometna de flujo con los antigenos CD34 y el CD45RA. Encontrando
diferencias cuantitativas entre las muestras, como un mayor porcentaje de CD34+
Si
bien
encontraron
un
2.- O B J E T I V O S
2.1.- OBTENER VALORES
CELULAS TOTALES:
LAS SUBPOBLACIONES:
2.2.-COMPARAR
OBTENIDOS
ESTADISTICAMENTE
EN AMBAS
LOS VALORES
DE
REFERENCIA
3.- H I P O T E S I S
3.1.-EXISTE UNA
4.- M A T E R I A L E S Y M E T O D O S
4.1. - OBTENCION DE MUESTRAS
4.1.1.- Muestras de SCUH
Se emplearon un total de 60 muestras de sangre de cordon umbilical humano
de productos sanos. Las muestras fueron obtenidas del area de Ginecologia del
Hospital General Dr. Manuel Gea Gonzalez, los criterios de exclusion para las muestras
fueron:
a ) Madres no clinicamente sanas
b ) Productos no clinicamente sanos
c ) Productos no a termino de gestation
Los cordones
fueron
obtenidos
con el consentimiento
de la madre
y bajo
los
fueron obtenidas
del Comite
de Etica de la
Seleccionar a la madre.
procede a:
c)
d)
e)
f ) Extraer la sangre del cordon por gravedad y mediante goteo, depositar 4.5
ml_ de la SCUH en tubos de 13 x 100 mm con anticoagulante EDTA.
g ) Procesar la muestra en los primeros 60 min para obtener el buffy-coat-lp.
Centrifugar la muestra de SCUH a 600 rpm por 5 min, para la obtencion del
plasma rico en plaquetas y el buffy-coat-lp.
b)
c)
asi como el AcMo marcado con ficoeritrina (PE) dirigido contra el CD34. Para
4.3.2.- Procedimiento
1. - Realizar el frotis de paquete leucocitario (12 pL de muestra).
2. - Agregar 10 pL del anti-CD34-PE (primer Ac) en camara humeda por 40 min.
3. - Lavar el frotis con agua bidestilada.
5.- R E S U L T A D O S
La forma en la que se obtuvo el cordon umbilical humano asi como su
correspondiente SCUH, se ejemplifica en las Figuras 3 y 4 respectivamente.
La manera en que se concentran las celulas por aferesis de flujo continuo se
ejemplifica en la Figura 5.
Los resultados de las 30 muestras de SCUH y de las 15 de CMSP analizadas, se
muestran en las Tablas 3 a 14.
A)
B)
A)
B)
LEU-PRE
(x 10%L)
35.5
35.9
45.1
40.8
30.8
63.0
44.6
39.1
35.3
28.4
32.8
34.2
37.4
16.2
48.1
LEU-POS
(x 10%L)
38.2
29.9
49.8
35.9
21.1
50.1
28.9
29.2
28.2
21.0
25.5
27.1
11.3
44.5
COSECHA
(x 10 9 /L)
314
370
381
314
346
303
774
381
406
329
422
192
352
425
66
VIABILIDAD
(%)
92.7
95
97
98
98
96
100
99
100
98
96
88
VT
(mL)
60
100
60
60
58
30
60
56
55
77
58
58
70
70
9
.EU-PRE, leucocitos precosecha; LEU-POS, leucocitos postcosecha; C O S E C H A , C M S P x 10 /L movilizadas con FEC-G y
ecolectadas por aferesis de flujo continuo; VIABILIDAD, porcentaje de leucocitos vivos; V T , volumen total obtenido de la
nuestra en mililitros.
LONGITUD
(cm)
VT
(ML)
1.2.3.4.5.6.78.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.1920.21.22.2324.25.26.27.28.29.30.-
10
12
10
9
15
8
12
12
10
15
15
12
8
7
10 .
09
10
13
14
8
5
15
8
12
8
10
9
10
10
14
10
12
9
9
14
8
11
12
10
15
15
15
8
7
10
9
10
12
14
8
5
15
8
10
8
10
10
9
10
14
LT x 10 3 /
ML
12.6
20.1
14.1
17.2
24.5
7.48
24.5
8.37
10.4
24.5
11.7
12.2
11.3
10.5
15.3
7.68
12.8
13.2
15.9
14.5
9.90
11.8
11.4
17.4
17.3
17.4
18.0
18.2
14.1
13.4
GESTACION
(semanas)
PARTO
(N o C)
EDAD*
(anos)
40.0
40.3
37.4
38.5
39.3
38.6
38.0
40 0
38.0
40,1
41.0
39.4
38.6
38.0
40.0
41.0
41.3
40.0
41.1
40.0
41.0
40.2
41.0
38.5
38.0
39.1
40.0
38.3
40.0
41.5
N
N
N
N
C
C
C
N
C
N
N
N
N
N
C
N
C
N
N
C
N
N
N
N
C
N
N
N
N
N
19
26
37
36
15
32
38
34
21
18
26
26
19
22
32
30
30
29
38
35
35
21
19
18
20
20
23
20
18
27
N. normal;
LT, leucocitos
SUBPOBLACIONES ESTUDIADAS
CD34+
CD45RA-
CD34+
CD45RA+
CD45RA+
CD34-
CD34CD45RA-
CD34+
CD71-
CD34+
CD71+
CD71+
CD34-
CD34CD71-
CD45RA+
CD71-
CD45RA+
CD71+
CD71 +
CD45RA-
0.2
0.4
0.4
0.4
0.6
0.2
0.2
0.2
0.4
0.4
0.2
0.4
0.6
0.4
0.6
0.8
0.6
1.0
0.4
0.4
0.8
0.6
0.8
0.8
0.4
0.4
0.8
1.0
0.8
0.4
82
82
83
78
81
80
80
74
73
78
80
77
84
78
80
7.0
7.0
15.6
21.2
18.0
19.0
19.2
25.0
25.8
21.2
19.4
21.8
14.4
20.8
19.0
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.2
0.4
0.4
0.6
0.4
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.4
0.4
0.6
0.8
0.4
0.4
0.6
0.4
0.8
0.4
0.4
0.4
0.6
0.6
0.4
0.4
98.8
98.2
98.4
99.0
98.8
98.6
99.0
98.6
98.8
98.8
98.8
98.6
98.4
99.2
98.8
83
81
82
77
80
80
79
73
72
77
80
78
83
77
79
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.6
0.8
0.4
0.4
0.8
0.4
0.8
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
CD45R
CD71
16.2
18.0
17.2
22.2
19.0
19.2
20.2
26.0
27.0
21.8
19.2
21.2
15.8
22.2
19.8
CD34+
CD45RA-
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
1.2
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
1.2
1.2
0.8
0.8
0.8
CD34+
CD45RA+
1.6
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
1.6
1.21.2
1.2
1.6
0.8
1.6
0.8
0.8
1.2
0.8
1.6
1.2
1.2
0.8
1.6
0.8
1.2
1.2
1.2
1.2
0.8
1.2
0.8
CD45RA+
CD34-
92
90
88
86
90
87
91
78
91
90
90
88
84
88
88
. 86
88
84
87
90
80
84
85
89
87
90
92
89
86
88
CD34CD45RA-
CD34+
CD71-
CD34+
CD71+
CD71+
CD34-
CD34CD71-
CD45RA+
CD71-
CD45RA+
CD71+
5.8
8.4
10.4
12.4
8.4
10.6
6.6
20.4
7.0
8.0
7.6
10.6
13.6
10.4
10.4
12.0
10.8
13.6
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.6
1.0
0.4
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
1.2
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
1.2
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8 .
0.8
0.4
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
1.0
0.8
0.8
0.8
0.8
0.6
1.2
0.8
0.8
0.4
0.4
0.6
0.8
0.6
0.8
0.4
1.0
0.8
1.2
0.8
0.8
0.4
0.8
0.4
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
0.8
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.8
0.8
0.6
0.4
98.0
97.6
97.4
97.8
98.0
97.2
97.6
97.6
97.6
97.6
98.4
98.0
98.0
98.2
97.6
97.6
98.4
97.8
97.8
97.2
98.0
98.0
98.0
98.0
98.2
97.4
97.2
97.6
98.2
98.6
93
92
89
85
88
85
92
80
83
91
88
86
87
87
85
87
86
84
84
88
78
85
86
88
82
91
91
89
85
89
0.8
1.2
0.8
0.4
1.0
0.8
1.2
0.8
1.2
0.8
0.4
1.0
1.2
0.6
0.8
0.8
1.2
0.8
1.0
0.8
0.8
1.2
0.8
0.8
1.0
0.8
1.2
0.8
0.8
0.8
11.0
7.6
18.8
13.6
13.4
9.0
11.2
7.6
5.6
9.4
12.0
10.4
CD71 +
CD45RA-
0.8
0.6
0.4
0.8
0.6
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.8
.0.6
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.4
0.6
0.6
0.8
0.8
0.4
0.8
0.6
0.8
0.6
CD45RACD71-
5.4
6.2
9.8
13.8
10.4
13.4
6.0
18.4
15.2
7.6
11.0
12.2
11.2
12.0
13.4
11.4
12.0
14.6
14.4
10.6
20.8
13.2
12.6
10.4
16.2
7.8
7.0
9.6
12.4
9.6
*DON
#
1.2.3.4.5.-
6.7.-
0.1.2.34.5.-
-6.7.-
89->0.-
-11.1224-2526.-27.-28?9 -30-
VI
<mL>
10
12
9
9
14
8
11
12
10
15
15
15
8
7
10
9
10
12
14
8
5
15
8
10
8
10
10
9
10
14
C D 4 5 R A + Total
PROMED
x 10
x !0 6
/jiL
en VT
(%)
93.7
1181
11810
92.0
1849
22188
89.4
1260
11340
86 1
1480
13320
89.9
2202
30828
86.8
649.2
5193.6
92.7
2271
24981
80.0
669.6
8035.2
84 7
880.8
8808
91.5
2241
33615
90.0
1053
15795
87.9
1072
16080
1007
89.2
8056
6482.7
882
926.1
87.3
1335
13350
87.5
672.0
6048
88.0
1126
11260
1124
13488
85.2
19264
86.6
1376
90.0
1305
10440
79.8
790.0
3950
85.9
15195
1013
983 8
86.3
7870.5
1494
14940
85 9
11840
85.6
1480
91.5
15920
1592
92.7
1668
16680
1634
89.8
14706
86 5
1219
12190
1196
16744
89.3
C D 7 1 + Total
PROMF.D
x 10*
x I0 6
/\iL
en V T
(%)
C D 3 4 + Total
PROMED
x!0J
x 106
<%)
/*iL
en VT
1.5
18.90
189.0
1.8
22.68
226.8
1.7
34.17
410.0
1.6
32.16
385.9
1.5
21.15
190.3
1.8
25.38
228.4
1.3
22 36
201.2
1.5
25.8
232.2
1.4
34.30
480.2
1.6
39.2
548.8
137.6
1.7
12.71
101.7
2.3
17.20
1.8
44.10
485.1
2.2
53.9
592.9
1.8
15.06
180.7
1.4
11.71
140.6
1.7
17.68
176.8
1.8
18.72
187.2
1.5
36.75
551.2
1.6
39.2
588.0
0.9
10.53
157.9
1.8
21.06
315.9
1.7
20.74
311.1
1.3
15.86
2379
1.5
16.95
1356
2.0
22.6
180.8
0.8
8.40
58.8
1.5
15.75
110.2
1.6
24 48
244 8
1.6
2448
244.8
1.6
12.28
110.5
1.8
13 8 2
124.4
1.6
20.48
204.8
1.0
12.8
128.0
1.4
18.48
221.7
2.0
26.4
316.8
1.6
25.44
356.1
1.7
27.03
3784
1.6
23.2
185.6
2.2
31.9
255.2
1.4
13.86
69.3
1.2
11.88
59.40
1.5
17.7
265.5
2.0
23.6
354.0
1.3
14.82
118.5
1.6
18.24
146 0
1.4
24 36
243.6
1.6
27.84
278.4
1.4
24.22
193 7
1.6
27.68
221.4
1.4
24.36
243.6
2.3
40.02
400.2
1.8
32.4
324 0
22
39.6
396.0
1.5
27.3
245 7
1.2
21.84
196.5
1.3
18.33
183.3
1.2
16.92
169.2
1.1
14 7 4
206 3
1.3
17.42
243.8
volumen total de la muestra en mililitros; PROMED, porcentaje promedio de las celulas con el inmunofenotipo indicado, obtenido
artir de la Tabla 6;
x10 3 / pL, concentraci6n de leucocitos con el inmunofenotipo indicado, obtenida multiplicando los valores de
Tabla 7 (CONTINUACION).
CD34+/45RA+
CD34+/CD71+
CD45RA+/CD71 +
6
3
)RDON VT CELULAS
x 10
CELULAS
x 10
x 10
x 10^ C E L U L A S
*10J
x 106
#
(%)
(mL)
/jiL
en VT
(%)
/nL
en V T
/yL
en VT
(%)
1.-
10
12
9
9
14
8
11
12
10
15
15
15
8
7
10
9
10
12
14
8
5
15
8
10
8
10
10
9
10
14
2.3.4.5.67.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.1819.2021.2223.24.25.2627.28.29.30.-
16
20.16
201.6
0 8
10 08
100 8
0.8
10.08
100.8
0.8
16 08
192.9
08
1608
192 9
1.2
2412
289 4
0 8
11.28
101.5
1.2
16 92
152.2
0.8
11.28
101.5
0.8
13 76
123 8
0.6
10.32
92.88
0.4
6.88
61.92
08
19.60
2744
0.8
1960
2744
1.0
24.50
3430
1.2
8 97
71.80
08
598
47.87
0.8
5.98
47 87
16
39 20
431.2
08
1960
215.6
1.2
29.40
323.4
1.2
10.04
120.5
0.8
669
80.35
0.8
6.69
80.35
1.2
12.48
124 8
08
8.32
83.20
1.2
12.48
124 8
08
19.60
2940
08
1960
294 0
0.8
19.60
2940
1.6
18 72
280 8
0.4
468
7020
0.4
4 68
70 20
08
9 760
146 4
0 8
9.76
146.4
1.0
1220
1830
1.6
18 08
144 6
0.8
9 04
72.32
1.2
13.56
1084
0 8
8 40
58 80
0.6
630
44.10
0.6
6 30
44.10
08
12.24
122.4
08
1224
122 4
0.8
12.24
122 4
1.2
9.21
82 94
0.8
6.14
55 29
0.8
6.14
55 29
153.6
0 8
10 24
102.4
04
5 12
51.20
1.2
15.36
1.6
21.12
2534
08
10.50
126.7
08
10.56
126.7
1.2
19.08
267.1
08
12.70
1780
1.0
15 90
222.6
92 80
1.2
17.40
139.2
10
14 50
116.0
0 8
11 60
0.8
7 920
39.60
08
792
39.60
0 8
7.92
39 60
16
18 88
2832
08
944
141.6
1.2
14 16
212.4
08
9.120
72.96
08
9.12
72 96
0 8
9.12
72.96
0.8
13.92
1392
0 8
13.90
139.2
0.8
13 92
139.2
1.2
20.76
166 0
06
1040
83 04
1.0
17.30
138 4
1.2
20 88
208 8
1.2
20 80
208.8
0.8
13 92
1392
216 0
12
21 60
216 0
08
1440
144 0
0.8
14.56
131.0
08
1450
131.0
1.2
16.92
169.2
04
5.64
0.8
10 72
150 0
0 4
5 36
1.2
21.60
0 8
14.56
131.0
56.40
0.8
11.28
1128
75.04
0.8
10.72
150 0
'
x10 I pL, concentracibn de leucocitos con el inmunofenotipo indicado, obtenida multiplicando los valores de CELULAS con los
0.4
0.4
0.1
25:0
0.2-0.6
M
X
S
CV
X 2S
0.8
0.7
0.2
25
0.3-1.1
CD34+/CD45RA+
0.8
0.6
1.0
0.4
0.4
0.8
0.6
0.8
0.8
0.4
0.4
0.8
1.0
0.8
0.4
Fa
1.0
1.0
1.4
0.8
1.0
1.0
0.8
1.0
1.2
0.8
0.6
1.2
1.6
1.2
1.0
0.4
0.4
0.1
25.0
0.2-0.6
CD34+
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.2
0.4
0.4
0.4
0.1
25.0
0.2 - 0.6
CD34+/CD71+
0.4
0.6
0.4
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.4
0.9
0.9
0.2
22.2
0.5-1.3
CD34+ TOT
0.9
1.0
1.1
0.7
0.9
0.9
0.7
0.8
1.0
0.8
0.7
1.0
1.3
0.8
0.9
Fb
0.8
1.0
0.8
0.6
0.8
0.8
0.6
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
0.4
0.8
ME, microscopia de epifluorescencia; CMSP, celulas movilizadas a sangre periferica; Fa, suma de los porcentajes de las celulas C D 3 4 + y CD34+/ CD45RA+
en los frotis de las muestras respectivas; Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 3 4 + y C D 3 4 + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variacion.
CD34+
0.2
0.4
0.4
0.4
0.6
0.2
0.2
0.2
0.4
0.4
0.2
0.4
0.6
0.4
0.6
MUESTRA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
. 14
15
80.0
79.3
3.0
3.9
73.1 - 8 5 . 5
83
78
81
80
80
74
73
78
80
77
84
78
80
82
82
CD45RA+
0.8
0.8
0.2
25
0.3 - 1.1
1..0
0.4
0.4
0.8
0.6
0.8
0.8
0.4
0.4
0.8
1.0
0.8
0.4
0.6
0.8
CD34+/CD45RA+
84.0
78.4
81.4
80.8
80.6
74.8
73.8
78.4
80.4
77.8
85.0
78.8
80.4
82.6
82.8
Fa
79 0
78.7
3.2
4.1
72.3 - 8 5 . 1
82
77
80
80
79
73
72
77
80
78
83
77
79
81
83
CD45+
LAS
04
05
02
40 0
0.1-0.9
- '
Fb
83.4
81.4
82.4
77.4
80.6
80.4
79.4
73.4
72.6
77.8
80.4
78.4
83.8
77.4
79.8
CD45RA+/CD71+
CD45RA+/CD71 +
CELULAS
80.1
79.6
3.1
3.9
73.4 - 85.8
CD45RA+ TOT
83.1
82.0
83.2
77.9
81.0
80.6
80.0
74.1
73.2
78.1
80.4
78.1
84.4
78.1
80.1
Y CD45RA+
Xc"lC1TCOpia
de
fP ifluorescencia ; C M S P , celulas movilizadas a sangre periferica; Fa, suma de los porcentajes de las celulas CD45RA+ y CD34+/ CD45RA+ en los
frotis de las muestras respect,vas;
Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 4 5 R A + y C D 4 5 R A + / C D 7 1 + en los fro^s de las muestras resDect,vas
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variacion
respect,vas.
M
X
S
CV
X2S
15
14
13
12
11
10
MUESTRA
0.4
0.5
0.1
20.0
0.3 - 0.7
M
X
s
CV
X 2S
0.4
0.4
0.1
25.0
0.2-0.6
CD34+/CD71+
.0.4
0.6
0.4
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.4
Fa
0.8
1.2
1.2
0.6
0.8
1.0
0.8
1.2
0.8
0.8
0.8
1.0.
1.0
0.6
0.8
0.4
0.4
0.1
25.0
0.2-0.6
CD71+
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.5
0.2
40.0
0 . 1 - 0 . *9
CD45RA+/CD71+
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.6
0.8
0.4
0.4
0.8
0.4
0.8
_
_
Fb
0.8
1.0
0.8
0.8
1.0
0.8
0.8
1.0
1.0
1.2
0.8
0.8
1.2
0.8
1.2
0.9
0.9
0.1
11.0
0vF. 7/ - 1JL. 1J.
CD71+ TOT
0.8
1.1
1.0
0.7
0.9
0.9
0.8
1.1
0.9
1.0
0.8
0.9
1.1
0.7
1.0
M E , microscopia de epifluorescencia; CMSP, celulas movilizadas a sangre periferica; Fa, suma de los porcentajes de las celulas CD71+ y C D 3 4 + / C D 7 1 + en los
frotis de las muestras respectivas; Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 7 1 + y C D 4 5 R A + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variation.
CD71+
0.4
0.6
0.8
0.4
0.4
0.6
0.4
0.8 .
0.4
0.4
0.4
0.6
0.6
0.4
0.4
MUESTRA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Tabla 10. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS CELULAS CD71+TOTALES DE CMSP DE
ALODONADORES.
0.8
0.8
0.2
25.0
0.41.2
M
X
0.8
1.1
0.3
27.3
0.5 1 . 7
CD34+/CD45RA+
1.2
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
1.2
1.6
1.6
1.6
0.8
0.8
0.8
1.2
Fa
2.4
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6
2.4
1.8
.2.4
2.4
2.4
1.2
1.6
1.6
2.0
0.8
0.8
0.1
12.5
0.61.0
CD34+
1.0
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
0.8
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
0.2
25.0
0.4 1 . 2
CD34+/CD71+
1.2
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
1.0
0.6
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
1.6
1.7
0.3
17.6
1.12.3
CD34+ T O T
2.3
1.6
1.6
1.6
1.6
1.8
2.2
1.6
2.0
2.0
2.0
1.0
1.6
1.6
1.7
Fb
2.2
1.6
1.6
1.6
1.6
2.0
2.0
1.4
1.6
1.6
1.6
0.8
1.6
1.6
1.4
Se seleccionaron 15 muestras al azar de S C U H para poder realizar la comparacion final (Tabla 14) con las 15 de CMSP, el numero en parentesis indica el
numero correspondiente de cordon en la Tabla 4
ME, microscopia de epifluorescencia; S C U H , sangre de cordon umbilical humano; Fa, suma de los porcentajes de las celulas CD34+ y C D 3 4 + / CD45RA+
en los frotis de las muestras respectivas; Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 3 4 + y C D 3 4 + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variation.
CV
X 2S
CD34+
1.2
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
0.6
0/8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
MUESTRA
1 (26)
2 (24)
3 (28)
4 (15)
5 (10)
6 (3)
7 (20)
8 (25)
9 (7)
10 (22)
11 (13)
12 (17)
13 ( 2 )
14 (5)
15 (19)
1.2
' 1.1
0.3
27.3
0.5-1.7
CD34+/CD45RA+
1.2
1.2
0.8
0.8
1.2
0.8
1.2
1,2
1.6
1.6
1.6
0.8
0.8
0.8
1.2
Fa
91.2
90.2
89.8
88.8
91.2
88.8
91.2
88.2
92.6
85.6
85.6
88.8
90.8
90.8
88.2
88
87.8
3.0
3.4
81.8-93.8
CD45RA+
91
88
89
85
91
89
88
82
92
85
87
86
92
88
84
1.0
1.0
0.2
20.0
0.6-1.4
CD45RA+/CD71+
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.0
1.0
Fb
91.8
88.8
89.8
85.8
91.8
89.8
88.8
83.0
93.2
86.2
88.2
87.2
93.2
89.0
85.0
89.8
89.3
2.2
2.5
84.9 - 93.7
CD45RA+ T O t
91.5
89.5
89.8
87.3
91.5
89.4
90.0
85.6
92.9
85.9
90.2
88.0
92.0
89.9
86.6
M E , microscopia de epifluorescencia; SCUH, sangre de cord6n umbilical humano; Fa, suma de los porcentajes de las celulas CD45RA+ y C D 3 4 + / CD45RA+ en los
frotis de las muestras respectivas;
Fb, suma de los porcentajes de las celulas CD45RA+ y C D 4 5 R A + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variation.
CV
X 2S
x
s
89
88.3
2.1
'2.4 :
84.1 - 9 2 . 5
CD45RA+
90
89
89
88
90
88
90
87
91
84
84
88
90
90
87
MUESTRA
1 (26)
2 (24)
- 3 (28)
4 (15)
5 (10)
6 (3)
7 (20)
8 (25)
9 (7)
10 (22)
11 (13)
12 (17)
13 ( 2 )
14 (5)
15 (19)
0.8
0.6
0.2'
33.3
0.2-1.0
0.8
0.8
0.2
25.0
0.4-1.2
CD34+/CD71+
1.2
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
1.0
0.6
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.1
16.7
0.4-0.8
CD71+
0.4
0.8
0.6
0.8
0.6
0.4
0.6
0.8
0.8
0.6
0.6
0.8
0.6
0.6
0.6
1.0
1.0
0.2
20.0
0.6-1.4
CD45RA+/CD71+
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.0
1.0
Fb
2.2
1.6
1.6
1.6
1.6
2.0
2.0
1.4
1.6
1.6 .
1.6
0.8
1.6
1.6
1.4
1.5'
1.5
0.1
6.7
1.3-1.7
CD71+ TOT
1.4
1.4
1.5
1.6
1.5
1.5
1.6
1.4
1.8
1.5
1.5
1.6
1.7
1.4
1.6
Fa
1.6
1.2
1.6
1.6
1.6
1.8
1.8
1.0
1.6
1.2
1.2
1.2
1.6
1.2
1.6
ME
M E , microscopia de epifluorescencia; SCUH, sangre de cordon umbilical humano; Fa, suma de los porcentajes de las celulas C D 7 1 + y C D 3 4 + / C D 7 1 + en los
frotis de las muestras respectivas; Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 7 1 + y C D 4 5 R A + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variation.
Se seleccionaron 15 muestras al a z a r d e S C U H para poder realizar la comparacion final (Tabla 14) con las 15 de CMSP, el numero en parentesis indica el
numero correspondient'e de cordon en la Tabla 4
CV
X 2S
(26)
(24)
(28)
(15)
(10)
(3)
(20)
(25)
(7)
(22)
(13)
(17)
(2)
(5)
(19)
M
X
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
CD71+
0.4
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.8
0.4
0.8
0.4
0.4
0.8
0.8
0.4
0.8
MUESTRA
0.6-1.4
20
0.2
1
1
0.2 - 0.8
40
0.2
, u r c pcriicricti: S ( T I I . sanyre de cordon umbilical humano: M. medians: X, media: S. desviacion estandar: CV, coeficiente de variation.
0.5
0.4
CD45RA+/CD71 +
0.4-1.2
25
0.2
0.8
0.8
0.2 - 0.6
25
0.1
0.4
0.4
CD34+/CD71 +
1.0-1.6
27.3
0.3
1.
1.0
0.3-1.1
28.5
0.2
0.7
0.4
CD34+/CD45RA+
1.3-1.7
7
0.1
1.5
1.5
0.7-1.1
15.5
0.I
0.9
0.9
CD71+ TOT
84.9 - 93.7
~>
2.5
89.3
84.4
72.4 - 85.8
3.8
3.1
79.6
80.1
CD45RA+ TOT
1.1-2.3
17.6
0.3
1.7
1.6
0.5-1.3
22.2
0.2
0.9
0.9
X 2S
c:v
CD34+ TO I
X2S
INMUNOFKNOT1PO
CV
DE REFERENCIA DE
CMSP
S
6.- D I S C U S I O N Y C O N C L U S I O N E S
Se analizaron un total de 45 muestras de las cuales 30 eran de SCUH
y 15 de
la
cantidad de estas, pero esta variacion fue minima y por consiguiente no significativa.
En cuanto a las celulas CD45RA se observo una mayor variacion en las cantidades de
las celulas por frotis,
poblacional. Por lo tanto, podemos tomar estos datos (CV respectivos) como una
medida de control interno, ya que si nuestro coeficiente de variacion entre un frotis y
otro de ia misma muestra no fue considerable,
maduras
tanto
CD45RA-/CD71-,
de
la
CD34+/CD45RA-
CD34+/CD71-
En
cuanto
consideramos
que
las
estan
relacionadas entre si. De tal forma que al tomar las CD34+/CD45RA- y CD34+/CD71-,
podemos pensar que el resto eran celulas CD45RA + leucocitos, CD71 + eritrocitos o
ambas y en le caso de las CD45RA- / CD71- que estaban presentes podemos pensar
que el resto eran celulas CD34+.
Posteriormente apareamos 15 muestras de SCUH escogidas al azar, con las 15 de
CMSP, con el fin de obtener los valores de referenda en ambas muestras con su
respectivo analisis estadistico. Asi, observamos que al comparar la cantidad de celulas
CD34+ totales en ambas muestras se encontro una mayor cantidad de estas en las
muestras de SCUH que en las de CMSP (Tabla 14). Siendo casi del doble, este dato es
muy significativo y de importancia, ya que como diversos autores han mostrado (1-8),
las celulas CD34+ totales son las que potencialmente dan origen a las subpoblaciones.
En cuanto a las celulas CD45RA+ totales los valores obtenidos para las SCUH
fueron de 84.9 - 93.7% (Tabla 12) y para CMSP fueron tambien menores 73.4 - 85.8%
(Tabla 9). Por io que se vuelve a observar lo que antes se discutio para ios valores de
las celulas CD34+. El porcentaje en las celulas CD71+ totales fue mayor tambien en
SCUH, 1.3 -1.7% (Tabla 13) que en CMSP 0.7 - 1.1%. (Tabla 10). Asi mismo tambien
observamos
la
misma
situacion
con
los
valores
de
las
subpoblaciones
la
subpoblacion CD34+/CD45RA+ el valor para SCUH fue de 0.5-1.7% (Tabla 11) y para
CMSP fue de 0.3 - 1.1% (Tabla 8). Para la subpoblacion CD34+/CD71 de SCUH el
valor fue de 0.4 - 1.2% (Tabla 11) significativamente mayor que el mostrado en las
CMSP, 0.2 - 0.6% (Tabla 8). Finalmente en la subpoblacion CD45RA+/CD71+ el valor
obtenido fue para la SCUH de 0.6 - 1.4% (Tabla 12) comparado con el valor de CMSP
que fue de 0.1 - 0.9% (Tabla 9) observando tambien un menor valor de estas.
Aunque cabe senalar que ninguno de estos autores enfocaron sus estudios a la
obtencion de valores de referenda, por lo que su numero de muestras con el que
trabajaron no fue estadisticamente significativo.
Nuestro estudio es el primero que muestra y aporta valores de referencia para las
diferentes subpoblaciones estudiadas tanto para muestras de SCUH como para
muestras de CMSP, que si bien fueron obtenidos por microscopia de epifluorescencia,
marcan la pauta para conocer datos estadisticamente significativos en futuros estudios
relacionados con el tema.
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Rapid